JPS61171432A

JPS61171432A - 免疫原性蛋白質またはペプチド複合体からなるワクチン

Info

Publication number: JPS61171432A
Application number: JP60233152A
Authority: JP
Inventors: エドウアルド　コーエン　ベウベリイ; トム　テールリンク; アントニウス　ルドビクス　バン　ウエゼル
Original assignee: Nederlanden Staat
Current assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1984-10-19
Filing date: 1985-10-18
Publication date: 1986-08-02
Also published as: EP0182401B1; NL8403195A; CA1251396A; EP0182401A1; DE3571551D1; ATE44651T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗原性蛋白質またはペプチドに由来する免疫
原注複合体からなるワクチンに関する。

発明の背景人および動物の免疫のために、抗原として精製された細
菌およびビールスの膜蛋白質、または合成ペプチド、お
よび組換えＤＮＡ技術により製造された蛋白質の使用は
、全細胞またはその１部の使用にまさるある種の利点を
提供する。即ち、精製された蛋白質の使用は、望ましく
ないたとえばパイロジエンａ反応を生じる成分の排除を
許容する。

更に、蛋白質は、それらが−可能な限り排他的に　−望
ましい免疫原性質を所有し、そして更に同遺伝子型変化
を示さないように選択しうる。しかしながら、高度に精
製された膜蛋白質、特に細菌外膜蛋白質およびビールス
外皮糖蛋白質は、それらが一般的に低い免疫原活性しか
所有しないという欠点を有している。

抗原性蛋白質は、清浄剤と複合体を形成しうろことが知
られている。清浄剤は、蛋白質を可溶化するのに役立っ
ている。それら蛋白質清浄剤複合体のあるものは、実験
的免疫原として使用されてきた。即ち、ジャーナル・オ
プ・ジェネラル・バイｏｏジー（、Ｔ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ
ｏｌ　、）、６４．１５５７〜１５６９（１９８３）中
には、パラインフルエンゾロ型ビールスの蛋白質サブユ
ニットワクチンが記載されており、それはトリトン（Ｔ
ｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００を含有するワクチンを包含
している。この保父は清浄剤不言蛋白質を超える清浄剤
複合体のどのような利点も指摘していない。

ＥＰ−Ａ−９０６６０は、ナイセリア・ゴノロエアエ（
Ｈｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の主要
外膜から蛋白質重を分離しそして精製する方法、および
それから製造されたワクチンに関するものである。この
方法は、清浄剤からなる特異可溶化剤の便用を包含して
いる。すべての清浄剤は、ワクチンにおける蛋白質の使
用の前に非常に注意深く除去されている。

ＦＲ−Ａ−２４４６１１１（フランス特許出願第７９０
１３０１号）は、デオキシコール酸ナトリウム、リゾチ
ームおよびＫＤＴＡナトリウムを抽出剤として使用する
、微生物からの抗原性複合体の抽出のための方法を記載
している。デオキシコール酸ナトリウムは、ワクチン中
に残留する。

発明の要約抗原性蛋白質およびペプチドの免疫原活性は、屑〈べき
ことには、もしもそれらが吸着された清浄剤複合体の形
におけるものであるならば改善されることが見出された
。蛋白質またはペプチドを清浄剤と複合体化することに
より得られる免疫原活性の改善は、吸着剤上への清浄剤
複合体の吸着により、非複合体化蛋白質またはペプチド
が吸着剤上に吸者されたとき観察される効果から期待さ
れるよりはかなりより強力に増η口する。かくして、清
浄剤と吸着剤との組合せは、真の相乗効果をもたらす。

従って、本発明は、抗原性蛋白質またはペプチド、ｆ＃
浄剤および吸着剤からなるワクチンに関する。

“抗原性蛋白質またはペプチド（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐ
ｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ）”なる表現は、
抗原性の蛋白質性生成物、たとえば糖蛋白質およびポリ
サッカライド−蛋白質結合体を包含するものと理解され
るべきである。

詳細な記述および好ましい態様本発明は、ナイセリア・ｔノロエアエ（Ｎｅ１θ５ｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナ
イ−ｔＣす７−）’＝７ギチジｘ　（Ｎｅｉｇｓｅｒｉ
ａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ヘモフィルス−イン
フルエンザｘ　（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕ
ｅｎｚａｓ）に由来する外膜蛋白質の吸着された清浄剤
複合体により、そしてまた麻疹糖蛋白質の吸着された清
浄剤複合体により王に説明される。しかしながら、本発
明はそれらに限定されない。

良い結果は、特に淋菌または髄膜炎菌に由来するボリン
（ＰＯｒｉｎｅ　）蛋白質で得られた。それら外膜蛋白
質は他の免疫原注蛋白質にまさる利点を有しており、そ
れはそれらが膜中に多波に存在しているからである。た
とえば、ナイセリア・ゴノロエアエのボリン蛋白質ＰＩ
は、外膜上に存在する蛋白質の約５０％にのぼる。災に
、ＰＩがすべての髄膜炎菌株甲に存在し、そして最小の
同遺伝子型変化を示すことは利点である。また、分子の
１部分が膜から突出しており、それで抗体と反応するこ
とが可能である〇血清型１髄膜炎菌ＰＩ、５および９の抗血清は、かなり
の交叉反応性を示すようであった。従って、蛋白質成分
が多数の異った血清型、たとえば血清型１．５および９
に由来する髄膜炎菌ＰＩの混合物である吸着された蛋白
質複合体をワクチン中に合体させるのが有利である。ワ
クチンが９種の血ｉｎ型のすべてのＰＩと反応する抗体
の形成を誘導する結果となる。

本発明に従うワクチン中に存在する清浄剤の性質は臨界
的でない。清睡剤は、双性イオン性、カチオン性、アニ
オン性またはノニオン性清浄剤でありうる。

適当な双性イオン性（ベタイン）清浄剤の例は、ツビツ
ｐジエント（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ）　、ｆｓとえ
ばｚ６−１４とまた呼ばれ、その化学名が５−ＣＮ−テ
トラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−アンモニオ）−ゾロパ
ン−１−スルホネートであるツビツタジエント３−１４
、ならびにより短かいかまたはより長い炭化水素鎖を有
するその誘導体、たとえばＺ３−１０、Ｚ３−１２、Ｚ
３−１６およびｚ３−１８である。更に、Ｎ−ラウロイ
ル−ずルコシン（ずルコシル）を、適当な双性イオン注
清浄剤として示しうる。

セトリモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ　）が適当なカチ
オン性清浄剤の例であり、そしてジオクチルナトリウム
スルホサクシネー）　（ＤＯＮＳ）、ナトリウムドデシ
ルスルホネート（ＳＤＳ）およびデオキシコール酸ナト
リウム（ＤＯＯ）が有効なアニオン性清浄剤として示さ
れうる。適当な中性またはノニオン性清浄剤は、たとえ
ばｎ−オクチルグルコシド、トリドアＸ−１００、ライ
−ｙ　（Ｔｗｅｅｎ）　２　Ｑ、ツイーン８０、ブリジ
（Ｂｒｉｊ）　５２、ブリジ５８およびミルジ（Ｍ７ｒ
ｊ）　４５である。

清浄剤に対する抗原性蛋白質またはペプチドの比率は、
吸着された蛋白質またはペプチド／清浄　　　（剤複合
体の免疫原性質に影響を与える。この比率の一般的規則
は、最も高い免疫原性を与える比率が使用した特定の蛋
白質またはペプチド、そして特定の清浄剤に依ヶして変
化するらしいので与える−とができない。最適比率は様
々の比率で抗原お、ヒび清浄剤を含有する１連のワクチ
ンの免疫原活性を試験することにより容易に決定しうる
。たとえば、髄膜炎菌ＰＩ外膜蛋白質の場合、マウスに
おける免疫原活性は、清浄剤がＺ３−１４であるとき約
１：５から１　：　２．５までの蛋白質：清浄剤比率（
Ｗ／Ｗ　）で、清浄剤がオクチルグルコシドまたはＤＯ
Ｃであるとき１：５の比率で、そして清浄剤がＣ！ＴＡ
Ｂであるとき１：１から１　：　０．６までの比率で最
適であるように思われる。

本発明に従うワクチン中の抗原性蛋白質が淋菌外膜蛋白
ｊｉＩｔＰＩ、または淋菌ＯＭＰのＰＩの混合物である
とき、最良の結果は、清浄剤としてｚ３−１０、ｚ３−
１４、Ｎ−ラウロイルずルコシン、デオキシコール酸ナ
トリウム、トリトンｘ−ｉｏＯ、ツイーン２０およびブ
リジ５８で得られた。３群、１５型ＣＰ１．１６）髄膜
炎菌外膜蛋白質の組合せで使用される好ましい清浄剤は
、Ｚ３−１４およびデオキシコール酸ナトリウムである
。

本発明のワクチンにおいて便用される吸着剤は、ワクチ
ンに一般的に使用される吸着剤である。そのような吸着
剤の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムお
よびリン酸カルシウムである。

リン酸アルミニウムが好ましい。

以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明するためのも
のである。

例１淋菌菌株Ｂ２（血清型１）、０３（血清型５）およびＦ
６（血清型９）を常法で生育させた。培養物を５６℃で
６０分間加熱することにより不活性化させた。細菌を遠
心分離の後に凍結乾燥した。

細胞不言培養液を外膜複合体（ＯＭ（！　）の製造に便
用し、そして精製ＰＩは凍結乾燥した細菌から製造した
。

細胞不言培養液をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）中空繊維カ
ートリッジ（ＨｌｏＰｌｏ）上で８０倍に濃縮した。濃
縮物を遠心分離（１０，［］ＯＯＸ、？　；２０分間）
して、残留細菌かあれば除云した。ＯＭＣを遠心分！（
２時ｒ’ｄｌ；　１００．０００ｘ、？　）Ｌ、４ｖツ
トを３００　ｍＭ　ＮａＣＪ　−５０ｍＭ　）リス、ｐ
Ｈ７，２中に懸〜し、再び遠心分離（２時間；　１００
．ＯＯＸ、１し、そしてペレットを最後に蒸留水に懸濁
して、２■／ゴの蛋白濃度を得た。

ＰＩの精製単離方法は、ブレーク（Ｂｌａｋｅ　）およびコ９ット
シュリツヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）により蛋白質■の
ために便用された方法〔ジャーナル・オブ・エキスペリ
メンタル・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　）、１
５９．４５２〜４６２（１９８４））＆Ｃ基＾た。凍結
乾燥した淋菌（乾燥型！２．５＆）を、総容量２５〇−
における０、５Ｍ塩化カルシウム中の３−　（Ｎ−テト
ラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニオ）−グロバンー
１−スルホネート（Ｚ　５−１４　）　２．５ｇでｐｉ
−１４，０にお＾て抽出した。１時間後に、無傷のｍ廁
および破片を遠心分離（２０分間、ｉｏ、ｏｏ。

Ｘ、Ｍ）した。もしも必要ならば上澄液の−を希Ｈ（Ｊ
で４．０に再調節し、そしてエタノールを２０係の濃度
１で加えた。３０分後に、沈澱した物質を遠心分離（２
０分間、１０．０００ｘ、９）により除去した。上澄液
を限外濾過（アミコン中空繊維ＨＩＤＸ５０）により１
５０ｍ１ｍ濃縮し：５ＱｍＭ５Ｑｘ　−１Ｑ　ｍｙｔ　
ＫＤＴＡ−０，０５％（Ｗ／ｖ）　ｚ　３−１４、ｐ）
１８．０（バッファーＡ）１５０−を加え、そして容量
を半分に減少させ；この操作を５回繰返してＣａｃｊ□
およびエタノールの除去を完全にした。その後、蛋白質
溶液を、バッファーＡで平衡化したＤＦｊＡＫ−セファ
ロースカラム（５０ｘ　１．８ｃＷＬ）に適用した。蛋
白質をバッファーＡ中の０．０から０．６　ＮａＣｊま
での線状グラジェント（２Ｘ４００−）で、５０ｍ／時
間の流速において溶出した。

結果な第１図に示す。両分を８ＤＢ−ＰＡＧＦｉにより
分析し、そしてＰＩ言有両分をためた。この生成物は部
分精製ＰＩと呼ばれる。

部分精製ＰＩを、５０　ｍＭ　−）リス−２００ｍＭＮ
ａＣＪ−ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＫＤＴＡ−０，０５％　（Ｗ／
Ｖ）Ｚ　５−１４、−７．２で予め平衡化したセファク
リルＢ−５００カラム（８０×５．６ｃｍ）に適用した
。カラムを５０−７時間の流速で溶出した。結果を第２
図に示す。ＰＩ含有画分をため、そして防腐剤として０
．０２％（Ｗ／Ｖ　）ナトリウムアチドを加えて４°Ｃ
０で貯蔵した。この段階で得られた生成物は、精製ＰＩ
と呼ばれる。

分析方法蛋白質は、ペターメン（ｐｅｔｅｒｓｏｎ）　（アナリ
チカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）、リー、６４６〜３５６（１９７７））により
変形され、ジャーナル・オデ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃ＋ｈｅｍ、）、１９３．２６
５〜２７５（１９５１）に記載されたローリ−（ＬＯＷ
ｒ７）の方法により、標準としてウシ血清アルブミンで
決定した。ケトデンキシオクタノエート（ＫＤＯ）は、
。

カルカニス（Ｋａｒｋｈａｎｉｓ）等の方法〔アナリチ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　）、８５．５９５〜６０１（１９７８）］に従い、
標準としてＫＤＯを使用して検定した。８Ｄ８−ＰＡＧ
Ｅは、レムリー（Ｌａ０ｍｍ１ｉ）により記載〔ネーチ
ュア（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７．６８０〜６８５　（１
９７０））された如くに遂行した。

生物学的活性家兎における発熱性試験のために、ヨーロッパ薬局方■
、５３〜６１頁（１９７１）のプロトコールを使用した
。

ＩＴ、＋工８Ａ方法血清検体の抗体水準の決定のために、マイクロタイター
プレートを、Ｑ、ｉ　５　Ｍ　Ｎａ（Ｊで希釈したＯＭ
Ｃで、１０μｇ／−の蛋白濃度に被僅した。

ＥＬＩＳＡの引続く工程は、インフエクシャス・イミュ
／Ｈジー（工ｎｆｅｃｔ、工ｍｍｕｎ、）、４０．３６
９〜３８０　（１９８３）中に記載された如く遂行した
。工ｇＧ抗体水準は随意（ａｒｂｉｔｒａｒ７）抗体単
位で表わした。

Ｚ！ｔ−１４を富有するバッファー中の精製ＰＩを８０
％エタノールで沈澱させた。蛋白質ペレットを８０％エ
タノールで１回洗滌して、残留Ｚ３’−１４を除去した
。蛋白質ペレット（１００μｇ）ニ０．９％（ｗ／ｖ）
　ＮａＣＪ中の清浄剤の１０ｍｙ／ｍ浴液０．０５−を
加え；１６時間のインキュベーショ７０間の後、０．９
　％　（Ｗ／Ｖ）　ＮａＣＪ浴液０．９５−を加え、そ
して検体を簡単に超音波処理（６０秒間、６０Ｗ）した
。免疫処置の前に、検体を次の最終濃度に希釈した：蛋
白質：５μｇ／−；清浄剤：２５　ｐｇ／　ｗｌ　；　
ＮａＣＪ　：　　９１１１１／　ｗｄ。若干の検体には
、Ａ１ＰＯ４懸濁液を最終濃度０．５μｇ／−に加えた
。

マウスの免疫無作為飼育マウス８匹からなる群に、Ｐニー洗浄剤複合
体０．５−を腹腔内（１，１）、）注射した。４週間後
に、マウスを出血させ、そしてためた血清の抗体水準な
ＩＴ、＋ＩＳＡにエリ決定した。

結果ＰＩは、細菌懸濁物から、ＣａＣｌ２の存在において、
Ｚ！１−１４によりｐ）４４．０で効果的に可溶化され
た。細菌１．９（乾燥重量）当り１ｇのＺ３−１４を、
蛋白質的１００ｑの可溶化のために使用した０２０％エ
タノール沈澱工程の後、エタノールおよびｃａＣ１２を
上置液から限外濾過により除去した。

蛋白質を引続いてＤＩ！１ＡＫ−セファロースカラムに
適用し、そしてＮａ（Ｊグラジェントで溶出した（第１
図）。部分精製ＰＩが、０．４モルにおいて対称注ぎ−
クとして浴出した。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の
溶出プロフィルをまた、ＫＤＯの検定により決定した。

第１図は、ＫＤＯビークの頂上がＰＩぎ−クのそれに先
んすることを示している。

しかしながら、両成分の完全な分離は、このカラム上で
は達成しえなかった。引続くセファクリルＳ−３００上
のｒル透過クロマトグラフィは、両成分のさらに先の分
割を提供した（第２図）。

ＰＩは対称注ぎ−ク（画分６４から６８まで）として溶
出し、若干の低分子量蛋白質および大量のりボボリサツ
カライドを含有する第２のピークが引続＾た。８ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析は、第１のピークが基本的に純粋なＰＩで
あることを明らかにした。

細菌２．５ＩＣ乾燥重量）から出発して、ＰＩ収量は通
常２０から５０１１ＩＩまでの間であった。表Ａは、　
　　す蛋白質およびＫＤＯについての言及を包合し、典
型的精製方法の結果の要約を示す。

精製Ｉ’ｍの分析および生物学的活性部分精製ＰＩのＫＤＯｉ量は、１５から５０μｇＫＤＯ
／■蛋白質の間にあった。セファクリルＳ−３００上更
に精製の後、この値は６から７ｇｇＫＤＯ／ｗｑ蛋白質
までに減少した。ＰＩの分子量を！＋４．０ＧＯと推定
して、これは蛋白質に対するＫＤＯのモル比が１に相当
する。精製ＰＩは、家兎体重１′にｇ当り２５　ｎｇの
蛋白質用址において発熱性−試験を通過した。

３種の異った条件において、ＰＩによるマウスにおける
抗体の誘導を試験した。それら条件は、（ａ）　Ｚ　３
−１４中の精製ｐｘ、（ｂ）ｚ３−１４がオクチルグル
コシドにより１を換された製剤、および（０）清浄剤な
しのＰＩであった。１回の注射の後に得られ、ためた血
清検体を、均一なＯＭＣが抗原としての役割を果たすＥ
ｉＬＩ８Ａで試験した。第６図は、各種検体の相対抗体
水準を示す。両方の清滌剤が精製ＰＩの免疫原活性を著
しく高めることは明らかである。Ｚ３−１４およびオク
チルグルコシドを含有する製剤の闇に有意の差は観察さ
れなかった。しかしながら、清浄剤の不存在において、
Ｐｌは劣った免疫原であった。そこで、Ｐｌの免疫原活
性に対する他の洗浄剤の影響を試験した。

表Ｂは免疫実験の結果を示す。

表Ｂマウスにおける、淋菌ＰＩ外膜蛋白質の免疫原力ナシ　
　　　　　　　６，３　　　　　０．４簀ｚ３−１０　　　　５５．４　　　　　　ｎ、ｔ。

Ｚ３−１２　　　　３０．４　　　　　　ｎ、ｔ。

ｚ　３−１４　　　　４５．３　　　　　６．９Ｚ　３
−１６　　　　１７．５　　　　　　ｎ、ｔ。

Ｚ３−１８　　　　３２．３　　　　　　ｎ、ｔ。

すゞルコシル　　　　　８５．７　　　　　　　ｎ＋ｔ
。

ＣＴＡＢ　　　　　　　　１４．８　　　　　　１．０
ＤＯＮＳ　　　　　　　　２６．４　　　　　　１．４
ＳＤＳ　　　　　　　　　３６．８　　　　　　　ｎ−
ｔ。

ＤＯＯ５２，Ｏｎ、ｔ。

オクチルグルコシド　　　３８，８　　　　　　　１３
．６トリトンＸ−１００６２，Ｉ　　　　　　　　ｎ、
ｔ。

ツイーン２０　　　　　　　４８．４　　　　　　　　
ｎ、ｔ。

ツイーン８０　　　　　　　３７．Ｏｎ、ｔ。

ブリジ５２　　　　１７．Ｉ　　　　　　ｎ、ｔ。

ブリジ５８　　　　４５．９　　　　　　ｎ、ｔ。

ミルジ４５　　　　　２７．Ｉ　　　　　　　ｎ、ｔ。

骨ｎ、ｔ、＝試験せず免疫原組成：蛋白質　　　　５μｇ／＋＋を清浄剤　　
　２５μｇ／ｄＡｉＰ０４　　　５００μｇ　／１ｗＮａ（Ｊ　　　　　　９ｗ／ｖ用量＝０．５−腹腔内１群８匹試験したすべての清浄剤は、Ｐｌの免疫原活性を高めた
。この効果は、蛋白質−清浄剤複合体をＡＪｌＰｏ、に
吸着させたとき相乗的に増７ＪＩ］した。

蛋白質−清浄剤比率の影響を４種の清浄剤で試験した（
表Ｃ参照）。

表Ｃマウスにおける、吸着された淋菌Ｐｌ外膜蛋白質の免疫
原力価に対する蛋白質−清浄剤比率の影響清浄剤　　　
　　比率（蛋白ｉｆ［／清浄剤（ｗ／ｗ　）　）１：５
　　１：２．５　　１：１．２５　１：０．６２Ｌ体単
位ｚ　３−１４　　　１７０．８　１７４．５　１７０．
５　１０８．７オクチルグルコシド　　１１６．２　　
　７４．８　　　４４．９　　　２７．８ＤＯＣ１４７
，４１０１，５７２，５９７，３０ＴＡＢ　　　　　　
　　　３１．９　　　７９，９　　　　７７．７　　　
９９．０清浄剤なしの対照：　　２４．２免疫原組成二ＰＩ蛋白質＝　　　　５μｇ／−清浄剤：
　　　　　　３．１２〜２５μｇ／−Ｍｐｏ４　　：　
　　　　　５００μｇ／ｄＮａ（Ｊ　　：　　　　　　
　　９ｍＡ／１ｒＬｔ用量二０．５−腹腔内１群８匹試験した最低清浄剤濃度において、４種の清浄剤すべて
が抗体応答を高めた。Ｚ３−１４、オクチルグルコシド
およびデオキシコレートの場合において、刺激効果は最
高清浄剤水準において増加した。清浄剤ＣＴＡＢでは、
反対の効果が観察された。

例２髄膜炎菌菌株Ｈ４４／７６［Ｂ：１５：Ｐｌ、１６　レ
ビュー・オブ・インフエクシャス・テ１シーズ（Ｒｅｖ
、　１ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ８．）、７．５０４〜５１０
（１９８５））を、培養器中で培養した。培養物を５６
′Ｃで６０分間加熱することにより不活性化した。遠心
分離の後、細菌をため、そして凍結乾燥した。細胞不言
培養液を、ＯＭＯの製造のために使用した。

ＯＭＯの製造、ならびにクラス１および３のＯＭＦの組
合せの精製を、例１に提示した方法に従い遂行した。

分析法および生物活性分析法および発熱活性の測定は、例１に記載した如くで
あった〇抗体の検定ＫＬ工ＳＡ技術およびウェスタン・プロッティング技術
（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ）の両方について、ＯＭＯを抗体の検定のための抗原
として使用した。ＥＬ工ＳＡ技術は、例１に記載した如
くに遂行した。ウェスタン°ブロッティング技術は、各
種外膜蛋白質をニトロセルロース紙に移し、そしてマウ
スからの血清検体、マウスエｇａ　１　＋２に対するパ
ーオキシダーゼ結合抗体、および基質と連続インキュベ
ートすることにより行った。

無作為飼育マウス８匹からなる群に、遊離状態およびｕ
ｐｏ４に吸着の両方で、各種清浄剤ミセル中にまたは凝
集物として存在するＯＭＦ組合せを腹腔内に注射した。

各種ＯＭＰ−清浄剤ミセルの製造は、例１に記載した如
くに行った。

結果ＯＭＦ組合せの特徴づけＯＭＣおよび精製ＯＭＦの組合せを５ＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析し、それは精製ＯＭＦ組合せが　−クラス１お
よび３のＯＭＦに加えて一少量の７７　ＫｄＯＭＦおよ
びクラス４　ＯＭＦを含有することを明らかにした。

精製ＯＭＦ組合せのＫＤＯ含量は、蛋白質１■当り約５
０μｇＫＤｏであった。組合せは家兎体重１ゆ当り２５
　ｎｇの蛋白質用量において、発熱性試験な通過した。

マウスの群に、異った条件においてＯＭＦ組合せを注射
した（表り参照）。１回の注射で得られ、ためた血清検
体を、ＫＬ工ＳＡおよびウェスタン・プロッティングで
試験した。結果を表Ｄ（ＫＬ工ＳＡ）およびＩ！４図（
ウェスタン・プロッティング）に示す。表りは、各檀清
浄剤（よる組合せの免疫原　　　１活性の少ない刺激お
よび清浄剤に吸着剤を加えることによる著しい刺激を示
している。

表Ｄマウスにおける、髄膜炎菌３群、１５型（Ｐｌ、１６）
外膜蛋白質組合せの免疫原力価に対する清浄剤および／
’−Ｑ　ＰＯ４の添加の効果。抗体はＥＬ工ＳＡ技術で
検定した。

ナシ　　　　　　　　８．７　　　　　ｎ、ｔ。

ｚ３−１４　　　　１１．９　　　　１．２ＤＯＣ１８
，０１，３オクチルグルコシド　　　１２．７　　　　　　２．２
トリトンＸ−１００１０，５ｎ、ｔ。

”ｎ、ｔ、　＝試験せず免疫原の組厄および用量、表Ｂ参照第４図において、クラス１および３のＯＭＦは、それぞ
れａおよびｂｏ）位置に帝として現われた。

この図は、ＤＯＯおよびＡｕＰＯ４の組合せが、他の組
合せと異って、ＯＭＦ組合せと一緒での注射後に、クラ
ス６のＯＭＦに幻する抗体を刺激しうろことを示してい
る。

第４図中のレーンは、次の生成物に関するものである：１、蛋白質＋Ａ１ＰＯ４２、蛋白質中２３−１４　＋ＡｆＰＯ４６、蛋白質中２
３，１４４、　蛋白質＋ＤＯＯ＋　／’ｕＰＯ４５、蛋白質＋Ｄ
ＯＯ６、蛋白質中オクチルグルコシド＋Ａ１．ＰＯ４Ｚ　蛋
白質中オクチルグルコシド８、　蛋白質中トリドアＸ　−１００＋ＡｆＰ０゜９　
対照ｎ（非免疫処理群）例６髄膜炎菌菌株Ｍａ１９（ジャーナル・オプ・インフエク
シャｘ−デジーズ（Ｊ、　１ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）
、Ｌス９，１４７〜１５３（１９７４）］およびヘモフ
ィルス書インフルエンデエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕθ□
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　□１ｎｆｌｕｅｎｚａｓ　
）　ｂ　Ｗ　ｌｆｌｇ　７　Ａステルダム〔アムステル
大学、パンアルフエｙ％±（Ｄｒ、Ｌ、　ｖａｎ　Ａｌ
ｐｈｅｎ）により提供された〕を培養器中で培養した。

培養物を５６°Ｃで３０分間加熱することにより不活性
化した。遠心分離の後、細胞不言培養液を髄膜炎精製髄
膜炎菌Ｃ一群ポリサッカライド（Ｐｓ）は、細胞不言培
養液から、ダブリュー・エイチ・オー・テクノロジー・
レポート（Ｗ　Ｈ００Ｔｅｃｈｎ、　Ｒｅｐ、）Ｂｅｒ
、　５９４．５０〜７５（１９６７）中に記載された如
くに製造した。ヘモフィルス・インフルエンザより型Ｏ
ＭＦは、例１に記載した方法に従い精製した。ツビッタ
ジエン）３−１４中＆Ｃおｆｆ６Ｃ−詳ＰＳとへモフィ
ルス・インフルエンザよりｇの結合のための条件および
結合体の精製は、結合体化の後に反応を停止させなかっ
た相違を有して、ｇ−ヘ１７　　（１３θｕｖｅｒｙ）
等によりイン７エクシヤス・イミュノロジー（工ｎｆｅ
ｃｔ、工ｍｍｕｎ、）、４０，３９〜４５（１９８３）
中に記載された如くに行った口分析法蛋白質は、例１に記載した如くに決定した。　Ｃ一群ｐ
ｓは、スベンネルホｋ　ム（ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｘｍ）
の方法〔ビオキミカ・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ）、２４．６
０４、（１９５７））により、標準としてＮ−アセチル
ニューラミン酸で検定した。

Ｃ一群ＰＳの抗体は、イン７エクシヤス・イミュノロジ
ー（工ｎｆｅｃｔ、工ｍｍｕｎ、）、４０．６６９〜３
８０（１９８３）に記載された如くに、ＥＩ、工８Ａで
検定した。

マウスの群に、例１に記載した如くに、結合体を、洗清
剤と共におよびそれなしで、そしてＡＪ、ＰＯ４と共に
およびそれなしで注射した。免疫原は、例１に記載した
如くに製造した。用量は、Ｃ−″詳ＰＳ２．５μｇにの
ぼった。

結果結合体の個々の成分および結合体の特徴づけＮ　Ｉ！　
Ｃ一群ｐｓｔｉ、Ｃ一群Ｐ　Ｓ　ニツイテノＷＨＯ（Ｆ
）最低要求〔ダブリュ・エイチ・オー・テクノロジー・
レポート（Ｗ　ＨＯＴｅｃｈ、　Ｒａｐ、　）、ｓｅｒ
、　５９４．５０〜７５（１９６７）］に、］０−アセ
チルが検出できなかったことを除き適合した。ヘモフィ
ルス・インフルエンザ二ｍ１ｌＬｌｌＣパンアルフェア
ｔｌ±（Ｄｒ、　ｖａｎ　Ａｌｐｈｅｎ）から提供され
た〕および精製ＯＭＰは５Ｄ８−ＰＡＧＥにより分析し
た。精製ＯＭＦは蛋白質ｂｃを官有した〔ジャーナル・
オデ・バクテリオロジ−（Ｊ、　ＢａＣｔｅｒｉＯｌ、
）、１５５．８７８〜８８５（１９８３））。結合体は
、はぼ等量のｐｓと蛋白質とから構成されていた。

マウスの群に、各種条件において結合体を注射した（表
Ｅ参照）。１回の注射で優られ、ためた血清検体を、Ｋ
Ｌ工ＳＡで試験した（表Ｅ）。結果は、清浄剤および吸
着剤の組合せが、結合体のｐｓ酸成分対する抗体応答に
相乗的に作用することを示している。

表Ｅマウスにおける、Ｃ詳髄膜炎菌ポリサッカライＶ／ヘモ
フイルス・インフルエンザエ外ｉ蛋白質結合体の免疫原
力価に対する清浄剤およびＡ１ＰＯ４添加の効果 −０５０，７ｚ　３−１４　　　　　　３．１　　　　　　０．１デ
ルコシル　　　　　２９　　　　　０．９ＤＯＯ３，３
０，４ＣＴＡＢ　　　　　　　　　２．５　　　　　１．２例
４エドモンストン（Ｅａｍｏｎｓｔｏｎ　）　株麻疹ビー
ルスの斑変種（ｐｌａｑｕｅ　ｖａｒｉａｎｔ）を、ミ
クロタイター培地中のペロ細胞（ｖｅｒＯ０（３１１）
中で製造した。ビールス懸濁液を濾過し、そしてアミコ
ン中空繊維（ＨｌｏＸｌｏｏ）限外濾過により濃縮した
。ビールスＰ、膚白寅な、１０　ｍＭ　−トリｘ　−Ｈ
ｒＪ　ＰＨ７，８，１５０ｍＭＮａｃｚ、６００ｍＭＫ
Ｃｌ−１０，１ＬＱＭ　ＭｇｆＪ２．２％（Ｖ／Ｖｌト
リトトリ−１００および１ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド中で可溶化しりしジャーナル・オプ・ジ
ェネラル・パイロロジ−（Ｊ、　ｇθｎ、　Ｖｉｒ＋）
１．）、６５．６５５〜６６６（１９８４）’：］。可
溶化および限外濾過（１００，０００Ｘ　、９．６０分
間）の後、融解蛋白質を上澄液からアフイニテイクロマ
トグラフイにより除去した。この終末において、融解蛋
白質に対するモノクロナール抗体は、セファロース４Ｂ
に共有的に結合していた。融解蛋白質を、２３　ｍＭト
リス−ＨＣＬ　ｐｊ（７，８，１ｍＭ　］ｆｌＤＴＡお
よび０．１　％（ｗ／ｖ）オクチルグルコシド中の５　
Ｍ　ＮＨ，ＳＯＮを使用することにより脱着させた。精
製された融解蛋白質を官有するＮＨ，ＳＯＮ　浴出液の
ためた両分を透析した。透析した画分な蛋白質につき検
定し〔アナリチカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、７２．２４８（１９７６）］、
５ＤＥＩ−ＰＡＧＥにより分析しく例１参照）、そして
−７０°Ｃで貯蔵した◎ＫＬＩＳＡ法マウスから、製剤を含有する各種融解蛋白質の注射後に
得られた血清検体を、ＫＬ工ＳＡで検定した。ミクロタ
イター・プレートは、次の工程の後に得られた精製し、
不活性化した麻疹ビールスで被覆した：ａ）ビールス懸
濁液の濾過、ｂ）懸濁液の濃縮、Ｃ）セファロース０ｎ
−６Ｂ上、ｌＩ！！！濁液のデル濾過、ｄ）６−ヒトロ
キシデロビオン酸ラクトンでのビールス懸濁液の不活性
化および凍結乾燥。

再構成されたｇ濁液を、赤血球を溶解するその力価につ
き試験した。この実験の結果は、懸濁液が赤血球の溶解
において完全に活性であったことを示している。

マウスの免疫マウスの詳の免疫処理を、例１に記載した如くに遂行し
た。マウスに、Ｚ３−１４ミセル中に存在するかまたは
普通の（ｐｌａｉｎ）および吸着された　　　（状態に
おける凝集物としての融解蛋白質を注射した。免疫原は
、例１に記載した如くに製造した。

注射敵は、蛋白質２．５μｇであった。

結果精製融合蛋白質の特徴づけビールス懸濁液、トリトンｘ−ｉｏｏ処理後の上澄液お
よび精製融解蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製融
解蛋白質製剤が殆んど排他的にこの蛋白質から構成され
ていることを明らかにした。ヘムアグルチニンは検出で
きなかった。

精製融解蛋白質の免疫原活性マウスの群に、精製融解蛋白質、およびＡＡＰＯ４との
組会せおよび吸着剤なしにおけるＺ６−１４ミセルとし
ての融解蛋白質を注射した。１回の注射後に得られ、た
めた血清検体を、ＫＬ工ＳＡで試験した。この試験の結
果を第５図に示し、そして組合せ清浄剤および吸着剤は
融解蛋白質による抗体応答に対し相乗的に作用すること
を示している。

第５図において、′Ｆ″は、融解蛋白質を意味している
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の蛋白質のＤＥＡＲ−セファロースカ
ラムクロマトグラフィの溶出曲線を示し；第２図は、第
１図に示したクロマトグラフィにより得られた部分精製
ＰＩのセファクリルＳ−６００カラムクロマトグラフイ
の溶出曲線を示し；第３図は、精製ＰＩの免疫原活性に
及ぼす清浄剤ｚ３−１４およびオクチルグルコシドの影
響を示し；第４図は、本発明の蛋白質と清浄剤および（または）吸
着剤の組合せのウェスタン・プロッティングの結果を示
し、第５図は、融解蛋白質それ自体、ならびに融解蛋白質と
清浄剤および（または）吸着剤の組合せのＥＬＸＢｋの
結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）１種もしくはそれ以上の抗原性蛋白質またはペプ
チド、清浄剤および吸着剤からなる、ワクチン。
（２）抗原性蛋白質が淋菌外膜蛋白質ＰＩである、特許
請求の範囲第１項のワクチン。
（３）抗原性蛋白質が多数の異つた血清型に由来する淋
菌ＰＩの混合物である、特許請求の範囲第１項のワクチ
ン。
（４）抗原性蛋白質がＢ群１５型髄膜炎菌外膜蛋白質組
合せである、特許請求の範囲第１項のワクチン。
（５）抗原性蛋白質が髄膜炎菌Ｃ群ポリサッカライド／
￥ヘモフイルス￥・￥インフルエンザエ￥外膜蛋白質結
合体である、特許請求の範囲第１項のワクチン。
（６）抗原性蛋白質が麻疹ビールス融合蛋白質である、
特許請求の範囲第１項のワクチン。
（７）清浄剤が双性イオン性、カチオン性、アニオン性
またはノニオン性清浄剤である、特許請求の範囲第１項
のワクチン。
（８）清浄剤がツビツタジエントＺ３−１０、ツビツタ
ジエントＺ３−１４、Ｎ−ラウロイルザルコシン、デオ
キシコール酸ナトリウム、トリトンＸ−１００、ツウイ
ーン２０およびブリジ５８からなる群から選択される、
特許請求の範囲第２項または第３項のワクチン。
（９）清浄剤がツビツタジエントＺ−１４およびデオキ
シコール酸ナトリウムからなる群から選択される、特許
請求の範囲第４項のワクチン。
（１０）吸着剤がリン酸アルミニウム、水酸化アルミニ
ウムまたはリン酸カルシウムである、特許請求の範囲第
１項のワクチン。
（１１）吸着剤がリン酸アルミニウムである、特許請求
の範囲第１０項のワクチン。