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JPH06192296A - 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。 - Google Patents

治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。

Info

Publication number
JPH06192296A
JPH06192296A JP4311158A JP31115892A JPH06192296A JP H06192296 A JPH06192296 A JP H06192296A JP 4311158 A JP4311158 A JP 4311158A JP 31115892 A JP31115892 A JP 31115892A JP H06192296 A JPH06192296 A JP H06192296A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
toxin
type
crystal
therapy
medicine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4311158A
Other languages
English (en)
Inventor
Genji Sakaguchi
玄二 阪口
Tomoko Shimizu
朋子 清水
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chiba Prefectural Government
Original Assignee
Chiba Prefectural Government
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiba Prefectural Government filed Critical Chiba Prefectural Government
Priority to JP4311158A priority Critical patent/JPH06192296A/ja
Priority to DK112793A priority patent/DK112793A/da
Priority to SE9303323A priority patent/SE9303323L/
Priority to DE4335366A priority patent/DE4335366A1/de
Priority to FR9312505A priority patent/FR2697163B1/fr
Priority to GB9321794A priority patent/GB2272697A/en
Publication of JPH06192296A publication Critical patent/JPH06192296A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 純粋な毒素を得ることにより、斜視、眼瞼痙
攣等の治療用医薬品としての安定性、有効性を高めるこ
と。 【構成】 ボツリヌスＡ型毒素をキトサン等の天然素材
からなる核酸除去剤を用いて、失活させることなく結晶
化させるようにしたこと。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、治療用医薬品としての
結晶Ａ型ボツリヌス毒素の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細菌由来神経毒素の代表であるボツリヌ
ス毒素は、クロストリジュウム属ボツリヌス菌の産生す
る蛋白質毒素である。このボツリヌス毒素は抗原性によ
りＡ，Ｂ，Ｃ1，Ｃ2，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇの８型に分類され
る。これらのうち、最初に精製され、結晶化されたのは
Ａ型毒素である（Ｌａｍａｎｎａ，Ｃ，Ｏ，Ｅ, ＭｃＥ
ｌｒｏｙ ａｎｄ Ｈ.Ｗ.Ｅｋｌｕｎｄ：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１０３：６１３〜６１４ １９４６）。従来、ボツ
リヌスＡ型結晶毒素の製造法は、酸による沈澱（１）、
水洗、塩化カルシウム抽出、酸による沈澱（２）、リン
酸緩衝液抽出、エタノール沈殿、抽出、硫安溶液による
析出の順に行われる複雑な手順を要し、操作も煩雑かつ
技術者の経験と勘を必要とし、しかも毒素の回収率も低
く、必要な量とその効果を期待できるものではなかつ
た。そのほかにプロタミン処理、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル瀘過などを組合せた方法も行われている
が、いずれも結晶化の効率は良くない。
【０００３】ボツリヌスＡ型毒素の結晶化について、問
題点の一つは結晶化しやすい巨大分子を有する毒素をど
のように、どれほど多く得られるかということと、二つ
めは培養液に含まれる核酸を主とする結晶化阻害物質
を、毒素を変性させることなくいかにして分離できるか
ということである。第一については分子量５０万〜９０
万のボツリヌスＡ型毒素を産生する菌株を選べばよい
が、第二としては温和な条件でいかに核酸を除去できる
かに係わつている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前述の従来
技術を基礎にこれを改良したもので、純粋な毒素を得る
ことにより、斜視、眼瞼痙攣等の治療用医薬品としての
安定性、有効性を高めることを目的としたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、ボツリヌスＡ型毒素をキトサン等の天然
素材からなる核酸除去剤を用いて、失活させることなく
結晶化させるようにしたことである。最初に、ボツリヌ
スＡ型毒素を産生する菌株のうち、血球凝集価の高い分
子量５０万のＬ毒素、９０万のＬＬ毒素を含み毒力の高
い菌株を選択する。これらの菌株を適当な培地、例えば
ＮＺ−アミン培地で培養し、培養瀘液に酸を加えて沈殿
を生ぜしめ、この沈殿物から有効に毒成分を抽出するた
めに塩化カルシウムの替りにモル濃度を変えたリン酸緩
衝液を用いる。更にこの抽出液をｐＨ調整、一夜放置、
遠心、酢酸緩衝液溶解、ｐＨ修正、更に遠心を繰返して
上清を得る。この上清に核酸除去剤を最も効果的な条件
で添加するものである。
【０００６】従来は、核酸除去のためにカルシウム及び
アルコールが常用されていた。しかしこれらの核酸除去
剤の濃度やｐＨなどの条件を変えてみても顕著な成果は
得られない。更に核酸除去剤としてプロタミンが知られ
ているが、除去剤としての効果は優れているが核酸だけ
でなく必要な蛋白質まで沈殿させ、更に天然物の致命的
な欠陥要素であるロット間の均質性の差が問題となり、
また生じた沈殿から過剰のプロタミンを分離する操作を
さらに加えなければならない。一方キトサン（大日本製
薬株式会社の商品名）は天然の高分子物質でカニ、エビ
等の外殻その他に含まれるキチン（ポリ−Ｎ−アセル−
β−Ｄ−グルコサミン）を脱アセチル化した天然物質で
あり、その低分子化したＣ−７，Ｃ−９はいずれも毒素
の損失なしに効率よく核酸除去を行うことができる。キ
トサンによる除核酸の後に硫安で塩析すると、過剰のキ
トサンは沈殿せず、塩析された毒素をリン酸緩衝液に溶
解した後、硫安を徐々に添加し、静置することにより毒
素を容易に結晶化し得た。Ｄｕｆｆらの方法を用いた製
造法では、結晶Ａ型ボツリヌス毒素の収率は培養液を１
００とした場合１.４〜３.１に過ぎなかった。更に抽出
法を改良することにより約５％に上昇することが出来た
が、これにキトサンを用いる本発明の核酸除去法により
毒素活性の収率を１０％にすることができた。
【０００７】
【実施例】以下の実施例について詳細に説明する。 （５％Ｃ−９溶液の準備）Ｃ−９（Ｋｕｒｉｍｏｖｅ
ｒ，大日本製薬、ＬｏｔNo.Ｋ１４３）１に対して１０
の蒸留水を加える。更に１Ｎ塩酸を２の割合で加え、ス
ターラーで２時間攪拌する。１ＮカセイソーダでｐＨを
４〜６に調整する。これを蒸留水で５％溶液になるよう
希釈する。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ボツリヌスＡ型毒素をキトサン等の天然
    素材からなる核酸除去剤を用いて、失活させることなく
    結晶化させることを特徴とした治療用医薬品としての結
    晶Ａ型ボツリヌス毒素の製造法。
JP4311158A 1992-10-28 1992-10-28 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。 Pending JPH06192296A (ja)

Priority Applications (6)

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JP4311158A JPH06192296A (ja) 1992-10-28 1992-10-28 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。
DK112793A DK112793A (da) 1992-10-28 1993-10-08 Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk type A botulinium toxin som et terapeutisk medikament
SE9303323A SE9303323L (sv) 1992-10-28 1993-10-11 Förfarande för framställning av kristallint botulinumtoxin typ a som terapeutisk medicin
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Publications (1)

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Family

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Country Status (6)

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DE (1) DE4335366A1 (ja)
DK (1) DK112793A (ja)
FR (1) FR2697163B1 (ja)
GB (1) GB2272697A (ja)
SE (1) SE9303323L (ja)

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FR2697163B1 (fr) 1995-06-23
FR2697163A1 (fr) 1994-04-29
SE9303323D0 (sv) 1993-10-11
SE9303323L (sv) 1994-04-29
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DK112793A (da) 1994-04-29
DK112793D0 (da) 1993-10-08
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GB2272697A (en) 1994-05-25

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