JPS6043333B2 - 抗炎症活性物質の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、炎症性疾患の治療に用いられる抗炎症活性物
質の製法に関するものである。

生体の有する自己防御機能の一つとして、炎症に対し治
療作用を示す自己物質が存在するとの仮説が提出されて
いる。

例えばこの物質は血漿中に存在して分子量数百の低分子
物質であるとされている（特開昭５０−８２２１４）が
、その物質の精製は充分にはなされておらず、物理化学
的性質についても未だ明らかではない。本発明者等は、
啼乳動物の体液より、かゝる低分子抗炎症物質とは異な
る分子量の抗炎症物質前駆体（分子量１０００〜１００
００）を分離し、これを高分子化することにより、抗炎
症活性物質に変え、−その精製を容易ならしめることに
成功し、本発明を完成した。

本発明によれば、抗炎症活性物質は啼乳動物の血清、血
漿、炎症性滲出液、乳汁、唾液などの体液を、ます限外
ろ過して高分子の蛋白質、糖質を除いた低分子の限外ろ
過液を取り、そのカルシウム濃度を低下させることによ
り同分画中の低分子抗炎症活性物質前駆体を高分子化さ
せ、再び限外濾過によりろ過されない高分子化した抗炎
症活性物質を分画し、次いでゲル濾過クロマトグラフィ
ー処理により活性分画を取り、更に弱塩基性イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよ
び弱酸性イオン交換クロマトグラ’フィーを行うことに
より、高度に精製された電気泳動的に単一な物質として
得ることができる。

この物質は糖質を主成分とし一部アミノ酸を含む糖蛋白
と考えられ、カラゲニン浮腫に対し静脈内投与で強力な
抗炎症活性を示す。又、ラットのＣＭＣ（カルボキシメ
チル−セルロース）嚢法を用いた生体内の白血球遁走試
験では、静脈内投与により強い遁走阻害活性を示し、生
体外のポイデン・チャンバー（Ｂ（）ｙｄｅｎＣｈａｍ
ｂｅｒ）を用いた遁走試験でも同物質の共存により白血
球遁走を著しく阻止する。本発明を実施するに当つて、
出発原料としては、啼乳動物の体液例えば人、牛、豚、
羊、ラット、モルモツトなどの血液、ラットの実験的炎
症部位への滲出液、又は分泌液として人、牛、馬あるい
は豚などの乳汁、唾液等が用いられるが、多量の原料入
手の点を考慮すると、牛、馬、豚等大動物家畜の血液及
び乳汁が最適である。

以下に分画、精製法について各段階毎に説明を加える。

〔第１段階〕原料は、まず低温遠心分離操作により血球
、脂質等を除き、次いで高分子蛋白等を除く目的で限外
泊過を行う。

以下の操作はできるかぎり４℃付近の低温室にて行う。
限外ろ過には例えば、アミコン社（ＡｍｉｃＯｎＣＯ．
）製ダイアフロー装置を用い、フィルターとしてはＵＭ
−１０等分子量１万以下のものを通過させるものを使用
すると有利である。又、同じくアミコン社製のフオロー
・ファイバー装置（ＤＣ−２型、ＨＩＤＰ−１０）を用
いると大量の原料処理が短時間にでき更に好適である。
例えば、血清を限外沖過する場合、まず細菌繁殖を防止
する意味で、１％ナトリウム・アザイド（ＮａＮ３）を
１１１０喀量加え、透析、希釈等の操作を加えることな
く直ちに限外沖過器にかける。この過程で、透析や希釈
を行い液のカルシウム濃度が低下すると（約５ＴｒＬｇ
％以下）、抗炎症物質前駆体の一部は高分子化し、限外
枦過器より流出せず収量が低下する。又、限外枦過は内
容物濃度上昇による高粘度のための時間と共に速度が低
下するので、原料の１１２〜１Ｂ容量が沖過された時点
で終了するのが好適である。沖過された低分子分画は凍
結により保存することができる。〔第■段階〕 この限外ｐ過された低分子分画中の抗炎症活性物質前駆
体について、共存するカルシウム・イオンの低下による
高分子化操作を行なう。

即ち、水等による希釈、透析又はカルシウムを除くよう
なキレート剤例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸
）、ＧＢＤＴＡ（グリコールエチレンジアミン四−酢酸
）等の添加により高分子化が起り、再度の限外沖過（Ｕ
Ｍ−１蒔）で？液中に出なくなる。高分子化はカルシウ
ムイオン濃度５ｍ９％で充分に起り、血清（カルシウム
を約１０ｍ９％含む）を例にとれば、その限外Ｐ過液を
水で２倍に希釈するのみ−てよい。但し、高分子化を確
実にする意味で３〜４倍希釈を用いる方が有効である。
この低カルシウム化した分画を限外淵過（ＵＭ−１０，
．ＵＭ−２等のフィルター）し、今度は枦過されずに残
つた高分子分画を採取する。この低カルシウム化による
高分子化過程と、それに続く限外ろ過濃縮過程で目的の
抗炎症活性物質を著しく精製することができる。本発明
の特徴は一つはこの過程にある。〔第■段階〕抗炎症活
性物質を含む第■段階の濃縮液をゲル洒過クロマトグラ
フィーにかける。

ゲル沖過には、セスアデツクスＧ−７５等（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘｌＰｈａｒｍａｃｉａＣＯ．）の架橋テキストラ
ンが有効に用”いられる。又、展開溶液としては、０．
９％の食塩水等の生理的条件に近い塩溶液を用いられる
。クロマト・カラムよりの溶離液は一定量づつ分取し、
その２７５ｍμ附近の紫外線吸収を目安にクロマトグラ
ムを書くと、抗炎症活性物質は第１のピーク附近に存在
し、ほとんど間隙容積（ＶＯｉｄｖＯＩｕｍｅ）直後に
溶出することが分かる。この第１ピーク及びその後部に
流出する裾野の部分を広く採取し、ＵＭ−２等のフィル
ターで限外淵過して活性物質を濃縮する。〔第■段階〕 第■段階の濃縮液を弱塩基性イオン交換体例えばＤＥＡ
Ｅ−セルロース（ジエチルアミノエチル−セルロース、
ＳｅｆｖａＣＯ．製）などを用いるイオン交換クロマト
グラフィーにかける。

このイオン交換体をあらかじめ低イオン強度の弱酸性緩
衝液例えば０．０５Ｍ，．ＰＨ５．８の酢酸緩衝液など
で緩衝化しておき、そのクロマトカラム上へ、第■段階
の濃縮液を吸着させる。この場合、濃縮後の塩濃度を０
．１Ｍ食塩水になるように調整しておく。吸着させた後
、０．２Ｍの酢酸緩衝液（ＰＨ５．８）を充分に流し２
７５７Ｔ１．μ紫外部吸収を指標として溶離するものを
できるかぎり除いた後、１Ｍの同緩衝液に換え濃縮溶離
する分画を集める。この分画に抗炎症活性物質が存在し
ている。〔第■段階〕 第■？階の１Ｍ溶離分画をゲル淵過する。

ゲル沖過は、第■段階よりも更に架橋度のあらい網目構
造の大きなもの例えばセフアデツクスＧ−２００などが
有効である。ゲル淵過クロマトグラフィーは第■段階と
同様に行い、抗炎症活性物質が流出する第１ピークを集
める。限外枦過（ＵＭ−１０、■−２等）で濃縮後、水
にて充分に透析して脱塩し、透析内液は凍結乾燥し低温
保存する。第■段階までの精製により抗炎症活性物質は
極めて高度に純化されるが、更にもう一段階精製過程を
おいてもよい。即ち、弱酸性イオン交換体例えばＣＭ−
セフアデツクス（カルボキシメチルーセフアデツクス）
などのカラムを通す第■段階である。〔第■段階〕 第■段階での第１ピークを水で透析したものをＣＭ−セ
フアデツクスを用いるイオン交換クロマトグラフィーに
かける。

ＣＭ−セフアデツクスはあらかじめ低濃度の緩衝液例え
ば０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．８）て緩衝化してお
き、活性分画を上部にのせた後０．０２ｒ！４の同緩衝
液を流して非吸着溶離してくるものを集める。この中に
抗炎症活性物質が含まれており、限外？過で濃縮後水で
充分透析し凍結乾燥することにより、目的の活性物質を
得ることができる。次に実施例をあげて本発明の方法を
更に具体的に説明する。

実施例１ 牛血液より抗炎症活性物質の分画、精製 牛血液１８０ｅを静置して凝固させ、５℃前後の低温放
置て血清を充分に分離させた後血餅を除去する。

血餅を除去した血清分画中の血球は遠心分離にて除く。
この場合、ドラバール型連続遠心機例えばバーチエス（
Ｂａｒｃｅｓ）遠心機などを用い、回転数を５０００ｒ
．ｐ．ｍで行えば能率よく透明な血清が約６０′得られ
る。血清に殺菌剤としてナトリウム・アザイドを最終０
．０１％になるように加え、限外淵過操作を行う。アミ
コン製ハイフローセル型ｐ過機（又はバイオエンジニア
リング社製．ダイアフィルターＭＣ−６型機）を用い、
フィルターは直径１５０Ｔ０ｔ（７）ＵＭ−１０を使用
し、窒素−ガス加圧下（４ｋ９１ｃｆ１）に行う。ＵＭ
−１０フィルターを通過するものは分子量約１万以下の
ものであり、約４８′が得られた。この淵液を水で４倍
に希Ｊ釈する。この希釈過程て低分子の抗炎症活性物質
前駆体は高分子化し、次の限外淵過ではフィルターを通
過しなくなる。この段階では、約２００ｅと処理量が多
いので、アミコン製フオロー・ファイバー（ＤＣ−２型
、ＨＩＤＰ−１０）を用いると能率が・よい。この様に
して通過するものを除き、通過しない高分子物質を濃縮
して３０ｍ１にまでする。この場合小型ダイアフロー限
外ろ過機を用い濃縮すると具合がよい。この濃縮した分
画をゲル淵過操作にかける。

まず、セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５を
０．９％食塩水に懸濁し、５×９５ｃｍのクロマトカラ
ム、（Ｅｘｃｅｌカラム、ＳＢ−５０１硝英ＫＫ）につ
める。この上部に濃縮液３０ｍ１をのせ、展開は０．９
％食塩水で行い、２７５７ｎ，μの紫外部吸収を指標に
して溶離してくる各フラクシヨンを分取する。抗炎症活
性物質は間隙容積（ＶＯｉｄＶＯｌＬｌｎｌｅ）に接し
てすぐ出てくる第１ピークに存在する。この第１ピーク
部ノ分を合併し、限外枦過（フィルターＵＭ−１０）で
濃縮し、約３０ｍｔにする。濃縮液は水にて１晩透析し
、次いで弱塩基性ＤＥＭ−セルロースを用いるイオン交
換カラムクロマトグラフィーにかける。ＤＥＡＥ−セル
ロースはあらかじめＰＨ５．８の０．０１Ｍ酢酸緩衝液
にて緩衝化しておき、２６×４０Ｃ７Ｔｔのカラム（Ｅ
ｘｃｅｌ）に充填しておく。この上に上記濃縮液をおき
吸着させた後、０．２Ｍ．．ＰＨ＝５．８の酢酸緩衝液
にて溶離するものをよく洗い出し、２７５７Ｔ１，Ｐの
吸収で溶離するものが無くなつたのを確認後、１Ｍの同
緩衝液に変える。この１Ｍ緩衝液により活性物質は濃縮
されながらカラムにより溶離してくる。次に、セフアデ
ツクスＧ−２００を用いゲル枦過を行う。

先のＧ−７５の場合と同様、０．９％食塩水にてＧ−２
００をカラム（４×９５Ｃ！ｒｌ）につめ、上部にＤＥ
ＡＥ−セルロースクロマトグラフィーによる１Ｍ溶離部
（約２０ｍ１）をのせ、０．９％の食塩水にて展関する
。この場合も活性物質は間隙容積のすぐ後の第１ピーク
に存在する。この第１ピーク部分を限外淵過（ＵＭ−１
０又はＵＭ−２）で濃縮し、水にて充分透析後、凍結乾
燥する。この段階で２６ｍ９の活性分質が得られた。こ
の物質はかなり精製され強い抗炎症活性を示す。又、次
のステップとして弱酸性のＣＭ−セフアデツクスを用い
るイオン交換クロマトグラフィーを行うと更に精製され
るが、一部抗炎症活は低下する場合もある。凍結乾燥標
品又はセフアデツクスＧ−２００クロマトグラフィー処
理の第１ピークを０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．８）
にて透析後、ＣＭ−セフアデツクスカラム（２．６×４
０ｃｒ！ｔ）にのせ同緩衝液に食塩を加えるグラージエ
ント（Ｇｒａｄｉｎｔ）の系でクロマトグラフィーを行
う。クロマト分画で食塩濃度０．０２〜０．２Ｍの範囲
で溶離してきた部分を採取し、限外淵過で濃縮（ＵＭ−
１０又はＵＭ−２）し水で透析後、凍結乾燥すると、１
０ｍ９の活性標品が得られた。この物質の各種性質を以
下列記する。

〔物理化学的性質〕

凍結乾燥標品は白色粉末であり、水に溶解するとＰＨ＝
４．３（１７ｙ１９１ｍ１）を呈する。

このものの紫外部吸収スペクトルは第１図のごとく２８
０ｗＬμ附近に肩をもつ。又、赤外吸収スペクトルは第
２図に示すとおりである。分子量はゲル枦過法によると
、２０万以上と考えられる。元素分析値は下記のようで
ある。

又、このものの組成は下記のようである。

糖の分析によると、グルコース、ガラクトース、フコー
スが多く、微量ではあるがラムノース、マンノースも含
んでいる。

アミノ酸分析では、アスパラギン酸、グルタミン酸、グ
ルタミン、セリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シンが存在する。

なお、シアル基、グルクロン酸、ガラクトサミンは認め
られない。

〔生物学的性質〕

抗カラゲニン浮腫作用 ウインター （Ｗｉｎｔｅｒ）の方法（１）で行つたラットの抗カラ
ゲニン浮腫作用で、この凍結乾燥標品溶液をカラゲニン
投与３吟前に静脈内に注射しておくと、３時間後の判定
時に足浮腫の著しい抑制が見られる。

下．に示す表の抑制率より、５０％抑制量を求めるとＤ
勅＝０．８８μｙ／ＢＯｄｙとなる。なお、プロナーゼ
（ＰｒＯｎａｓｅ）にて、当物質の蛋白部分を分解して
も、抗カラゲニン活性に影響は与えない。

ＣＭＣ嚢法（３）を用いた白血球遊走阻止作用：ラツト
の背部にＣＭＣ（カルボキシメチル セルロース）を皮
下投与しその局所に遊走してくる白血球数を測定するＣ
ＭＣ嚢法を用いる。

標品溶液は、ＣＭＣ投与時及び３時間後に２回静注する
。６時間目の局所白血球数からその遊走阻害をみると著
しい抑制がみとめられる。

表に示すように、０．５μＦｌｌｂＯｄｙを２回投与す
るのみで、白血球遊走を７２％阻害している。（３）飯
塚義夫、他；第２４回日本薬理学要旨集、３０５頁（１
９６７）石川浩、他；薬誌、？１４７２（１９６８）ボ
イデン●チャンバー（ＢＯｙｄｅｎＣｈａｍｂｅｒ）法
（４）での白血球遊走阻止作用：マイクロボア・フィル
ターで２室に分けられたＢＯｙｄｅｎＣｈｅｍ？ｒの上
室にモルモツト白血球〔腹腔内の多形核白血球（ＰＭＮ
−１ｅｕｃ０ｃｙｔｅ）〕を、下室にその遊走因子（モ
ルモツト血清＋チモーザン（ＺｙｍＯｓａｎ））を入れ
白血球がフィルター内を因子側に移動するのを測定する
。

標品を遊走因子側に入れた場合は白血球遊走にあまり影
響ないが、標品が白血球側に存在すると（４．４ｐｆＩ
ｍ１）、その白血球遊走を著しく抑制（８６％）する。
この抑制作用は白血球に対する標品の細胞毒性によるも
のではなく、遊走抑制である。（４）Ｓ．ＢＯｙｄｅｎ
；Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．、川−、４５３（１９６２
）実施例２ ラットの実験的炎症局所への滲出液を原料とする方法ラ
ットの背部に無菌的にスポンジ（例えば、ポリウレタン
製のモルトブレンなどが利用できる）を移殖し４日後に
これを取り出す。

普通、直径３鑞、厚さ１Ｃ７７！の円径スポンジなら２
〜３個を１匹に移殖することができ、スポンジ中の滲出
液は１０ｎｔ程度は採取可能である。この滲出液をプー
ルし原料とする。滲出液を遠心分離し（１万Ｒ．ｐ．ｍ
ｌ２紛）混入している血球を除去後、限外ｔ過操作に入
る。以下は実施例１の方法と同じである。このようにし
て精製された抗炎症活性物質も牛血中の物質とほぼ同じ
性質を示す。。実施例３ 牛乳を原料とする方法 新鮮牛乳を低温（イ）〜５℃）で遠心分離（１方Ｒ．ｐ
．ｍｌ３扮）し、浮上する脂質を除去後、再び遠心操作
を行つて充分に脂質をとり除く。

脱脂した牛乳は限外ろ過操作（ＵＭ−１０など）により
分子量１万以下のものを採取する。牛乳が血清と違う点
は、含まれるカルシウム濃度が何倍も高いことであり、
低カルシウム化による抗炎症物質前駆体を高分子化させ
るには、多量の水による希釈が必要となる。しかるに容
量が増加すると次の操作”に都合がわるいため透析操作
で脱カルシウムをした方が得策である。即ち、限外ｐ過
により取出した分子量１万以下の分画を透析チューブに
入れ、水に対して充分透析する。透析内液をアミコン製
フェロー・ファイバーにて通過するものを除き、内部に
残る高分子のものを濃縮後、セフアデツクスＧ−７５を
用いるクロマトグラフィーにかける。以下は実施例１と
同じに行う。このようにして取出した物質も牛血清中の
抗炎症性物質とほぼ同じ性質を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１による牛血清より分画、精製した抗炎
症活性物質の紫外部吸収スペクトルを示したもので、２
ｍｇの標品を３ｍ１の水にとかして測定した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 哺乳動物の体液を限外濾過し、濾過液にカルシウム
   濃度低下による高分子化操作を施した後、再び限外濾過
   を行なつて濾過されない高分子物質を分画し、更に得ら
   れた高分子分画を精製することを特徴とする抗炎症活性
   物質の製法。