JPH11507033A - トロンボポイエチンを精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トロンボポイエチンを含む溶液からタンパク質汚染物質を除去する方法が開示されている。前記溶液をヒドロキシアパタイトに暴露し、それによりタンパク質汚染物質はヒドロキシアパタイトに結合し、トロンボポイエチンは実質的に結合しないままであり、前記結合していないトロンボポイエチンを回収する。ヒドロキシアパタイトの使用と、イオン交換クロマトグラフィー、リガンドアフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外ろ過及び示差沈殿を含む、他の精製及び濃縮技術とを有利に組合せる。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンボポイエチンを精製する方法 発明の背景 造血は、骨髄中の多能性の幹細胞から、血球が発生し、分化する過程である。 この過程は標的細胞上の膜結合受容体を経て作用するポリペプチド成長因子（サ イトカイン）の複雑な相互作用を伴う。サイトカイン作用は、しばしば系統特異 的及び／または工程特異的である特定のサイトカインに対する反応を伴う、細胞 増殖及び分化を生じる。幹細胞からの単細胞型、たとえば血小板の発生は、適当 な連鎖中で作用する多数のサイトカインの調和して機能する作用を必要とするか もしれない。 公知のサイトカインは、インターロイキン、たとえばIL−１，IL−２，IL−３ ，IL−６，IL−８等のインターロイキン及びコロニー刺激因子、たとえばＧ−CS F ，Ｍ−CSF ，GM−CSF 、エリトロポイエチン（EPO）等を含む。一般に、イン ターロイキンは免疫と炎症応答の仲介者として作用する。コロニー刺激因子は骨 髄由来細胞の増殖を刺激し、成熟白血球を活性化させ、そうでなければ、炎症、 感染及び免疫攻撃に対する宿主の応答の組込まれた一部分を形成する。 種々のサイトカインが治療剤として開発された。たとえば、赤血球の発生を刺 激するエリトロポリエチンは腎不全から生じる貧血の治療に用いられる。患者の 免疫システムの回復の速度を速めるために、いくつかのコロニー刺激因子ががん の化学療法と関連して用いられた。インターロイキン−２、α−インターフェロ ン及びγ−インターフェロンは特定のがんの治療に用いられる。 巨核球新生及び血小板新生を刺激する活性が血小板減少症の動物の体液中に同 定され、文献では「トロンボポイエチン」という｛最近、マクドナルドにより、 論評された。「Exp．Eematol．」16，p．201〜 205（1988年）及び「Am．J．Ped ．Hematol．Oncol．」14，p．8〜21（1992年）｝。最近、いくつかのグループが 、細胞 mpl受容体に結合し、巨核球新生及び血小板新生を刺激する能力に基づい て、トロンボポイエチン（TPO）を単離及び／またはクローン化した。ド・ソー ベージ他の「Nature」369，p.533〜 538，1994年、ロック他の「Nature」369，p .565〜 568，1994年、カウシヤンスキー他の「Nature」369，p.568〜 571，1994 年及びバートレー他の「Cell」77，ｐ 1117〜1124，1994年を参照。 ヒト及びマウスのTPO cDNAの主要な翻訳生成物のアミノ酸配列をそれぞれ配列 番号１及び配列番号２に示す。分析的及び実験的証拠は、成熟タンパク質が Ser −22（ヒト）及び Ser−45（マウス）残基で始まることを示している。TPOはタ ンパク質分解を受け、異種性のまたは分解した形で単離されている（de Sauvage 他の「Nature」369，p.533〜 538，1994年、Bartley他の「Cell」77，ｐ 1117〜 1124，1994年）。25kD位に小さい分子種が試験管内で活性であることが見い出さ れ（Bartley他、同書）、そして、組換えヒト TPOアミノ酸末端ポリペプチドの 153（de Sauvage他、同書）及び 174アミノ酸（Bartley他、同書）が、完全な長 さのヒトcDNAの発現の生成物が有しているように（Bartley他、同書）、試験管 内で活性であることが報告されている。 少なくともいくつかのタンパク質分解生成物が生物学的に活性であるけれども 、科学文献中で報告されたトロンボポイエチンの製剤は、種々の分子種の組成及 び相関的活性をよく特徴づけていない。しかしながら、現在までトロンボポイエ チンの大規模生産に関して ほとんど研究がなされておらず、そのタンパク質を大量に、そして、費用効率の 高い方法で生産する方法について当業界にいまだにニーズがある。特に生物学的 液体からトロンボポイエチンを精製する方法及びそれを医薬製剤中で用いるのに 適切な形に生産することについてのニーズがある。TPOのフラグメント及び凝集 物を含む、汚染物質タンパク質のないトロンボポイエチンを製造する方法につい てのニーズもある。本発明は、このような方法並びに他の関係する利益をもたら す。 発明の概要 本発明は、トロンボポイエチン及び、トロンボポイエチンの凝集物を含む、タ ンパク質汚染物質を含む溶液から、タンパク質汚染物質を除去する方法をもたら す。これらの方法は、前記溶液をヒドロキシアパタイトに暴露し、それによりタ ンパク質汚染物質はヒドロキシアパタイトに結合し、トロンボポイエチンは実質 的に結合してないままであり、そして結合していないトロンボポイエチンを回収 することを含む。本発明の１つの態様では、TPO含有溶液を、イオン交換クロマ トグラフィー、リガンドアフィニティクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用 クロマトグラフィーによって分別することにより調製する。他の態様では、回収 されたトロンボポイエチンをカチオン交換クロマトグラフィーまたは限外ろ過に より濃縮する。 関連する面では、本発明は生物学的液体からトロンボポイエチン(TPO)を単離 する方法をもたらす。これらの方法は、（ａ）リガンドアフィニティクロマトグ ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー 及び限外ろ過からなる群から選択される方法により TPO含有生物学的液体の容積 を減少させて 、濃縮された画分をもたらす工程、（ｂ）前記濃縮された画分の塩濃度を調整し て、調整された溶液をもたらす工程、（ｃ）前記調整された溶液を酸性にして汚 染物質タンパク質を沈殿させて透明な溶液をもたらす工程、（ｄ）前記透明な溶 液をアニオン交換クロマトグラフィーにより分別して、TPOの豊富化された画分 をもたらす工程、（ｅ）前記 TPOの豊富化された画分をヒドロキシアパタイトに 暴露し、それによりタンパク質汚染物質はヒドロキシアパタイトに結合し、TPO は実質的に結合していないままである工程、（ｆ）前記結合していない TPOを回 収する工程及び（ｇ）前記回収された TPOをカチオン交換クロマトグラフィーま たは限外ろ過により濃縮する工程を含む。１つの態様では前記生物学的液体は細 胞順化培地またはそれらの一部分である。他の態様では前記 TPOはヒト TPOであ る。さらに他の態様では、前記減少させる工程が、染料−リガンドアフィニティ クロマトグラフィー、たとえば誘導体化、架橋アガロースビーズのマトリックス 上の直接捕獲による、直接捕獲を含む。さらなる態様では、調整工程は限外ろ過 を含む。他の態様では、濃縮工程はカチオン交換クロマトグラフィーまたはアニ オン交換クロマトグラフィーを含む。 本発明の好ましい態様では、ヒドロキシアパタイトから回収した TPOの分子量 は、変性条件下の SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して、70,0 00±10,000ダルトンであって、実質的に低分子量（＜55kD）のタンパク質汚染物 質及び高分子量の凝集物を含まない。 本発明のこれらの及び他の面は次の詳細な説明を参照することにより明らかと なるだろう。 発明の詳細な説明 この発明を詳細に明らかにする前に、本明細書で用いられる特定の用語を定義 することは、その理解の助けとなるだろう。 「生物学的液体（biological fluid）」は、細胞、細胞成分もしくは細胞生成 物から由来するか、または含有する任意の液体をいう。生物学的液体は、限定す るわけではないが、細胞培養上清、細胞溶解産物、透明な細胞溶解産物、細胞抽 出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、ミルク及びそれらの部分を含む。 「細胞−順化培地(Cell-conditioned culture medium)」は、細胞が培養され た、そして、細胞生成物を含有する栄養培地をいう。 本発明は、細胞−順化培地を含む、生物学的液体からの TPOの精製方法をもた らす。これらの方法は、TPOのタンパク質分解生成物及び高分子量の凝集物を含 むタンパク質汚染物質が実質的にない TPOの均質製剤をもたらす点で特に有利で ある。 本発明の方法はヒト及び非−ヒト（たとえば、マウス、イヌ、ブタ、ウシ及び ヒツジ）トロンボポイエチンの製剤に有用である。これらの方法は、細胞−順化 培地またはそれらの部分（すなわち、前に他の分離技術によって TPOについて豊 富化された、細胞−順化培地の部分）からの TPOの精製に特によく適している。 このように当業界で一般的に公知である方法にしたがって、遺伝子工学的に培養 された細胞中でこれらのトロンボポイエチンを生産することが好ましい。これら の方法を要約すると、TPOをコードする DNA分子は、宿主細胞中でその維持及び 転写をもたらす他の DNA配列と結合している。生じた発現ベクターを宿主細胞に 挿入し、生じた「形質転換された」細胞を適切な栄養培地中で培養する。TPOを 細胞溶解産物から回収し、試験管内で処理して活性タンパク質を生産させること ができるが、培地中に TPOを分泌するように細胞を工作することが好ましい。一 般的に、de Sauvage他の「Nature」369，p.533 〜 5 38，1994年、Lok他の「Nature」369，p.565〜 568，1994年、Kaushansky他の「N ature」369，p.568〜 571，1994年、Wendling他の「Nature」369，p.571〜 574 ，1994年、Bartley他の「Cell」77，p.1117〜1124，1994年及び出願中のいっし ょに譲渡された米国特許出願第08／366,859 号及び第08／347,029 号（これらは 参照によりことごとく本明細書に組入れる）を参照。 TPOをトランスジェニック動物により生産することもできる。トランスジェニ ック動物を用いる場合には、異種タンパク質をミルク中に生産させるのが特に有 利である。したがって、酪農動物、たとえば、牛、羊及びヤギが好ましい宿主で ある。たとえば国際特許出願公報、WO 88／00239 号、WO 90／05188 号、WO 91 ／02318 号及び WO 92／11757 号及び米国特許第 4,873,191号明細書、第 4,873 ,316号明細書及び第 5,304,489号明細書（これらは参照によりことごとく本明細 書に組入れる）を参照。 本発明は部分的には、トロンボポイエチン及びタンパク質汚染物質の溶液は、 その溶液をヒドロキシアパタイトに暴露することにより効率的に分別することが できるという発見に基づく。TPOの高分子量凝集物を含む、タンパク質汚染物質 は優先的にヒドロキシアパタイトに結合するが、完全な、生物学的に活性のトロ ンボポイエチンは実質的に結合しないままである。ヒドロキシアパタイトの使用 は、イオン交換クロマトグラフィー、リガンドアフィニティクロマトグラフィー 、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外ろ過及び示差沈殿を含む、他の精製 及び濃縮技術と有利に組合せる。ヒドロキシアパタイトに暴露する前に、複雑な 、トロンボポイエチン含有溶液（たとえば細胞−順化培地）を濃縮及び／または 分別することが好ましい。濃縮は、リガンドアフィニティクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ ー、限外ろ過またはこれらの技術の組合せによる直接捕獲を用いる容積減少のよ うな技術によって達成することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、 溶液をヒドロキシアパタイトに暴露する前の分別化（豊富化）のための好ましい 方法である。 本発明の好ましい態様では、TPO及びタンパク質汚染物質を含有する生物学的 液体から、リガンドアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは限外ろ過で始まる一連の工程 から精製して、出発物質に比べて減少した容積を有する濃縮画分をもたらす。濃 縮された画分中の塩濃度を次に調整して調整された溶液をもたらす。塩濃度を調 整する方法は、ダイアフィルトレーション、希釈、透析及び疎水性相互作用クロ マトグラフィーを含む。次に調整された溶液を酸性化して、汚染物質タンパク質 を差別的に沈殿させ、それをろ過または他の手段により溶液から取り除く。生じ た透明な溶液を次にアニオン交換クロマトグラフィーで分別して、TPOの豊富な 画分をもたらす。アニオン交換クロマトグラフィーの前に、任意にpHをpH５〜９ 、好ましくは約７〜８に調整し得る。次に TPOの豊富な画分をヒドロキシアパタ イトといっしょにし、それによりタンパク質汚染物質はヒドロキシアパタイトに 結合し、TPOは実質的に結合しないままである。次に結合していない TPOを捕集 し、たとえばカチオン交換クロマトグラフィーまたは限外ろ過により濃縮する。 当業者は、日常の実験を用いて、これらの工程の順序を変えることができること を認識するだろう。緩衝液組成物、イオン強度及びpHは工程の順序並びに特定の 技術及び分別媒体の選択によって必要とされるように調整されるだろう。 細胞、細胞破片等を含有する生物学的液体を扱う時は、まず、ろ過してこれら の微粒子の汚染物質を取り除くことが好ましい。 上記のように、容積減少工程は、リガンドアフィニティクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは限外 ろ過を用いることができる。リガンドアフィニティクロマトグラフィーによる直 接捕獲を用いる容積減少が好ましく、染料−リガンドアフィニティ媒体の使用は 特に好ましい。適切な染料−リガンドアフィニティ媒体は、MIMETIC Red(商標) ２ A6XL、MIMETIC Red(商標)３ A6XL、MIMETIC Blue（商標）１ A6XL、MIMET IC Blue（商標）２ A6XL、MIMETIC Orange（商標）１ A6XL、MIMETIC Orange （商標）２ A6XL、MIMETIC Orange（商標）３ A6XL、MIMETIC Yellow（商標） １ A6XL、MIMETIC Yellow（商標）２ A6XL及びMIMETIC Green(商標)１ A6XL （Affinity Chromatography Ltd.，英国、フリーポート）を含む。これらの媒体 は６％架橋アガロースビーズ（45〜 164μｍ）で、染料リガンドはそれにスペー サー腕を介して結合している。MIMETIC Green(商標)１ A6XLを 1.0ml樹脂のカ ラムサイズ／ 300mlのサンプル容積といっしょに用いることが特に好ましい。次 の媒体に適用する前に生物学的液体のpH及びイオン強度を調整する必要を不要に して、TPOは TIC(商標)１ A6XL、MIMETIC Blue（商標）１ A6XL、MIMETIC Blue（商標）２ A6XL 及びMIMETIC Red(商標)１ A6XL に結合する。結合した TPOは増加した 塩濃度、増加したpH、変性化剤またはそれらの組合せを用いて溶出できる。たと えば、MIMETIC Green(商標)１ A6XLに結合した TPOは１％ NH₄OH中の３Ｍ NaCl または４Ｍグアニジンで溶出できる。他の好ましい染料−リガンドアフィニテ 州、ピスケータウェイ）等を含む。バクテリア汚染の可能性を最小にするために この工程を冷い所（４〜10℃）で行うことが好ましい 。TPOに適切な染料−リガンドアフィニティ媒体の結合特異性及び溶出条件を決 定する方法は当業界で公知であり、市販のアッセイキット｛たとえば、Affinity Chromatography Ltd.から得られる PIKSI（商標）テストキット｝を含む。たと えば、Kroviarski他の「J. Chromatography」449，p.403〜 412，1988年及び Mi ribel他の「J．Biochem．Biophys．Methods」16，p.1 〜16，1988年参照。TPO含 有生物学的液体の容積を減少させる代替方法も用いることができる。容積の減少 は前記液体のpH及び導電率の適当な調整後、アニオンまたはカチオン交換媒体上 で TPOを捕獲することによって達成できる。捕獲後、TPOは塩またはpHグラジエ ントで溶出できる。第２の代替では、液体の塩濃度の適当な調整後、疎水性相互 作用クロマトグラフィー(HIC)によって、TPOを捕獲できる。TPOを低イオン強度 の緩衝液を用いて HICカラムから溶出できる。限外ろ過も容積を減少させるため に用いることができる。これらの方法の種々の組合せも用いることができる。 次に、濃縮された画分の塩濃度を次の分別で必要なように調整する。たとえば 、アニオン交換クロマトグラフィーは、典型的には、許容できない損失を回避す るために約３〜６mS／cmに導電率を調整することを要する。好ましい調整方法は ダイアフィルトレーションによる緩衝液交換である。他の塩濃度を調整する方法 は所望の導電率への希釈及びpHの調整、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲ ルろ過並びに逆相クロマトグラフィーを含む。好ましい HIC媒体は ュージャージー州、ギブスタウン）を含む。HICの使用は一般に、塩の添加によ り、前記豊富にされた画分の導電率をまず増加させる ことを必要にするだろう。次に、TPOを低イオン強度の緩衝液を用いて HIC媒体 から溶出する。必要なら、溶出液のイオン強度を追加の分別の前にさらに調整す る。好ましいゲルろ過媒体はアガロース、ポリアクリルアミドまたは他のポリマ ーの架橋ビーズ、たとえば 孔性樹脂Oligo Ｒ２及びOligo Ｒ３（PerSeptive Biosystems，Inc．マサチュセ ッツ州、フラミングハム）を含む。 汚染タンパク質は、穏やかな酸沈殿及びろ過により、前記生じた調整された溶 液から除去できる。調整工程でダイアフィルトレーションを用いた時は、酸性交 換緩衝液(たとえば25mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0)を用い、それにより塩 濃度の調整及び汚染物質の示差沈殿を組合せることは便利である。 アニオン交換クロマトグラフィーを、一般に第３または４級アミノ基で誘導体 化した不溶性の微粒子支持体を含む媒体を用いて行なう。この点に関して、適切 な支持体は、アガロースビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンビーズ等を 含む。適切なアニオン交換 州、ハーキュルス、Q-Hyper D （商標、BioSepra Inc．Marlboroug M Science、ニュージャージー州、ギブスタウン）である。アニオン交換クロマ トグラフィーは典型的には、Trisまたはリン酸塩緩衝液中で、pH５〜９、好まし くは 6.5〜 8.0で、温度約18〜25℃、好ましくは約20℃（室温）で行う。好まし いカラムサイズは20〜30mg総タンパク質当り 1.0mlの樹脂である。 次に、アニオン交換カラムからの溶出液を、タンパク質汚染物質 がヒドロキシアパタイトに結合し、TPOが実質的に結合されないままであるよう に、ヒドロキシアパタイトに暴露する。好ましい手順では、1.0mlの樹脂／ 4.0 〜 8.0mgのサンプル中の総タンパク質を用いて、カラムの形にヒドロキシアパタ イトを調製する。カラムを低イオン強度緩衝液を用いて、わずかに酸性〜中性に 近いpH、たとえば10mMのリン酸ナトリウムで pH5.5〜 7.5に平衡化する。アニオ ン交換工程からの溶出液の導電率を約10〜30mS／cm、好ましくは約11mS／cmに調 整し、この溶液を室温でカラムに適用し、TPOを含有する流出画分を捕集する。 結合していない TPOを含有する流出画分を次に濃縮する。適切な濃縮方法はカ チオン交換クロマトグラフィー及び限外ろ過を含む。カチオン交換クロマトグラ フィーは一般に、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を用いて誘導体化 した不溶性微粒子支持体を含む媒体を用いて行なう。この点に関して適切な支持 体は、ビーズ化された架橋アガロース、アクリルアミド、メタクリレート等を含 む。スルホプロピル基で誘導体化された支持体が好ましい。この型の市販のカチ オン交換媒体は S-Hyper D(商標、Bio Sepra)、TSK ience)である。典型的な手順では、酸性pH(たとえば 4.0〜5.0)及び低イオン強 度（たとえば、３〜６mS／cm）の TPO含有溶液を 1.0mlの樹脂／ 3.0〜 6.0mg総 タンパク質（Ａ₂₈₀による）を用いて、 していない物質を除去するためにカラムを洗浄し、より高いイオン強度の緩衝液 (たとえばpH６〜９で 0.1〜 0.5Ｍ NaCl)を用いて TPOを溶出する。好ましい溶 出緩衝液は、0.28Ｍ NaCl を含有する40 mMリン酸Na緩衝液、pH９である。 上記及び後記実験例における手順はカラムクロマトグラフィーを用いるが、当 業者はバッチ処理も用いることができることを認識するだろう。 本発明により調製したトロンボポイエチンは、骨髄中で細胞の増殖の増加が望 ましいところではどこでも、たとえば血球減少症、たとえば骨髄形成異常症候群 、化学療法または先天性血球減少症により誘発されるものの治療に、治療的に用 いることができる。TPOは特に血小板生産を増加させるのに、たとえば血小板減 少症の治療に有用である。血小板減少症は、その症状を単独または協力して作り 出す、多様な群の病気及び臨床状態に伴う。減少した血小板数は、たとえば、血 小板生産における欠陥、異常な血小板分布、大量の輸血による希釈的な減量また は異常な血小板破壊によることがある。たとえばがん治療に用いられる化学療法 薬は骨髄中の血小板始原細胞の発生を抑制し、生じた血小板減少症は化学療法を 制限し、輸血を必要とするかもしれない。さらに、特定の悪性疾患は血小板生産 及び血小板分配を与えることがある。悪性細胞を殺すのに用いられる放射線療法 も血小板始原細胞を殺す。血小板減少症は薬、新生児の同種免疫または血小板輸 血同種免疫により誘発される自己免疫疾患からも生ずるかもしれない。TPOは輸 血の必要性を減少または除き、それにより、血小板同種免疫の発生を減少させる ことができる。血小板の異常破壊は、（１）血管の移植片または傷つけられた組 織における増加した血小板の消費または（２）たとえば薬物誘発血小板減少症、 特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、自己免疫病、血液学病、たとえば、白血病及 びリンパ腫または骨髄を含む転移がんを伴う免疫メカニズムに起因することがあ る。他の TPOの兆候は形成不全の貧血及びたとえば化学療法または AZTを用いる HIV感染の治 療に起因する、薬物誘発骨髄抑制を含む。 血小板減少症は、増加した出血、たとえば鼻−口付近、胃腸管からの粘膜の出 血、並びに傷、潰瘍または注射部位からの分泌として証明される。 医薬用途のためには、TPOは慣用の方法により、非経口、特に静脈内または皮 下のデリバリーのために処方される。静脈内投与はボーラス注射または注入より １〜数時間の典型的な期間にわたるだろう。一般に、医薬製剤は TPOに、医薬と して許容し得る賦形剤、たとえば、生理的塩類液、緩衝化生理的塩類液、５％デ キストロース水溶液または、同様のものを組合せて含む。製剤はさらに１または 複数の補形剤、保存剤、溶解化剤、緩衝剤、ガラスびんの表面へのタンパク質の 損失を防ぐためのアルブミン等を含んでもよい。さらに、TPOを他のサイトカイ ン、特に初期に作用するサイトカイン、たとえば幹細胞因子、IL−３，IL−６， IL−11またはGM−CSF と組合せてもよい。このような組合せ療法を用いる時、サ イトカインを単一の製剤で組合せても、分離した製剤として投与してもよい。製 剤化の方法は当業界で周知であり、たとえば、「レミントンの医薬の科学(Remin gton's Pharmaceutical Sciences)」（Gennaro編、Mack Publishing Co., ペン シルベニア州、イートン、1990年。参照により本明細書に組入れる）に開示され ている。治療用量は一般に１日当りの患者の重量１kg当り 0.1〜 100μｇの範囲 で、好ましくは１日当り 0.5〜20μｇ／kgで、正確な用量は、治療されるべき症 状の性質及び程度、患者の特性等を考慮に入れて、許容できる基準にしたがって 臨床医が決定する。用量の決定は当業者のレベル内である TPOは一般に、化学療 法もしくは骨髄移植後に28日までの期間または血小板数が＞20,000／mm³、好ま しくは＞50,000／mm³が達成されるまで投与されるだろう。より一般的には、TPO は１週間ま たはそれよりも少なく、しばしば１〜３日の期間にわたって投与されるだろう。 一般に、TPOの治療的に有効量は、リンパ球または骨髄始原細胞の増殖及び／ま たは分化の臨床的に有意な増加を生成するのに十分な量であって、それは、成熟 細胞（たとえば、血小板、赤血球または、好中球）の循環レベルにおける増加と して示されるだろう。血小板疾患の治療は、したがって、血小板数が少なくとも 20,000／mm³、好ましくは50,000／mm³に到達するまで継続されるだろう。TPOは 、他のサイトカイン、たとえばIL−３，IL−６及びIL−11、幹細胞因子、エリト ロポイエチン(EPO)、Ｇ−CSF 並びにGM−CSF と組合せて投与することもできる 。組合せ療法の養生法では、他のサイトカインの毎日の用量は一般に、EPO ＜ 1 50Ｕ／kg、GM−CSF ５〜15μｇ／kg、IL−３ １〜５μｇ／kg及びＧ−CSF １〜 25μｇ／kgであろう。EPOとの組合せ療法は、たとえば低 EPOレベルの貧血の患 者で必要である。 TPOは、造血細胞の分化と発生の試験官内研究、たとえば細胞分化のメカニズ ムの解明及び成熟細胞の系統の決定のための貴重な手段でもあり、そして、細胞 培養における増殖剤としても有用性を見い出すことができる。 TPOは体外、たとえば自己由来の骨髄培養でも用いることができる。簡単に言 うと、化学療法の前に患者から骨髄を除去し、任意に１または複数の他のサイト カインと組合せた TPOで処理する。次いで、骨髄の回復の速度を早めるために化 学療法後に、処理された骨髄を患者に戻す。さらに、TPOは骨髄または末梢血液 始原（PBPC）細胞の体外増殖のために用いることができる。化学療法に先立って 、末梢循環中に早期に始原細胞を遊離させるために、骨髄を幹細胞因子(SCF)ま たはＧ−CSF で刺激することができる。これらの始原体を末梢血液から捕集し、 濃縮し、次いで、任意に SCF，Ｇ−CSF ，IL−３，GM−CSF，IL−６またはIL−11を含むが、それらに限定されない１ま たは複数の他のサイトカインと組み合せた TPOで培養を処理して高密度の巨核球 培養に分化及び増殖させることができ、次にそれを高用量化学療法後に患者に戻 すことができる。 本発明をさらに次の非限定的例により説明する。 例 例１ MIMETIC Green(商標)１ A6XL（Affinity Chromatography Ltd.、英国、フリ ーポート）のカラム（直径９cm×高さ12cm）を調製した。カラム操作を４℃で行 った。カラムを５カラム容のリン酸塩緩衝化塩類液(PBS，120mM NaCl，2.7mM KC l，10mM リン酸塩、pH7.2)を用いて流速１cm／分で平衡化した。 ヒト TPO発現ベクターをトランスフェクトした赤ちゃんハムスター腎臓細胞で 順化し、TPOを含有している、200ｌの細胞培地を、0.22μｍ酢酸セルロースまた はポリスホン(polysufon)膜フィルターを通してろ過した。ろ過された培地をカ ラム上に１cm／分の速度で積載した。カラムを５カラム量の PBCで、または吸光 度(280nm)が基線に達するまで洗浄した。結合したタンパク質を１％の水酸化ア ンモニウム、３Ｍ NaCl の溶液を用いてカラムから溶出した。カラム溶出液のタ ンパク質含量を 280nmの吸光度で監視した。ピーク画分を捕集した。タンパク質 ピークを典型的に約２カラム容で溶出した。 溶出ピークを４℃で15分間置いておき、次にpHを50％の酢酸を用いて 5.0に調 整した。乳白色の沈殿が生成し、それを溶出液中で−80℃で貯蔵した。 カラムを３カラム容の 1.0Ｍ NaOH を用いて清浄化した。前記Na OHを樹脂上に２時間置いておき、次に樹脂を５容の水で洗浄し、20％のエタノー ル中に貯蔵した。 700mlの順化培地（出発容積）を４バッチでMIMETIC Green(商標)カラムを通し て処理し、次に溶出した物質をプールした。このプールはほぼ６ｇの総タンパク 質を含有していた。 MIMETIC Green(商標)カラム（ほぼ２ｌ容積）からの溶出液／沈殿物を室温で 一夜解かし、次に、155cm²，３μｍポリウレタン膜カプセルフィルター（＃1211 6 ひだをつけたカプセル、Gelman Sciences、ミシガン州、アン アーバー）を 通してろ過し、いかなる沈殿をも除去した。ろ過が完了した時、カプセルを 300 mlの25mM酢酸ナトリウム、pH5.0で洗浄した。 すき通ったろ液の塩濃度をAG／Technology（マサチュセッツ州、ニードハム） からのダイアフィルトレーション中空繊維膜（30,000分子量カットオフ）及びハ ウジングサイズ６(面積0.28ｍ²、AG／Technologyからの＃UFP-30-E-6A)を用いて 限外ろ過によって調整した。交換緩衝液は25mM酢酸ナトリウム、pH5.0であった 。ろ液の流動速度は約 1.4kg／cm²(20psi)で約60ml／分であった。前記物質は約 ３容のダイアフィルトレーション後、曇った。約７容後、導電率は約４mS／cmに 達した。pHは 5.0でその物質は乳白色の濁った外観を有していた。この物質を４ ℃で１夜貯蔵した。 ダイアフィルトレーションユニットを水をどっと流し、システム中に 0.5Ｍ N aOH を１時間循環させ、再度水をどっと流すことにより清浄化した。システムを 20％エタノールまたは 0.1Ｍ NaOH 中に貯蔵した。 ダイアフィルトレーションした物質を１Ｍ Tris pH8.0 を用いて20mM Tris に 調整し、生じた溶液のpHを２Ｍ NaOH を用いて 8.0に調整した。次に、溶液を0. 45μｍポリウレタン膜カプセルフィルタ ー｛＃12131 Versaflow(商標)カプセル、Gelmal Sciences、ミシガン州、アン アーバー）を通してろ過した。 TMAE −650(s)の直径９cm×11cm（ほぼ 700mlの樹脂）の高いカラム（EM Scien ce）上のアニオン交換クロマトグラフィーによって分別した。カラムを最初に３ カラム容の20mM Tris、pH8.0 で平衡化した。タンパク質溶液をカラム上に直線 速度１cm／分で積載した。積載されたカラムを３カラム容の20mM Tris、pH8.0 で洗浄し、次いで結合したタンパク質を10カラム容の20mM Tris、pH8.0 中の０ 〜 0.3Ｍ NaCl グラジエントで溶出し、続いて２カラム容の20mM Tris、pH8.0 中の 0.3Ｍ NaCl で溶出した。TPOは約30mM NaCl でカラムから溶出し始めた。 aCl で洗浄し、３カラム容の 0.5Ｍ NaOH で衛生的にし、次いで、0.5Ｍ NaOH 中に２時間置いた。次にカラムを５容積の水で洗浄し、20％のエタノール中に貯 蔵した。 カラムからの画分を、還元条件下の10〜20％グラジエントのポリアクリルアミ ドゲル(Novex、カリフォルニア州、サンディエゴ)上での電気泳動後、ウェスタ ンブロットにより分析した。ウェスタンブロットで陽性を示す70kDの物質をプー ルした。 TMAE溶出液のタンパク質含量を 280nmの吸光度で測定することによって定量し た。溶出液を 0.5Ｍリン酸ナトリウムを用いて、10mMリン酸ナトリウムに調整し 、この溶液のpHを２Ｎ NaOH を用いて 6.8に調整した。水を用いる希釈（ほぼ２ 倍の希釈）により導電率を10mS／cmに調整し、必要な時にはpHを 6.8に調整した 。 次いで希釈された溶出液を、約６mgの総タンパク質当り１mlの樹 ラミック ヒドロキシアパタイト、40μｍ、Bio-Rad Laboratories、カリフォル ニア州、ハーキュルス）のカラムを貫流した。700ｌのこの点まで処理した順化 した培地は約 900mgのタンパク質を含有し、これを 150mlの樹脂（カラムサイズ 、直径 4.4cm×15cm）上で処理した。カラムを10mM リン酸ナトリウム、pH6.8 で平衡化し、次いで 1.5cm／分の流速で積載した。流出画分を捕集した。次にカ ラムを４カラム容の10mMのリン酸ナトリウム、pH6.8で洗浄し、洗浄の最初の１ カラム容を前記流出画分といっしょにした。残存汚染物質及び残留TPO(全 TPOの 約10〜20％)を 0.5Ｍリン酸ナトリウム、pH6.8でカラムから洗浄した。カラムを ３カラム容の 0.5Ｍ NaOH で衛生的にし、カラムをそのNaOH中に２時間置き、そ の後それを５カラム容の水で洗浄した。次にカラムを20％エタノール中に貯蔵し た。 ヒドロキシアパタイトによる精製前後の生成物流を、Ｃ−18カラム及びアセト ニトリルグラジエントを用いて逆相HPLCによって分析した。結果は、本質的にす べてのTMAE溶出液プールに存在する不純物がヒドロキシアパタイトに結合したこ とを示した。ヒドロキシアパタイトカラムからの流出画分はHPLCによる１個のピ ークを含有していた。 ヒドロキシアパタイトカラムからの TPO含有画分は、Ａ₂₈₀により約 250mgの 総タンパク質を含有していた。この物質を粉末化酢酸ナトリウムの添加により、 20mM酢酸ナトリウムに調整し、pHを 5.0に調整し、その溶液を水で導電率６mS／ cmまで希釈した。 る、直径 3.2cm× 3.7cmカラムを３カラム容の20mM酢酸ナトリウム、pH5.0で平 衡化した。TPO溶液を流速２cm／分でカラム上に積載した。カラムを５カラム容 の20mM酢酸ナトリウム、pH5.0で洗浄し た。TPOを 0.5Ｍ NaCl を含有する、20mM酢酸ナトリウム、pH5.0でカラムから溶 出した。溶出液のタンパク質濃度は約１mg／mlであった。 カラムを３容の 0.5Ｍ NaOH で清浄化し、NaOH中に２時間置き、次に５カラム 容の水で洗浄し、20％エタノール中に貯蔵した。 例２ 本質的に例１に開示されたように調製したヒト TPOを、４〜20％Tris−グリシ ンゲル(Novex、カリフォルニア州、サンディエゴから得た)上の電気泳動により 分析し、続いて銀染色またはウェスタンブロットを行った。１μｇのタンパク質 を還元条件下で電気泳動し、そのゲルをクーマシーブルーで染色し、脱色し、続 いてダイイチ銀染色キット（Integrated Separation Systems、マサチュセッツ 州、ナティック）を用いて染色した。この重いゲル積載を用いて、 を非還元条件下電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットを抗− TPO モノクローナル抗体の反応混液で探査し、ホースラディシュペルオキシダーゼ複 合ヤギ抗−マウス抗体及びECL(商標)検出試薬（Amersham Corp.）が続いた。次 にブロットをＸ線フィルムに暴露した。約70kDに集中した広いバンドが存在した 。ちょうど 250kDで始まるいくつかのずっとかすかなバンドも検出された。 TPOの生物学的活性を、標的細胞として、ヒト MPL受容体をコードする発現ベ クターでトランスフェクトされたBaF3細胞(Vigon他「Proc．Natl．Acad．Sci．U SA」89．p.5640〜5644，1992年)を用いる、有糸分裂誘発アッセイで、検定した 。BaF3は、マウスの骨髄から由来した、インターロイキン依存性プレ−リンパ球 系統である（Palacios及びSteinmetz の「Cell」41，p.727 〜734，1985 年、Ma they-Prevot 他の「Mol．Cell．Biol.」6，p.4133 〜4135，1986年 ）。細胞を³Ｈ−チミジンの存在下、試験サンプルに暴露した。細胞 DNA中に取 り込まれた³Ｈ−チミジンの量をヒト TPOの標準曲線との比較によって定量した 。製剤は1.77×10⁶単位／mlの活性を有することが見い出され、そこで10Ｕ／ml が有糸分裂誘発アッセイにおける半−最大（half-maximal）刺激を与える量と定 義された。アミノ酸分析により、製剤中のタンパク質濃度は0.41mg／mlで、特異 的活性4.32×10⁶Ｕ／mgを示す。 説明の目的で本発明の特定の態様を明細書に記載したけれども、前記のものか ら、本発明の精神及び範囲を離れることなしに種々の変更をなし得る。したがっ て、本発明は添付された請求の範囲によって以外には限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 チャン，ジン−ジー アメリカ合衆国，ワシントン 98207，イ ザクア，トゥーハンドレッドフォーティー シックスス プレース サウス イースト 4318 (72)発明者 ダウネイ，ウィリアム アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル イレブンス アベニュ ノース ウエスト 6544 (72)発明者 フォーストローム，ジョン ダブリュ. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル サーティース アベニュ ノース イースト 7559 (72)発明者 ファン，リン アメリカ合衆国，ワシントン 98133，シ アトル，ノース ワンハンドレッドトウェ ンティエイス ストリート 721

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的液体からトロンボポイエチン(TPO)を精製する方法であって、 リガンドアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー及び限外ろ過からなる群から選択された方法 により、TPO−含有生物学的液体の容積を減少させて濃縮された画分をもたらし 、 前記濃縮された画分の塩濃度を調整して、調整された溶液をもたらし、 前記調整された溶液を酸性化して、汚染物質タンパク質を沈殿させ、透明な溶 液をもたらし、 前記透明な溶液をアニオン交換クロマトグラフィーにより分別して、TPOを豊 富化させた画分をもたらし、 前記 TPOを豊富化させた画分をヒドロキシアパタイトに暴露させ、それにより タンパク質汚染物質は前記ヒドロキシアパタイトに結合し、TPOは実質的に結合 してないままであり、 前記結合していない TPOを捕集し、そして、 前記捕集した TPOをカチオン交換クロマトグラフィーまたは限外ろ過により濃 縮することを含む前記方法。 ２．前記生物学的液体が細胞順化培地またはそれらの部分である請求項１に記 載の方法。 ３．前記 TPOがヒト TPOである請求項１に記載の方法。 ４．前記減少させる工程が染料−リガンドアフィニティクロマトグラフィーに よる直接捕獲を含む請求項１に記載の方法。 ５．前記減少させる工程が誘導体化、架橋アガロースビーズのマトリックス上 の直接捕獲を含む請求項４に記載の方法。 ６．前記調整工程が限外ろ過を含む請求項１に記載の方法。 ７．前記濃縮工程がカチオン交換クロマトグラフィーを含む請求項１に記載の 方法。 ８．前記濃縮工程がスルホプロピル基を用いて誘導体化された不溶性支持体を 用いるものである請求項７に記載の方法。 ９．前記分別工程がアニオン交換クロマトグラフィーを含む請求項１に記載の 方法。 10．前記分別工程がトリメチルアミノエチル基を用いて誘導体化された不溶性 支持体を用いるものである請求項９に記載の方法。 11．前記捕集された TPOの分子量が、変性条件下の SDS−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により測定して、70,000±10,000ダルトンである請求項１に記載の 方法。 12．前記タンパク質汚染物質がトロンボポイエチンの凝集物を含む請求項１に 記載の方法。 13．生物学的液体からトロンボポイエチン(TPO)を精製する方法であって、 TPO含有生物学的液体の容積を、染料−リガンドアフィニティクロマトグラフ ィーによる直接捕獲により減少させて、濃縮画分をもたらし、 前記濃縮された画分中の塩濃度を限外ろ過により調整して、調整された溶液を もたらし、 前記調整された溶液をアニオン交換クロマトグラフィーによって分別して、TP Oを豊富化された画分をもたらし、 前記 TPOを豊富化された画分をヒドロキシアパタイトに暴露し、それによりタ ンパク質汚染物質をヒドロキシアパタイトに結合させ、そして TPOは溶出させ、 前記溶出された TPOをカチオン交換クロマトグラフィーにより濃 縮する方法。 14．トロンボポイエチン及びタンパク質汚染物質を含む溶液からタンパク質汚 染物質を除去する方法であって、前記溶液をヒドロキシアパタイトに暴露させ、 それにより前記タンパク質汚染物質は前記ヒドロキシアパタイトに結合し、前記 トロンボポイエチンは実質的に結合しないままであり、そして、結合していない トロンボポイエチンを回収することを含む前記方法。 15．前記タンパク質汚染物質がトロンボポイエチンの凝集物を含む請求項14記 載の方法。 16．トロンボポイエチン含有液体組成物をイオン交換クロマトグラフィー、リ ガンドアフィニティクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用イオンクロマトグ ラフィーによる分別することにより、前記溶液を調製する請求項14に記載の方法 。 17．前記溶液をトロンボポイエチン含有液体組成物のアニオン交換クロマトグ ラフィーによる分別により調製する請求項16に記載の方法。 18．前記溶液をトロンボポイエチン含有液体組成物のアニオン交換クロマトグ ラフィー及びリガンドアフィニティクロマトグラフィーの組合せによる分別によ り調製する請求項16に記載の方法。 19．前記回収されたトロンボポイエチンをカチオン交換クロマトグラフィーま たは限外ろ過により濃縮する請求項14に記載の方法。