JPS588400B2 - グアヤコン酸ａ，その製法，及び該物質を含有する糞便中潜出血を検出するための診断剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的はグアヤコン酸Ａ、その製法並びに過酸化
水素、色原体及び常用の助剤と一緒にして糞便中潜出血
を検出するための診断剤としてグアヤコン酸Ａを使用す
ることである。

糞便中の潜出血の検出は、出血を伴う消化器の疾患の診
断に重要である。

胃腸管の出血は多《の場合潰瘍、ポリープ及び特に腫瘍
が原因となる。

従って、糞便中血液の検出は消化器の癌の早期診断に重
要である。

この検出に際し、グアヤク試験が既に長い間使われてお
り、その際にベルオキシダーゼ作用性血液成分による触
媒作用を利用する。

過酸化水素から遊離した酸素が色原体上に運ばれて、こ
れが酸化されて色素になり、このようにベルオギシダー
ゼ作用性物質の存在が認められる。

グアヤク試験のいくつかの変形が知られている。

一般的には次のように行なわれる：糞便懸濁液に過酸化
水素とグアヤク樹脂のアルコール性溶液を加える。

青色への着色が血液の存在を示す。最近、糞便中血液を
診断するための早期診断薬も存在する。

この場合には、グアヤク樹脂を沢紙上に含浸させる。

このＰ紙に糞便検体を塗布し、展開するためにその裏面
に過酸化水素のアルコール性溶液を滴加する。

血液が存在する場合には、青色環が生じる。

しかし糞便中血液を検出するためにグアヤク樹脂を使用
することに問題がある。

試験管試験では非常に度々偽陽性の結果が得られ、迅速
試験では検出限界が糞便検体の他の内容物質に著しく左
右される。

これはグアヤク樹脂の性質から説明することができる。

熱帯性樹ユソウ木（ Ｇｕａｊａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉ
ｎａｌｉｓＬ，）及びグアヤクム・サンクトウム（Ｇｕ
ａｊａｃｕｍＳ ａｎｃｔｕｍ Ｌ ， ）の心材は樹
脂約１５〜２５％を含有し、これは就中エタノールで抽
出することにより得られる。

グアヤク樹脂として公知のこの生成物は多数の成分から
成っており、これは３つの主要フラクションに単離する
ことができる。

主要分（約７０％）はエーテル抽出により得られる生成
物を形成する。

これは“グアヤコン酸”と呼ばれ（ Ｈ． Ａｕｔｅｒ
ｈｏｆｆ及びその他共著、“Ａ ｒｃｈ．ｐｈａｒｍｚ
．”、２９９巻、６１８頁（１９６６年）及び３０２巻
、５４５頁（１９６９年）参照〕かつ同様に血液とべル
オキシダーゼのようなペルオキシダーゼ作用性物質の存
在で過酸化水素により青色に呈色する。

この生成物を薄層クロマトグラフイにより分離すると３
種の主要成分が得られたが、それらの単離は著しい因難
を伴うのでその構成は確実ではない。

酸化による呈色に関与するグアヤク樹脂中の成分につい
ての研究でα−グアヤコン酸として記載された単一物質
が極めて僅かな収量で単離された（ Ｋｒａｔｏｃｈｖ
ｉｌ及びその池共著、” Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ”、１０巻、２５２９頁以下（１９７１年）参照〕。

同様に酸化される僅少量で産出する池の数種の化合物と
共に、指示薬反応には作用しないが場合によっては阻止
する多数の内容物質がある。

例えば、それはグアヤレト酸、ジヒドログアヤレト酸、
グアヤシン酸、バニリン等である。

天然産物では常にすべての成分が同じ割合で産生される
とは限らず、それ故天然産生グアヤク樹肪がその都度の
単離工程で異なる組成を有していることは必然的な成り
行きである。

更に、グアヤク樹脂による含浸工程で混合物の不安定成
分が分解されることもあり、それ故また異なる組成の成
分混合物が形成され得ることも直ちに明らかである。

最近非常に重要になってきた迅速診断剤で、それらの実
用性に関する主要前提の１つは、それらを厳密にーかつ
常に再現可能に一製造し得ることである。

従来記載された迅速診断剤ではこの前提は挙げられてい
なかった。

それ故、精確にかつ再現可能に製造されておりかつ分析
的に精査されておりかつ十分に安定である、糞便中潜出
血を検出するための迅速診断剤を定義が明瞭で十分に純
粋な試薬を使用することにより開示するという課題が生
じた。

ところで、グアヤク樹脂から主要フラクションを単離す
るための公知の抽出法を変更することにより、前記の必
要な特性を有しておりかつ更に明確な実際的な検出限界
を有している唯一の主要成分が得られ、従ってそれを潜
出血を測定するための迅速診断剤中の色原体として使用
することができることが判明し驚異的であった。

グアヤク樹脂は主に２種の色素形成主成分、フログアヤ
シン及びグアヤコン酸から成り、その際にフログアヤシ
ンの構造は合成により明瞭に説明されている。

実験により、フログアヤシンが糞便中血液の迅速診断剤
の色原体として有用ではないことが明らかになった。

それというのもそれにより極めて敏感でありかつ更に不
安定である試験紙が得られるからである。

従来、他の主成分であるグアヤコン酸の単離は、文献に
よれば調製薄層クロマトグラフイーによってのみ可能で
あり、その際に該物質は、迅速診断剤の色原体として実
際上問題にならない程僅少量で生じた。

文献に多量のグアヤコン酸を単離するための種種の実験
が記載されてはいるが、その結果は余り満足すべきもの
ではない。

殊に、Ｊ．キュール（Ｋ昏ｈｌＴＨ Ｂ ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ）の学位論文、２１頁（
１９６４年）に、珪酸ゲルによるグアヤコン樹脂のカラ
ムクロマトグラフイー分離が可能ではないことが記載さ
れた。

ところで意外にも、この先入見にもかかわらず、天然グ
アヤク樹脂を珪酸ゲルを用いてカラムクロマトグラフイ
ーにより分離しかつ更に精製せずに糞便中血液を測定す
るための診断剤に使用できる、殆んど純粋な形のグアヤ
コン酸が得られることが判明した。

この成分をグアヤコン酸Ａと記載するが、初めに挙げた
文献で得られたフラクションとは同一ではない。

例えば、本発明によるグアヤコン酸Ａはアウターホツフ
（ Ａｕｔｅｒｈｏｆｆ ）による文献で形成された薄
層クロマトグラムとは異なり、その文献中に記載された
条件下で採取した薄層クロマトグラム中にＲＦ〜０．５
で唯１個のはん点を示すに過ぎない。

それ故本発明の目的は、ベルオキシダーゼ及び過酸化水
素との反応後に測定して６ ０ ０ ｎｍで比１６００
ｃｍ−１（ｍ）、１５０５ｃｍ−１（ｖ．ｓ）、１２６
０ｃｍ−１（ｓ；ｂ）、１１１５ｃｍ−１（ｍ）、１０
２５ｃｍ−１（ｍ）、１２００ｃｍ−１（ｓ：ｂ）及び
ＲＦ一値０．４５（トルエン／ジオキサン／氷酢酸９０
：２５：１０）を特徴としかつ好適な溶離液、例えばｎ
−ヘプタン／酢酸エステルー又はトルエン／アセトンー
混合液を用いて保護ガス下に、酸で前処理した中性珪酸
ゲルでカラムクロマトグラフイー処理して分離すること
により得られるグアヤコン酸（技術水準のものと区別す
るためにグアヤコン酸Ａと記載する）である。

既に記載したように、このようにして得られたグアヤコ
ン酸Ａは薄層クロマトグラフイー法では完全には単一で
はなく、即ちそれは光で又はベルオキシダーゼと過酸化
水素で青色になる主成分以外に、極く低濃度のために診
断剤中の色原体としてそれを使用する際に無視し得るの
ではあるが不純物を含有する。

本発明によるグアヤコン酸Ａは無定形でありかつ前記の
ようにＩＲ−スペクトルの吸収帯、並びに比吸光係数及
び薄層クロマトグラムのＲＦ一値により特徴付けること
ができる（例１参照）。

比吸光係数特性の記載は、前記の不純物並びに場合によ
り存在する溶剤残分がＵＶ一及び即−スペクトルのよう
な通常の分析法を著しく阻害するのでそれが有利である
と判明した。

比吸光係数とは、ベルオキシダーゼと過酸化水素による
溶液１００ｍｌ中のグアヤコン酸Ａ１ｇで生成される吸
光度であり、その際に長さ１ｃｍのキ例１で詳説したグ
アヤコン酸Ａの単離は本発明方法の優れた１方法である
に過ぎない。

勿論、天然グアヤク樹脂のアセトン／トルエンー沈澱に
よる随伴物質の分離は他の方法でも可能であり、例えば
エタノール／トルエンー沈澱、氷酢酸中に溶解しかつ水
で３０％−酢酸に稀釈し、沈澱をアセトン／トルエン（
１：５）中に採ることにより二又はメチルイノブチルケ
トン中に溶解し、ｐＨ１３の水酸化ナトリウム／ホスフ
エートー緩衝液で抽出し、有機相を濃縮しかつトルエン
で稀釈することによる。

更に、例えばキシレン／アセトン及びメチルイノブチル
ケトン／トルエンのような溶剤混合物を溶離剤として直
ちに使用することもでき、その際に量比は変動させるこ
とができる。

更に、使用するグアヤク樹脂及び溶離剤の処理量も変動
可能である。

有利には、保護ガスとしては窒素及び二酸化炭素が該当
する。

本発明の他の目的は、公知のグアヤク試験と同様に、改
良された糞便中の潜出血検出用診断剤であり，本発明で
は色原体として天然グアヤク樹脂の代りに、ベルオキシ
ダーゼ及び過酸化水素との少なくとも２００のグアヤコ
ン酸Ａを使用する。

意外にも実験により、公知のグアヤク試験と同様に製造
したが、色原体としてグアヤコン酸Ａを含有している試
験紙は“人造糞便“（水中血液）と、精製していないグ
アヤク樹脂をベースとする市販の試験紙と全く同様に敏
感に反応することが認められた。

これに対して、血液約１〜３％を加えた自然糞便中では
本発明による試験紙は陽性で反応するが、市販の試験紙
は変動結果を与え、その際に感度限界は血液１〜７％及
びそれに人工の糞便に応じて変動する。

既に記載したように、本発明によるグアヤコン酸Ａはそ
の比吸光係数により特徴付けられる。

グアヤコン酸の単離法ではグアヤコン酸Ａの純度は使用
するグアヤク樹脂及びその都度の方法条件に左右される
ので、得られるグアヤコン酸Ａの比吸光係数も異なる。

比吸光係数値が２００を越える、診断剤中のグアヤコン
酸Ａの調製物が特に好適であることが明らかになった。

粗製グアヤク樹脂は、グアヤコン酸Ａ、フログアヤシン
及び他の未知の酸化可能な成分の変動する量により得ら
れる値約１００を有している。

グアヤコン酸Ａは、診断剤において含浸溶液１００ｍｌ
当り４０〜２５０ｍｇ、殊に５０〜１５０ヤの量で、し
かも比吸光係数２５０で使用する。

他の比吸光係数では数値を相応して補正する。

ここ数年、医療プラクチス及び臨床実験で診断補助手段
としてますます所謂迅速試験が実施されている。

一般に、これは検出反応に必要な試薬で含浸されかつ検
査すべき液体中へ浸透後に呈色反応を呈する吸収性担体
、たいていの場合紙である。

これにより、病理学的身体内容物の検出又は半定量的測
定を迅速にかつ医学の助手のような訓練されていない人
でも確実に行なうことができる。

この種の試験紙は固有の反応成分以外に場合により、使
用する指示薬及び試験の用途に応じて必要である一連の
添加物、例えば緩衝液、湿潤剤、粘稠剤、保護コロイド
、錯体ビルダー及び安定剤を含有する。

本発明の目的はまた、ベルオキシダーゼ及び過酸化水素
との反応後に測定して６ ０ ０ ｎｍで比吸を色原体
として含有する、糞便中潜出血の診断用試験紙である。

グアヤコン酸Ａで含浸されている紙が光及び／又は空気
により青に変色するのを回避するには、適当な安定剤を
添加する必要がある。

その際、従来未公知のアリールセミカルバジド類からの
安定剤がこの青色着色を抑制することが判明した。

更に、一定範囲内でこのアリールセミカルバジドを加え
ることにより感度を弾力的に変えることができることが
判明した。

この酸化指示薬の新規安定剤並びにその使用については
西ドイツ国特許出願明細書第Ｐ ２ ７ １ ６ ０ ６ ０．７号に記載されており、
アリールセミ力ルバジドとは一般式Ｉ ： Ａｒ−ＮＨ−ＮＨ −ＣＯ −ＮＨ２ （Ｉ）Ｃ式中Ａ
ｒは場合によりアルキル、アルコキシ又はハロゲンによ
り置換されているアリール基を表わす〕の化合物である
。

有利には、■式のアリール基はフエニル又はナフチルを
表わし、アルキル基又はアルコキシ基は炭素原子１〜４
個を含有し、殊にメチル基又はエチル基でありかつハロ
ゲンは殊に弗素、塩素及び臭素を表わす。

更に、試験紙を錯体ビルダーで含没すると有利であり、
これにより殆んどの試験紙に含まれている金属イオンを
錯結合する。

このための特に好適なものとしては、エチレンジアミン
テトラ酢酸の塩、特にカリウム塩であり、しかもそれは
同時に緩衝剤としても使用することができる。

試験紙は水溶性物質が比較的多量であるので流出するこ
ともあり、従ってメチルセルロース、ゼラチン及びポリ
ビニルピロリドンのような粘稠剤を処方に加えると実質
的であり、この際にこれは保護コロイドとしても作用し
得る。

湿潤剤としては、殊に長鎖状の有機サルフエート又はス
ルホネートを使用することができる。

本発明による試験紙の製造は、例えば沢紙、セルロース
又は合成繊維フリースのような吸引性担体を、成分を有
利には水及び低級アルコールもしくはアセトンの混合液
中に含有している溶液で含浸しかつ引続いて試験紙を乾
燥させる。

しかしまた例えば錯体ビルダーを初めに水から前含浸さ
せ、その後で他の成分を有機溶液から後含浸させること
もできる。

種々の製法によるこれらの紙は同じ結果を示す。

これとは反対に、未精製グアヤク樹脂で含浸されている
紙は轟然その感度において強い変動を示す。

常用の試験片とは反対に、本発明による試験ではすべて
の反応成分が担体に含浸されているとは限らない。

それ故、呈色を直ちに評価できる場合には、初めに過酸
化水素の添加を行なうべきことは安定性という理由から
明らかである。

この場合、糞便中の潜出血の検出を次のように行なう：
その製造については以下の実施列に記載した試験片を初
めに検査すべき糞便の検体で塗布する。

検体の乾燥後、これに担体の裏面からアルコール中の過
酸化水素の溶液を滴加する。

その際に、血液の存在では青色に呈色する。

次に、本発明を実施例により詳説する。

例１ グアヤコン酸Ａの製造 粉砕したグアヤク樹脂２００ｇをアセトン、５００ｍｌ
と攪拌し、その際に樹脂はほぼ完全に溶解する。

攪拌下にトルエン３ｌを滴加し、約３０分後に沈澱物質
（約６０ｇ）を吸引ろ別しかつこの残渣を廃棄する。

ｒ液を真空中で濃縮すると、暗褐色のガラス状残渣約１
６０１が得られる。

これをｎ−ヘプタン／酢酸エステルー混合液（２：５）
５００ｍｌ中に加温下に溶解しかつ冷却後に直径８０ｃ
ｍ及び高さ１．６５ｍの珪酸ゲル力ラム（珪酸ゲル３．
１ｋｇ、粒径０．０ ６ ３ 〜０．２ｍｍ）に加える
。

珪酸ゲルは予め２Ｎ−ＨＣＩ により鉄分を除き、蒸
留Ｈ２０で中性になるまで洗浄しかつ真空乾燥する。

分離は、ｎ−ヘプタン／酢酸エステルー混合液（２：５
）７．５ｇで保護ガスとしてのＣＯ２下に行なう。

１回５９ｍｌで１５０のフラクションが捕集される。

フラクション１１５〜工４５から濃縮後に黄灰色のガラ
ス状物約１６．５ｇが得られ、キンレン１５０／ｒＬｌ
からの再結晶によりグアヤコン酸Ａ約１２１がそこから
得られる。

各フラクションを薄層クロマトグラフイーで検査すると
有利である。

それというのも場合によっては所望物質の溶離による移
動が起り得るからである。

薄層クロマトグラフイー 珪酸ゲル調製板６０Ｆ−２５４メルク（Ｍｅｒｃｋ社） 展開剤：トルエン／ジオキサン／氷酢酸（９０：２５：
１０）；ＲＦ一値０．４５ 散布液： 水中のべルオキシダーゼ０．０５％及びＨ２０２０．５
％によりグアヤコン酸Ａは青色に呈色する。

水中のホルマリン６％及び硫酸２６％によりかつ５分間
の加熱によりグアヤコン酸Ａは褐紫色に呈示しかつその
不純物は赤色乃至紫色に呈色する。

比吸光係数の測定 グアヤコン酸Ａ４．Ｏｒｖを５０％一水性アルコール４
００ｒｒＬ７ｉ中に溶解する。

この溶液１，Ｏｍｌ，蒸留水中のポリビニルピロリドン
Ｋ９０の３％一溶液０． ５ ｍｌ， Ｑ， １ モル
ーＨ２０２水溶液１．０ｍｌ及び蒸留水中の西洋わさび
ベルオキシダーゼの１％一溶液０． １ ｒｕｌ（ １
〜２・１０３Ｕ／ｍ９）を蒸留水で１０ｒｒＬｌに調製
する。

十分に混合した溶液を５〜１０分後に１ｃｍのキュベッ
ト中６ ０ ０ ｎｍで測定する。

比吸光係数＝測定した吸光度・１ ０ ０ ０ ＩＲ一
吸収帯（ＫＢＲ） ： １６００ｃｍ−１（ｍ）；１５
０５ｃｍ−１（ｖ．ｓ），１２６０ｃｍ−１（ｓ ｙｂ
）；１１１５ｃｍ−１（ｍ）：１０２５ｃｍ−１（ｍ）
：１２００ｃｍ−１（ｓ ：ｂ ）例２ 糞便中潜出血の検出用試験紙 ろ紙ンユライヒヤー＆シュル（ Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆Ｓｃｈａｌｌ ） ５ ９ ７ＮＦ−Ｉｎｄ，を次
の溶液で含浸しかつ５０℃で乾燥させる： 異なる基本員の糞便３０個に漸次増加する量の血液を混
合しかつ均質化し、標準条件下に常に同量を試験紙上に
もたらしかつ乾燥後に裏面にベルヒドロール１１ｍｌと
エタノール１００ｍｌとの混合液２滴を施す。

陰性及び陽性反応の、市販の試験紙に対するパーセンテ
ージを次表に示す。

で陽性反応を呈する、被検物質の濃度である）が本発明
による試験紙では血液２％の添加であることが明らかで
ある。

市販品の実質的検出限界は挙げることができず、これは
製造者もその案内書で明記していない。

血液水溶液により両方の試験紙は稀釈度１：５０００以
上で湯性反応する。

例３ 糞便中潜出血の検出用試験紙 で）６０ｍｇをエタノール中に溶解する。

この溶液でＰ紙ワットマンＮｏ１を含没する。

５０℃で乾燥後、例２に記載したものと実質的に同特性
を有する試験紙が得られる。

例４ 酸Ａ１４０η及び後記の１−アリールセミカルバジド７
０ηをメタノール１００ｍｌ中に溶解する。

予めＥＤＴＡ とカセイソーダからのｐＨ５．５の０
．４モル緩衝液で前含浸したろ紙ワットマンＮｏ１を前
記溶液で含没する。

５０℃で乾燥後に例２で記載したものと実質的に同じ特
性を有する試験紙が得られる。

１−フエニルセミカルバジド １ − （ ｏ − トリル）一セミカルバジド１−（
ｍ− トリル）一セミカルバジド １−（ｏ−メトキシフエニル）一セミカルバジド １−（ｐ−メトキシフエニル）一セミカルバジド １−（ｍ−クロルフエニル）一セミカルハシト１−（α
−ナフチル）セミカルバジド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼ及び過酸化水素との反応後とも２
   ００、ＩＲ一吸収帯１６００ｃｍ−１ （ｍ）・１５０
   ５ｃｍ−１（ｖ−ｓ）、１２６０ｃｍ−１（ｓ；ｂ）、
   １１１５ｃｍ−１（ｍ）、１０２５ｃｍ−１（ｍ）、１
   ２００ｃｍ−１（ｓ ；ｂ）及びＲＦ−値０．４５（ト
   ルエン／ジオキサン／氷酢酸９０ ： ２５ ：１０）
   を有し、天然グアヤク樹脂から、酸で前処理した中性珪
   酸ゲルでｎ−へプタン／酢酸エステルー又はトルエン／
   アセトンー混合液を用いて不活性ガスによる保護下にカ
   ラムクロマトグラフイー処理により分離して得られるグ
   アヤコン酸Ａ０２ ペルオキシダーゼ及び過酸化水素と
   の反応後とも２００、ＩＲ一吸収帯１６００ｃｍ−１（
   ｍ）、１５０５ｃｍ−１（ｖ．ｓ）、１２６０ｃｍ−１
   （ｓｏｂ）、１１１５ｃｍ−１（ｍ）、１０２５ｃｍ−
   １（ｍ）、１２００ｃｍ−１（ｓ：ｂ）及びＲＦ一値０
   ．４５（トルエン／ジオキサン／氷酢酸９０：２５：１
   ０）を有し、天然グアヤク樹脂から、酸で前処理した中
   性珪酸ゲルでｎ−ヘプタンー酢酸エステルー又はトルエ
   ン／アセトンー混合液を用いて不活性ガスによる保護下
   にカラムクロマトグラフイー処理により分離して得られ
   るグアヤコン酸Ａを製造する方法において、天然グアヤ
   ク樹脂をアセトン中に溶かし、トルエンの添加により得
   られる沈殿を除去し、濾液を蒸発乾固し、残渣をｎ−ヘ
   プタン／酢酸エステル又はトルエン／アセトン中に溶か
   し、前処理した中性珪酸ゲルで充填されているカラムを
   介してこの溶液なｎ−ヘプタン／酢酸エステル又はトル
   エン／アセトンを用いてカラムクロマトグラフイー処理
   により分離し、ＲＦ＝０．４５（トルエン／ジオキサン
   ／氷酢酸９０：２５：１０）の得られたフラクションを
   捕集しかつ蒸発濃縮した残渣をキシレンから再結晶させ
   ることを特徴とするグアヤコン酸Ａの製法。 ３ ペルオキシダーゼ及び過酸化水素との反応後とも２
   ００、ＩＲ一吸収帯１６００ｃｍ−１（ｍ）、１５０５
   ｃｍ−１（ｖ．ｓ）、１２６０ｃｍ−１（ｓ：ｂ）、１
   １１５ｃｍ−１（ｍ）、１０２５ｃｍ−１（ｍ）、１２
   ００ｃｍ −１（ｓ：ｂ）及びＲＦ一値０．４５（トル
   エン／ジオキサン／氷酢酸９０：２５：１０）を有し、
   天然グアヤク樹脂から、酸で前処理した中性珪酸ゲルで
   ｎ−へプタン／酢酸エステルー又はトルエン／アセトン
   ー混合液を用いて不活性ガスによる保護丁にカラムクロ
   マトグラフイー処理により分離して得られる色原体とし
   てのグアヤコン酸Ａを過酸化水素及び常用の助剤と一緒
   に含有して成るグアヤコン酸Ａを含有する糞便中潜出血
   を検出するための診断剤。