JPS5883631A - 肝炎のための安全なワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎は感染および非感染の型で存在しつるウィルス性病
気である。血液の輸注における伝搬に特に関連している
。病気の症状があられれない多くのウィルスの保有者が
存在することは知られている。それにもかかわらずこの
人々は、感染に対して感受性のある他の人々に、特に血
液の輸注（血液が慎重に監視されない場合）を通じて、
病気を伝搬することができる。

肝炎の広範囲の特性ゆえに、この病気のために人々にワ
クチン化することが望ましい。ワクチン化にはウィルス
の蛋白膜（ｐｒｏｔ＠ｉｎ　ｅｏａｔ　）に期待が掛け
られており、困難であるが可能であり、ウィルス性クロ
マトシームの包含をさける念めに慎重に精製しなければ
ならない。蛋白膜の分離および精製に費用のかかる性質
ゆえに、用いられるワクチンは安価に得られることはな
く、特にこの領域で、現在、高費用で、有効なワクチン
を得ることはできない。

ヒト血清アルブミンおよび肝炎８表面抗原は、肝炎Ｂウ
ィルスのウィルス性膜蛋白質と関係がある〔ニューラス
ら：　ＰＮＡＳ　、　ＵＳＡ　７１巻、２６６３（−〕
（１９７４）；イオネスキューマテユウら：Ｊ、　Ｍａ
ｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　６巻、１７５４−ジ（１９８０）
〕チオライスら：　Ｓｃｉ＠ｎｃｅ　２１３巻、４ｏ６
−２−ノ（１９８１）参照〕。肝ぞうにおいて、ウィル
ス複製の膜蛋白でアルブミン分子のありふれた存在は、
当然期待される。イン・ビトロにおけるアルフミンの老
化または熱またはグルタルアルデヒド重合化は、免疫さ
れる動物において抗体を誘発する生成物となる〔オニ力
ら：　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１７巻、７ｓ３−ｅ−ジ（１９８０）参照〕。重合化し
念アルブミンに対する抗体は、急性もしくはｔ鞭性肝ぞ
う病患者の血清において発見された〔レンケイら：　Ｊ
−Ｍ＠ｄｅ　Ｖｌｒｏｌ、　１巻、２ｔａ−ニー）（１
９７７）参照〕。重合化しなヒトアルブミン（ＰＨＡＬ
Ｂ　）に対する生理学的および病理学的抗体の生成は、
オニ力およびレンｌイ（でよって報告されている〔オニ
力ら：　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、　１５巻、
９４１ページ（１９７８）：レンケイおよびｒエテイエ
：　ａＬ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ｌ　
６巻。

２３−ｅ−ジ（１９７７）；イマイら：Ｇａ５ｔｒｏ＠
ｎｔ＠ｒｏｌｏｇｙ　７６巻＃２４２ページ（１９７９
）参照〕。肝ぞう病患者および正常者の血清におけるＰ
ＨＡＬＢとの血清学上の反応性の関係およびＣ１，とＰ
ＨＡＬＢとの相互作用は、ミリヒらによって報告されて
いる〔ミリヒら：Ｇａａｔｒｏｓｎｔ＠ｒｏｌｏｇｙ　
７９巻ｅｌ１１６．（’−〕（１９８０）；ミリヒら：
　Ｇａｉｔｒｏｓｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８１巻、２１８ペ
ージ（１９８１）参照〕。

本発明は、他の肝炎ウィルス誘導性免疫原の不在下に肝
炎のためのワクチンとして生理学的に許容され得る担体
において、重合化しなヒトアルプミ／を用いることを提
供するものである。甲いられる重合化したヒトアルブミ
ンは少なくても６重量体であり、活性な免疫原は生成さ
れ、その場合注射はＰＨＬＢへの免疫原反応をもならし
、しかし単量体アルブミンで社もたらさない（肝炎から
ホスト保護ができる）。

重合化したヒト血清アルブミン（ＰＨＡＬＢ　）　１″
ｉ、肝炎ウィルスのためのワクチンとして生理学的に許
容され得る担体において製造され、用いられる。

重合化し念アルデミン組成は、望ましくけ平均して少な
くても６重合体であり、好ましくけ約８重合体であり、
一般的に約１２以下にすべきであり、約１０以下にある
こと（６−１２；７−１０）が望ましく、その場合９０
チもしくは大部分が同程度の重合度であり、平均して８
重合体の組成であることが非常に望ましい０重合化しな
ヒトアルブミンを、常法、すなわち老化によって、熱も
しくは光処理、化学的交叉連結によって、たとえばアル
デヒド、ホルムアルデピド、ジアルデヒド、グルタルア
ルデヒドまたは他の生理学的に許容され得る力めし止剤
によって生成することができる。

望ましい重合度のものを生成（所望ならば次いで精製す
ることによって）する最適の条件を選択する。分子量に
よる大規模の分離のために、沈降または遠心法が用いら
れ、同密度帯、勾配密度クロマトグラフィー遠心、ｔた
は大き々カラムでのｒルクロマトグラフィーによる分子
ふるいを用いる。

重合化したヒトアルブミンを化学的にもしくは熱力的に
、生理学的許容され得る多価性カチオンもしくは熱処理
で凝集化する。

一方重合化したアルブミンは、ヒトのために望ましく、
ある種のための同種間の重合化したアルブミンは、肝炎
に抗する安価なワクチンを提供すべく哺乳類の種のため
に使用され得る。ゆえに肝炎感染の対象となる家畜また
は他の哺乳動物のために、発明に係る実験材料はワクチ
ンとして使用できる。

適用方法は、広範囲に変化しつる。死菌ワクチン投与の
常法が応用される。固体で生理学的に許容され得る基剤
での経口膜島まえは生理学的に許容され得る分散剤で、
防着外に、注射もしくは類似の方法で、投与される。ワ
ク′チンの投与量は、投与経路に依存し、ホストの大き
さに基づいて変化する。なぜならワクチンは副作用はほ
とんどなく、相対的に多量の投与量を、ホストに損傷を
与えることなく用いることができる０通常、ワクチンの
量は、約１μＮ−２０，０■／に１？ホストであり、ワ
クチンによる免疫化を高める補助剤または適当な担体と
混合し今後、皮下Ｋｔ九は筋肉内に約５μｍ１−２．０
Ｍ９／に９で投与するのがもつと一般的である。

ワクチンへの補助効果を得るための種々の方法は、水酸
化アルオニウムまたはリン酸アルミニウムのような試薬
の使用を含み、通常塩化ナトリウム−リン酸緩衝液の０
．０５−０．１−液として用い、糖の合成重合体（カル
＆／−ル）と混合した０、２５−溶液として用い、温度
範囲７０°−１０１℃で３０−２分間熱処理によるワク
チンにおける蛋白質の凝集、アルブミンに対するペプシ
ン処理をした（　Ｆａｂ　）抗体との反応による凝集、
Ｃ，パルパン（Ｃ，ｐａｒｖｕｍ）のようなバクテリア
細胞または内生毒素またはグラム−陰性バクテリアのリ
ポ多糖類成分との混合、マンニットモノ−オレイン酸塩
（アラセルム、Ａｒａｅｅｌム）のような生理学的に許
容され得る油賦形剤における乳化、血液代用として使用
スるノ臂−フロロカー〆ン（フルオソールーＤＡ　ａ　
Ｆｌｕｏｓｏｌ　−Ｄム）の２０チ溶液での乳化管含む
０補助剤化のもつと新規・の方法はホストが前免疫化さ
れていることに抗するバクテリア毒素を含み、たとえば
破傷風−トキソイドまたはジフテリア−トキソイドの１
モルにつきワクチンの５モルをカップリングすることに
よって、ワクチン化合物はＰＨＡＬＢＫ対する高−免疫
反応を誘発する。補助剤量は、補助剤の特性に依存して
広範囲に変化し、一般的に免疫原−重量の０．１〜１０
０倍であシ、もっと一般的には１〜１０倍である。

′多くの場合に１ワクチンの重複投与することが望まし
く、一般的には六つのワクチン接種以下で、もっと−一
的に４つのワクチン接種以下で、好ましくは１つもしく
はそれ以上で、一般的には少なくても３つのワクチン接
種である。ワクチン接種は通常２−１２週期間で、もつ
と通常では３−５週期間である。１−５年間の間隔で、
通常３年間周期的増強法は、抗体の保膜レベルを維持す
るために望ましい。免疫化の過程はＰＨＡＬＢへの抗体
の丸めの効力検定を経て進む。効力検定は、慣例的なラ
ベル、九とえば放射性核種のようなものでＰＨＡＬＢの
ラベル化によって酵素、螢光およびその他によって行な
われる。これらの技術（手段）は良く知られており、こ
の種の効力検定の実鉦として米国特許番号３７９１９３
２．４１７４３８４および３９４９０６４のような種々
の特許に広範囲に開示されている。効力検定の型は分離
段階を含まない均質（同質）と分離段階を含む不均質（
ｊ！質）とに分けることができる。

放射性免疫検定（ラジオイムノアッセイ）は不均質（同
質）検定である。放射性免疫検定は、表面に、粒子もし
くはコンテナの表面のいずれかにＰＨＡＬＢ　１に結合
させることによって、結合したＰＨＡＬＢに血清試料を
加え、Ｐ）ＩＡＬＢ対するある抗体が、結合したＰＨＡ
ＬＢと反応する、十分な時間で、培養を行なう０次いで
放射性核種−ラベルしたＰＨＡＩＪｆ：コンテナに加え
、ラベルしたＰＨＡＬＢが表面に結合し九ある抗体と結
合する十分な時間で培養し、洗浄し、次いで表面に結合
した放射性活性を測定する。必要に応じて、グロトコー
ルを用いる。

均質（同質）検定において、ＰＨＡＬＢ　ｉ螢光性の分
子で置換し、ラベルしたＰＨＡＬＢ　ｉ試料と結合させ
、次四で螢光体に抗体を添加する。螢光体の選択に依存
して、抗体の螢光体への結合は螢光の増加もしくは減少
をもたらす、抗体のＰＨＡＬＢへの結合は螢光体への抗
体の結合を抑制するので、検定媒質の螢光の測定によっ
て、すなわちＰＨＡＬＢ対する既知Ｉの抗体管含む検定
媒質と、試料におけるＰＨＡＬＩＩ対する抗体の存在量
と比較して決定できる。

特別の方法で、血清試料におけるＰＨＡＬＢに対する抗
体の存在を決定するのは、本発明に保る重要な面ではｔ
い。

次に実験によってこの発明をさらに具体的に説明すゐ。

実験 交叉一連結したＰＨＡＬＢ　ｌ製造するために、結晶ヒ
ト血清アルブミン（ＢＳＡ　）を０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，８：３．６耐）に溶解する０重合化は２．５
饅グルタルア某デヒドー０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ（
、ｇ：Ｑ、４１１Ｊ？）を添加することによって、成【
７遂げられる。室温で２時間放置後、反応混合物は、Ｐ
Ｈ８（３Ｘ５００ｉ＋／）に対して透析し、３．６およ
び１８時間間隔で交換する。ＰＨＡＬＢは、重合体を安
定化するために、０．１１ナトリウム硼化水素化物で処
理し、未反応のアルデヒド基を中性化し、ＰＢＳ中でセ
フ丁アクリルＳ−３０（１”ルカラムでりｐマドグラフ
ィー処理管する０分離された第一の主分画は平均分子量
ｓｏｏ、ｏｏｏダルトンである。

放射性免疫検定の実施や丸めに、ＨｓＡはクロールアミ
ｙ　−Ｔ　（ｃｈｌｏｒａｒｎｌｎｅ−Ｔ　）またはフ
ンターーケルデン試薬（Ｈｕｎｔ＠ｒ−Ｂｏ市ｉ＋）を
用いて１２５Ｎで前ラベルし　１２５１−丹仄ｌ試験材
料を得るために前記の１合化操作を行なう、０．５ａｍ
直径の一すスチレンピーズを第一に丹囚ＩＪ　−ＰＢＳ
　ｌ液（０，５η／１）でコーティングする。　ＰＨＡ
ＬＢ−コーティングしたビーズは０．２慢ツウイーン２
ｏおよび０、５　％　ＢＳＡ　Ｉ含むＰＨ８（Ｆ”６．
４）テ洗浄し、空気乾燥する。２テスト血清は、滴定の
ために連続的にＰＨ８および２．５嘔Ｂ８Ａ（ＰＨ７，
２）で希釈し、各々の希釈液に丹用Ｊ−コーティングし
たビーズを加え、２時間３７℃で培養し、次いで、ビー
ズを４回、脱イオン化水で洗浄する。各々のビーズは１
２５Ｘ−ラベルしたＰＨＡＬＢ試験材料と反応させ、４
時間３７℃で培養し、４回洗浄し、ビーズに結合した放
射性活性はガンマ−カウンターでカウントする。ネガテ
ィブ−コントロールの２．１倍ｊＭ上のカウントを与え
る血清試料の最大希釈を４ジテイブと判断し、滴定の最
終点とする。ネガティブ−コントロールビーズは重合化
し九トランスフェリンでコーティングする。

急性肝炎Ａ患者からのヒト血清、回復期肝炎Ｂからの血
清、および慢性非Ａ／非Ｂ肝炎からの血清はガンマ−グ
ロブリン画分において、ＰＨＡＬＪ３に対する抗体の存
在を示めす。抗体の血清学上の特異性は限定抗体の４単
位を用いての中和反応によって明らかにされる。ＰＨＩ
、Ｂ　（０，１ｄ　）および精製した肝炎ウィルス−エ
ンペロブ蛋白（３，０μＩＩ）は抗体を中和し、ｌ５Ａ
（１０００μＩｊＪ下）および他の血漿蛋すはＰＨ１，
Ｂ’に対するヒト抗体を抑制すること゛はできない。ｎ
１１１したＨＢＶおよびＰＨＡＬＢのエンペロブ蛋白は
血清学上の決定因子を共有し、ＰＨＡＬＢに対する抗体
は肝炎Ｂウィルスを含む肝親和性のウィルスによる感染
に対抗して効果的な保ＩＩＩを提供する。

ワクチンの製造のために、ＰＨＡＬＩＩ　（６，０■）
ｔ−ｒｙ＝、）−ｘ（２０Ｍ９）／ＰＢＳ　（１ｉｄ）
と混合し、６０℃で１１時間加熱し、次いで１０１℃で
１−２分間加熱する。加熱処理管したＰｆ（Ａｌｌは０
．１−水酸化アルミニウムの同量と混合し、毒性および
発熱性試験をする。ＰＨＡＬＢは免疫のためのワクチン
として用いられ、常法で処方する。ミネラルイオン（ア
ルミニウムは第一の免疫性反応の導入に要するけれども
、免疫化の部位で、延長した肉゛芽腫を生成するので）
増強のために熱処理したＰＨＡＬｊｌだけを、アル電の
補助剤なしに第二免疫法に用いる。

与えられた免疫性の効能は、ＰＨＡＬＢに対する抗体の
ためのホスト血清の血清学上の試験によって検試される
。ＩｇＭ−型の第一免疫性反応は、０．１Ｍ２−メルカ
ゾトエタノールを用いてのテスト血清の処理によりてＩ
ｇＧ−型第二免疫性反応から区別される。ＰＨＡＬＢ　
Ｋ対する第二免疫反応は長く続き肝親和性ウィルスによ
る感染に対抗して保護する・ 本発明に基づいて、安価な安全なワクチンは提供され、
肝親和性ウィルスによる肝炎感染の場合に１迅速な免疫
性反応の丸めに〈シ返して、哺乳類ホストに投与するこ
とができる。ヒト血清アルプインは容易に精製すること
ができ、生理学的成分へ重合化することができる。非常
に費用のかかる技術（手段）Ｋよって製造されたワクチ
ンのできない個体群（住民）も肝炎から保護することが
できる。

前記の発明に関して、実施例、および参考例によって詳
細に藪明されているけれども、ある変化、改善は添付し
た特許請求の範囲内で行なわれ得る可能性がある。

特許出願人 デリージェンツ　オプザユニパーシティオツ　カリフォ
ルニア 特許出願代理人 弁理士青水　朗 弁理士西舘和之 弁理士　　内　１）幸　男 弁理士　　山　　口　　昭　　之

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生理学的に許容され得る担体においてホス）　（ｈ
   ｏｓｔ　）に免疫原反応を誘発する重合化した血清アル
   ミプミンの効能量を該ホストに投与し、該重合化した血
   清アルブミンが６から１２血清アルブミン単位を有し、
   肝親和性ウィルスのいかなる部分も含まないことからな
   る肝炎感染に対する該ホスト感受性を保護するための方
   法。 ２、同じホストに少なくても二回該投与すゐ特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３、該重合化した血清アルブミンが平均して８重合株で
   ある特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の方法。 ４、＃重合化した血清アルブミンを熱力的にまたは化学
   的に、凝集させる特許請求の範囲第１項もしくは第２項
   ゛記載の方法。 ５．６−１２単位からなり、肝親和性ウィルスから誘導
   された遺伝物質または他の蛋白質を含まない１および免
   疫原反応を誘発するに十分量である重合化しな血清アル
   ブミンと免疫原補助剤と併用してなる肝炎に抗する哺乳
   類ホストのためのワクチン化に有用なワクチン。 ６　該重合化血清アルブミンを熱力的にもしくは化学的
   に凝集させる特許請求の範囲第５項記載によるワクチン
   。