JPS60133887A - エラスタ−ゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエラスターゼの製造方法に関する。

エラスターゼは、咄乳動物膵臓中に存在している所謂セ
リンプロテアーゼの一種であるが、不溶性硬タンパク質
であるエラスチンを分解する、きわめて特異なプロテア
ーゼである。近年、エラスチンの分解現象と、加令、動
脈硬化症、あるいは肺気腫、１Ｆｔ−炎、血管炎、等と
の関係が注目されてオリ（金抜全う（、ｏｎｎｅｃｔｉ
ｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　６　（１）　１　（１９７４））
、将来エラスターゼの医薬品としての利用が高まるもの
と考えられる。このような観点から、エラスターゼを効
率よ（工業的規模で製造する方法の開発が望まれている
。

従来エラスターゼの製造方法に関して多くの報告がなさ
れているが、そのほとんどは研究室レベルでの製造方法
である。現在までに報告されているエラスターゼの製造
方法として最も代表的なものにしｅｗｉｓらの方法（Ｊ
　−Ｂｉｏｌ　ｃｈｅ＋ｎ　２２２７０５（１９５６）
）がある。

この方法は、膵臓及びパンクレアチンの稀酢酸抽出物に
硫安を４５％飽和に加えて、生じた沈澱を０．１　Ｍ炭
酸緩衝液に溶解し、次いで脱塩により生じるオイクロプ
リン画分を０．１　Ｍ炭酸塩緩衝液に溶解し、硫安を３
５％飽和に加えてエラスターゼの沈澱を得る。しかる後
、再び０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解して結晶化させるもの
である。

特公昭５０−２１５５７にかかる方法はＬｅｗ　ｉ　ｓ
らの方法の４５％硫安飽和で得られる沈ｆ殿をｐ　Ｈ５
〜１Ｏの水溶液に溶解し、５〜５０℃に１時間以上放置
した後に再度塩析することを特徴とするもので、基本的
にはＬｅｗ　ｉ　ｓ　らの方法と同様である。

特開昭５２−１１０８９２にかかる方法は膵臓抽出液を
直接陽イオン交換体に作用させエラスターゼを吸着させ
た後、溶出し分画することを特徴とするものである。

また特開昭５２−６１２８７では、膵臓に哺乳動物の十
二指腸あるいは、その抽出液を加えてエラスターゼ前駆
物質を活性化することを特徴とするエラスターゼの製造
方法を示している。

上記の方法は、いずれも膵臓抽出液を得るための前処理
が全（なかったり、あるいはきわめて不十分であるため
、膵臓抽出液を収率よ（、し力）も清澄に得ることがき
わめて困難である。

それに加えて、抽出液のタンノ々りその他生体成分の含
量が多く、その後の精製過程に於て操作力≦煩雑となり
、高純度のエラスターゼを収率よく工業的な規模で製造
する方法としては十分とは言ｌＪ）難い。

これらの点に特に注意して研究した結果、高純度のエラ
スターゼを得る本発明を完成させるに至った。

本発明は哺乳類の膵臓を２０〜６０℃好ましくは４０〜
５０°Ｃに少な（とも１時間界」ニ自己消化させたのち
、消化Ｐ液に１０〜３０％の水可溶性有機溶剤存在下に
アルカリ土類金属を１％以」二に加え、生じた沈澱を除
去してエラスターゼ抽出液を得ることを特徴とする。

必要によりこのエラスターゼ抽出液に対して、通常行な
われるとおり透析した後、硫安を２５〜４５％飽和好ま
しくは、３５％飽和に加えて生じた沈澱１．Ｈ８−１１
５の水に溶解した後、脱塩し、Ｈを中和することにより
エラスターゼが複合体を結晶として析出させ、或いは」
上記の脱塩の後弱塩基性陰イオン交換体に通じ、未吸着
画分を集めた後に中和することにより、純エラスターゼ
結晶を析出させることも出来る。

本発明にかかるエラスターゼは牛、豚、羊等、哺乳動物
の膵臓に含有されているが、特に豚膵臓に多量に存在し
ているため、工業的製造のための原料としては豚膵臓を
用いるのが有利である。

精製エラスターゼは低温下ではＰＨ４〜］、　０．５の
範囲できわめて安定であるが、２０℃以」ニでは不安定
である事が知られている。しかし膵臓自己消化時に於け
るエラスターゼの安定性はきわめて高く、ブタ膵臓細切
物を２０〜６０℃で少なくとも１時間界」二例えば５０
℃３時間の自己消化を行なった場合に於いても、公知の
方法（特開昭５２−６１２８７）と比較したかきり、は
とんどエラスターゼの分解が認められない事を発見した
。

この条件で得られる自己消化液はきわめて粘性が低く、
従へてｒ過が速やかで且つ大量の清澄Ｐ液を得ることが
出来た。

更に比較的高温度下での自己消化により、結合組織タン
パクその他の不要タンパクの多くが低分子化を受け、そ
の後のエラスターゼ製造工程に都合の良い消化Ｐ液を得
ることが出来た。

自己消化清澄ρ液に、アルカリ土類金属を１％以上にな
る様に加えた後、エタノール、メタノール、アセトン等
、水可溶性有機溶剤を］０〜３０％となる様に加えてタ
ンパク質沈澱を除去し、エラスターゼ含有溶液を得る。

ここで使用しうるアルカリ土類金属塩としては例えば塩
化カルシウム、塩化マグネシウム等の水溶性塩が有効で
ある。

本発明による上記方法とＬｅｗｉｓらの方法とのエラス
ターゼ精製度を下表に参考として示した。

精製度はｌｅｗｉｓらの方法によって得られたエラスタ
ーゼ含有溶液の粗抽出液の精製度を１８０としてその倍
率を示している。

本発明による　ＬｅＷｌＳらの方法 方法の精製度　による精製度 エラスターゼ含有溶液　３．、Ｏ１，０硫安４５％沈澱
　２８ オイグロブリン沈澱　４７ 硫安３５％沈澱　９１　５７ 工ラスターピ複合体結晶　１２，０　１１．２但し本発
明方法により得られるエラスターゼのエラスチン分解能
の測定は、不溶性エラスチンの分解により生じる可溶性
エラスチン分解物の量をチロジン価として算出し、１分
間に１μグの千ロジンの遊離する活性を１単位とするＲ
Ｏｂｌ）ｌｎＳらの方法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　６６．３９６、（，１９７５）
）の改良法により測定した。

タンパク質はＬＯＷｒｙ法（Ｊ　、］３ｉｏ１・ｃｈｅ
ｍ−１９３・２６５・（１９５１））に従い、卵白アル
ブミンを標準として定量した。

以下に本発明を実施例をもって更に詳細に説明する。

豚膵臓細切１物１　Ｋ９を強く攪拌しながら５０℃に３
時間自己消化にかけた後、３１！の水を加え、ρ過によ
り、３．５１の清澄を夜を得た。清澄液に８Ｏグの酢酸
カルシウムを加えたのち、アセトン５００記を加えた。

生じる沈澱を遠心分離により除きエラスターゼ含有の遠
心上ａ３．３１を得た。

該上清を透析して塩及び有機溶剤を除き、透析内液に固
形硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように溶解し、
生じた沈澱を遠心分離により集め、１００−の水に懸濁
し、アンモニア水でＰＨを１０に調節する事により沈澱
を溶解した。

溶液の、）Ｊを８〜１１．５に保ちながら透析して脱塩
した後、酢酸で溶液の、Ｈを７にする事によりエラスタ
ーゼ複合体を晶出させた。結晶をρ過により集め冷蒸留
水で洗浄することにより、１５０単位／　ｍｙタンパク
のエラスターゼ複合体６１７を得た。

出願人　大蔵製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　補乳動物の膵臓を自己消化させた後、消化ρ液に１
   ０〜３０％の水可溶性有機溶剤存在下にアルカリ土類金
   属塩を１％以上となる様に加え、生じた沈澱を除去して
   エラスターゼ抽出液を得ることを特徴とするエラスター
   ゼの製法。 ■　膵臓の自己消化は４０〜５０℃に少なくとも１時間
   以上行なう特許請求の範囲第１項の方法。