JPS60205367A - 抗‐エプスタイン‐バールビールス抗体の酵素‐免疫螢光試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗−ＥＢＶ抗体の測定法に関する。

ｉ見弦１ 免疫螢光法は人間血清の伝染病単核症に伴う抗−エプス
タイン−バールビールス（ＥＢＶ）抗体の存在試験に一
般に使われている。この免疫螢光抗体法は２抗原−抗体
反応」、り成る。第１反応は血清試料中に含まれている
抗−ＥＢＶ抗体と特定基質に集中している特定抗原間に
おこる。第２反応は抗−ＥＢＶ抗体−抗原複合物と螢光
ラベルをつけられたアンチ人イムノグロブリン（Ｉｇ）
抗体との間でおこる。第２反応ｖｋ螢光顕徹煉を用いて
基質の螢光をしらべる。陽性試料については螢光型が患
者のかかっている伝染病単核症段階の指標として使われ
る。

この免疫螢光法はその使用法の正確と賽易さにも拘わら
ず主要な１欠点をもっている。各試料は血清が陽性か陰
性かを検べるため螢光頭徹鋺のもとで個々に検べる必要
があるので、多数の血清試料の迅速検査はできかねる。

通常試験される血清の大半は抗−ＥＴ３Ｖ抗体に陰性な
ので陰性血清の顕微鏡検査を省略できる方法の利益は明
らかである。

本発明の目的は多数の血清試料の抗−ＥＢＶ抗体につい
ての迅速正確な検査法を提供することにあり、もし上記
抗体があればそれは患者のかかつている伝染病単核症段
階として螢光ｗ４黴鏡により直ちに特徴づけられる。

楚団辺（１ 本発明は抗−ＥＢＶ抗体の測定法に関する。特に本発明
は試験試料中の抗−ＥＢＶ抗体の存在を検べ患者がかか
つている伝染病単核症段階を特徴づけるに使用できる簡
単な試験法に関する。本発明の方法の独得な特徴は抗−
ＥＢＶ抗体と特定抗原の複合物を酵素と螢光の両ラベル
をつけられたアンチ人イムノグロブリンでラベル付けす
ることにある。試験方法が抗−ＥＢＶ抗体の検出と特徴
づけに使用できるのはこの二重ラベリングである。

要するに本発明は試験試料中の抗−ＥＢＶ抗体の測定法
に関するが、その方法は上記抗−ＥＢＶ抗体用の基質を
つ＜す、上記基質を試験試料と接４− 触させ、上記接触させた基質を （ａｌ　酵素ラベル化アンチ人１ｇ抗体と螢光ラベル化
アンチ人１ｇ抗体の混合物； （ｂ）　酵素と螢光ラベルを付けたアンチ人１ｇ抗体；
（ｃ）　螢光ラベル化抗体中に使つｔこ抗体をえた動物
種に対する酵素ラベル化抗体をあとで加えた螢光ラベル
化アンチ人■ｇ抗体；および （ｄｉ　酵素ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物種
に対する螢光ラベル化抗体をあとで加えた酵素ラベル化
アンチ人１ｇ抗体： より成る群から選ばれたラベル化アンチ人イムノグロブ
リン（Ｉｇ）抗体と処理し、処理した基質の酵素活性を
もつかどうかを分析測定しかつえられた酵素活性基質の
免疫螢光型を測定することより成る。

本発明の好ましい第１形態はラベル化アンチ人Ｉｇ抗体
が酵素ラベル化アンチ人ｒｇ抗体と螢光ラベル化アンチ
人１ｇ抗体の混合物であるという実施態様に関する。

本発明の第２の好ましい形態はアンチ人Ｔｇ抗体が酵素
と螢光両方でラベル化されている様な実施態様に関する
。

本発明の好ましい第３形態はラベル化アンチ人ＩｇＶｉ
体が螢光ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物種に対
する酵素ラベル化抗体をあとから加えた螢光ラベル化ア
ンチ人１ｇ抗体である様な実施態様に関する。

発用（ト）１ 本発明の方法によって測定される抗体は伝染病ｌｉｔ核
症を診断しかつ患者のかかっている病状を特徴づけろ補
助として便利である。

本発明によろ抗−ＥＢＶ抗体の検出と定量は適当抗原基
質を試験試料と接触させ、接触させた基質を（ａｌ酵素
ラベル化抗体と螢光ラベル化抗体の混合物、（ｂｌ酵素
と螢光ラベルを付けたアンチ人１ｇ抗体、ｔｅｌ螢光ラ
ベう化抗体中に使った抗体をえた動物種に対する酵素ラ
ベル化抗体を後から加えた螢光ラベル化アンチ人１ｇ抗
体およびｆｄｌ酵素酵素ラベル化生体中った抗体をえた
動物種に対する螢光ラベル化抗体を後から加えた酵素ラ
ベル化アンチ人Ｉｇ抗体より成る鮮から選ばれたラベル
化アンチ人１ｇ抗体と処理し、処理した基質の酵素活性
を測定しかつ酵素活性を示す基質の免疫螢光型を測定す
ることによってできる。

本発明に使用するに適した基質はＥ　ＢＶを感染させた
細胞培養物がある。基質は試験試料中に抗−ＥＢＶ抗体
存在を検べろに使われる抗原を含む。

よい結果をえるには抗原を含んでいる細胞培養物又は他
の基質物質は抗原決定子を保存する様な方法で製造され
ることが望ましい。これは固定子を避けることが最もよ
く又は注意してのみ使用できることを意味する。

本明細書で使用する基質は免疫螢光型を測定できる様な
平らな透明面上に支持されるとよい。特に適した支持面
は組織培養処理されたミクロタイター板によってできる
。この板は０．５ｍ＋以下のよい底厚さをもち基質検査
に高倍率接眼レンズ使用を可能にする。

抗体と抗原混合物にラベルづけするに使うラベル化アン
チ人Ｔｇ抗体は次の範鴫ニ ア− （０１Ｍ素うベル化アンチ人１ｇ抗体と螢光ラベル化ア
ンチ人１ｇ抗体より成る混合物； （１１）　酵素と螢光ラベルを付けられたアンチ人１ｇ
抗体； （ｃｌ　螢光ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物種
に対する酵素ラベル化抗体をあとから加えた螢光ラベル
化アンチ人１ｇ抗体；および ｔｄｌ　酵素ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物種
に対する螢光ラベル化抗体をあとから加えた酵素ラベル
化アンチ人１ｇ抗体； から選ばれたものである。

本明細書で酵素ラベル化アンチ人Ｉｇ抗体として使われ
るフルオロクロム共役抗血清は市販入手できるし又はこ
の分腎に既知の方法で容易に製造できろ。ラベリング剤
として特に好ましい酵素には例えばわさび（ホーセラデ
ィツシュ）ペルオキシダーゼ１アルカリ性ホスフアター
ゼ、グ、レコースオキシダーゼ、ラクトペルオキシダー
ゼおよび−ガラクトシダーゼがある。

別法において酵素と螢光両ラベルを付けられた８− アンチ人１［抗体は酵素ラベル化アンチ人１ｇ抗体と螢
光ラベル化アンチ人１ｇ抗体の混合物の代わりに使われ
る。フルオロクロム−酵素共役抗血清は市販の酵素−フ
ルオロクロム−共役物を適当精製されたイムノグロブリ
ン部分と反応させて容易に製造できる。

他の別法において、螢光ラベル化アンチ人１ｇ抗体が使
われる。板洗浄後、螢光ラベル化抗体中に使った抗体を
えた動物種に対する酵素ラベル化抗体を加え、次いでこ
れを任意の付着螢光ラベル化アンチ人１ｇ抗体とでも混
合させる。ラベル化抗体は市販で入手できるし又はこの
分野で既知の方法で容易に製造できる。特に好ましいの
は螢光ラベル化兎アンチ人１ｇ後の酵素ラベル化山羊ア
ンチ兎１ｇＧである。

他の別法においては酵素ラベル化アンチ人１ｇ抗体が使
われる。板洗浄後、酵素ラベル化抗体中に使った抗体を
えた動物種に対する螢光ラベル化抗体をあとで加え、次
いで任意の付着螢光ラベル化アンチ人１ｇ抗体とでも混
合できる。ラベル化抗体は市販を入手できる又はこの分
時に既知の方法で賽易に製造できる。特に好ましいもの
は酵素ラベル化兎アンヂ人１［後の酵素ラベル化山羊ア
ンチ兎ＩｇＧである。

本発明の方法実施にあたり抗原基質、抗−ＥＢＶ抗体を
含むと思われる試験試料およびラベル化アンチ人１ｇ抗
体を混合し下記のとおり処理する。

抗−ＥＢＶ抗体用抗原基質を室温で抗−ＥＢＶ抗体を含
むと思われる試験試料と接触させる。接触時間は３０分
乃至１時間である。試験試料がもし基質中に集中してい
る抗原に特有の抗−ＥＢＶ抗体を含むならば、抗−ＥＢ
Ｖ抗体−抗原複合物を結合した基質が生成されろ。反復
洗浄後接触した基質は（ａｌ　ｍ素うベル化アンチ人Ｔ
ｇ抗体と螢光ラベル化アンチ人１ｇ抗体の混合物、ｆｂ
ｌ　酵素と螢光両ラベルを付けられたアンチ人１ｇ抗体
、（Ｃ）　螢光ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物
種に対する酵素ラベル化抗体をあとから加えた螢光ラベ
ル化アンチ人１ｇ抗体；およびｆｄｌ　酵素ラベル化抗
体中に使った抗体をえた動物種に対する螢光ラベル化抗
体をあとから加えた酵素ラベル化アンチ人Ｉｇ抗体より
成る群から選ばれたラベル化アンチ人１ｇ抗体と処理さ
れる。ラベル化抗体を含む基質処理は３０分乃至１時間
室温で行われる。処理された基質が結合抗−ＥＩ１３Ｖ
抗体を含むならばラベル化基質はこの段階で生成される
。反復洗浄後基質の酵素活性は酵素に特定の基質添加に
より測定される。本明細書にあげられ使われる酵素に適
当する種々の基質はＢｅｒｇＩｌｅｙｅｒの１９６５年
ニューヨーク市アカデミツクプレスの肛穂ｏｄ　ｏｆ　
Ｅｎｚ　ｍａｄ更に記載されている。

基質中の酵素活性の存在は肉眼でおよび分光分析的に測
定できる。初めの場合基質は酵素基質の酵素的さけ目に
よって生じに色（発色物質）について肉眼で簡単に検査
できる。第２の場合発色物質溶液の光学的密度を測定し
試験試料の抗−ＥＢ■抗体量の推定である抗−ＥＩ３Ｖ
抗体力価と比較する。かくて本発明の方法における酵素
ラベルの使用は抗−ＥＦ’３Ｖ抗体測定用定性又は定員
試験のいずれの方法使用も可能にさせろ。

１１− 酵素活性を表わす試験試料は螢光顕微鋺を用いて免疫螢
光型を決定するエビイルミネーション方式によって直接
検査してミクロタイター板を逆にして底をとおして見る
ことによって更に特徴づけられる。

患者のかかっている伝染病単核症の段階は特定免疫螢光
型を観察することによって決定される。

これは細胞中に認められた螢光の特定位置の研究によっ
てなされる。螢光が核のはなれた部分に局在しているな
らば伝染病単核症は初期である。

同様に螢光がもしも細胞原形質と核全体に散乱している
ならば、螢光が核のはなれた部分に局在している場合よ
抄も伝染病単核症は末期である。

１２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗−エプスタイン−バールビールス抗体用基質を試
   験試料と接触させ、」：記接触させｔコ基質を＋ａ＋　
   酵素ラベル化アンチ人イムノグロブリン抗体と螢光ラベ
   ル化アンチ人イムノグロブリン抗体より成る混合物； （）））酵素と螢光ラベルを付けられｔこアンチ人イム
   ノグロブリン抗体； （ｃｌ　螢光ラベル化抗体中に使った抗体をえた動物種
   に対ずろ酵素ラベル化抗体をあとから加えた螢光ラベル
   化アンチ人イムノグロブリン抗体；および （Ｃ））酵素ラベル化抗体中に使つｔこ抗体をえた動物
   種に対する螢光ラベル化抗体をあとから加えた酵素ラベ
   ル化アンチ人イムノグロブリン抗体；より成る群から選
   ばれたラベル化アンチ人イムノグロブリン抗体と処理し
   、処理した基質の酵素活性をもつかどうかを分析測定し
   かつ酵素活性をもつ基質中の免疫螢光型を測定する工程
   Ｊ：り成ることを特徴とする試験試料中の抗−エプスタ
   イン−バールビールス抗体のＩｌｌ　定？Ａ。 ２　上記ラベル化アンチ人抗体が（ａｌより成る特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３　上記ラベル化アンチ人抗体がｆｂ）より成る特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４　上記ラベル化アンチ人抗体が（ｃｌ　、１：り成る
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５　上記ラベル化アンヂ人抗体がｔｄ）　Ｊ、り成る特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　上記酵素がわさびペルオキシダーゼである特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ７　上記酵素がわさびペルオキシダーゼである特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ８　上記酵素がわさびペルオキシダーゼである特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ９　上記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 １０　上記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 １１」二記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 １２　上記酵素がわさびペルオキシダーゼでありかっ」
   二記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 １３　上記酵素がわさびペルオキシダーゼでありかつ上
   記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 １４」二記醇素がわさびペルオキシダーゼでありか−）
   上記螢光ラベルがフルオレスセインである特許請求の範
   囲第４項記載の方法。 １５　上記アンチ人抗体がアンチ人ＩｇＧである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １６　上記基質がエプスタイン−パールビールスを伝染
   させた細胞培養物より成る特許請求の範囲第１項記載の
   方法。