JPS61252215A - アミノ基を有する分子の固定化用物質、その製造方法およびその使用方法 - Google Patents
アミノ基を有する分子の固定化用物質、その製造方法およびその使用方法Info
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Landscapes
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の分野］
本発明は、有効なアミノ基を含む分子の共有結合性固定
化における新規な器具および新規な技術に関するもので
ある。詳しくは本発明は、血清のような体液中に低濃度
で存在する蛋白質の検出、および定量に適用される。さ
らに詳しくは本発明は、免疫検定法（Ｉｓ扉ｕｎｏａｓ
ｓａｙ ）の技術を用いる抗原性物質の定量に利用する
ことができる抗体および抗原の固定化に適用される。
化における新規な器具および新規な技術に関するもので
ある。詳しくは本発明は、血清のような体液中に低濃度
で存在する蛋白質の検出、および定量に適用される。さ
らに詳しくは本発明は、免疫検定法（Ｉｓ扉ｕｎｏａｓ
ｓａｙ ）の技術を用いる抗原性物質の定量に利用する
ことができる抗体および抗原の固定化に適用される。
［発明の背景］
血清または他の体液中に低濃度で存在する抗原性物質の
存在または濃度を決定するには、免疫検定法の技術を利
用する場合が多くなっている。上記技術は、抗体が対応
する抗原に対して特異的に結合すること、およびその反
応［抗体Ａｂ＋抗原Ａｇ−（抗体抗原ＡｇＡｂ） ］が
凝集反応の原理に従うこぐ と等の利点を有している。
存在または濃度を決定するには、免疫検定法の技術を利
用する場合が多くなっている。上記技術は、抗体が対応
する抗原に対して特異的に結合すること、およびその反
応［抗体Ａｂ＋抗原Ａｇ−（抗体抗原ＡｇＡｂ） ］が
凝集反応の原理に従うこぐ と等の利点を有している。
最近、様々な免疫検定法の技術が利用されており、これ
らはその結合の性質によって分類することができる。最
も一般的に利用されているものとして、競合的結合測定
法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＢｉｎｄｉｎｇＡｓｓａ
ｙ ）および非競合的サンドイッチ型測定法（Ｎｏｎ−
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ａｓ５ａ
ｙ）を挙げることができる。どのような技術を用いると
しても、標識化された抗体または抗原の結合体を検出に
おいて使用しなければならない、最も広範囲に使用され
ている標識としては、放射性同位体、酵素および蛍光体
を挙げることができる。これらの標識を利用する方法は
それぞれ順に、ラジオイムノアッセイ［以下ＲＩＡと略
す場合もある］、エンザイムイムノアッセイ［以下ＥＩ
Ａと略す場合もある］及び蛍光イムノアッセイ［以下Ｆ
ＩＡと略す場合もある］と呼ばれている。
らはその結合の性質によって分類することができる。最
も一般的に利用されているものとして、競合的結合測定
法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＢｉｎｄｉｎｇＡｓｓａ
ｙ ）および非競合的サンドイッチ型測定法（Ｎｏｎ−
ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ａｓ５ａ
ｙ）を挙げることができる。どのような技術を用いると
しても、標識化された抗体または抗原の結合体を検出に
おいて使用しなければならない、最も広範囲に使用され
ている標識としては、放射性同位体、酵素および蛍光体
を挙げることができる。これらの標識を利用する方法は
それぞれ順に、ラジオイムノアッセイ［以下ＲＩＡと略
す場合もある］、エンザイムイムノアッセイ［以下ＥＩ
Ａと略す場合もある］及び蛍光イムノアッセイ［以下Ｆ
ＩＡと略す場合もある］と呼ばれている。
標識として放射性同位元素１２５工、１４Ｇあるいは３
Ｈを利用するラジオイムノアッセイは、非常に高感度で
あるため、現在でも最も広範囲に使用されている免疫検
定法である。上記ＲＩＡの多くは、ＩＱ−１６モル程度
の微量な抗原または抗体を検出することができる。ＲＩ
Ａはこのように高感度ではあるが、高エネルギーのガン
マ線およびベータ線を放出する同位体を検出法に用いる
危険性および放射性廃棄物の処理問題等から生じる多く
の不利な点が存在する。近年、ＲＩＡと同程度の感度お
よび測定の迅速性を有する新しいエンザイムイムノアッ
セイ―システムおよび蛍光イムノアッセイ・システムを
開発する試みが多くなされている。これらのシステムは
、抗原φ抗体結合反応を検出するための手段としての放
射性活性に代えて、酵素または蛍光体を利用するもので
ある。
Ｈを利用するラジオイムノアッセイは、非常に高感度で
あるため、現在でも最も広範囲に使用されている免疫検
定法である。上記ＲＩＡの多くは、ＩＱ−１６モル程度
の微量な抗原または抗体を検出することができる。ＲＩ
Ａはこのように高感度ではあるが、高エネルギーのガン
マ線およびベータ線を放出する同位体を検出法に用いる
危険性および放射性廃棄物の処理問題等から生じる多く
の不利な点が存在する。近年、ＲＩＡと同程度の感度お
よび測定の迅速性を有する新しいエンザイムイムノアッ
セイ―システムおよび蛍光イムノアッセイ・システムを
開発する試みが多くなされている。これらのシステムは
、抗原φ抗体結合反応を検出するための手段としての放
射性活性に代えて、酵素または蛍光体を利用するもので
ある。
イングラオール（Ｅｎｇｗａｌｌ ）およびペールマン
（Ｐｅｒｌｍａｎ ）がイムノケミストリー（Ｉ＋ｓ＋
ｓｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｇｔｒｙ ） ８：８？ｌ （Ｉ
９７１）に最初に記載して以来、標識物質として酵素を
用いる方法が発展してきた。これに関する記載の例とし
ては、米国特許第３，６５４，０９０号、同３，７９１
゜９３２号、同３，８５０，７５２号および同３゜８７
９．２６２号各明細書の記載およびジャーナル参オブー
イムノロジカル・メソード（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ） １：２４
７ （Ｉ９７２）およびメソードＯオプ・エンザイモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
７０二４１９ （Ｉ９８０）の記載を挙げることがで
きる。上記記載中の各方法は、ヘテロジニアスＥ Ｉ
Ａ （Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ＥＩＡ）測定原理に
基づくものである。この測定原理には、未反応の酵素標
識された結合体から反応済の酵素標識された成分を分離
する工程が含まれる。これらの検定法は、体液中に存在
する分子量−万以上の抗原または抗体等の物質の検出と
測定に特に適している。
（Ｐｅｒｌｍａｎ ）がイムノケミストリー（Ｉ＋ｓ＋
ｓｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｇｔｒｙ ） ８：８？ｌ （Ｉ
９７１）に最初に記載して以来、標識物質として酵素を
用いる方法が発展してきた。これに関する記載の例とし
ては、米国特許第３，６５４，０９０号、同３，７９１
゜９３２号、同３，８５０，７５２号および同３゜８７
９．２６２号各明細書の記載およびジャーナル参オブー
イムノロジカル・メソード（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ） １：２４
７ （Ｉ９７２）およびメソードＯオプ・エンザイモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
７０二４１９ （Ｉ９８０）の記載を挙げることがで
きる。上記記載中の各方法は、ヘテロジニアスＥ Ｉ
Ａ （Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ＥＩＡ）測定原理に
基づくものである。この測定原理には、未反応の酵素標
識された結合体から反応済の酵素標識された成分を分離
する工程が含まれる。これらの検定法は、体液中に存在
する分子量−万以上の抗原または抗体等の物質の検出と
測定に特に適している。
また、バイオケミカル争バイオフィジカルｅリサーチ拳
Ｄ ムニケーシｇ ７ （Ｅｌｉａｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈ２ｓ。
Ｄ ムニケーシｇ ７ （Ｅｌｉａｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈ２ｓ。
Ｒｅｓ、 Ｇｏｍｓ、） ４７：８４Ｂ （Ｉ９７２）
および米国特許第３．８１７，８３７号明細書に記載さ
れているホモジニアス・エンザイムイムノアツセイも重
要である。これらの検定法では、／＼ブテン（Ｈａｐｔ
ｅｎ）と酵素の関係が、／飄ブテンが抗体に結合すると
、酵素活性が変化するようになっている。ホモジニアス
ＥＩＡでは分離工程を必要としないため、通常これらの
方法は非常に迅速に実施できる。これらの検定法は、治
療薬レベルの測定、誤用薬の検定および他の分子量−万
以上の抗原性物質の測定等、非常に広範囲に利用されて
いる。
および米国特許第３．８１７，８３７号明細書に記載さ
れているホモジニアス・エンザイムイムノアツセイも重
要である。これらの検定法では、／＼ブテン（Ｈａｐｔ
ｅｎ）と酵素の関係が、／飄ブテンが抗体に結合すると
、酵素活性が変化するようになっている。ホモジニアス
ＥＩＡでは分離工程を必要としないため、通常これらの
方法は非常に迅速に実施できる。これらの検定法は、治
療薬レベルの測定、誤用薬の検定および他の分子量−万
以上の抗原性物質の測定等、非常に広範囲に利用されて
いる。
蛍光イムノアッセイは、ＲＩＡの感度とほぼ等しい感度
を有している。高くかつ変動するブランクが非常にしば
しば出現するため、この方法はＲＩＡに比較して信頼度
が低い、いくつかの代表的なＦＩＡ測定原理は、メソー
ド働オブ番エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） ？４：３．２８゜８０．７
８および８７ （Ｉ９８１）および米国特許第３，９０
１，６５４号明細書に記載されている。
を有している。高くかつ変動するブランクが非常にしば
しば出現するため、この方法はＲＩＡに比較して信頼度
が低い、いくつかの代表的なＦＩＡ測定原理は、メソー
ド働オブ番エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） ？４：３．２８゜８０．７
８および８７ （Ｉ９８１）および米国特許第３，９０
１，６５４号明細書に記載されている。
化学ルミネセンスもまた、免疫検定法の処理に利用され
てきた。化学ルミネセンスは、化学変化の結果として生
じる光に関するものである。これには、化学反応の自由
エネルギーの光エネルギーへの変換が含まれる。よく知
られている化学ルミネセンス反応には、酸化剤として過
酸化水素を使用し、そして触媒（例、Ｆｅ３・、Ｃｕ２
・またはＣｏ２・）の存在下での、塩基性溶液中におけ
るルミノール（５−アミノ−１，４−ジヒドロキシフタ
ラジン）の酸化がある。いくつかの化学ルミネセンス免
疫検定法の代表的方法は、米国特許第４．１０４，０２
９号、同４，３７５，９７２号、同４，３８０，５８０
号の各明細書に記載されている。
てきた。化学ルミネセンスは、化学変化の結果として生
じる光に関するものである。これには、化学反応の自由
エネルギーの光エネルギーへの変換が含まれる。よく知
られている化学ルミネセンス反応には、酸化剤として過
酸化水素を使用し、そして触媒（例、Ｆｅ３・、Ｃｕ２
・またはＣｏ２・）の存在下での、塩基性溶液中におけ
るルミノール（５−アミノ−１，４−ジヒドロキシフタ
ラジン）の酸化がある。いくつかの化学ルミネセンス免
疫検定法の代表的方法は、米国特許第４．１０４，０２
９号、同４，３７５，９７２号、同４，３８０，５８０
号の各明細書に記載されている。
免疫検定法の処理における標識手段として用いる電子ス
ピン共鳴については、米国特許第３゜８５０．５７８号
明細書に記載されている。この方法は、比較的高価な装
置および標識（潜在的な発癌性物質である）を生じる自
由電子を必要とする。
ピン共鳴については、米国特許第３゜８５０．５７８号
明細書に記載されている。この方法は、比較的高価な装
置および標識（潜在的な発癌性物質である）を生じる自
由電子を必要とする。
エンザイムイムノアッセイは、臨床分析の分野ばかりで
なく、微生物学、ビールス学、生化学。
なく、微生物学、ビールス学、生化学。
組織培養および免疫学の分野にもその適用範囲が広がっ
ている。これらの検定法のうち、代表的なものとして、
多数の試験を並行して作業処理するのに便利なように、
９６個のウェル（Ｗｅｌｌ ； ８ Ｘ１２配Ｍ）が設
けられているプラスチック製マイクロ滴定皿（旧ｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ Ｄｉｓｈ ）中で実施する方法を挙げるこ
とができる。上記くぼみ（容量、０．３ｍｊＬ）は分光
光度計のキュベツトのように、自動Ｘ−Ｙ移動および表
示機構を備えた高速比色計を用いて、垂直軸方向にそれ
ぞれの内容物の吸光度が読み取られるように機能する。
ている。これらの検定法のうち、代表的なものとして、
多数の試験を並行して作業処理するのに便利なように、
９６個のウェル（Ｗｅｌｌ ； ８ Ｘ１２配Ｍ）が設
けられているプラスチック製マイクロ滴定皿（旧ｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ Ｄｉｓｈ ）中で実施する方法を挙げるこ
とができる。上記くぼみ（容量、０．３ｍｊＬ）は分光
光度計のキュベツトのように、自動Ｘ−Ｙ移動および表
示機構を備えた高速比色計を用いて、垂直軸方向にそれ
ぞれの内容物の吸光度が読み取られるように機能する。
市販のマイクロ滴定器を用いるＥＴＡは、はとんど全て
へテロジニアス・イムノアッセイであり、ウェルの固体
表面への第一抗体または抗原°の物理的吸着を用いてい
る０個々の抗体または抗原の三次構造は様々であるが、
蛋白質とポリマーの間における弱い疎水性のファン・デ
ル・ワールスカの相互作用により、約１乃至２００ｎｇ
／ｃｔｎ’の比較的弱い結合密度が得られる。抗体と抗
原の吸着結合は測定範囲に明確な限界があり、また低い
結合密度および抗体φ抗原複合体の多様な脱着による誤
差が生じるものであるが、上記吸着結合は、依然として
、サンドイッチ型のＥＩＡとＦＩＡのみならず、ヘテロ
ジニアスな競合的ＲＩＡでも広く用いられている。
へテロジニアス・イムノアッセイであり、ウェルの固体
表面への第一抗体または抗原°の物理的吸着を用いてい
る０個々の抗体または抗原の三次構造は様々であるが、
蛋白質とポリマーの間における弱い疎水性のファン・デ
ル・ワールスカの相互作用により、約１乃至２００ｎｇ
／ｃｔｎ’の比較的弱い結合密度が得られる。抗体と抗
原の吸着結合は測定範囲に明確な限界があり、また低い
結合密度および抗体φ抗原複合体の多様な脱着による誤
差が生じるものであるが、上記吸着結合は、依然として
、サンドイッチ型のＥＩＡとＦＩＡのみならず、ヘテロ
ジニアスな競合的ＲＩＡでも広く用いられている。
最近、抗体または抗原を固相（例、ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソード３４：３１５（Ｉ９８０）に
報告されたポリスチレン・ビーズ）に共有結合を介して
付着させるいくつかの方法が開示された。上記方法にお
いてポリスチレン・ビーズは、硝酸で処理され、そして
亜ニチオン酸ナトリウムのアルカリ性溶液で還元されて
、アミノポリスチレン表面が形成される。上記ビーズは
グルタルアルデヒドを用いて活性化され、抗体を共有結
合するために使用される。これらの共有結合により固定
化された抗体を生成するビーズは、さらにサンドイッチ
型イムノアッセイにおいても使用された。抗体が共有結
合したポリスチレン・ビーズを用いるこれらの検定法で
は、抗体の表面密度が高いこと、インキュベーション時
間が短縮されたことおよび精度と測定範囲が改善された
こと等が認められた。類似した方法が、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジカル・メソード５７：８７ （Ｉ９８３
）に記載されている。上記方法では、マンソン住血吸虫
（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｇｏｎｉ ）抗原を
９６個のウェルが設けられているポリスチレン製マイク
ロ滴定皿の表面に共有結合により付着させる。上記マイ
クロ滴定器は、のちにエンザイムイムノアッセイにおい
て患者の血清中の抗体測定にも使用された。
イムノロジカル・メソード３４：３１５（Ｉ９８０）に
報告されたポリスチレン・ビーズ）に共有結合を介して
付着させるいくつかの方法が開示された。上記方法にお
いてポリスチレン・ビーズは、硝酸で処理され、そして
亜ニチオン酸ナトリウムのアルカリ性溶液で還元されて
、アミノポリスチレン表面が形成される。上記ビーズは
グルタルアルデヒドを用いて活性化され、抗体を共有結
合するために使用される。これらの共有結合により固定
化された抗体を生成するビーズは、さらにサンドイッチ
型イムノアッセイにおいても使用された。抗体が共有結
合したポリスチレン・ビーズを用いるこれらの検定法で
は、抗体の表面密度が高いこと、インキュベーション時
間が短縮されたことおよび精度と測定範囲が改善された
こと等が認められた。類似した方法が、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジカル・メソード５７：８７ （Ｉ９８３
）に記載されている。上記方法では、マンソン住血吸虫
（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｇｏｎｉ ）抗原を
９６個のウェルが設けられているポリスチレン製マイク
ロ滴定皿の表面に共有結合により付着させる。上記マイ
クロ滴定器は、のちにエンザイムイムノアッセイにおい
て患者の血清中の抗体測定にも使用された。
上記操作において、アミノポリスチレン表面は、氷酢酸
中の発煙硝酸の混合物を用いるニトロ化反応およびアル
カリ性亜ニチオン酸ナトリウムを用いる還元により、ウ
ェル中に形成される。抗原性蛋白質は、単一の蛋白質を
結合させる短鎖のカップリング分子として作用するＮ−
エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−力ル
ポジイミドおよびスペリン酸を用いて、上記アミノポリ
スチレン表面に結合させる。この報告はまた共有結合さ
れた抗原を用いて行なう上記検定法が、物理的に吸着さ
れた抗原を用いるものと比較してより高い感度を有する
ことを示している。
中の発煙硝酸の混合物を用いるニトロ化反応およびアル
カリ性亜ニチオン酸ナトリウムを用いる還元により、ウ
ェル中に形成される。抗原性蛋白質は、単一の蛋白質を
結合させる短鎖のカップリング分子として作用するＮ−
エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−力ル
ポジイミドおよびスペリン酸を用いて、上記アミノポリ
スチレン表面に結合させる。この報告はまた共有結合さ
れた抗原を用いて行なう上記検定法が、物理的に吸着さ
れた抗原を用いるものと比較してより高い感度を有する
ことを示している。
［発明の要旨］
本発明は、抗体あるいは抗原のような分子を共有結合に
より各種ポリマー表面に固定化するための新規方法およ
び手段を提供するものである。また本発明は免疫検定法
への適用において、検出および定量対象物質の広い濃度
範囲において直線的な検出関係が得られる器具を提供す
るものでもある。さらに本発明は測定または生産を目的
として、活性アミノ基を有する全ての分子の固定化に利
用することができる０例えば、酵素の固定化、ＤＮＡの
固定化１、細胞の固定化、ビールスの固定化、バクテリ
アの固定化、あるいはアフィニティークロマトグラフィ
ー等に利用することができる。
より各種ポリマー表面に固定化するための新規方法およ
び手段を提供するものである。また本発明は免疫検定法
への適用において、検出および定量対象物質の広い濃度
範囲において直線的な検出関係が得られる器具を提供す
るものでもある。さらに本発明は測定または生産を目的
として、活性アミノ基を有する全ての分子の固定化に利
用することができる０例えば、酵素の固定化、ＤＮＡの
固定化１、細胞の固定化、ビールスの固定化、バクテリ
アの固定化、あるいはアフィニティークロマトグラフィ
ー等に利用することができる。
本発明の器具は、プラスチック製構造体（例。
小びん、キュベツト、ビーズ、９６（ＩＩのウェルが設
けられているマイクロ滴定器）の形態をとるものである
。免疫検定法への適用において抗体は、新規方法を用い
て共有結合によって上記構造体に固定化することができ
、そしてヘテロジニアス・エンザイムイムノアッセイま
たは蛍光イムノアッセイにおいて使用することができる
。上記の方法は、単に粘着性の蛋白質の結合を利用した
先行技術よりも簡便であり、かつ現状の共有結合系を利
用する技術よりも精度が高い。
けられているマイクロ滴定器）の形態をとるものである
。免疫検定法への適用において抗体は、新規方法を用い
て共有結合によって上記構造体に固定化することができ
、そしてヘテロジニアス・エンザイムイムノアッセイま
たは蛍光イムノアッセイにおいて使用することができる
。上記の方法は、単に粘着性の蛋白質の結合を利用した
先行技術よりも簡便であり、かつ現状の共有結合系を利
用する技術よりも精度が高い。
本発明においては例えば、サンドイッチ型のエンザイム
イムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイにおいて非標
識抗体として使用する抗体（蛋白質）は、長いスペーサ
ー分子（スペーサー自身も共有結合によりポリマー表面
に゛付着している）に共有結合させることにより、重合
体表面に共有結合で固定化することができる。上記スペ
ーサー分子は合成ポリで−である。スペーサー分子は、
二またはそれ以上の適当なモノマーおよびフリー・ラジ
カル発生系を用いて、化学的または光化学的にグラフト
重合を開始させることで上記ポリマー表面に共有結合で
付着させる。モノマーの−っは、ＣＨ２＝ＣＲＷＺ （
Ｚ基は、蛋白質の反応性アミノ酸基と化学的に反応する
ことができる）の構造を有している。よって蛋白質は、
スペーサー分子に共有結合で付着する。第二のモノマー
は、スペーサー分子にそって活性基Ｚを間隔を空けて配
置する。また上記モノマーは、ＣＨ２＝ＣＲＹ（Ｙ基は
、長いスペーサー分子に必要なだけの親水性を与えるこ
とが〒きる基である）の構造を有している。上記モノマ
ーのグラフト重合は、様々な溶媒またはそれらの混合物
中で、光化学的にグラフト重合を開始させる方法におい
ては０℃から、化学的にグラフト重合を開始させる方法
においては４０℃から、これらの溶媒の沸点温度までの
温度範囲で、そして不活性な気体中において実施するこ
とができる。グラフト化が終了したのち、グラフト化し
たプラスチック性構造体を洗浄して、未反応のモノマー
、グラフト化していないポリマー、有機溶媒および開始
剤の残液を除去する。そして水性緩衝溶液中で抗体を、
活性化されたスペーサー分子に共有結合で固定化する。
イムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイにおいて非標
識抗体として使用する抗体（蛋白質）は、長いスペーサ
ー分子（スペーサー自身も共有結合によりポリマー表面
に゛付着している）に共有結合させることにより、重合
体表面に共有結合で固定化することができる。上記スペ
ーサー分子は合成ポリで−である。スペーサー分子は、
二またはそれ以上の適当なモノマーおよびフリー・ラジ
カル発生系を用いて、化学的または光化学的にグラフト
重合を開始させることで上記ポリマー表面に共有結合で
付着させる。モノマーの−っは、ＣＨ２＝ＣＲＷＺ （
Ｚ基は、蛋白質の反応性アミノ酸基と化学的に反応する
ことができる）の構造を有している。よって蛋白質は、
スペーサー分子に共有結合で付着する。第二のモノマー
は、スペーサー分子にそって活性基Ｚを間隔を空けて配
置する。また上記モノマーは、ＣＨ２＝ＣＲＹ（Ｙ基は
、長いスペーサー分子に必要なだけの親水性を与えるこ
とが〒きる基である）の構造を有している。上記モノマ
ーのグラフト重合は、様々な溶媒またはそれらの混合物
中で、光化学的にグラフト重合を開始させる方法におい
ては０℃から、化学的にグラフト重合を開始させる方法
においては４０℃から、これらの溶媒の沸点温度までの
温度範囲で、そして不活性な気体中において実施するこ
とができる。グラフト化が終了したのち、グラフト化し
たプラスチック性構造体を洗浄して、未反応のモノマー
、グラフト化していないポリマー、有機溶媒および開始
剤の残液を除去する。そして水性緩衝溶液中で抗体を、
活性化されたスペーサー分子に共有結合で固定化する。
固定化された抗体を含むプラスチック性構造体は、（ス
ペーサー分子上に残る活性基を中和したのち）乾燥して
、競合的エンザイムイムノアッセイ、サンドイッチ型の
エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイに
おいて使用することができる。
ペーサー分子上に残る活性基を中和したのち）乾燥して
、競合的エンザイムイムノアッセイ、サンドイッチ型の
エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイに
おいて使用することができる。
したがって本発明は、有効なアミ７基を含む分子の固定
化において使用する表面処理を施した重合物質を提供す
る。上記物質はこれに結合する複数のポリマーを有し、
上記ポリマーは少なくとも二つのモノマーの混合物より
生成され、上記モノマーのうちの一つは上記固定化され
る分子中のアミ７基に結合するために有効な活性基を含
み、そして多数の上記活性基が上記物質との間に間隔を
置いて上記ポリマー上に分散している０本発明は、上記
物質とポリマーの結合物の製造方法および免疫検定法の
処理方法に特有な使用方法をも提供する。
化において使用する表面処理を施した重合物質を提供す
る。上記物質はこれに結合する複数のポリマーを有し、
上記ポリマーは少なくとも二つのモノマーの混合物より
生成され、上記モノマーのうちの一つは上記固定化され
る分子中のアミ７基に結合するために有効な活性基を含
み、そして多数の上記活性基が上記物質との間に間隔を
置いて上記ポリマー上に分散している０本発明は、上記
物質とポリマーの結合物の製造方法および免疫検定法の
処理方法に特有な使用方法をも提供する。
それゆえ免疫検定法に本発明を適用することにより、現
在抗原性物質としてヘテロジニアス・エンザイムイムノ
アッセイまたは蛍光イムノアッセイにおいて使用されて
いる、粘着により固定化された多クローン性の抗体に代
えて、長いスペーサー分子（スペーサー自身も共有結合
で重合物質である支持体に付着している）を介して共有
結合で固定化された抗体を用いることができる。よって
本発明は、体液中に存在する様々な種類の抗原性物質や
その他の生物学的物質の濃度または存在を検出するため
に有益である０本明細書では本発明を、免疫検定法の処
理方法等における抗原および抗体の固定化を参照しなが
ら記述する。それゆえ、本明細書で使用される抗原また
は抗原性物質という一言葉は一般に、これに対する多ク
ローン性または単クローン性抗体が生産され得る物質を
言う０本発明の方法で検定することができる特定の抗原
としては、ヒトのＩ ｇＧ、 ヒトのＩｇＭ、ヒトの
Ｉ ｇＡ、マウスのＩｇＧおよびヒトのフィブリノーゲ
ン等を挙げることができる。
在抗原性物質としてヘテロジニアス・エンザイムイムノ
アッセイまたは蛍光イムノアッセイにおいて使用されて
いる、粘着により固定化された多クローン性の抗体に代
えて、長いスペーサー分子（スペーサー自身も共有結合
で重合物質である支持体に付着している）を介して共有
結合で固定化された抗体を用いることができる。よって
本発明は、体液中に存在する様々な種類の抗原性物質や
その他の生物学的物質の濃度または存在を検出するため
に有益である０本明細書では本発明を、免疫検定法の処
理方法等における抗原および抗体の固定化を参照しなが
ら記述する。それゆえ、本明細書で使用される抗原また
は抗原性物質という一言葉は一般に、これに対する多ク
ローン性または単クローン性抗体が生産され得る物質を
言う０本発明の方法で検定することができる特定の抗原
としては、ヒトのＩ ｇＧ、 ヒトのＩｇＭ、ヒトの
Ｉ ｇＡ、マウスのＩｇＧおよびヒトのフィブリノーゲ
ン等を挙げることができる。
本発明はまた、各種ホモジニアスな競合的ラジオイムノ
アッセイ、エンザイムイムノアッセイ及び蛍光イムノア
ッセイに使用できる共有結合による抗原の固定化にも有
益である０本発明により共有結合で固定化される特定の
抗原の例としては、プロティンＡが挙げられる。
アッセイ、エンザイムイムノアッセイ及び蛍光イムノア
ッセイに使用できる共有結合による抗原の固定化にも有
益である０本発明により共有結合で固定化される特定の
抗原の例としては、プロティンＡが挙げられる。
しかしながら本発明は、有効なアミノ結合基を有する分
子をプラスチック性物質に結合させることで、分析や生
産等を目的として上記分子を固定化するためにも利用す
ることができる。たとえば本発明は、ポリペプチド、多
糖類、あるいは酵素のような蛋白質、ＤＮＡ、ビールス
、バクテリアまたは細胞等を共有結合で固定化するため
に利用することができる。
子をプラスチック性物質に結合させることで、分析や生
産等を目的として上記分子を固定化するためにも利用す
ることができる。たとえば本発明は、ポリペプチド、多
糖類、あるいは酵素のような蛋白質、ＤＮＡ、ビールス
、バクテリアまたは細胞等を共有結合で固定化するため
に利用することができる。
［発明の詳細な記述］
本発明の上記およびその他の特徴については、添付した
図面を参照しながら以下において詳細に記述する。
図面を参照しながら以下において詳細に記述する。
第１図は、ポリマー表面に共有結合で付着した長いスペ
ーサー分子の形成におけるグラフト化処理方法および活
性化されたスペーサー分子による抗体の共有結合による
固定化を説明する構成図である。
ーサー分子の形成におけるグラフト化処理方法および活
性化されたスペーサー分子による抗体の共有結合による
固定化を説明する構成図である。
第２図は、マウスのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭ
についての三種類のエンザイムイムノアッセイにおいて
、従来の粘着により結合した多クローン性抗体を用いて
得られた結果を示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に
対する吸光度のプロットを標準誤差線（３σ）と共に示
す。
についての三種類のエンザイムイムノアッセイにおいて
、従来の粘着により結合した多クローン性抗体を用いて
得られた結果を示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に
対する吸光度のプロットを標準誤差線（３σ）と共に示
す。
第３図は、マウスのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭ
についての三種類のエンザイムイムノアッセイにおいて
、長いスペーサー上に共有結合で固定化された多クロー
ン性抗体を用いて得られた結果を示す、抗原濃度の自然
対数（ｌｏｇ）に対する吸光度のプロットを標準誤差線
（３σ）と共に示す。
についての三種類のエンザイムイムノアッセイにおいて
、長いスペーサー上に共有結合で固定化された多クロー
ン性抗体を用いて得られた結果を示す、抗原濃度の自然
対数（ｌｏｇ）に対する吸光度のプロットを標準誤差線
（３σ）と共に示す。
前述したように本発明は特に、抗体または抗原の固定化
を参照しながら記述する。
を参照しながら記述する。
本発明に従う、スペーサー分子を介して抗体または抗原
を重合体表面に共有結合で付着させる代表的な方法は１
本発明の第１図に示されている。
を重合体表面に共有結合で付着させる代表的な方法は１
本発明の第１図に示されている。
この方法の主な特徴は、共有結合の使用（結果として、
ポリマー表面と抗体を不可逆的な固定化となるように結
合させる）だけでなく、抗体分子とポリマー表面との間
に合成鎖状分子（本明細書ではスペーサー分子として記
述する）を介して間隔を置くことでもある。
ポリマー表面と抗体を不可逆的な固定化となるように結
合させる）だけでなく、抗体分子とポリマー表面との間
に合成鎖状分子（本明細書ではスペーサー分子として記
述する）を介して間隔を置くことでもある。
以下において詳細に説明するが、スペーサー分子は、数
種類のモノマーをグラフト化することにより形成され、
プラスチック性物質のポリマー表面に共有結合で付着す
る鎖状ポリマーを生じる。
種類のモノマーをグラフト化することにより形成され、
プラスチック性物質のポリマー表面に共有結合で付着す
る鎖状ポリマーを生じる。
モノマーの一つは、スペーサー分子にそって分ｌｔ＆し
抗体に共有結合する活性部位ｒＺＪを供給する。ゆえに
測定対象となる抗原は、抗体および分析を目的として抗
原を追跡するトレーサーあるいは標識化された抗体に結
合させることができる。
抗体に共有結合する活性部位ｒＺＪを供給する。ゆえに
測定対象となる抗原は、抗体および分析を目的として抗
原を追跡するトレーサーあるいは標識化された抗体に結
合させることができる。
長い（上限は、数百オングストロームまでの長さ）スペ
ーサー分子によりポリマー表面に結合された抗体分子は
、吸着した抗体分子（実質的にポリマー表面上で固定化
されている）と比較して、並行運動および回転運動の自
由が増大り、溶解した分子に非常に類似した動きを示す
、ｆａれているが、固定化されている抗体分子の並行運
動および回転運動に関する高い自由度は、代表的な競合
的イムノアッセイにおいて抗原結合の反応速度を向上さ
せる。この効果は、酵素と結合した第二抗体の存在がさ
らにサンドイッチ複合体周囲の立体的凝集を促進するサ
ンドイッチ型のエンザイムイムノアッセイにおいて、な
おいっそう顕著である。
ーサー分子によりポリマー表面に結合された抗体分子は
、吸着した抗体分子（実質的にポリマー表面上で固定化
されている）と比較して、並行運動および回転運動の自
由が増大り、溶解した分子に非常に類似した動きを示す
、ｆａれているが、固定化されている抗体分子の並行運
動および回転運動に関する高い自由度は、代表的な競合
的イムノアッセイにおいて抗原結合の反応速度を向上さ
せる。この効果は、酵素と結合した第二抗体の存在がさ
らにサンドイッチ複合体周囲の立体的凝集を促進するサ
ンドイッチ型のエンザイムイムノアッセイにおいて、な
おいっそう顕著である。
この処理方法では、抗原の結合および第二抗体・酵素間
の結合に要するインキュベーション時間は、測定結果の
明らかな劣化を生じることなく大幅に減少させることが
できる。
の結合に要するインキュベーション時間は、測定結果の
明らかな劣化を生じることなく大幅に減少させることが
できる。
加えて本発明には、ポリマー表面上に共有結合で固定化
された抗体または抗原の密度の制御において優れている
ことが認められる点も重要である。粘着性結合により得
られた抗体および抗原のタンパク表面密度は非常にバラ
ツキがあり、蛋白質の構造、塗布液中に使用された蛋白
質濃度、温度およびｐＨ等の吸着処理が行なわれた時の
条件、これらの抗体または抗原が吸着されるプラスチッ
クの表面構造等に従って変化する。先行技術において実
施された種類の粘着結合は、一般に利用可能な収量が低
いという欠点があるが、プラスチック表面における抗体
の密度は許容し得るものである。抗原、特に低分子量の
抗原の粘着結合はさらに不安定であり、抗原の低表面密
度はこれらの分析の感度および分析量の範囲（Ｄｙｎａ
ｍｉｃＲａｎｇｅ ）に重大な影響を及ぼすことがある
。第１図に示すように、リシン残基よりの自由アミノ基
を有する抗体または抗原は、スペーサー分子上の活性基
Ｚと反応して、蛋白質分子を永続的に固定する共有結合
を形成する。それゆえ上記処理操作において、結合した
抗体または抗原の収量は、先行技術である粘着結合と比
較して大幅に増大する。さらにと記載量は、スペーサー
分子上の反応性Ｚ基のクエンチング反応によって容易に
制御することもできる。
された抗体または抗原の密度の制御において優れている
ことが認められる点も重要である。粘着性結合により得
られた抗体および抗原のタンパク表面密度は非常にバラ
ツキがあり、蛋白質の構造、塗布液中に使用された蛋白
質濃度、温度およびｐＨ等の吸着処理が行なわれた時の
条件、これらの抗体または抗原が吸着されるプラスチッ
クの表面構造等に従って変化する。先行技術において実
施された種類の粘着結合は、一般に利用可能な収量が低
いという欠点があるが、プラスチック表面における抗体
の密度は許容し得るものである。抗原、特に低分子量の
抗原の粘着結合はさらに不安定であり、抗原の低表面密
度はこれらの分析の感度および分析量の範囲（Ｄｙｎａ
ｍｉｃＲａｎｇｅ ）に重大な影響を及ぼすことがある
。第１図に示すように、リシン残基よりの自由アミノ基
を有する抗体または抗原は、スペーサー分子上の活性基
Ｚと反応して、蛋白質分子を永続的に固定する共有結合
を形成する。それゆえ上記処理操作において、結合した
抗体または抗原の収量は、先行技術である粘着結合と比
較して大幅に増大する。さらにと記載量は、スペーサー
分子上の反応性Ｚ基のクエンチング反応によって容易に
制御することもできる。
さらに本発明は先行技術と比較して、非特異的タンパク
結合の制御により優れていることが認められる。蛋白質
の非特異的結合（例、抗体・酵素結合体）は、確実に実
証されている現象であり、おそらくヘテロジニアス参イ
ムノアッセイにおける誤差の主要な原因の一つである。
結合の制御により優れていることが認められる。蛋白質
の非特異的結合（例、抗体・酵素結合体）は、確実に実
証されている現象であり、おそらくヘテロジニアス参イ
ムノアッセイにおける誤差の主要な原因の一つである。
標準的な粘着によるエンザイムイムノアツセイおよび蛍
光イムノアッセイにおける非特異的タンパク結合は、全
ての分析溶液中に適当な蛋白質（例、ウシ血清アルブミ
ン［Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ ＡＩｂｕ＋ｓｉｎ；
Ｂ Ｓ Ａ］ 、ブタのゼラチン）を高濃度で使用する
ことにより、プラスチック表面を飽和させ、抗体・酵素
結合体または抗体・蛍光体結合体の非特異的結合を減少
させて防止する。ＢＳＡ分子を用いる上記表面の飽和は
、抗体・抗原複合体の周囲の立体的凝集を増加させるこ
とで抗体舎酵素結合体の結合を減少させるものであるが
、一方では免疫検定法の感度を減少させてしまう、しか
し本発明においては。
光イムノアッセイにおける非特異的タンパク結合は、全
ての分析溶液中に適当な蛋白質（例、ウシ血清アルブミ
ン［Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ ＡＩｂｕ＋ｓｉｎ；
Ｂ Ｓ Ａ］ 、ブタのゼラチン）を高濃度で使用する
ことにより、プラスチック表面を飽和させ、抗体・酵素
結合体または抗体・蛍光体結合体の非特異的結合を減少
させて防止する。ＢＳＡ分子を用いる上記表面の飽和は
、抗体・抗原複合体の周囲の立体的凝集を増加させるこ
とで抗体舎酵素結合体の結合を減少させるものであるが
、一方では免疫検定法の感度を減少させてしまう、しか
し本発明においては。
抗体または抗原分子は長いスペーサー分子を介してポリ
マーに共有結合しているため、上記スペーサーが効果的
に上記分子をＢＳＡやゼラチンにより飽和されている表
面から隔離し、よって立体的凝集は無視できる程度とな
る。さらにスペーサー分子の形成において適当なモノマ
ーを用いることで上記スペーサー分子に、スペーサー自
体が非特異的結合を妨害する親水性の性質をもたせるこ
ともできる。
マーに共有結合しているため、上記スペーサーが効果的
に上記分子をＢＳＡやゼラチンにより飽和されている表
面から隔離し、よって立体的凝集は無視できる程度とな
る。さらにスペーサー分子の形成において適当なモノマ
ーを用いることで上記スペーサー分子に、スペーサー自
体が非特異的結合を妨害する親水性の性質をもたせるこ
ともできる。
本発明において、抗体または抗原を重合体（プラスチッ
ク製）の構造体に共有結合させる方法は、二段階の工程
からなる。第１図に示すように、まずスペーサー分子を
プラスチック構造体の表面上に、二またはそれ以上のモ
ノマーのグラフト化を化学的または光化学的に開始する
処理方法を用いて形成する。ついで上記スペーサー分子
に抗体または抗原を共有結合させる。上記モノマー（グ
ラフト重合させて、よってポリマー表面上でスペーサー
分子を形成する）のうちの一つは５下記−殻構造式を有
するビニル・モノマーであることが好ましい。
ク製）の構造体に共有結合させる方法は、二段階の工程
からなる。第１図に示すように、まずスペーサー分子を
プラスチック構造体の表面上に、二またはそれ以上のモ
ノマーのグラフト化を化学的または光化学的に開始する
処理方法を用いて形成する。ついで上記スペーサー分子
に抗体または抗原を共有結合させる。上記モノマー（グ
ラフト重合させて、よってポリマー表面上でスペーサー
分子を形成する）のうちの一つは５下記−殻構造式を有
するビニル・モノマーであることが好ましい。
ＣＨ２＝ＣＲ＋ −Ｗ−Ｚ
Ｒ１基は、水素原子、メチル基、または炭素原子数１６
以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である脂肪族ある
いは芳香族よりなる基である。Ｘ基は活性エステル基で
あり、下記−膜構造式よりなることが必要である。
以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である脂肪族ある
いは芳香族よりなる基である。Ｘ基は活性エステル基で
あり、下記−膜構造式よりなることが必要である。
Ｒ３基およびＲ４基は、水素原子であるか、または炭素
原子数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である
炭化水素基であって、炭化水素基の構造は脂肪族、芳香
族あるいは脂肪族と芳香族の両方よりなり、複素原子と
して酸素原子、窒素原子、硫黄原子、フッ素原子、臭素
原子および塩素原子を有することができる。Ｒ３基およ
びＲ４基は互いに結合していても互いに結合していなく
てもよく、Ｒ３とＲ４が結合している場合には、両者が
芳香族よりなる基を形成してもよい、Ｘ基の好ましい構
造の一つは、下記−膜構造式の活性エステル基を含む。
原子数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である
炭化水素基であって、炭化水素基の構造は脂肪族、芳香
族あるいは脂肪族と芳香族の両方よりなり、複素原子と
して酸素原子、窒素原子、硫黄原子、フッ素原子、臭素
原子および塩素原子を有することができる。Ｒ３基およ
びＲ４基は互いに結合していても互いに結合していなく
てもよく、Ｒ３とＲ４が結合している場合には、両者が
芳香族よりなる基を形成してもよい、Ｘ基の好ましい構
造の一つは、下記−膜構造式の活性エステル基を含む。
上記−膜構造式において、ｎはｌ、２または３である。
Ｘ基をビニル基に結合させるＷ基は、炭素原子を１６個
以下、好ましくは１乃至６個有し、その構造は脂肪族、
芳香族あるいは脂肪族と芳香族の組合せよりなる。また
Ｗ基は、複素原子として酸素原子、窒素原子および硫黄
原子を含むことができる。上記活性エステルはＮ−ジア
シルヒドロキシルアミノの誘導体であって、蛋白質中の
りシン残基上のアミノ基と容易に反応してアミド誘導体
を形成することが知られている。上記アミド誘導体を介
して蛋白質分子は、活性エステルを有する基に共有結合
する。上記アミド形成反応は、ｐＨ７，５から８．５の
範囲の至適ＰＨを有している。また上記アミド形成反応
は、約１０６ という非常に高いアミノ分解／加水分解
比を有することが知られており、そのため非常に低く蛋
白質濃度においてもアミド形成反応の高い収量を保証す
る。上記活性エステル基の他の好ましい特徴としては、
上記エステル基をアンモニウム・イオンあるいは化合物
を含む第一級アミノ基によって容易に抑制できるため、
蛋白質結合を適切かつ好ましく制御することが可能であ
る点を挙げることができる。
以下、好ましくは１乃至６個有し、その構造は脂肪族、
芳香族あるいは脂肪族と芳香族の組合せよりなる。また
Ｗ基は、複素原子として酸素原子、窒素原子および硫黄
原子を含むことができる。上記活性エステルはＮ−ジア
シルヒドロキシルアミノの誘導体であって、蛋白質中の
りシン残基上のアミノ基と容易に反応してアミド誘導体
を形成することが知られている。上記アミド誘導体を介
して蛋白質分子は、活性エステルを有する基に共有結合
する。上記アミド形成反応は、ｐＨ７，５から８．５の
範囲の至適ＰＨを有している。また上記アミド形成反応
は、約１０６ という非常に高いアミノ分解／加水分解
比を有することが知られており、そのため非常に低く蛋
白質濃度においてもアミド形成反応の高い収量を保証す
る。上記活性エステル基の他の好ましい特徴としては、
上記エステル基をアンモニウム・イオンあるいは化合物
を含む第一級アミノ基によって容易に抑制できるため、
蛋白質結合を適切かつ好ましく制御することが可能であ
る点を挙げることができる。
グラフト重合させてスペーサー分子を形成する第二のモ
ノマーは、下記一般式を有している。
ノマーは、下記一般式を有している。
ＣＨ２＝ＣＲ２−Ｙ
上記一般式において、Ｒ】は水素原子、メチル基、また
は炭素原子数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６
である脂肪族あるいは芳香族よりなる基である。Ｙ基は
炭素原子数１６以下の脂肪族および／または芳香族より
なる基であり、複素原子として酸素原子、窒素原子およ
び硫黄原子を含むことができる。上記基は、スペーサー
分子上の活性Ｘ基と重合物質との間に間隔を与え、また
スペーサー分子に好ましい親水性を与える。上記Ｙ基は
炭素原子数１乃至６である脂肪族よりなる基であること
が好ましい、特に比較的親水性であるスペーサーが必要
とされる場合には、Ｙ基は水酸基、アミドおよびカルボ
キシル基あるいはこれらに類似した親木性基を含有する
ことが好ましい。
は炭素原子数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６
である脂肪族あるいは芳香族よりなる基である。Ｙ基は
炭素原子数１６以下の脂肪族および／または芳香族より
なる基であり、複素原子として酸素原子、窒素原子およ
び硫黄原子を含むことができる。上記基は、スペーサー
分子上の活性Ｘ基と重合物質との間に間隔を与え、また
スペーサー分子に好ましい親水性を与える。上記Ｙ基は
炭素原子数１乃至６である脂肪族よりなる基であること
が好ましい、特に比較的親水性であるスペーサーが必要
とされる場合には、Ｙ基は水酸基、アミドおよびカルボ
キシル基あるいはこれらに類似した親木性基を含有する
ことが好ましい。
またさらに、第三のモノマーもグラフト重合させてスペ
ーサー分子を形成することができる。第三のモノマーは
下記−膜構造式を有している。
ーサー分子を形成することができる。第三のモノマーは
下記−膜構造式を有している。
ＣＨ２＝ＣＲ５−Ｘ−Ｒｓ Ｃ＝ＣＨ２上記−膜構造式
において、Ｒ５は水素原子、メチル基、または炭素原子
数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である脂肪
族あるいは芳香族よりなる基である。Ｘ基は、炭素原子
を１６個以下有し、その構造は脂肪族、芳香族あるいは
脂肪族と芳香族の組合せよりなる。またＸ基は、複素原
子として酸素原子、窒素原子および硫黄原子を含むこと
ができる。またＸ基は、炭素原子を１乃至６個有するこ
とが好ましい、上記ジビニル化合物は、架橋剤または分
岐剤として加え、スペーサー分子の構造に作用させる。
において、Ｒ５は水素原子、メチル基、または炭素原子
数１６以下、好ましくは炭素原子数１乃至６である脂肪
族あるいは芳香族よりなる基である。Ｘ基は、炭素原子
を１６個以下有し、その構造は脂肪族、芳香族あるいは
脂肪族と芳香族の組合せよりなる。またＸ基は、複素原
子として酸素原子、窒素原子および硫黄原子を含むこと
ができる。またＸ基は、炭素原子を１乃至６個有するこ
とが好ましい、上記ジビニル化合物は、架橋剤または分
岐剤として加え、スペーサー分子の構造に作用させる。
グラフト化処理操作において使用する上記モノマー
ＣＨ２＝ ＣＲ＋ −Ｗ −Ｚ、
ＣＨ２＝ＣＲ２−Ｙおよび
ＣＨ２＝ ＣＲｓ −Ｘ −Ｒｓ Ｃ＝ ＣＨ２の
モル比が、スペーサー分子上の活性基（結合部位）の数
と間隔、スペーサー分子の親水性およびスペーサー分子
の架橋構造を決定する。上記方法が、高濃度物質の正確
な測定を可能にするために必要である、より広い間隔を
もって配置された結合部位を作り出すことは明らかであ
ろう。
モル比が、スペーサー分子上の活性基（結合部位）の数
と間隔、スペーサー分子の親水性およびスペーサー分子
の架橋構造を決定する。上記方法が、高濃度物質の正確
な測定を可能にするために必要である、より広い間隔を
もって配置された結合部位を作り出すことは明らかであ
ろう。
化学的に開始するグラフト化処理は、アゾ化合物、有機
過酸化物および過酸エステルのようなフリー・ラジカル
を生じる化合物によって開始する。上記化合物は全て一
定の温度で分解し、重合およびグラフト化反応を開始す
るフリー・ラジカル種を生成する。上記化学的に開始す
るグラフト化処理は、４０℃から上記処理に使用する溶
媒の沸点の範囲内の温度で実施する。最も適している溶
媒は、良好な溶解度を有し、モノマーに対して不活性で
あり、グラフト化したプラスチック製構造体を溶かした
り膨張させたりすることがなく、そして５０℃以上の沸
点を有するものである。使用できる溶媒の種類の例とし
ては、アルコール、ニーチル、エステルおよびケトン等
を挙げることができる。グラフト化処理操作は全て不活
性な気体中で行なわれねばならない、たとえば、大気圧
あるいはそれ以上の圧力下において、窒素またはアルゴ
ン中で行なう０反応時間は様々であるが、通常は２時間
から１０時間の範囲内である。
過酸化物および過酸エステルのようなフリー・ラジカル
を生じる化合物によって開始する。上記化合物は全て一
定の温度で分解し、重合およびグラフト化反応を開始す
るフリー・ラジカル種を生成する。上記化学的に開始す
るグラフト化処理は、４０℃から上記処理に使用する溶
媒の沸点の範囲内の温度で実施する。最も適している溶
媒は、良好な溶解度を有し、モノマーに対して不活性で
あり、グラフト化したプラスチック製構造体を溶かした
り膨張させたりすることがなく、そして５０℃以上の沸
点を有するものである。使用できる溶媒の種類の例とし
ては、アルコール、ニーチル、エステルおよびケトン等
を挙げることができる。グラフト化処理操作は全て不活
性な気体中で行なわれねばならない、たとえば、大気圧
あるいはそれ以上の圧力下において、窒素またはアルゴ
ン中で行なう０反応時間は様々であるが、通常は２時間
から１０時間の範囲内である。
光化学的に開始するグラフト化処理は、ＵＶ照射および
芳香族ケトンのようなフリー・ラジカルを生じる光活性
化合物を用いる。上記化合物は、高量子収量を有する特
定波長の紫外線を吸収し、グラフト化および重合反応を
開始するフリー・ラジカル種を生成する本発明に使用す
る好ましい紫外線としては、３２０から４００ｎｍ、好
ましくは３６０ｎｍ＃後の近紫外線を挙げることができ
る。上記領域のＵＶスペクトルは、黒色光蛍光放電灯、
高圧水銀放電灯あるいはキセノン放電灯を用いることで
容易に発生する０通常の場合、本発明に使用するＵＶ照
射のエネルギー密度は、２５Ｗｈ／ｒｎ’から１ｏＯＷ
ｈ／ｒｎ’の範囲内である。上記光グラフト化処理操作
は、０℃から上記処理に使用する溶媒の沸点までの温度
で実施する。
芳香族ケトンのようなフリー・ラジカルを生じる光活性
化合物を用いる。上記化合物は、高量子収量を有する特
定波長の紫外線を吸収し、グラフト化および重合反応を
開始するフリー・ラジカル種を生成する本発明に使用す
る好ましい紫外線としては、３２０から４００ｎｍ、好
ましくは３６０ｎｍ＃後の近紫外線を挙げることができ
る。上記領域のＵＶスペクトルは、黒色光蛍光放電灯、
高圧水銀放電灯あるいはキセノン放電灯を用いることで
容易に発生する０通常の場合、本発明に使用するＵＶ照
射のエネルギー密度は、２５Ｗｈ／ｒｎ’から１ｏＯＷ
ｈ／ｒｎ’の範囲内である。上記光グラフト化処理操作
は、０℃から上記処理に使用する溶媒の沸点までの温度
で実施する。
化学的に開始するグラフト化に使用するものと同じ種類
の溶媒を、光グラフト化処理操作にも使用することがで
きる。上記溶媒のうち最も代表的であるものは、アルコ
ール、エーテル、エステルおよびケトンである。好まし
い光開始化合物は、三重項エネルギー（Ｔｒｉｐｌｅｔ
Ｅｎｅｒｇ７ ； Ｅ Ｔ）が６７キロΦ力ロリー１
モルのベンゾフェノンであることが知られている。また
不活性な気体は一般に、大気圧下の窒素またはアルゴン
により得られる０反応時間は様々であるが１通常は１０
分から２時間までである。
の溶媒を、光グラフト化処理操作にも使用することがで
きる。上記溶媒のうち最も代表的であるものは、アルコ
ール、エーテル、エステルおよびケトンである。好まし
い光開始化合物は、三重項エネルギー（Ｔｒｉｐｌｅｔ
Ｅｎｅｒｇ７ ； Ｅ Ｔ）が６７キロΦ力ロリー１
モルのベンゾフェノンであることが知られている。また
不活性な気体は一般に、大気圧下の窒素またはアルゴン
により得られる０反応時間は様々であるが１通常は１０
分から２時間までである。
グラフト化したプラスチック製構造体は、有機溶媒およ
び脱イオン水を用いて洗浄し、沈殿したコポリマー、有
機溶媒、未反応のモノマーおよび開始化合物の分解産物
を除去する。グラフト化したプラスチック製構造体は、
一般に直ちに抗体または抗原の結合に使用するが、ある
いは単に真空乾燥してポリエチレンの袋に密閉し冷蔵す
ることもできる。無水条件下で保存した場合には、グラ
フト化したプラスチックは少なくとも六カ月間、抗体ま
たは抗原を共有結合で固定化する活性が残存することが
解っている。
び脱イオン水を用いて洗浄し、沈殿したコポリマー、有
機溶媒、未反応のモノマーおよび開始化合物の分解産物
を除去する。グラフト化したプラスチック製構造体は、
一般に直ちに抗体または抗原の結合に使用するが、ある
いは単に真空乾燥してポリエチレンの袋に密閉し冷蔵す
ることもできる。無水条件下で保存した場合には、グラ
フト化したプラスチックは少なくとも六カ月間、抗体ま
たは抗原を共有結合で固定化する活性が残存することが
解っている。
使用され得る代表的なプラスチック物質としては、ポリ
スチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネートおよびポリアクリレートを挙げ
ることができる。
スチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネートおよびポリアクリレートを挙げ
ることができる。
抗体または抗原をスペーサー分子に共有結合させる処理
は、水性かつ非求核性の緩衝溶液中、ｐＨ７，５から８
．５の範囲内および０℃から３７℃の範囲内の温度で実
施する０反応時間は。
は、水性かつ非求核性の緩衝溶液中、ｐＨ７，５から８
．５の範囲内および０℃から３７℃の範囲内の温度で実
施する０反応時間は。
１時間から１８時間までの短時間である。結合溶液中の
蛋白質濃度は、１１００ｎ／ｍＪＬ程度の低濃度とする
ことができるが、抗体を用いる場合には約ｓｇｇ／ｍｉ
程度とするのが一般的である。
蛋白質濃度は、１１００ｎ／ｍＪＬ程度の低濃度とする
ことができるが、抗体を用いる場合には約ｓｇｇ／ｍｉ
程度とするのが一般的である。
抗体または抗原で被覆されたプラスチック表面の表面安
定化処理を、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、ツイ
ン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０；登録商標）のような非イ
オン性界面活性剤あるいはこれらの混合物を含む溶液を
用いて行なう、場合によっては、スペーサー分子上に残
存する活性エステル基を抑制するために、安定化溶液中
に一定量のアンモニウム・イオンを含有させる方が有利
である。
定化処理を、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、ツイ
ン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０；登録商標）のような非イ
オン性界面活性剤あるいはこれらの混合物を含む溶液を
用いて行なう、場合によっては、スペーサー分子上に残
存する活性エステル基を抑制するために、安定化溶液中
に一定量のアンモニウム・イオンを含有させる方が有利
である。
抗体または抗原で被覆されたプラスチック表面は凍結乾
燥して無水条件下、氷点下の温度で少なくとも１２力月
間保存できる。
燥して無水条件下、氷点下の温度で少なくとも１２力月
間保存できる。
本発明の結合した構造体を用いることで、より高濃度の
物質を測定対象として把握できるばかりでなく、物質の
光学透明度が高濃度における適用でも保たれ、よって分
析対象である結合物質の正確な測定が可能となる。
物質を測定対象として把握できるばかりでなく、物質の
光学透明度が高濃度における適用でも保たれ、よって分
析対象である結合物質の正確な測定が可能となる。
以下に例示するマウスのＩｇＧ、ヒトのＩｇＡ、ヒトの
ＩｇＧ、ヒトのＩｇＭおよびヒトのフィブリノーゲンの
エンザイムイムノアッセイは、ヤギまたはウサギの多ク
ローン性抗体を用いて実施した。上記の検定法は全て、
酵素触媒により形成された生産物の測光または蛍光測定
に第二抗体−酵素結合体を使用するサンドイッチ型であ
る。抗体・酵素結合体には、基質としてｐ−ニトロフェ
ニル・フォスフェートを用いるアルカリ性フォスファタ
ーゼまたは色原体として２，２°−アゾ−ジー（３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホネート）（ＡＢＴＳ
、登録商標）を用いるワサビダイコンのペルオキシダ
ーゼのうちいずれかを使用した。アルカリ性フォスファ
ターゼ結合体には、蛍光物質４−メチルウンベリフェリ
ル・７、スフ ｚ−） （４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌ
ｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓ−ｐｈａｔｅ ）も使用した
。酵素生成物の測光測定には、９６個のウェルが設けら
れているプレートのリーダー（グイナテック社製ＭＲ６
００）を使用した。蛍光測定法は、９６個のウェルが設
けられているプレートのリーダー（ダイナチック社製マ
イクロフルオロ；登録前Ｉｅ′：りを使用した。
ＩｇＧ、ヒトのＩｇＭおよびヒトのフィブリノーゲンの
エンザイムイムノアッセイは、ヤギまたはウサギの多ク
ローン性抗体を用いて実施した。上記の検定法は全て、
酵素触媒により形成された生産物の測光または蛍光測定
に第二抗体−酵素結合体を使用するサンドイッチ型であ
る。抗体・酵素結合体には、基質としてｐ−ニトロフェ
ニル・フォスフェートを用いるアルカリ性フォスファタ
ーゼまたは色原体として２，２°−アゾ−ジー（３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホネート）（ＡＢＴＳ
、登録商標）を用いるワサビダイコンのペルオキシダ
ーゼのうちいずれかを使用した。アルカリ性フォスファ
ターゼ結合体には、蛍光物質４−メチルウンベリフェリ
ル・７、スフ ｚ−） （４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌ
ｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓ−ｐｈａｔｅ ）も使用した
。酵素生成物の測光測定には、９６個のウェルが設けら
れているプレートのリーダー（グイナテック社製ＭＲ６
００）を使用した。蛍光測定法は、９６個のウェルが設
けられているプレートのリーダー（ダイナチック社製マ
イクロフルオロ；登録前Ｉｅ′：りを使用した。
第２図および第３図に示すように、吸着により抗体を被
覆した９６個のウェルが設けられているプレートおよび
上記本発明の共有結合で固定化したプレートを用いたマ
ウスのＩｇＧ、ヒトのＩｇＧおよびヒトのＩｇＭのエン
ザイムイムノアッセイを順次比較することにより、抗体
を吸着した検定法は抗原の高濃度領域において低下する
ことが容易に認められる。第２図のプロットにおいて重
複して記載した誤差線によって示される利用可能な検出
範囲は、吸着により被覆し・たプレートに対して抗原が
０．８ｎｇから２０ｎｇまでである。
覆した９６個のウェルが設けられているプレートおよび
上記本発明の共有結合で固定化したプレートを用いたマ
ウスのＩｇＧ、ヒトのＩｇＧおよびヒトのＩｇＭのエン
ザイムイムノアッセイを順次比較することにより、抗体
を吸着した検定法は抗原の高濃度領域において低下する
ことが容易に認められる。第２図のプロットにおいて重
複して記載した誤差線によって示される利用可能な検出
範囲は、吸着により被覆し・たプレートに対して抗原が
０．８ｎｇから２０ｎｇまでである。
第３図に示される共有結合で被覆したプレートでは、利
用可能な検出範囲は０．８ｎｇから２００ｎｇまでの抗
原に拡張される。さらに本発明の共有結合で固定化した
抗体を用いると、誤差線（３σ）は明らかに縮小する。
用可能な検出範囲は０．８ｎｇから２００ｎｇまでの抗
原に拡張される。さらに本発明の共有結合で固定化した
抗体を用いると、誤差線（３σ）は明らかに縮小する。
これは抗体濃度が高いこと、抗体が重合体表面に永続的
に固定化されていること、あるいは抗体を固定化し抗体
の運動に高い自由度を与える長いスペーサー分子によっ
て立体的凝集が低下すること等によるものである。
に固定化されていること、あるいは抗体を固定化し抗体
の運動に高い自由度を与える長いスペーサー分子によっ
て立体的凝集が低下すること等によるものである。
本発明のグラフト化した重合物質は免疫検定法の処理方
法の他にも、スペーサー分子上に設けられる活性基（す
なわち活性エステル基）に結合する活性アミノ基を有す
る全ての物質の同定および測定を行なう、全ての種類の
検出処理方法に使用することができることは明らかであ
ろう、また、用いられる標識の種類およびエンザイムイ
ムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッ
セイあるいは冷光イムノアッセイのうちいずれを使用す
るかについては、特に制限はない、加えて本発明は、そ
の他の上記分子の固定化を必要とする利用方法（例、Ｄ
ＮＡの変性）にも使用することができる。
法の他にも、スペーサー分子上に設けられる活性基（す
なわち活性エステル基）に結合する活性アミノ基を有す
る全ての物質の同定および測定を行なう、全ての種類の
検出処理方法に使用することができることは明らかであ
ろう、また、用いられる標識の種類およびエンザイムイ
ムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッ
セイあるいは冷光イムノアッセイのうちいずれを使用す
るかについては、特に制限はない、加えて本発明は、そ
の他の上記分子の固定化を必要とする利用方法（例、Ｄ
ＮＡの変性）にも使用することができる。
［実施例１］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１．
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド１．Ｏ
Ｏｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．ＯｍｊＬ中に、２５℃にてマグネチックスターラー
を用いて溶解した。
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド１．Ｏ
Ｏｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．ＯｍｊＬ中に、２５℃にてマグネチックスターラー
を用いて溶解した。
２．２″−７ゾビスー（２−メチルプロピオニトリル）
（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア七トン０゜５０ｍ１中に
溶解し、この溶液を上記２−プロパツール溶液に加えて
、さらに２分間マグネチックスターラーを用いて攪拌し
たのち、焼結ガラス製フィルターで濾過した。
（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア七トン０゜５０ｍ１中に
溶解し、この溶液を上記２−プロパツール溶液に加えて
、さらに２分間マグネチックスターラーを用いて攪拌し
たのち、焼結ガラス製フィルターで濾過した。
９６個のウェルが設けられているポリスチレン製のマイ
クロ滴定プレート（リンプロ［ＬｉｍｂｒｏＪ社製）二
枚に、フリーラジカルを生成するＡＺＯＢＩＳおよびモ
ノマーを含む上記濾過した？−プロパツール溶液を、ウ
ェル当り０．２８０ｍ１になるように充填した。プレー
トｔ１５７℃に熟した真空オーブン中に入れた。上記オ
ーブンは圧力が１００ミリバールに低下するまで急速に
吸引し、そして圧力が１０００ミリバールに達するまで
純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さらにオーブ
ン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を二回以上
繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で４．５時
間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が現れた。
クロ滴定プレート（リンプロ［ＬｉｍｂｒｏＪ社製）二
枚に、フリーラジカルを生成するＡＺＯＢＩＳおよびモ
ノマーを含む上記濾過した？−プロパツール溶液を、ウ
ェル当り０．２８０ｍ１になるように充填した。プレー
トｔ１５７℃に熟した真空オーブン中に入れた。上記オ
ーブンは圧力が１００ミリバールに低下するまで急速に
吸引し、そして圧力が１０００ミリバールに達するまで
純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さらにオーブ
ン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を二回以上
繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で４．５時
間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が現れた。
４．５時間後プレートをオーブンより取り出して、３０
分間放置冷却し。
分間放置冷却し。
９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定プレート
の洗浄装置で脱イオン水を用い５回洗浄した。二枚のプ
レートの洗浄操作に要した時間は３分未満であった。
の洗浄装置で脱イオン水を用い５回洗浄した。二枚のプ
レートの洗浄操作に要した時間は３分未満であった。
洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ［Ｔａｇｏ］社製、アフィニティー精製）溶液
（ｐＨ８，５の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗
体５鉢ｇ ／ ｍ ｌ含有）０．１５ｍｕを充填した。
体（タボ［Ｔａｇｏ］社製、アフィニティー精製）溶液
（ｐＨ８，５の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗
体５鉢ｇ ／ ｍ ｌ含有）０．１５ｍｕを充填した。
プレートは２０℃で１時間放置したのち、４℃で１８時
間保存した。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し
、それぞれのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．
０２％のアジ化ナトリウムを含むｐＨ８，５の燐酸ナト
リウム緩衝液Ｏ０３００ｍｆＬを充填した。プレートは
４時間２０℃に、さらに１８時間４℃に保った。
間保存した。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し
、それぞれのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．
０２％のアジ化ナトリウムを含むｐＨ８，５の燐酸ナト
リウム緩衝液Ｏ０３００ｍｆＬを充填した。プレートは
４時間２０℃に、さらに１８時間４℃に保った。
そして再度上記プレートを脱イオン水で３回洗浄した。
抗原または試料の標本を１％のウシ血清アルブミン、０
００２％のアジ化ナトリウム、および塩化カルシウム２
ｍＭを含むｐＨ８、２（７）Ｏ、１Ｍトリス・塩酸緩衝
液中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍ文容量加え
た。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について
分析を行なった。
００２％のアジ化ナトリウム、および塩化カルシウム２
ｍＭを含むｐＨ８、２（７）Ｏ、１Ｍトリス・塩酸緩衝
液中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍ文容量加え
た。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について
分析を行なった。
標準試料はウェル当り０．８ｎｇから２００ｎｇの範囲
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。ヤギの抗マウスＩｇ
Ｇ抗体・アルカリ性フォスファターゼ結合体（タボ社製
、アフィニティー精製）を、１％のウシ血清アルブミン
、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム
２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ）リス中塩酸緩衝液
中に存在比１ ： １０００となるように希釈した。結
合体溶液０．１５０ｍＭをブランクとなるウェルを除く
各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２時間
そして２０℃で１時間インキュベートした。脱イオン水
で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍＭのｐ−ニトロ
フェニルφフォスフェート溶液（塩化マグネシウム２ｍ
Ｍおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含むｐＨ８，２の１．０
Ｍトリス・塩酸緩衝液中）０．１５０ｍ文を充填した。
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。ヤギの抗マウスＩｇ
Ｇ抗体・アルカリ性フォスファターゼ結合体（タボ社製
、アフィニティー精製）を、１％のウシ血清アルブミン
、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム
２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ）リス中塩酸緩衝液
中に存在比１ ： １０００となるように希釈した。結
合体溶液０．１５０ｍＭをブランクとなるウェルを除く
各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２時間
そして２０℃で１時間インキュベートした。脱イオン水
で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍＭのｐ−ニトロ
フェニルφフォスフェート溶液（塩化マグネシウム２ｍ
Ｍおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含むｐＨ８，２の１．０
Ｍトリス・塩酸緩衝液中）０．１５０ｍ文を充填した。
ウェルの４１０ｎｍにおける吸光度の増加率は、デジタ
ル・エクィップメント（Ｉｌｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ ）社のＶＡＮＩＩ／７５０：１ンビユーター
に接続させたグイナテック社製ＭＲ６００の自動プレー
ト・リーダーで読み取った。上記コンピューターは、動
力学的データをそのまま受は取り、抗原濃度の自然対数
（ｌｏｇ）に対する吸光度のプロットおよび抗原濃度の
自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロットを行なう
ように、統計的およびグラフ的に処理する。
ル・エクィップメント（Ｉｌｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐ
ｍｅｎｔ ）社のＶＡＮＩＩ／７５０：１ンビユーター
に接続させたグイナテック社製ＭＲ６００の自動プレー
ト・リーダーで読み取った。上記コンピューターは、動
力学的データをそのまま受は取り、抗原濃度の自然対数
（ｌｏｇ）に対する吸光度のプロットおよび抗原濃度の
自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロットを行なう
ように、統計的およびグラフ的に処理する。
［実施例２］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１．
５０ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．７０ｇ
およびＮ、Ｎ“−メチリン−ビス−アクリルアミド０．
０３０ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下
）７０．ＯｍｆＬ中に、２５℃でマグネチック・スター
ラーを用いて溶解した。２．２°−７ゾビスー（２−メ
チルプロピオニトリル）（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア
セトン０．５０ｍ１中に溶解し、この溶液を上記２−プ
ロパツール溶液に加えて、さらに２分間マグネチック・
スターラーを用いて攪拌したのち、焼結ガラス製フィル
ターで謹過した。
５０ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．７０ｇ
およびＮ、Ｎ“−メチリン−ビス−アクリルアミド０．
０３０ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下
）７０．ＯｍｆＬ中に、２５℃でマグネチック・スター
ラーを用いて溶解した。２．２°−７ゾビスー（２−メ
チルプロピオニトリル）（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア
セトン０．５０ｍ１中に溶解し、この溶液を上記２−プ
ロパツール溶液に加えて、さらに２分間マグネチック・
スターラーを用いて攪拌したのち、焼結ガラス製フィル
ターで謹過した。
９６個のウェルが設けられているポリスチレン製マイク
ロ滴定プレート（リンプロ［Ｌｉｍｂｒｏ］ 社製）二
枚に、フリーラジカルを生成するＡＺＯＢＩＳおよびモ
ノマーを含む上記濾過した２−プロパツール溶液を、ウ
ェル当り０．２８０ｍＡになるように充填した。プレー
トは５７℃に熱した真空オーブン中に入れた。上記オー
ブンは圧力がｌＯＯミリバールに低下するまで急速に吸
引し、そして圧力が１０００ミリバールに達するまで純
粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さらにオーブン
中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を二回以上繰
り返した。プレートはオーブン中に５７℃で４．５時間
置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が現れた。４
゜５時間後にプレートをオーブンより取り出し、３０分
間放置冷却し、９６個のウェルが設けられているマイク
ロ滴定プレートの洗浄装置で脱イオン水を用いて５回洗
浄した。二枚のプレートの洗浄操作に要した時間は、３
分未満であった。
ロ滴定プレート（リンプロ［Ｌｉｍｂｒｏ］ 社製）二
枚に、フリーラジカルを生成するＡＺＯＢＩＳおよびモ
ノマーを含む上記濾過した２−プロパツール溶液を、ウ
ェル当り０．２８０ｍＡになるように充填した。プレー
トは５７℃に熱した真空オーブン中に入れた。上記オー
ブンは圧力がｌＯＯミリバールに低下するまで急速に吸
引し、そして圧力が１０００ミリバールに達するまで純
粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さらにオーブン
中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を二回以上繰
り返した。プレートはオーブン中に５７℃で４．５時間
置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が現れた。４
゜５時間後にプレートをオーブンより取り出し、３０分
間放置冷却し、９６個のウェルが設けられているマイク
ロ滴定プレートの洗浄装置で脱イオン水を用いて５回洗
浄した。二枚のプレートの洗浄操作に要した時間は、３
分未満であった。
洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ Ｐ ｇ
／ｍｆＬを含む）０．１５０ｍｕを充填した。プレート
は２０℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存し
た。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞ
れのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％の
アジ化ナトリウムを含むＰＨ８，５の燐酸ナトリウム緩
衝液０．３００ｍＪ１を充填した。プレートは４時間２
０℃に、次に１８時間４℃に保った。そして再度上記プ
レートを脱イオン水で３回洗浄した。
体（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ Ｐ ｇ
／ｍｆＬを含む）０．１５０ｍｕを充填した。プレート
は２０℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存し
た。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞ
れのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％の
アジ化ナトリウムを含むＰＨ８，５の燐酸ナトリウム緩
衝液０．３００ｍＪ１を充填した。プレートは４時間２
０℃に、次に１８時間４℃に保った。そして再度上記プ
レートを脱イオン水で３回洗浄した。
抗原または血清試料の標本を１％のウシ血清アルブミン
、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム
２ｍＭを含むｐＨ８，０の０．１ＭトリスΦ塩酸緩衝液
中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍＭ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。標準試料はウェル当り０．８ｎｇから２
００ｎｇの範囲で使用した。プレートは１８時間４℃で
インキュベートした。酵素・抗体結合体を加えるまえに
、再度上記プレートを脱イオン水で３回洗浄した。
、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム
２ｍＭを含むｐＨ８，０の０．１ＭトリスΦ塩酸緩衝液
中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍＭ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。標準試料はウェル当り０．８ｎｇから２
００ｎｇの範囲で使用した。プレートは１８時間４℃で
インキュベートした。酵素・抗体結合体を加えるまえに
、再度上記プレートを脱イオン水で３回洗浄した。
ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体・ワサビダイコンのペルオキ
シダーゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、
１％のウシ血清アルブミン、０゜０１％のメチオレート
および１％の塩化ナトリウムを含むｐＩ（ａ 、 ５の
０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に存在比１ ： １
０００となるように希釈した。結合体溶液０．１５０ｍ
ｊＬをブランクとなるウェルを除く各ウェルに配分した
。上記プレートは、２０℃で１時間インキュベートした
。脱イオン水で３回洗浄したのち、ウェルに０．１％の
２．２°−アゾ−ジー（３−エチルベンズチアゾリン−
６−スルホネー））（ＡＢＴＳ）溶液（０，００３％の
過酸化水素を含むｐＨ５，０のクエン酸／燐酸緩衝液中
）０．１５０ｍ１を充填した。ウェルの吸光度は４１０
ｎｍにおいて、デジタル・エクィップメント社のＶＡＮ
ＩＩ／７５０コンピューターに接続させたダイナチック
社製ＭＲｆ； ＯＯの自動プレート・リーダーで読み取
った。上記コンピューターは、実施例１において記載し
たように統計的およびグラフ的な機能を行なう。
シダーゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、
１％のウシ血清アルブミン、０゜０１％のメチオレート
および１％の塩化ナトリウムを含むｐＩ（ａ 、 ５の
０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に存在比１ ： １
０００となるように希釈した。結合体溶液０．１５０ｍ
ｊＬをブランクとなるウェルを除く各ウェルに配分した
。上記プレートは、２０℃で１時間インキュベートした
。脱イオン水で３回洗浄したのち、ウェルに０．１％の
２．２°−アゾ−ジー（３−エチルベンズチアゾリン−
６−スルホネー））（ＡＢＴＳ）溶液（０，００３％の
過酸化水素を含むｐＨ５，０のクエン酸／燐酸緩衝液中
）０．１５０ｍ１を充填した。ウェルの吸光度は４１０
ｎｍにおいて、デジタル・エクィップメント社のＶＡＮ
ＩＩ／７５０コンピューターに接続させたダイナチック
社製ＭＲｆ； ＯＯの自動プレート・リーダーで読み取
った。上記コンピューターは、実施例１において記載し
たように統計的およびグラフ的な機能を行なう。
［実施例３］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）２１
．５ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド１０．
０ｇの溶液を、２−プロパツール（水分含有量０．２％
以下）１０００ｍｉ中に、２５℃でマグネチック・スタ
ージーを用いて調製した。ＡＺＯＢＩＳＯ，７２ｇを含
む別の溶液をア七トン５．ＯｍＪＬ中に調製し、この溶
液を攪拌下上記２−プロパツール溶液に加えた。上記溶
液を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個の
ウェルが設けられているマイクロ滴定プレート（リンプ
ロ社製）３６枚のウェルに、ウェル当り０．２８０ｍ立
量を配分した。
．５ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド１０．
０ｇの溶液を、２−プロパツール（水分含有量０．２％
以下）１０００ｍｉ中に、２５℃でマグネチック・スタ
ージーを用いて調製した。ＡＺＯＢＩＳＯ，７２ｇを含
む別の溶液をア七トン５．ＯｍＪＬ中に調製し、この溶
液を攪拌下上記２−プロパツール溶液に加えた。上記溶
液を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個の
ウェルが設けられているマイクロ滴定プレート（リンプ
ロ社製）３６枚のウェルに、ウェル当り０．２８０ｍ立
量を配分した。
上記プレートは５７℃に熱した真空オーブン中に入れた
。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下するま
で急速に吸引し、そして圧力が１０００ミリバールに達
するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さら
にオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を
二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で
４゜５時間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が
現れた。４．５時間後プレートをオーブンより取り出し
て、３０分間放置冷却し、９６個のウェルが設けられて
いるマイクロ滴定プレートの洗浄装置で脱イオン水を用
いて５回洗浄した。
。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下するま
で急速に吸引し、そして圧力が１０００ミリバールに達
するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さら
にオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を
二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で
４゜５時間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が
現れた。４．５時間後プレートをオーブンより取り出し
て、３０分間放置冷却し、９６個のウェルが設けられて
いるマイクロ滴定プレートの洗浄装置で脱イオン水を用
いて５回洗浄した。
洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗ヒトＩｇＭ抗体
（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５の
０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５＃ｇ／ｍｆ
Ｌを含む）０．１５０ｍＭを充填した。プレートは２０
℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存した。さ
らにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞれのウ
ェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％のアジ化
ナトリウムを含むｐＨ８，５の燐酸ナトリウム緩衝液０
．３００ｍｆＬを充填した。プレートは４時間２０℃に
、さらに１８時間４℃に保った。プレートを脱イオン水
で３回洗浄し、残りの水をウェルから振り落して、最後
にポリエチレンの袋に密閉して一１８℃で保存した。
（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５の
０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５＃ｇ／ｍｆ
Ｌを含む）０．１５０ｍＭを充填した。プレートは２０
℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存した。さ
らにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞれのウ
ェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％のアジ化
ナトリウムを含むｐＨ８，５の燐酸ナトリウム緩衝液０
．３００ｍｆＬを充填した。プレートは４時間２０℃に
、さらに１８時間４℃に保った。プレートを脱イオン水
で３回洗浄し、残りの水をウェルから振り落して、最後
にポリエチレンの袋に密閉して一１８℃で保存した。
ヤギの抗ヒトＩｇＭ抗体を共有結合で固定化した上記の
プレートは、−１８℃で保存してから１２力月間、ヒト
のＩｇＭについてのエンザイムイムノアッセイにおいて
何らの低下をも示さなかった・ ［実施例４］ アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１９
．３ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド９．０
ｇの溶液を、２−プロパツール（水分含有量０．２％以
下）９００ｍ文中に、２５℃でマグネチック・スターラ
ーを用いて調製した。ＡＺＯＢＩＳＩｏ、８４ｇ含む別
の溶液をアセトン１５ 、Ｏｍｉ中に調製し、この溶液
を攪拌下上記２−プロパツール溶液に加えた。上記溶液
を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個のウ
ェルが設けられているマイクロ滴定プレート（リンプロ
社製）３６枚のウェルに、ウェル当り０．２８０ｍＪｌ
量を配分した。
プレートは、−１８℃で保存してから１２力月間、ヒト
のＩｇＭについてのエンザイムイムノアッセイにおいて
何らの低下をも示さなかった・ ［実施例４］ アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１９
．３ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド９．０
ｇの溶液を、２−プロパツール（水分含有量０．２％以
下）９００ｍ文中に、２５℃でマグネチック・スターラ
ーを用いて調製した。ＡＺＯＢＩＳＩｏ、８４ｇ含む別
の溶液をアセトン１５ 、Ｏｍｉ中に調製し、この溶液
を攪拌下上記２−プロパツール溶液に加えた。上記溶液
を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個のウ
ェルが設けられているマイクロ滴定プレート（リンプロ
社製）３６枚のウェルに、ウェル当り０．２８０ｍＪｌ
量を配分した。
上記プレートは５７℃に熱した真空オーブン中に入れた
。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下するま
で急速に吸引し、そして圧力が１ｏｏｏミリバールに達
するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さら
にオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を
二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で
４．５時間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が
現れた。４．５時間後プレートをオーブンより取り出し
て、３０分間放置冷却した。そしてプレートを、９６個
のウェルが設けられているマイクロ滴定プレートの洗浄
装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。上記プレート
を２４時間２５℃においてｏ、ｉミリバールの真空中で
乾燥し。
。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下するま
で急速に吸引し、そして圧力が１ｏｏｏミリバールに達
するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした。さら
にオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記操作を
二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５７℃で
４．５時間置かれた。約１時間でウェル中に白色沈殿が
現れた。４．５時間後プレートをオーブンより取り出し
て、３０分間放置冷却した。そしてプレートを、９６個
のウェルが設けられているマイクロ滴定プレートの洗浄
装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。上記プレート
を２４時間２５℃においてｏ、ｉミリバールの真空中で
乾燥し。
直ちにポリエチレンの袋（袋の中には、残りの湿気を吸
着するドライエリ−） ［ＤＲＩＥＲＩＴＥ；登録商
標］を入れる）に密閉した。なお上記ドライエリートは
、スペーサー分子上の活性エステル基を加水分解する恐
れがある湿気を吸収させるだめのものである。上記プレ
ートは、２０℃で保存した場合には３力月問および４℃
で保存した場合には６力月間、抗体または抗原の結合に
関する活性に何らの損失をも示さなかった。
着するドライエリ−） ［ＤＲＩＥＲＩＴＥ；登録商
標］を入れる）に密閉した。なお上記ドライエリートは
、スペーサー分子上の活性エステル基を加水分解する恐
れがある湿気を吸収させるだめのものである。上記プレ
ートは、２０℃で保存した場合には３力月問および４℃
で保存した場合には６力月間、抗体または抗原の結合に
関する活性に何らの損失をも示さなかった。
［実施例５］
実施例２において記載した方法と同様に、９６個のウェ
ルが設けられているプレート（グイナテック社製、マイ
クロフルオロ・Ｂ［旧ｃｒｏｆｌｕｏｒ”Ｂ“コ ；登
録商標）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミドお
よびアクリルアミドを用いてグラフト化し、ヤギの抗マ
ウスＩｇＧ抗体（タボ社製）で被覆した。
ルが設けられているプレート（グイナテック社製、マイ
クロフルオロ・Ｂ［旧ｃｒｏｆｌｕｏｒ”Ｂ“コ ；登
録商標）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミドお
よびアクリルアミドを用いてグラフト化し、ヤギの抗マ
ウスＩｇＧ抗体（タボ社製）で被覆した。
抗原または試料の標本を１％のウシ血清アルブミン、０
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐ）Ｉａ 、２の０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液
中に希釈して、ウェル当り０゜１５０ｍ１容量加えた。
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐ）Ｉａ 、２の０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液
中に希釈して、ウェル当り０゜１５０ｍ１容量加えた。
各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分析
を行なった。標準試料は３３ピコ・グラムから９．０ナ
ノ・グラム（９０００ピコ・グラム）の範囲で使用した
。プレートは１８時間４℃でインキュベートしてから、
脱イオン水で３回洗浄した。
を行なった。標準試料は３３ピコ・グラムから９．０ナ
ノ・グラム（９０００ピコ・グラム）の範囲で使用した
。プレートは１８時間４℃でインキュベートしてから、
脱イオン水で３回洗浄した。
ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体Ｏアルカリ性フォスファター
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐｉ（８、２の０．１
Ｍ）リス・塩酸緩衝液中に存在比１ ： １０００とな
るように希釈した。
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐｉ（８、２の０．１
Ｍ）リス・塩酸緩衝液中に存在比１ ： １０００とな
るように希釈した。
結合体溶液０．１５０ｍＭをブランクとなるウェルを除
く各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２時
間そして２０℃で１時間インキュベートした。脱イオン
水で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍＭの４−メチ
ルウンベリフェリル・フォスフェート溶液（塩化マグネ
シウム２ｍＭおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含むｐＨ８，
２のｌ。
く各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２時
間そして２０℃で１時間インキュベートした。脱イオン
水で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍＭの４−メチ
ルウンベリフェリル・フォスフェート溶液（塩化マグネ
シウム２ｍＭおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含むｐＨ８，
２のｌ。
ＯＭ）リス・塩酸緩衝液中）０．２００ｍｊＬを充填し
た。蛍光の増加率は、グイナテック社製マイクロフルオ
ロ（旧ｃｒｏＦＬＯＵＲ；商標）・リーダーＭＲ６００
の自動プレート・リーダーで測定した。
た。蛍光の増加率は、グイナテック社製マイクロフルオ
ロ（旧ｃｒｏＦＬＯＵＲ；商標）・リーダーＭＲ６００
の自動プレート・リーダーで測定した。
励起波長は３５０ｎｍであり、発光は４８０ｎｍで測定
した。動力学的データをそのまま、抗原濃度の自然対数
（ｌｏｇ）に対する蛍光（任意の単位）および抗原濃度
の自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロットを行な
うように、統計的およびグラフ的処理の機能をするデジ
タルＱエクィップメント社のＶＡＮ １１／７５０コン
ピユーターに送った・ ［実施例６］ 実施例２において記載した方法と同様に、９６個のウェ
ルが設けられているマイクロ滴定用ポリスチレン製プレ
ート（リンプロ社製）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスク
シンイミドおよびアクリルアミドを用いてグラフト化し
た。実施例１において記載した方法と同様に、上記プレ
ートを抗体（ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆し、つ
いで１％のＢＳＡを用いて不活性化した。ただし、Ｉｌ
衝液液７５終 性フォスファターゼで標識化した第二抗体を各ウェルに
加え、直ちに同容量の緩衝液中の試料あるいは標準試料
について同様の操作を繰り返した。
した。動力学的データをそのまま、抗原濃度の自然対数
（ｌｏｇ）に対する蛍光（任意の単位）および抗原濃度
の自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロットを行な
うように、統計的およびグラフ的処理の機能をするデジ
タルＱエクィップメント社のＶＡＮ １１／７５０コン
ピユーターに送った・ ［実施例６］ 実施例２において記載した方法と同様に、９６個のウェ
ルが設けられているマイクロ滴定用ポリスチレン製プレ
ート（リンプロ社製）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスク
シンイミドおよびアクリルアミドを用いてグラフト化し
た。実施例１において記載した方法と同様に、上記プレ
ートを抗体（ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆し、つ
いで１％のＢＳＡを用いて不活性化した。ただし、Ｉｌ
衝液液７５終 性フォスファターゼで標識化した第二抗体を各ウェルに
加え、直ちに同容量の緩衝液中の試料あるいは標準試料
について同様の操作を繰り返した。
そして上記プレートを２時間３７℃でインキュベートシ
た．基質を加え、４ １ ０ ｎｍで吸光度を読み取る
等のその他の操作は，実施例１において記載した標準的
な分析方法と同様であった。
た．基質を加え、４ １ ０ ｎｍで吸光度を読み取る
等のその他の操作は，実施例１において記載した標準的
な分析方法と同様であった。
［実施例７］
実施例２において記載した方法と同様に、９６個のウェ
ルが設けられているマイクロ滴定用ポリスチレン製プレ
ート（リンプロ社製）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスク
シンイミドおよびアクリルアミドを用いてグラフト化し
た。
ルが設けられているマイクロ滴定用ポリスチレン製プレ
ート（リンプロ社製）二枚を、Ｎ−アクリルオキシスク
シンイミドおよびアクリルアミドを用いてグラフト化し
た。
プレートは、ｐＨ８ 、５の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム
緩衝液中のヒトのフィブリノーゲンを用いて、−夜４℃
において被覆する．１０個のウェルをフィブリノーゲン
の各濃度における試験に使用する．ウェル当り使用した
フィブリノーゲンの量は，Ｏ’．１５ｍ１容最に対し２
０００、５００。
緩衝液中のヒトのフィブリノーゲンを用いて、−夜４℃
において被覆する．１０個のウェルをフィブリノーゲン
の各濃度における試験に使用する．ウェル当り使用した
フィブリノーゲンの量は，Ｏ’．１５ｍ１容最に対し２
０００、５００。
１００、５０、ｌＯおよび１ｎｇである．洗浄後，上記
プレートをＰＨ８ 、５の０．０５Ｍ燐酸緩衝液中の１
％ＢＳＡ溶液を用いて４時間．室温不活性化する。
プレートをＰＨ８ 、５の０．０５Ｍ燐酸緩衝液中の１
％ＢＳＡ溶液を用いて４時間．室温不活性化する。
過剰量のＢＳＡを洗浄により除去したのち、１％のＮａ
ｃｊＬ、１％（７）ＢＳＡおよび０．０１％のメチオレ
ートを含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液中に存在比１ ： ５
００に希釈された、ワサビダイコンのペルオキシダーゼ
で標識化されたヤギの抗ヒト・フィブリノーゲン抗体を
上記プレートに加える。
ｃｊＬ、１％（７）ＢＳＡおよび０．０１％のメチオレ
ートを含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液中に存在比１ ： ５
００に希釈された、ワサビダイコンのペルオキシダーゼ
で標識化されたヤギの抗ヒト・フィブリノーゲン抗体を
上記プレートに加える。
各ウェルは抗体０−１５ｍＪＬを収容する．プレートは
１時間半，酵素と共に室温でインキュベートする．洗浄
後，０．０３％の過酸化水素を含むｐＨ５ 、０のクエ
ン酸／燐酸緩衝液中の１％ＡＢＴＳ−０．１５ｍＪｌを
各ウェルに加える．基質を加えて５分後プレートを読み
取る。
１時間半，酵素と共に室温でインキュベートする．洗浄
後，０．０３％の過酸化水素を含むｐＨ５ 、０のクエ
ン酸／燐酸緩衝液中の１％ＡＢＴＳ−０．１５ｍＪｌを
各ウェルに加える．基質を加えて５分後プレートを読み
取る。
［実施例Ｂ］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１．
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．７
００ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）
７０．ＯｍＪＬ中に、２５℃でマグネチック・スターラ
ーを用いて溶解した。
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．７
００ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）
７０．ＯｍＪＬ中に、２５℃でマグネチック・スターラ
ーを用いて溶解した。
２、２′−７ゾビスー（２−メチルプロピオニトリル）
（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア七トン０。
（ＡＺＯＢＩＳ）５０ｍｇをア七トン０。
５０ｍ！；Ｌ中に溶解し、この溶液を上記２−プロパツ
ール溶液に加えて、さらに２分間マグネチック・スター
ラーを用いて攪拌したのち焼結ガラス製フィルターで濾
過した。
ール溶液に加えて、さらに２分間マグネチック・スター
ラーを用いて攪拌したのち焼結ガラス製フィルターで濾
過した。
９６個のウェルが設けられているポリビニル製マイクロ
滴定プレート（ダイナチック社製）二枚に、フリーラジ
カルを生成するＡＺＯＢＩ Ｓ及びモノマーを含む上記
濾過した２−プロパツール溶液を、ウェル当り０．２０
ｍＡになるように充填した。プレートは５７℃に熱した
真空オーブン中に入れた。上記オーブンは圧力が１００
ミリバールに低下するまで急速に吸引し、そして圧力が
１０００ミリバールに達するまで純粋（９９，９％）ア
ルゴンを満たした。さらにオーブン中の酸素濃度を低下
させるため、上記操作を二回以上繰り返した。プレート
はオーブン中に５７℃で４．５時間置かれた。約１時間
でウェル中に白色沈殿が現れた。４．５時間後プレート
をオーブンより取り出して、３０分間放置冷却し、９６
個のウェルが設けられているマイクロ滴定プレートの洗
浄装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。二枚のプレ
ートの洗浄操作に要した時間は、３分未満であった・ 洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ルｇ／ｍ
立を含む）０．１５０ｍ文を充填した。プレートは２０
℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存した。さ
らにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞれのウ
ェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％のアジ化
ナトリウムを含むｐＨ８−５の燐酸ナトリウム緩衝液０
゜２０ ｍ ｉを充填した。プレートは４時間２０℃に
、さらに１８時間４℃に保った。そして再度上記プレー
トを脱イオン水で３回洗浄した。
滴定プレート（ダイナチック社製）二枚に、フリーラジ
カルを生成するＡＺＯＢＩ Ｓ及びモノマーを含む上記
濾過した２−プロパツール溶液を、ウェル当り０．２０
ｍＡになるように充填した。プレートは５７℃に熱した
真空オーブン中に入れた。上記オーブンは圧力が１００
ミリバールに低下するまで急速に吸引し、そして圧力が
１０００ミリバールに達するまで純粋（９９，９％）ア
ルゴンを満たした。さらにオーブン中の酸素濃度を低下
させるため、上記操作を二回以上繰り返した。プレート
はオーブン中に５７℃で４．５時間置かれた。約１時間
でウェル中に白色沈殿が現れた。４．５時間後プレート
をオーブンより取り出して、３０分間放置冷却し、９６
個のウェルが設けられているマイクロ滴定プレートの洗
浄装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。二枚のプレ
ートの洗浄操作に要した時間は、３分未満であった・ 洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ社製、アフィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ルｇ／ｍ
立を含む）０．１５０ｍ文を充填した。プレートは２０
℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間保存した。さ
らにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、それぞれのウ
ェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０２％のアジ化
ナトリウムを含むｐＨ８−５の燐酸ナトリウム緩衝液０
゜２０ ｍ ｉを充填した。プレートは４時間２０℃に
、さらに１８時間４℃に保った。そして再度上記プレー
トを脱イオン水で３回洗浄した。
抗原または試料の標本を１％のウシ血清アルブミン、０
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐａａ 、２のＯ，１Ｍトリス・塩酸緩衝液中
に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｎＪＬ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐａａ 、２のＯ，１Ｍトリス・塩酸緩衝液中
に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｎＪＬ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。
標準試料はウェル当り０．８ｍｇから２００ｎｇの範囲
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。
ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体・アルカリ性フォスファター
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ
）リス・塩酸緩衝液中に存在比１ ： １０００となる
ように希釈した。
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ
）リス・塩酸緩衝液中に存在比１ ： １０００となる
ように希釈した。
結合体溶液０．１５０ｍＪＬをブランクとなるウェルを
除く各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２
時間そして２０℃で１時間インキュベートシた。
除く各ウェルに配分した。上記プレートは、３７℃で２
時間そして２０℃で１時間インキュベートシた。
脱イオン水で３＠洗浄した後、ウェルに０．５ｍ Ｍ
（７） Ｐ−ニトロフェニル−フォスフェート溶液（塩
化マグネシウム２ｎＭおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含む
ＰＨ８，２１７）１．０Ｍ）リス・塩酸緩衝液中）０．
１５０ｍｊＬを充填した。ウェルの４１０ ｎｍにおけ
る吸光度の増加率は、デジタ２しΦエクィシプメント社
のＶＡＮ ｌ １／７５０コンピユーターに接続させた
ダイナチック社製ＭＲ６００の自動プレート・リーダー
で読み取った。
（７） Ｐ−ニトロフェニル−フォスフェート溶液（塩
化マグネシウム２ｎＭおよび塩化亜鉛０．５ｍＭを含む
ＰＨ８，２１７）１．０Ｍ）リス・塩酸緩衝液中）０．
１５０ｍｊＬを充填した。ウェルの４１０ ｎｍにおけ
る吸光度の増加率は、デジタ２しΦエクィシプメント社
のＶＡＮ ｌ １／７５０コンピユーターに接続させた
ダイナチック社製ＭＲ６００の自動プレート・リーダー
で読み取った。
上記コンピューターは、動力学的データをそのまま受は
取り、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する吸光度の
プロットおよび抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する
変動値のプロットを行なうように、統計的およびグラフ
的に処理する。
取り、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する吸光度の
プロットおよび抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する
変動値のプロットを行なうように、統計的およびグラフ
的に処理する。
［実施例９］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１．
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．７
０ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．ＯｍＪｌ中に、２５℃でマグネチックースターラー
を用いて溶解した。ａ−クミル−ペルオキシネオデカノ
エート（ａ−ｃｕｓ＋ｙトｐｅｒｏｘｙｎｅｏｄｅｃａ
ｎｏａｔｅ） ５０ 、０ ｐ＋１をアセトン０＝５０
ｍｉ中に溶解し、この溶液を上記２−プロパツール溶液
に加えて、さらに２分間マグネチツク・スターラーを用
いて攪拌したのち、焼結ガラス製フィルターで濾過した
。
５０ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．７
０ｇを２−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．ＯｍＪｌ中に、２５℃でマグネチックースターラー
を用いて溶解した。ａ−クミル−ペルオキシネオデカノ
エート（ａ−ｃｕｓ＋ｙトｐｅｒｏｘｙｎｅｏｄｅｃａ
ｎｏａｔｅ） ５０ 、０ ｐ＋１をアセトン０＝５０
ｍｉ中に溶解し、この溶液を上記２−プロパツール溶液
に加えて、さらに２分間マグネチツク・スターラーを用
いて攪拌したのち、焼結ガラス製フィルターで濾過した
。
９６（［１のウェルが設けられているポリスチレン製の
マイクロ滴定プレート（リンプロ社製）二枚に、フリー
ラジカルを生成するａ−クミル−ペルオキシネオデカノ
エートおよびモノマーを含む上記濾過した２−プロパツ
ール溶液を、ウェル当り０．２８０ｍｊＬになるように
充填した。プレートは５７℃に熱した真空オーブン中に
入れた。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下
するまで急速に吸引し、そして圧力が１０００ミリバー
ルに達するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした
。さらにオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記
操作を二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５
７℃で４．５時間置かれた。
マイクロ滴定プレート（リンプロ社製）二枚に、フリー
ラジカルを生成するａ−クミル−ペルオキシネオデカノ
エートおよびモノマーを含む上記濾過した２−プロパツ
ール溶液を、ウェル当り０．２８０ｍｊＬになるように
充填した。プレートは５７℃に熱した真空オーブン中に
入れた。上記オーブンは圧力が１００ミリバールに低下
するまで急速に吸引し、そして圧力が１０００ミリバー
ルに達するまで純粋（９９，９％）アルゴンを満たした
。さらにオーブン中の酸素濃度を低下させるため、上記
操作を二回以上繰り返した。プレートはオーブン中に５
７℃で４．５時間置かれた。
約１時間でウェル中に白色沈殿が現れた。４．５時間後
プレートをオーブンより取り出して、３０分間放置冷却
し、９６債のウェルが設けられているマイクロ滴定プレ
ートの洗浄装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。二
枚のプレートの洗浄操作に要した時間は、３分未満であ
った。
プレートをオーブンより取り出して、３０分間放置冷却
し、９６債のウェルが設けられているマイクロ滴定プレ
ートの洗浄装置で脱イオン水を用いて５回洗浄した。二
枚のプレートの洗浄操作に要した時間は、３分未満であ
った。
洗浄したプレートのウェルに、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ社製、アブィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ μｇ
／ ｍ ｆＬを含む）０．１５０ｍｊＬを充填した。プ
レートは２０℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間
保存した。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、
それぞれのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０
２％のアジ化ナトリウムを含むＰＨ８，５の燐酸ナトリ
ウム緩衝液０．３００ｍＪＬを充填した。プレートは４
時間２０℃に、さらに１８時間４℃に保った。そして再
度上記プレートを脱イオン水で３回洗浄した。
体（タボ社製、アブィニティー精製）溶液（ｐＨ８，５
の０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中に抗体５ μｇ
／ ｍ ｆＬを含む）０．１５０ｍｊＬを充填した。プ
レートは２０℃で１時間放置したのち、４℃で１８時間
保存した。さらにプレートを脱イオン水で３回洗浄し、
それぞれのウェルに１％のウシ血清アルブミンと０．０
２％のアジ化ナトリウムを含むＰＨ８，５の燐酸ナトリ
ウム緩衝液０．３００ｍＪＬを充填した。プレートは４
時間２０℃に、さらに１８時間４℃に保った。そして再
度上記プレートを脱イオン水で３回洗浄した。
抗原または試料の標本を１％のウシ血清アルブミン、０
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐ ！（８、２の０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液
中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍＭ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。
．０２％のアジ化ナトリウムおよび塩化カルシウム２ｍ
Ｍを含むｐ ！（８、２の０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液
中に希釈して、上記ウェルに０．１５０ｍＭ容量加えた
。各試料あるいは標準試料は少なくとも三組について分
析を行なった。
標準試料はウェル当り０．８ｎｇから２００ｎｇの範囲
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。
で使用した。プレートは１８時間４℃でインキュベート
した。酵素・抗体結合体を加えるまえに、再度上記プレ
ートを脱イオン水で３回洗浄した。
ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体・アルカリ性フォスファター
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ
）リス魯塩酸緩衝液中に存在比ｉ ： １０００となる
ように希釈した。
ゼ結合体（タボ社製、アフィニティー精製）を、１％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のアジ化ナトリウムお
よび塩化カルシウム２ｍＭを含むｐＨ８，２の０．１Ｍ
）リス魯塩酸緩衝液中に存在比ｉ ： １０００となる
ように希釈した。
結合体溶液０．１５０ｍ１をブランクとなるウェルを除
く各ウェルに配分した。上記プレートは。
く各ウェルに配分した。上記プレートは。
３７℃で２時間そして２０℃で１時間インキュベートシ
た。脱イオン水で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍ
Ｍのｐ−ニトロフェニル・フォスフェート溶液（塩化マ
グネシウム２ｍＭおよび塩化夏鉛０．５ｍＭを含むｐＨ
８，２の１．０Ｍ）リス−塩酸緩衝液中）０．１５０ｍ
１を充填した。
た。脱イオン水で３回洗浄したのち、ウェルに０．５ｍ
Ｍのｐ−ニトロフェニル・フォスフェート溶液（塩化マ
グネシウム２ｍＭおよび塩化夏鉛０．５ｍＭを含むｐＨ
８，２の１．０Ｍ）リス−塩酸緩衝液中）０．１５０ｍ
１を充填した。
ウェルの４１０ｎｍにおける吸光度の増加率は。
デジタル・エクィップメント社のＶＡＮＩＩ／７００コ
ンピューターに接続させたダイナチック社製ＭＲ６００
の自動プレー）−リーダーで読み取った。上記コンピュ
ーターは、動力学的データをそのまま受は取り、抗原濃
度の自然対数（Ｉａｇ）に対する吸光度のプロットおよ
び抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロ
ットを行なうように、統計的およびグラフ的に処理する
。
ンピューターに接続させたダイナチック社製ＭＲ６００
の自動プレー）−リーダーで読み取った。上記コンピュ
ーターは、動力学的データをそのまま受は取り、抗原濃
度の自然対数（Ｉａｇ）に対する吸光度のプロットおよ
び抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する変動値のプロ
ットを行なうように、統計的およびグラフ的に処理する
。
［実施例１０１
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）０．
３８ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．２
５ｇを１−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．０ｍＭ中に、２５℃でマグネチック拳スターラーを
用いて溶解した。ベンゾフェノン１．２５ｇを上記ｌ−
プロパツール溶液に加えて、さらに１０分間攪拌したの
ち、焼結ガラス製漏斗で濾過した。９６個のウェルが設
けられているポリスチレン製マイクロ滴定プレート（リ
ンプロ社製）二枚に、紫外線光の活性化によりフリーラ
ジカル種を生成する光開始化合物でアルベンゾフェノン
およびモノで−を含む上記濾過した１−プロパツール溶
液を、ウェル当り０゜２８０ｍ１になるように充填した
。プレートをガラス製の平底容器（長さ１２インチＸ幅
１２インチ×高さ２インチ）に入れ、１５分間純粋アル
ゴン流を吹き付けて酸素を除去した。上記容器は、縦方
向に互いにイインチ間隔で配列された九個の黒色光蛍光
放電灯から垂直方向に１インチ上方に載置した。上記光
源（シルバニア［５ｙｌｖａｎｉａ１社製、Ｆｌ ５Ｔ
８／ＢＬＥ蛍光放電灯、１８インチ×７／８インチ）は
、上記グラフト化容器のガラス製底面においテ、 ３６
０ ｎｍテ４０Ｗｈ／ｍ″のＵＶ照射エネルギーを発す
る。放電灯と容器は圧縮空気で冷却した。容器内温度を
測定したところ２５℃であった。
３８ｇおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド０．２
５ｇを１−プロパツール（水分含有量０．２％以下）７
０．０ｍＭ中に、２５℃でマグネチック拳スターラーを
用いて溶解した。ベンゾフェノン１．２５ｇを上記ｌ−
プロパツール溶液に加えて、さらに１０分間攪拌したの
ち、焼結ガラス製漏斗で濾過した。９６個のウェルが設
けられているポリスチレン製マイクロ滴定プレート（リ
ンプロ社製）二枚に、紫外線光の活性化によりフリーラ
ジカル種を生成する光開始化合物でアルベンゾフェノン
およびモノで−を含む上記濾過した１−プロパツール溶
液を、ウェル当り０゜２８０ｍ１になるように充填した
。プレートをガラス製の平底容器（長さ１２インチＸ幅
１２インチ×高さ２インチ）に入れ、１５分間純粋アル
ゴン流を吹き付けて酸素を除去した。上記容器は、縦方
向に互いにイインチ間隔で配列された九個の黒色光蛍光
放電灯から垂直方向に１インチ上方に載置した。上記光
源（シルバニア［５ｙｌｖａｎｉａ１社製、Ｆｌ ５Ｔ
８／ＢＬＥ蛍光放電灯、１８インチ×７／８インチ）は
、上記グラフト化容器のガラス製底面においテ、 ３６
０ ｎｍテ４０Ｗｈ／ｍ″のＵＶ照射エネルギーを発す
る。放電灯と容器は圧縮空気で冷却した。容器内温度を
測定したところ２５℃であった。
ＵＶ放電灯を点灯してから１０分後に、ウェル中に白色
沈殿が現れた。１時間後ＵＶ放電灯を消灯して、プレー
トを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定プレ
ートの洗浄装置で２−プロパツールを用いて２回洗浄し
、水不溶性の光開始剤であるベンゾフェノンを除去した
。そしてプレートを上記洗浄装置で脱イオン水を用いて
５回洗浄した。二枚のプレートの洗浄操作に要した時間
は５分未満であった。プレートを抗体（タボ社製、ヤギ
め抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操作、以下順次、プ
レートをＢＳＡで不活性化する操作、標準試料および試
料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、ワサビダイコンの
ペルオキシダーゼにより標識化された第二抗体を加える
操作、基質を加える操作および４１０ ｎｍにおける吸
光度の測定は、実施例２において記載した分析方法の操
作と同様である。
沈殿が現れた。１時間後ＵＶ放電灯を消灯して、プレー
トを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定プレ
ートの洗浄装置で２−プロパツールを用いて２回洗浄し
、水不溶性の光開始剤であるベンゾフェノンを除去した
。そしてプレートを上記洗浄装置で脱イオン水を用いて
５回洗浄した。二枚のプレートの洗浄操作に要した時間
は５分未満であった。プレートを抗体（タボ社製、ヤギ
め抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操作、以下順次、プ
レートをＢＳＡで不活性化する操作、標準試料および試
料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、ワサビダイコンの
ペルオキシダーゼにより標識化された第二抗体を加える
操作、基質を加える操作および４１０ ｎｍにおける吸
光度の測定は、実施例２において記載した分析方法の操
作と同様である。
［実施例１１］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）０．
３８ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．２５ｇ
およびベンゾフェノン１．２５ｇを１−プロパツール（
水分含有量０．２％以下）７０．０ｍｌ中に、２５℃で
マグネチック会スターラーを用いて溶解した。上記溶液
を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個のウ
ェルが設けられているポリ塩化ビニル製プレート（ダイ
ナチック社製）二枚に、上記１−プロパツール溶液を（
０，２０ｍ１／ウエル）充填した。プレートをガラス製
の平底容器（長さ１２インチＸ幅１２インチＸ高さ２イ
ンチ）に入れ、１５分間純粋アルゴン流を吹き付けて酸
素を除去した。上記容器は、縦方向に互いにイインチ間
隔で配列された９個の黒色光蛍光放電灯から垂直方向に
１インチ上方に載置した。上記光源（シルバニア社製、
Ｆ １５Ｔ８／ＢＬＢ蛍光放電灯、１８インチ×７７８
インチ）は、上記グラフト化容器のガラス製底面におい
て、３６０ ｎ ｍ テ４０ Ｗ ｈ ／ ｒｎ’ ｃ
７） Ｕ Ｖ照射エネルギーを発する。
３８ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．２５ｇ
およびベンゾフェノン１．２５ｇを１−プロパツール（
水分含有量０．２％以下）７０．０ｍｌ中に、２５℃で
マグネチック会スターラーを用いて溶解した。上記溶液
を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９６個のウ
ェルが設けられているポリ塩化ビニル製プレート（ダイ
ナチック社製）二枚に、上記１−プロパツール溶液を（
０，２０ｍ１／ウエル）充填した。プレートをガラス製
の平底容器（長さ１２インチＸ幅１２インチＸ高さ２イ
ンチ）に入れ、１５分間純粋アルゴン流を吹き付けて酸
素を除去した。上記容器は、縦方向に互いにイインチ間
隔で配列された９個の黒色光蛍光放電灯から垂直方向に
１インチ上方に載置した。上記光源（シルバニア社製、
Ｆ １５Ｔ８／ＢＬＢ蛍光放電灯、１８インチ×７７８
インチ）は、上記グラフト化容器のガラス製底面におい
て、３６０ ｎ ｍ テ４０ Ｗ ｈ ／ ｒｎ’ ｃ
７） Ｕ Ｖ照射エネルギーを発する。
光開始によるグラフト化を３０分間行なったのち、プレ
ートを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定プ
レートの洗浄装置で２−プロパツールヲ用いて２回洗浄
してベンゾフェノンを除去し、さらに上記洗浄装置で脱
イオン水を用いて５回洗浄した。プレートを抗体（タボ
社製、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操作、そ
して以下順次、プレートをＢＳＡで不活性化する操作、
標準試料および試料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、
ワサビダイコンのペルオキシダーゼにより標識化された
第二抗体を加える操作、基質を加える操作、および４１
０ ｎｍにおける吸光度の測定は、実施例２において記
載した分析方法の操作と同様である。
ートを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定プ
レートの洗浄装置で２−プロパツールヲ用いて２回洗浄
してベンゾフェノンを除去し、さらに上記洗浄装置で脱
イオン水を用いて５回洗浄した。プレートを抗体（タボ
社製、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操作、そ
して以下順次、プレートをＢＳＡで不活性化する操作、
標準試料および試料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、
ワサビダイコンのペルオキシダーゼにより標識化された
第二抗体を加える操作、基質を加える操作、および４１
０ ｎｍにおける吸光度の測定は、実施例２において記
載した分析方法の操作と同様である。
［実施例１２］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）１．
１５ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．７５ｇ
およびベンゾフェノン１ 、２５０ｇを１−プロパツー
ル（水分含有量０．２％以下）２１０．ＯｍｆＬ中に、
２５℃でマグネチックφスターラーを用いて溶解した。
１５ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．７５ｇ
およびベンゾフェノン１ 、２５０ｇを１−プロパツー
ル（水分含有量０．２％以下）２１０．ＯｍｆＬ中に、
２５℃でマグネチックφスターラーを用いて溶解した。
上記溶液を焼結ガラス製フィルターで濾過したのち、９
６個のウェルが設けられているポリスチレン製プレート
（リンプロ社製）大枚に、光開始化合物およびモノマー
を含む上記溶液を（Ｇ 、２８ｍＪＬ／ウェル）充填し
た。プレートを光グラフト化装置内に入れた。プレート
のグラフト化操作および洗浄操作は、実施例１１におい
て記載した方法と同様である。上記プレートを２４時間
２５℃において０．１ミリバールの真空中で乾燥し、直
ちにポリエチレンの袋（袋の中には、残余の湿気を吸着
するドライエリートを入れる）に密閉した。上記の湿気
は、スペーサー分子上の活性エステル基を加水分解する
恐れがある。上記活性化したプレートは、２０℃で保存
した場合には３力月間、４℃では６力月間、抗体または
抗原の結合に関する活性に何らの損失をも示さなかった
。
６個のウェルが設けられているポリスチレン製プレート
（リンプロ社製）大枚に、光開始化合物およびモノマー
を含む上記溶液を（Ｇ 、２８ｍＪＬ／ウェル）充填し
た。プレートを光グラフト化装置内に入れた。プレート
のグラフト化操作および洗浄操作は、実施例１１におい
て記載した方法と同様である。上記プレートを２４時間
２５℃において０．１ミリバールの真空中で乾燥し、直
ちにポリエチレンの袋（袋の中には、残余の湿気を吸着
するドライエリートを入れる）に密閉した。上記の湿気
は、スペーサー分子上の活性エステル基を加水分解する
恐れがある。上記活性化したプレートは、２０℃で保存
した場合には３力月間、４℃では６力月間、抗体または
抗原の結合に関する活性に何らの損失をも示さなかった
。
［実施例１３］
アクリルアミド（純度は電気泳動に使用する程度）０．
７５ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．５０ｇ
およびベンゾフェノン１．２５ｇをアセトン５０ ｍ
ｆＬ中に、０℃でマグネチック・スターラーを用いて溶
解し、０．１ｍＡの氷酢酸を含む水冷脱イオン水をゆっ
くり攪拌しながら加えた。得られた均一溶液を、Ｎ−ア
クリルオキシスクシンイミドの活性エステルの加水分解
を最小限とするため、迅速に、前もって冷却しておいた
焼結ガラス製漏斗で濾過した。
７５ｇ、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド０．５０ｇ
およびベンゾフェノン１．２５ｇをアセトン５０ ｍ
ｆＬ中に、０℃でマグネチック・スターラーを用いて溶
解し、０．１ｍＡの氷酢酸を含む水冷脱イオン水をゆっ
くり攪拌しながら加えた。得られた均一溶液を、Ｎ−ア
クリルオキシスクシンイミドの活性エステルの加水分解
を最小限とするため、迅速に、前もって冷却しておいた
焼結ガラス製漏斗で濾過した。
９６個のウェルが設けられているポリスチレン製プレー
ト（リンプロ社製）二枚への充填操作および光グラフト
化操作は、３０分間４℃の冷室中で行なった。ついでプ
レートを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定
プレートの洗浄装置で２−プロパツールを用いて２回、
氷冷脱イオン水を用いて５回洗浄した。プレートを抗体
（タボ社製、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操
作、以下順次、プレートをＢＳＡで不活性化する操作、
標準試料および試料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、
ワサビダイコンのペルオキシダーゼにより標識化された
第二抗体を加える操作、基質を加える操作および４１０
ｎｍにおける吸光度の測定は、実施例２において記載し
た分析方法の操作と同様である。
ト（リンプロ社製）二枚への充填操作および光グラフト
化操作は、３０分間４℃の冷室中で行なった。ついでプ
レートを９６個のウェルが設けられているマイクロ滴定
プレートの洗浄装置で２−プロパツールを用いて２回、
氷冷脱イオン水を用いて５回洗浄した。プレートを抗体
（タボ社製、ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体）で被覆する操
作、以下順次、プレートをＢＳＡで不活性化する操作、
標準試料および試料（マウスのＩｇＧ）を加える操作、
ワサビダイコンのペルオキシダーゼにより標識化された
第二抗体を加える操作、基質を加える操作および４１０
ｎｍにおける吸光度の測定は、実施例２において記載し
た分析方法の操作と同様である。
第１図は、ポリマー表面に共有結合で付着した長いスペ
ーサー分子の形成におけるグラフト化処理方法および活
性化されたスペーサー分子による抗体の共有結合による
固定化を説明する構成図である。 第２図の（Ｉ）、（２）および（３）はそれぞれ、マウ
スのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭについての三種
類のエンザイムイムノアッセイにおいて、従来の粘着に
より結合した多クローン性抗体を用いて得られた結果を
示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する吸光度の
プロア）を標準誤差線（３σ）と共に示す。 第３図の（Ｉ）、（２）および（３）はそれぞれ、マウ
スのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭについての三種
類のエンザイムイムノアツセイにおいて、長いスペーサ
ー上に共有結合で固定化された多クローン性抗体を用い
て得られた結果を示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）
に対する吸光度のプロットを標準誤差線（３σ）と共に
示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ←−Ｖ ？’２ −ｙ ＦＩＱｊｌＥ ｌ
ーサー分子の形成におけるグラフト化処理方法および活
性化されたスペーサー分子による抗体の共有結合による
固定化を説明する構成図である。 第２図の（Ｉ）、（２）および（３）はそれぞれ、マウ
スのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭについての三種
類のエンザイムイムノアッセイにおいて、従来の粘着に
より結合した多クローン性抗体を用いて得られた結果を
示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）に対する吸光度の
プロア）を標準誤差線（３σ）と共に示す。 第３図の（Ｉ）、（２）および（３）はそれぞれ、マウ
スのＩｇＧおよびヒトのＩｇＧとＩｇＭについての三種
類のエンザイムイムノアツセイにおいて、長いスペーサ
ー上に共有結合で固定化された多クローン性抗体を用い
て得られた結果を示す、抗原濃度の自然対数（ｌｏｇ）
に対する吸光度のプロットを標準誤差線（３σ）と共に
示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ←−Ｖ ？’２ −ｙ ＦＩＱｊｌＥ ｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、有効なアミノ基を含む分子の固定化において使用す
る表面処理を施した重合物質であって、上記物質はこれ
に結合する少なくとも一つのポリマーを有し、上記ポリ
マーは少なくとも二つのモノマーの混合物より生成され
、上記モノマーのうちの一つは上記固定化される分子中
のアミノ基に結合するために有効な活性基を含み、そし
て多数の上記活性基が上記物質との間に間隔を置いて上
記ポリマー上に分散していることを特徴とする重合物質
。 ２、上記重合物質が、さらに有効なアミノ基を含む複数
の分子を含有し、そして上記複数の分子はそれぞれ上記
ポリマー上に分散している上記活性基の一つに上記アミ
ノ基によって共有結合していることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の表面処理を施した重合物質。 ３、有効なアミノ基を含む分子の固定化において使用す
る表面処理を施した重合物質であって、上記物質はこれ
に結合する少なくとも一つのポリマーを有し、上記ポリ
マーは下記一般式（ I ）によって表されるモノマー及
び下記一般式（III）によって表されるモノマーの混合
物より生成されることを特徴とする表面処理を施した重
合物質。 ＣＨ＿２＝ＣＲ＿１−Ｗ−Ｚ（ I ） ［一般式（ I ）において、 Ｒ＿１は、水素原子、メチル基、または炭素原子数１６
以下の脂肪族あるいは芳香族よりなる基であり； Ｚは、下記一般式（II）によって表される 基であり；そして、 Ｗは、炭素原子数１６以下の脂肪族、芳香 族あるいは脂肪族と芳香族よりなる基、または、原子数
１６以下の脂肪族、芳香族あるいは脂肪族と芳香族より
なる基である］ ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ［一般式（II）において、 Ｒ＿３およびＲ＿４は、互いに結合していても結合して
いなくてもよく、水素原子、炭素原子数１６以下の脂肪
族、芳香族あるいは脂肪族と芳香族よりなる基、または
複素原子として酸素原子、窒素原子、硫黄原子、フッ素
原子、臭素原子および／または塩素原子を有しかつ炭素
原子数１６以下の脂肪族、芳香族あるいは脂肪族と芳香
族よりなる基であって、Ｒ＿３とＲ＿４が結合している
場合には、両者が単一の芳香族よりなる基を形成しても
よい］ＣＨ＿２＝ＣＲ＿２−Ｙ（III） ［一般式（III）において、 Ｒ＿２は、水素原子、メチル基、または炭素原子数１６
以下の脂肪族あるいは芳香族よりなる基であり；そして
、 Ｙは、炭素原子数１６以下の脂肪族、芳香 族あるいは脂肪族と芳香族よりなる基または複素原子と
して酸素原子、窒素原子および硫黄原子を有しかつ炭素
原子数１６以下の脂肪族、芳香族あるいは脂肪族と芳香
族よりなる基である］ ４、上記一般式（ I ）乃至（III）において、Ｚが下記
一般式によって表わされる基であり、Ｙが炭素原子数１
乃至６である脂肪族よりなる基であり、そしてＲ＿１、
Ｒ＿２、ＸおよびＷが炭素原子数１乃至６を含むことを
特徴とする特許請求の範囲第３項記載の表面処理を施し
た重合物質。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［上記一般式において、 ｎは１、２または３である］ ５、上記一般式（III）において、Ｙが親水性基を含有
することを特徴とする特許請求の範囲第３項または第４
項記載の表面処理を施した重合物質。 ６、上記一般式（III）において、Ｙが水酸基、アミド
およびカルボキシル基からなる群より選ばれる一種類の
基を含む親水性基を含有することを特徴とする特許請求
の範囲第３項または第４項記載の表面処理を施した重合
物質。 ７、上記ポリマーが、さらに下記一般式（IV）によって
表わされるモノマーを含有することを特徴とする特許請
求の範囲第３項記載の表面処理を施した重合物質。 ＣＨ＿２＝ＣＲ−Ｘ−ＲＣ＝ＣＨ＿２（IV）［一般式（
IV）において、 Ｒは、水素原子、メチル基、または炭素原 子数１６以下の脂肪族あるいは芳香族よりなる基であり
；そして、 Ｘは、炭素原子数１６以下の脂肪族、芳香 族あるいは脂肪族と芳香族よりなる基または複素原子と
して酸素原子、窒素原子あるいは硫黄原子を有しかつ炭
素原子数１６以下の脂肪族と芳香族よりなる基である］ ８、上記ポリマーが、さらに下記一般式（Ｖ）によって
表わされるモノマーを含有することを特徴とする特許請
求の範囲第４項記載の表面処理を施した重合物質。 ＣＨ＿２＝ＣＲ＿５−Ｘ−Ｒ＿５Ｃ＝ＣＨ＿２（Ｖ）［
一般式（Ｖ）において、 Ｒ＿５は、水素原子、メチル基、または炭素原子数１６
以下の脂肪族あるいは芳香族よりなる基であり；そして
、 Ｘは、炭素原子数１乃至６である脂肪族、 芳香族あるいは脂肪族と芳香族よりなる基または複素原
子として酸素原子、窒素原子あるいは硫黄原子を有しか
つ炭素原子数１乃至６である脂肪族と芳香族よりなる基
である］ ９、上記重合物質が、さらに活性アミノ基を含む複数の
分子を含有し、そして上記複数の分子はそれぞれ上記ポ
リマー上に分散している上記Ｚ基の一つに上記アミノ基
によって共有結合していることを特徴とする特許請求の
範囲第３項、第４項または第７項記載の表面処理を施し
た重合物質。 １０、上記重合物質が、さらに複数の抗体または抗原分
子を含有し、そして上記複数の分子はそれぞれ上記ポリ
マー上に分散している上記Ｚ基の一つにそれぞれのアミ
ノ基によって共有結合していることを特徴とする特許請
求の範囲第３項、第４項または第７項記載の表面処理を
施した重合物質。 １１、上記重合物質が、さらにポリペプチドおよび多糖
類からなる群より選ばれる一種類の分子を複数含有し、
そして上記複数の分子はそれぞれ上記ポリマー上に分散
している上記Ｚ基の一つにそれぞれのアミノ基によって
共有結合していることを特徴とする特許請求の範囲第３
項、第４項または第７項記載の表面処理を施した重合物
質。 １２、上記重合物質が、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル
、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートお
よびポリアクリレートからなる群より選ばれる一種類の
物質を含むことを特徴とする特許請求の範囲第３項、第
４項または第７項記載の表面処理を施した重合物質。 １３、上記モノマーを、不活性な気体中および上記モノ
マーに対して不活性な溶媒の存在下で、フリー・ラジカ
ルを生じる化合物（化学的および光化学的のうちいずれ
かの作用により分解して、グラフト重合を開始させるフ
リー・ラジカル化合物を生成する）と反応させることに
よってグラフト重合させて上記重合物質を得ることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の表面処理を施した
重合物質の製造方法。 １４、下記一般式（ I ）によって表されるモノマーお
よび下記一般式（III）によって表されるモノマーを、 ＣＨ＿２＝ＣＲ＿１−Ｗ−Ｚ（ I ） ［一般式（ I ）において、 Ｒ＿１、ＷおよびＺは特許請求の範囲第３項にて定義し
た通りである］ ＣＨ＿２＝ＣＲ＿２−Ｙ（III） ［一般式（III）において、 Ｒ＿２およびＹは特許請求の範囲第３項において定義し
た通りである］ （ｉ）上記モノマーに対して不活性な溶媒からなる溶液
中に溶解し、不活性な気体中、上記重合物質の存在下お
よび４０℃から上記溶媒の沸点の範囲内の温度で、フリ
ー・ラジカルを生じる化合物（上記範囲内の温度で分解
してフリー・ラジカル化合物を生成する）と処理し；そ
して、 （ｉｉ）上記重合物質を脱イオン水で洗浄することによ
って、 上記複数のポリマーを形成して上記重合物質に結合させ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の表面処
理を施した重合物質の製造方法。 １５、下記一般式（ I ）によって表されるモノマーお
よび下記一般式（III）によって表されるモノマーを、 ＣＨ＿２＝ＣＲ＿１−Ｗ−Ｚ（ I ） ［一般式（ I ）において、 Ｒ＿１、ＷおよびＺは特許請求の範囲第３項において定
義した通りである］ ＣＨ＿２＝ＣＲ＿２−Ｙ（III） ［一般式（III）において、 Ｒ＿２およびＹは特許請求の範囲第３項において定義し
た通りである］ （ｉ）上記モノマーに対して不活性な溶媒（光反応性の
フリー・ラジカルを生じる化合物を含む）からなる溶液
中に溶解し、不活性な気体中、上記重合物質の存在下お
よび０℃から上記溶媒の沸点の範囲内の温度で放射処理 （上記フリー・ラジカルを生じる化合物からのフリー・
ラジカル化合物の生成を促進す る）し；そして、 （ｉｉ）上記重合物質を脱イオン水で洗浄することによ
って、 上記複数のポリマーを形成して上記重合物質に結合させ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の表面処
理を施した重合物質の製造方法。 １６、上記の（ｉ）および（ｉｉ）の工程に加えて、 （ｉｉｉ）上記重合物質を乾燥する、 工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１４項ま
たは第１５項記載の製造方法。 １７、上記溶媒がアルコール、エーテル、エステルおよ
びケトンからなる群より選ばれる一種類の物質を含み、
上記フリー・ラジカルを生じる化合物がアゾ化合物、有
機過酸化物および過酸エステルからなる群より選ばれる
一種類または二種類以上の物質を含み、そして上記不活
性な気体が窒素およびアルゴンからなる群より選ばれる
一種類の気体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１４項記載の製造方法。 １８、上記溶媒がアルコール、エーテル、エステルおよ
びケトンからなる群より選ばれる一種類の物質を含み、
上記フリー・ラジカルを生じる化合物が芳香族ケトンを
含み、そして上記不活性な気体が窒素およびアルゴンか
らなる群より選ばれる一種類の気体を含むことを特徴と
する特許請求の範囲第１５項記載の製造方法。 １９、上記フリー・ラジカルを生じる化合物がベンゾフ
ェノンからなることを特徴とする特許請求の範囲第１５
項記載の製造方法。 ２０、上記（ｉ）の工程における反応時間が２乃至１０
時間であることを特徴とする特許請求の範囲第１４項ま
たは第１７項記載の製造方法。 ２１、上記（ｉ）の工程における反応時間が１０分乃至
２時間であることを特徴とする特許請求の範囲第１５項
、第１８項または第１９項記載の製造方法。 ２２、上記の（ｉ）および（ｉｉ）の工程に加えて、 （ｉｉｉ）上記表面処理を施した重合物質を水性かつ非
求核性の緩衝溶液中、ｐＨ７．５から８．５の範囲内、
０℃から３７℃の範囲内の温度、および加水分解試薬の
存在下で、それぞれ有効なアミノ基を有する複数の分子
と処理することで、上記分子をそれぞれ上記ポリマー上
に分散している上記活性Ｚ基の一つに上記アミノ基によ
って共有結合させる、 工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１４項記
載の製造方法。 ２３、上記の（ｉ）および（ｉｉ）の工程に加えて、 （ｉｉｉ）上記表面処理を施した重合物質を水性かつ非
求核性の緩衝溶液中、ｐＨ７．５から ８．５の範囲内、０℃から３７℃の範囲内の温度、およ
び加水分解試薬の存在下で、それぞれ有効なアミノ基を
有する複数の分子と処理することで、上記分子をそれぞ
れ上記ポリマー上に分散している上記活性Ｚ基の一つに
上記アミノ基によって共有結合させる、 工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１５項記
載の製造方法。 ２４、上記加水分解試薬が、ウシ血清アルブミン、卵ア
ルブミン、非イオン性界面活性剤およびこれらの混合物
からなる群より選ばれる物質を含むことを特徴とする特
許請求の範囲第２２項またほ第２３項記載の製造方法。 ２５、上記有効なアミノ基を有する分子が抗体または抗
原を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２２項また
は第２３項記載の製造方法。 ２６、免疫検定法の処理方法において、特許請求の範囲
第１項、第３項または第４項記載の表面処理を施した重
合物質を用いて、抗原または抗体のアミノ基を上記重合
物質が有するポリマーに結合させることにより、上記抗
原または抗体を、上記重合物質と間に間隔を置いた関係
となるように固定化する方法。 ２７、有効なアミノ基を有する分子を固定化する処理方
法において、特許請求の範囲第１項、第３項または第４
項記載の表面処理を施した重合物質を用いて、上記分子
のアミノ基を上記重合物質が有するポリマーに結合させ
ることにより、上記分子を、上記重合物質と間に間隔を
置いた関係となるように固定化する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA453747 | 1984-05-07 | ||
| CA453747 | 1984-05-07 | ||
| US725708 | 1985-04-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61252215A true JPS61252215A (ja) | 1986-11-10 |
Family
ID=4127817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60097675A Pending JPS61252215A (ja) | 1984-05-07 | 1985-05-07 | アミノ基を有する分子の固定化用物質、その製造方法およびその使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61252215A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1985
- 1985-05-07 JP JP60097675A patent/JPS61252215A/ja active Pending
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| JPWO2017188346A1 (ja) * | 2016-04-27 | 2019-02-28 | 国立大学法人 東京大学 | マイクロファイバーを用いた血中循環細胞の捕捉及び回収用材料及び当該材料を用いる方法 |
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