JPS60138462A - 抗原カラムを用いる抗原の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原の定量法に関するものである。

更に詳しくは、検液中の抗原と該抗原に対応する酵素で
標識された抗体（以下酵素標識抗体という。）の過剰量
を反応させ、抗原と結合していない未反応の酵素標識抗
体を抗原不溶化担体に充填したカラムに結合せしめた後
、該担体に抗体を介して結合した酵素活性を測定するこ
とにより、検液中の抗原を定量することを特徴とする抗
原カラムを用いる抗原の定量法に関するものである。

近年臨床医学の分野においては、疾病の診断、あるいは
、病態の経過追跡のために血液、尿などの体液中に含ま
れる微量成分の定量が重視されている。これらの微量成
分としては、種々のペプチドホルモン、甲状腺ホルモン
、ステロイドホルモン、各種腫瘍マーカー、各種薬物な
どがある。このような微量成分の体液中での濃度は極め
て低いため通常の化学的分析法では検出できず、一般的
には免疫化学的な手法によって定量されている。

免疫化学的な手法として、近年測定の簡便さ及び測定感
度の高さから酵素免疫測定法が注目されている。酵素免
疫測定法において抗原を定量する際には、通常サンドイ
ンチ法と競合法という２つの反応様式が用いられる。サ
ンドインチ法は抗体不溶化担体に抗原を結合させ、次に
該担体に結合した抗原と酵素標識抗体を結合させるもの
である。

即ち、抗原を抗体不溶化担体と酵素標識抗体とで挟み込
むもので、この方法は測定感度は高いが低分子の抗原は
測定できないという欠点がある。一方競合法は抗原と酵
素で標識された抗原を抗体に対して競合的に結合させる
もので、低分子抗原を定量できるという利点はあるもの
の、サンドインチ法より測定感度が低いという欠点があ
る。

本発明者らは、このような点を考慮し、低分子抗原も高
分子抗原をも感度良く測定できる方法について鋭意検討
した結果、本発明を完成したものである。即ち、本発明
は抗原と酵素標識抗体を反応させた後、未反応の酵素標
識抗体を抗原不溶化担体を充填したカラムに結合せしめ
、該担体に抗体を介して結合した酵素の活性を測定する
ことによって抗原を定量するものである。

抗原と過剰量の酵素標識抗体とを反応させた後未反応の
酵素標識抗体を抗原不溶化担体に結合させるという方法
は既に従来より知られている。しかし、従来の方法にお
いて用いられる抗原不溶化のための担体は合成ポリマー
、あるいはガラスなどのビーズ、チューブであり、これ
らに不溶化できる抗原量は多くても１０ｎｇ以下であっ
た。従って、測定に用いる酵素標識抗体を上記抗原不溶
化担体に完全に結合せしめることは不可能であり、従っ
て測定感度が低（しかも広い濃度範囲の抗原を定量する
ことは不可能であった。このため、この測定法は実用化
され難いものであった。この欠点に対して本発明者らは
、微粒状あるいは繊維状の担体に抗原を結合させ、しか
もこれをカラムに充填して用いる方法を見い出した。微
粒状あるいは繊維状の担体を用いることにより単位容積
当りに不溶化できる抗原の量が著しく増加し、しかもこ
れをカラムに充填することによって酵素標識抗体と抗原
不溶化担体との反応効率が著しく上昇した。

不溶化される抗原が多くなることの利点は、例えば以下
に述べることによって明らかである。分子量１０万の抗
原を、例えば直径３．３ｆｌのポリスチレンビーズに不
溶化した場合、不溶化できる抗原量は０．５１ｇ程度で
ある。この担体を用いてｌｏｇの抗原を測定する場合を
考え、酵素標識抗体を抗体（分子量約１５万とする。）
の量として１５ｎｇ用いるとすると、抗体のうち抗原と
結合するのは１．５１ｇ、抗原と結合しないのは１３．
５ｎｇである。一方上記抗原不溶化ポリスチレンビーズ
に結合し得る抗体量は理論的には０．７５ｎｇが限界で
ある。上記の抗原が無い場合の抗体量１１−５ｎと抗原
１ｎｇが存在したときの抗原と結合していない抗体１３
．５ｎｇはいずれも抗原不溶化ポリスチレンビーズの抗
体結合％ｑ０．７５ｎＨに対して圧倒的に多いため両者
の間で抗原不溶化ポリスチレンビーズに結合する抗体量
の差は全くないかあってもごく微かである。一方セファ
ロース１ｍｌ当りには１０■の抗原でも充分不溶化でき
る。

セファロース１　ｍＦ当りに１０■の抗原を不溶化し、
これを０．１−のカラムに充填して用いると、カラム１
本当り１■の抗原が不溶化されていることになり、前述
の抗体量１５ｎｇと１３．５ｎｇは完全に結合し得る量
である。従って１５ｎｇと１３．５ｎｇの差である１、
５ｎｇの抗体量はそのままカラムに結合する酵素標識抗
体の量の差として検出され、ｌｏｇの抗原が定量される
ことになる。ここでカラムを用いたためにすべての酵素
標識抗体が抗原不溶化セファロースに結合せしめること
ができるのであって、例えば同じ量の抗原不溶化セファ
ロースを懸濁液として用いた場合にはこのように効率良
く反応はしない。これは分子間の衝突頻度の問題であっ
て、カラムを用いると酵素標識抗体が抗原不溶化セファ
ロースのマトリックス中を通過するので、抗原が過剰量
であればほぼ完全に酵素標識抗体がカラム内に保持され
る。しかし、抗原不溶化セファロースを懸濁液として用
いると反応が平衡状態になるのに極めて長時間を要し、
しかも反応を完全に行わせるためには攪拌などの煩雑な
操作を必要とする。

即ち、本発明者らの方法においては、まず第一にカラム
を用いることにより抗原不溶化担体と酵素標識抗体の反
応を短時間に且つ完全に行わせ、第二に担体に不溶化す
る抗原量を酵素標識抗体に対して過剰量用いることによ
り測定感度を高めた点が従来にない大きな特徴である。

更にカラムを用いることの利点としては、上記に加えて
測定誤差を小さくできること即ち測定精度を向上させ得
る点にある。本発明に述べる方法においては抗原不溶化
担体と酵素標識抗体を結合せしめた後、反応液中に存在
する抗原−酵素標識抗体結合物を洗浄除去する必要があ
る。この際、担体としてビーズを用いると試験管内にピ
ースを入れて、これに洗浄液を入れた後吸引除去すると
いう煩雑な操作が必要である上に、抗原−酵素標識抗体
結合物は希釈されるけれども一部が残存することもあり
、これが測定誤差の原因となる。ところが、カラムを用
いると洗浄液によってカラム内の抗原−酵素標識抗体は
ほぼ完全に洗い流されるのである。

本発明法に用いられる酵素標識抗体において、抗体とし
てはイムノグロブリンあるいはイムノグロブリンをプロ
テアーゼで限定分解して得られるＦ　（ａｂ”）２、Ｆ
（ａｂ）２、Ｆａｂ’　、、　Ｆａｂなどが用いられる
。抗体としては多クローン性抗体あるいは単クローン性
抗体のいずれをも使用できる。酵素としてはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など一般に市販されている
精製された酵素が使用できる。酵素と抗体を結合させる
方法は公知であり、種々の架橋試薬も市販されている。

抗原不溶化担体において用いられる水不溶性担体は微粒
状あるいは微繊維状で０．０５〜０．５飢のミ二カラム
に均一に充填し得るものであれば良い。

具体的な材質としては多糖あるいは各種合成ポリマーが
実用的である。これら水不溶性担体に抗原を不溶化させ
る方法としては物理的あるいは化学的な結合反応が応用
される。効率の良い反応の例トシては、多糖の場合では
臭化シアン、エピクロルヒドリン等で活性化し抗原のア
ミノ基と結合させる方法あるいは担体表面のアミノ基、
カルボキシル基と抗原のアミノ基、カルボキシル基をカ
ルボジイミド誘導体、グルタルアルデヒドなどで結合さ
せる方法などがある。この際、不溶化する抗原量は酵素
標識抗体に対して過剰量であり、カラム当りの抗原量が
測定に供される酵素標識抗体の１０倍以上の当量である
ことが好ましい。

カラムの容量は操作性、経済性を考慮すると０．０５ｄ
以上且つ０．５−以下であることが好ましい。

以上の如く本発明法によれば抗原を感度良く正確に測定
し得るが、以下実施例によってこのことを示す。

実施例１　インスリンの測定 （１）酵素標識抗体の調製 モルモットにインスリンを免疫することによって得られ
た抗インスリン血清を硫安分画後ＤＢＡＥ−セルロース
によって精製しインスリン抗体を得た。このインスリン
抗体をペプシンで限定分解しＦ　（ａｂ’）２フラグメ
ントを得た。

得られたＦ　（ａｂ’）２フラグメントをメルカプトエ
チルアミンで還元し、ＳＨ基を持つＦａｂ’フラグメン
トとした後、これをＮ、　Ｎ’−０−フェニレンジマレ
イミドを用いて大腸菌のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと結
合させた。

（２）インスリン不溶化セファロースの調製インスリン
と臭化シアンで活性化したセファロースを反応させイン
スリン不溶化セファロースを得た。インスリンの結合量
はセファロース１　ｍＱ当りＩ　Ｘ　１０−７モルとし
た。このインスリン不溶化セファロースを０．１ｍＲの
カラムに充填して用いた。

（３）測定 インスリン標準液（０，１，３，１０，３０，１００μ
Ｕ／−）の０．１ｍｌと酵素標識抗体の溶液（抗体とし
てＩ　Ｘ　１０−１３モル／ｍｌり１ｍを混合し３７℃
で２時間反応させた。この反応液を（２）で調製したカ
ラムに流し、次いでカラムを洗浄後β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの基質である０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの溶液でカラムを満たし、室温（２５”Ｃ）で
１晩酵素反応を行った。次に５０１炭酸ソ一ダ熔液１ｍ
βでカラムを洗浄し、得られた洗浄液中のＯ−二トロフ
ェノールの量を４２０ｎｍの吸光度を測定することによ
ってめた。検体のインスリン量と４２０ｎｍの吸光度の
関係、即ち検量線を第１図に示す。

次にヒト血清５検体について上と同じ方法で測定し、第
１図に示す検量線によりインスリン濃度を計算したとこ
ろ、各々１３．２０．１２．４５．９８μＵ／　ｍｅで
あった。同じ血ｉＦＪについて放射免疫測定法（Ｒ，Ｉ
Ａ法）の市販キットを用いてインスリンを測定したとこ
ろ、各々１５．２３．１１．４７．９３μＵ／ｍｌとな
り、本発明法による測定値はＲ１，Ａ法と良く一致した
。

実施例２　サイロキシンの測定 ウサギの抗サイロキシン血清とβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼを用いて実施例１（１）に準じて酵素標識抗体を調製
した。

一方、エピクロルヒドリンで活性化したトコパールＨＷ
−５５（東洋曹達社製）と６−アミノカプロン酸を反応
させカルボキシペンチル−トヨパールＨＷ　”　５５を
調製した。この担体とサイロキシンを水溶性カルボジイ
ミドによって結合させた。トヨパールＨＷ　−５５１ｍ
Ｅ当り８　Ｘ　１０−７モルのサイロキシンが結合した
。このサイロキシン不溶化１−ヨバールＨＷ　−５５を
０．１ｍｅのカラムに充填して用いた。

サイロキシン標準液（０，２，５，５，１０，２ｈｇ／
直）または検体血清の各々２５声を酵素標識抗体の溶液
（抗体として４　Ｘ　１０−１３モル／　ｍＥを含む）
０．５−と混合し２５℃で１時間反応させた。この反応
液を上記のカラムに流した後、カラムを洗浄した。

次いで実施例１に準じて酵素反応を行った（但し反応は
２５℃で１時間）。

サイロキシン標準液を用いた場合の吸光度より検量線を
作製し、この検量線よりヒト血清５検体のサイロキシン
濃度をめたところ５．６．１１．２．７．８．６．５．
１５．５ｐｇ／みであった。同じ検体のＲＩＡ法による
測定値は各々　５．０．１２，５．７．５．６．９．１
６．０となり両者は良く一致した。

実施例３　α−フェトプロティンの測定ウサギより得ら
れた抗α−フェトプロティン血清、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、α−フェトプロナイン、セファロースを用いて
実施例１に準じて酵素標識抗体とα−フェトプロティン
不溶化セファロースを調製した。これらの試薬を用いて
実施例１と同じ方法でα−フェトプロティン標準液（０
，１２，５，２５，５０，１００，２００，４００ｎｇ
／　ｍｅ　）とヒト血清について測定を行ったところ、
ヒＩ・血ンｎ中のα−フェトプロティンは３４．１０．
６９．１７．２４３ｎｇ／　ｍｅであった。

実施例４　トリヨードサイロニンの測定実施例２に準じ
てトリヨードサイロニンの測定を行った。ヒト血清のト
リヨードサイロニン濃度は７５、１２３．８９．１６５
．３５０ｎｇ／ｄ１であった。同じ検体のＲＩＡ法によ
る測定値は６８、１１９．９５．１７８．３４５　ｎｇ
／　ｄｉであり本発明法による測定値はＲＩＡ法のそれ
と良く一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗原カラムを用いてインスリン標準
液を定量して得られたインスリンの検量曲線を示すもの
である。 特許出願人　天野製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　検液中の抗原と該抗原に対応する酵素で標識された
   抗体の過剰量を反応させ、未反応の酵素で標識された抗
   体を抗原不溶化担体を充填したカラムに結合せしめた後
   、該担体に抗体を介して結合した酵素活性を測定するこ
   とにより、検波中の抗原を定量することを特徴とする抗
   原カラムを用いる抗原の定量法。 ２　カラムに充填される抗原不溶化担体の容量が０．０
   ５＋＋＋ｅ１２Ｊ上且つ０．５ｍＲ以下であるところの
   特許請求の範囲第１項記載の抗原カラムを用いる抗原の
   定量法。 ３　カラムに充填される抗原不溶化担体中の抗原の量が
   酵素で標識された抗体の量に対して１０倍以上であると
   ころの特許請求の範囲第１項又は第２項記載の抗原カラ
   ムを用いる抗原の定量法。