JPS5879163A - 糖結合ヘモグロビンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液試料中の糖結合ヘモグロビンの測定法に関
する。

糖結合ヘモグロビン（Ｉ（ｂＡＩ）はヘモグロビン（Ｈ
ｂＡｏ）の酵素的ではない糖結合により起る。正常では
血中の糖結合ヘモグロビンの濃度は全ヘモグロビンに対
して約５％である。糖尿病患者の場合、この濃度は２〜
４倍に上昇する全ヘモグロビンに対する糖結合ヘモグロ
ビンの割合の測定は最近糖尿病診断で重要になっている
［　Ｌ、ＪｏｖａｎｏｖｉＱ及びＯ，Ｍ、Ｐｅｔｅｒａ
ｏｎ共著、”　Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、　”、７０巻、３３
１〜３３δ頁（１９８１年）参照〕。個々のヘモグロビ
ン分子とグルコースとの反応により安定な反応生成物が
生成し、これは赤血球の全寿命の間、従って約１００〜
２００日間保持されている。血糖含量の短時間の変動は
糖結合ヘモグロビンの濃度に決定的には影響を与えない
。それ故糖結合ヘモグロビンの濃度は長期間にわたる患
者の血中平均グルコース濃度を比較的正確に示す。

全ヘモグロビンに対する糖結合ヘモグロビンの割合を測
定するためのいくつかの方法が公知である。

臨床研究室で最も広く行なわれているのはクロマトグラ
フィ分離法である。この場合、糖結合ヘモグロビンを非
糖結合ヘモグロビンからクロマトグラフィカラム、ミク
ロカラム或いはまりＨＰ：ｒＪＯ（高圧液体クロマトグ
ラフィ）を用いて分離し、その際カラムはイオン交換体
、例えばビオレックス（ＢｉｏＲｅｘ　）　７０で充填
されている。しかしすべてのこれらの方法はｐＨ値、温
度、イオン濃度の変化に対して非常に敏感である。それ
故、最適な結果を得るにはこの方法を非常に注意深〈実
施しなければならない（前記文献、３３２頁参照）。

西ＩＳイツ国特許公開第２９５０４５７号明細書から血
液試料中の糖結合ヘモグロビンの測定法が公知であり、
この方法ではアロステリックエフェクタを添加する際に
血液試料の分光学的性質が変化するのをＨｂＡ、ｌ　　
の測定に利用する。

この場合、非糖結合の主要分のヘモグロビンが作用を受
けるに過ぎない。測定した吸光度差は極めて小さい。更
に、全ヘモグロビンに対スル糖結合ヘモグロビンの割合
が増加する場合には吸光度差は一層小さくなる。

それ故、本発明の課題は、糖結合ヘモグロビンを技術的
に簡単に実施することのできる迅速法で確実にかつ正確
に測定できる方法を開示することであった。

本発明によりこの課題は、赤血球からヘモグロビンを遊
離するために血液試料を化学的又は物理的に処理した後
で糖結合と非糖結合のヘモグロビンの分化をハプトグロ
ビンを用いて実施しかつヘモグロビンとハプトグロビン
との間の反応を動力学的に追求するか又はハプトグロビ
ンに結合したヘモグロビン或いはハプトグロビンに結合
していないヘモグロビンの割合を公知方法で測定するこ
とにより解決される。糖結合ヘモグロビンと非糖結合の
ヘモグロビンとの分化とは、糖結合ヘモグロビンと非糖
結合ヘモグロビンとの区別をその化学的及び物理的性質
に基づいて許容するすべての方法である。

それ故、本発明の目的は、初めに血液試第１・１を化学
的又は物理的に処ＪＪｌｊすることにより糖結合ヘモグ
ロビン及び非糖結合ヘモグロビンを赤血球から遊離し、
場合によりヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換し、
その後糖結合及び非糖結合のヘモグロビンの分化を実施
し、次いで非糖結合ヘモグロビン或いはまた糖結合ヘモ
グロビンの割合を公知方法で測定する血液試ネ・ｌ中の
糖結合ヘモグロビンの測定法であり、糖結合ヘモグロビ
ンと非糖結合ヘモグロビンとの分化をハプトグロビンを
用いて行なうことを特徴とする。

本発明方法は好適な緩衝系の存在において実施すること
ができる。本発明範囲において好適な緩衝系としてはそ
れぞれｐＨ範囲４．０〜８５、殊に６．０〜７０で作用
性の緩衝剤を使用することができる。ホスファート緩衝
剤及びビス−トリス−緩衝剤が特に有効であることが判
明した。

ハプトグロビン（Ｊ（ｐ　）は血漿蛋白である。ノ・シ
トグロビンが赤血球から遊離したヘモグロビンと結合し
得ることは長い間公知である〔Ｔ。

５ａｓａｚｕｋｉ著、″工ｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉ８ｔ
ｒｙ　”、８巻、６９５〜７０４−頁（１９７１年）参
照〕。

糖結合及び非糖結合のヘモグロビンがハプトグロビンに
対するその結合挙動において異なっていることが認めら
れ驚異的であった。糖結合ヘモグロビンは非糖結合ヘモ
グロビンよりも速くハプトグロビンＯこ結合する。例え
ばこれは糖結合もしくは非糖結合のヘモグロビンを添加
した後でハプトグロビン含有測定溶液の螢光強さの低下
を試験することＧこよりその結果として生しる。ヘモグ
ロビンとハプトグロビンとの間の相互作用の尺度である
螢光線の測定は公知方法で行なう。第１図に両方の測定
溶液の螢光強さを時間Ｇこ対してプロツトシた。糖結合
ヘモグロビンを添加した後の螢光強さは非糖結合ヘモグ
ロビンを添加した後よりも迅速に低下することが明らか
である。これは、ハプトグロビンと糖結合ヘモグロビン
との結合作用がハプトグロビンと非糖結合外とのそれよ
りも強いことを示す全ヘモグロビンに対する糖結合分を
測定する方法は、初めＯこ常法により赤血球から糖結合
及び非糖結合のヘモグロビンを遊離して行なうと有利で
ある。溶血した血液試料に、場合により好適な酸化剤を
予め添加してヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換し
た後で、ハプトグロビン含有溶液を添加する。糖結合ヘ
モグロビンが優先的にハプトグロビンに結合する。結合
ヘモグロビンもしくはメトヘモグロビンを非結合のもの
と区別するために常用の測定法を適用する。異なる糖結
合ヘモグロビン含量の種々のヘモグロビン含有試着を測
定すること０こより検量曲線を作成することができ、そ
れに基づいて未知試料中の全ヘモグロビンに対する糖結
合割合を測定することができる。

糖結合ヘモグロビンと非糖結合ヘモグロビンのハプトグ
ロビンに対する結合挙動における相違をアロステリック
エフェクタ部位への結合作用を有する化合物１種又は数
種を添加することにより強めることができる。そのよう
な化合物は公知である。例えば、２．３−、ジポスポグ
リセラート及びイノシットヘキサホスファートのような
有機リン化合物、イノシットヘキザザルフエートのよう
な有機サルフェート及びメリト酸のようなカルボン酸が
挙げられる。

それ故、本発明方法の優れた実施形では糖結合と非糖結
合のヘモグロビンの分化をハプトグロビンを用いてヘモ
グロビンのアロステリックエフェクタ部位に結合作用を
有する化合物１種又は数種を添加して実施する。本発明
方法を実施するに当り、アロステリックエフェクタ部位
への結合作用を有する一連の物質を当業者は使用するこ
とができる。本発明ではイノシットヘギサホスファート
、２．３−ジボスホグリセラート及びメリト酸が特に好
適である。それらをヘモグロビン含■に対して少なくと
も当量で溶液に添加する。しかし、一般にはこの物質を
過剰量で、殊に１０〜２００倍のモル過剰量で使用する
ことは有利である。

ハプトグロビンに対する糖結合及び非糖結合ノヘモクロ
ビンの結合挙動に対するイノシットヘキサポスファート
の作用は第２図から明らがである。該図では糖結合ヘモ
グロビンとイノジットへギサポスフアートもしくは非糖
結合ヘモグロビンとイノシットヘキサホスファートの添
加後のハプトグロビン溶液の螢光強さの低下を時間に対
してゾロットシた。測定曲線は、イノジットへキザホス
ファートの存在において糖結合ヘモグロビンが非糖結合
ヘモグロビンよりも著しく迅速にハプトグロビンに結合
することを明瞭に示す。

場合により、糖結合ヘモグロビンと非糖結合ヘモグロビ
ンとを分化する前に一般に赤血球の溶血後に存在するヘ
モグロビンをメトヘモグロビンに変換すると有利である
。これについては当業者は一連の公知方法、例えばカリ
ウムへキサシアノフエラート（■）又は亜硝酸ナトリウ
ムによる酸化を適用することができる。

ヘモグロビンかつまたメトヘモグロビンをヘム結合の配
位子１個又は数個で安定化することは有利である。原則
的に、すべて　の可能なヘム結合配位子が本発明方法に
好適である。アルギルイソシアニＰＸ酸素、−酸化炭素
及び−酸化窒素がヘモグロビンのヘム結合配位子として
並びにフルオリド、アジ１７１シアニ＋ｙ及び水がメト
ヘモグロビンのヘム結合配位子として特に優れている。

測定溶液中のヘム結合配位子の濃度はヘム濃度に対して
少なくとも等モルにずべきである。各ヘモグロビン分子
は４個のヘム基を有しているので、最低濃度はヘモグロ
ビン濃度の４倍Ｇこ相当する。しかしヘム結合配位子を
大過剰で、殊に１０〜１０　倍のモル過剰量で使用する
と有利である。

更に、測定溶液に、ハツトグロビンと接触させる前にイ
オン結合安定化剤を添加すると有利である。例えば、イ
オン結合に対して安定化作用をするこのような物質はポ
リエチレングリコール及びサッカロースである。

ヘモグロビンは血液中に２つの形で存在する。即ちオキ
シ型とデオキシ型である。本発明方法では溶血させた血
液試料中に含まれるヘモグロビンを乍−の型にすること
は有利である。これはオキシ型でもデオキシ型でもよい
。全ヘモグロビンを糖結合及び非糖結合ヘモグロビンの
分化識別前にデオキシ型に変換すると有利である。オキ
シ型をデオキシ型にもしくはデオキシ型をオキシ型に変
換する方法は当業者には周知である。例えば、オキシ型
を亜ニチオン酸塩又は他の還元剤によりデオキシ型に変
換することができる。

溶血させた血液試料中に含有されるヘモグロビンを還元
剤、例えば亜ニチオン酸ナトリウムで完全にデオキシ型
に変換し、アロステリックエフェクタ部位に対して結合
作用を有する物質１種又は数種及び／又はヘム結合配位
子１個又は数個を加え、その後でハプトグロビンと接触
させる本発明方法の実施形が特に優れている。

この方法で、試料の全ヘモグロビン含量のうちの糖結合
分だけがハプトグロビンと結合しかつ定量的に測定する
ことができる。

ハツトグロビンはヘモグロビンに対して少なくとも当モ
ル量で使用する。しかし著しい過剰量も有利である。：
＋２〜５０倍のモル量を使用すると有利である。

ハプトグロビンは遊離形で測定溶液と接触させることが
できる。この場合には、均質相中の全ヘモグロビンに対
する糖結合分を公知方法で測定すると有利である。例え
ば、糖結合ヘモグロビンをナーゲル及びギブノンによる
螢光消失法　［Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｌδｓｃｈｕｎ
ｇｓｍｅｔｈｏｄｅ　　、　　　Ｎａｇｅｌ及びＧｉｂ
ｓｏｎ共著、”　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、”、２４２
巻、３４２８頁（１９６７年）〕により測定することが
できる。他の可能性は遊離及びハブトグロビン結合のヘ
モグロビンのゾソイ１．ｓｏルオキシダーゼ活性の異な
るｐＨ依存性から得られる［　Ｋａｗａｍｕｒａ及びそ
の他共著、”　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｊ、ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　”、２８５巻、２２〜２
７頁（１９７２年）参照〕。

ハプトグロビンはヘモグロビンの天然抗体と見なすこと
ができるので、ハプトグロビンとヘモグロビンとの間の
相互作用を測定する他の方法としては免疫膣断学から公
知のすべての方法、例えばラジオイムノアッセイ、エン
チムイムノアツセイが該当する。

更に、ハプトグロビンをキャリア上に固定させることが
できる。この場合、測定法は、ａ）ハプトグロビンを含
有するキャリアを溶血させた、場合により前処理した血
液試料中に浸漬するか又は ｂ）所定量の前処理した血液試料をノ・シトグロビンギ
ヤリア上に流加するカ又は Ｃ）所定量の前処理した血液試料でノ・ブトグロビンを
キャリアから溶離する ＋１５１ ことによって実施することができる。

キャリア物質としては分析的な検出用試薬に常用のキャ
リア、例えば紙、セルロース、繊維フリース、多孔性プ
ラスチック等が好適である。その製造はハプトグロビン
含有溶液中に浸漬するか又はそれを噴霧することにより
行なう。

ハプトグロビンは不溶性キャリアに共有結合していても
よい。キャリアとしては蛋白の固定に好適なすべての常
用のキャリア４１料が好適である。ハプトグロビンとキ
ャリア拐料との結合は当業者に一般に知られている方法
で行なう。

キャリアに固定したハプトグロビンを、場合により前記
の添加物を含有している溶血した血液試料に添加する。

十分な接触時間、例えば約１分後に結合した糖結合ヘモ
グロビンを含有する不溶性ハプトグロビンを分離しかつ
糖結合ヘモグロビンを常法で直接測光法でその固有色に
基いて又はそのゾソイｔペルオキシダーゼ活性に基づい
て測定する。

ハプトグロビン含有キャリアをカラノ、上に注（１０ ぐこともでき、そのカラムを通して場合により添加物を
含む溶血した血液試料を流動させる。

糖結合ヘモグロビンはこの方法の場合キャリア結合のハ
プトグロビンに結合し、それ故溶液中に残留する非糖結
合のヘモグロビンから容易に分離することができる。こ
の場合、溶出液中の結合しなかった非糖結合ヘモグロビ
ンを測定すると有利である。ＨｂＡｌ　　含量は全ヘモ
グロビンと測定した非糖結合ヘモグロビンとの差から明
らかである。

更に、本発明の目的は血液試料中の糖結合ヘモグロビン
を測定するための試薬であり、これは好適な緩衝系中に
赤血球の溶血用の薬剤並びに遊離の又はキャリア結合の
ハプトグロビンを含有スる。有利に、試薬にアロステリ
ックエフェクタ部位に対する結合作用を有する物質１種
又は数種、ヘム結合配位子１個又は数個及び／又はイオ
ン結合に対し安定化作用をする物質を添加できる。

本発明の他の目的は糖結合及び非糖結合のヘモグロビン
を分化するための試薬で、これは）ハプトグロビンを遊
離形又はギヤリア結合形で含有する。

次に本発明を実施例により詳説する。

例１ ホスファート緩衝剤（ｐＨ６，７０）ｌ○０ミリモル／
ｌ中Ｍ　Ｋ３［Ｆ１３（ＯＮ）６］　ｏ、　３ミリモル
／ｌ、弗化ナトリウム２５ミリモル／ｌ及びヒトに由来
するハプトグロビン（混合型）４５．５ｍｇ／ｌを含有
する溶液のうち２．２　ｙｄを測定キュベツト中に装入
する。同様にＫ　［Ｆθ（ａ＋Ｖ）６）０３ミリモル／
ｌ及び弗化ナトリウム２５ミリモル／ｌを含有する糖結
合ヘモグロビンの０．０５％溶液１００μｌの添加後、
螢光強さの低下を時間的に追跡する（励起波長２８０　
ｎｍ　、吸光波長記○ｎｍ　）。測定結果は第１図の曲
線１で示す。

前記と同様にして、糖結合ヘモグロビンの代りに非糖結
合ヘモグロビンを測定溶液に添加した後で螢光強さを測
定する。結果を第１図の曲線２で示す。

例２ 例１に記載したように測定溶液を予め調製する。ホスフ
ァート緩衝液の代りに０．０５モル−ビス−トリス−緩
衝液（ｐＨ６，７０）を使用する（ビス−トリス−緩衝
剤＝Ｎ、Ｎ−ビス−（２−ヒＩＳロギシーエチル）−イ
ミノ−トリス（ヒ１？口ギシメチル）メタン）。糖結合
もしくは非糖結合のヘモグロビンの添加前に測定溶液に
それぞれイノジットへキザホスファート０．２ミリモル
／ｌを加える。螢光強さの時間的低下を第２図に図示し
た。

例３ ベーリンクヴエルケ（Ｂｅｈｒｊ。ｎｇｗｅｒｋｅ　）
　ＡＧ社のヒト産生のハプトグロビン（混合型）２０ｍ
９をブロムシアン活性セファロース４ｇにクライン及び
ミヒャエスコ（Ｋｌｅｉｎ　ｕｎｄ　Ｍｊｈａｅｓｃｏ
　）の方法［”　Ｂｊ、ｏｃｈｅｍ、ｕｎｄ　Ｅｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｏｏｍｕｎ。

”、５２巻、７７４〜７７８頁（１９７３年）〕により
結合させる。不活性セファロース１６ｇの添加により得
られたキャリア結合のハプトグロビン製剤を稀釈する。

湿潤物質１ｇ当りヘモグロビン５×１０　モルの結合能
力を有するセファロース結合ハプトグロビン製剤が得ら
れる。

ハプトグロビン−セファロースに結合したヘモグロビン
の測定 ビス−トリス−緩衝剤（ｐＨ６，７０）　０．０５モル
ｌＩＪ中のヘモグロビンのδｘｌ○　モル／ｌ−溶液１
　ｒｄにデオキシ型に変換するために亜ニチオン酸すト
リウム約５　ｍｇを加える。順次に次の濃度のイノシッ
トヘキザホスファ−１・及びＮ−ブチルイソシアニ１？
を添加する。

この溶液を前記のように製造したハプトグロビン−セフ
ァロース製剤１６０ｍｇと１分間振盪下に激しく混合す
る。次いで、亜ニチオン酸塩含有緩衝剤、２回緩衝剤で
洗いかつ上澄みを分離する。

ハプトクロビン−セファロースに結合シタヘモグロビン
をそのシソイドペルオキシダーゼ活性に基いてグアヤコ
ールにより公知方法で測定する。その際に、遠心分離し
たハプトグロビン−セファロースにアセタート緩衝剤（
ｐＨ４，０）０１モルｌＩｌ中の３０ミリモル／ｌ−グ
アヤコール溶液１−を加える。１％−過酸化水素溶液５
０μノを添加して反応を開始させる。５分間の反応時間
後Ｏこ、セファロースから遠心分離しかつ上澄み中の生
成した染料の吸光度を４３６ｎｍで測定する。測定した
吸光度は前記の表中に記載した。

吸光度から、イノシツトヘキサホスファートだけが存在
する場合、糖結合ヘモグロビンも非糖結合ヘモグロビン
もハプトグロビンセファロ（２１） 一スとは結合しないことが明らかである。イノジットへ
キサホスフアートを添加しないＮ−プチルインシアニＰ
の存在ではハプトグロビンと非糖結合ヘモグロビンかつ
また糖結合ヘモグロビンとの間の相互作用は起る。糖結
合ヘモグロビンと非糖結合ヘモグロビンとの間の区別は
、イノジットへギサホスフアート及びＮ−プチルイソシ
アニＰを試料に添加する場合に極めて正確に可能である
。前記の吸光度値から、この場合は糖結合ヘモグロビン
だけがハプトグロビン−セファロースに結合することが
明らかである例牛 ０．０５モル／ｌ−ビスートリスー緩衝剤（ｐＨ６、７
０）　中のヘモグロビンの８×１０　モル／ｌ−溶液１
　ｍｌをデオキシ型に変換するために亜二チオン酸ナト
リウム約５　ｍｇを加える。Ｏ，１モル／７−面硝酸ナ
トリウム溶液２５μｌを添加する。５分間の反応後にイ
ノシットヘキサホスファートを次の濃度で添加する。

（２２） この溶液を例３に記載したように製造したハプトグロビ
ン−セファロース製剤１６０ｍ９と１分間振盪下に激し
く混合しかつ例３と同様に更に処理する。

バーｊ’トｆロビンーセファロースに結合シタヘモグロ
ビンを例乙に記載したように測定する。

得られた吸光度値から、イノシットヘキサホスファート
の存在において糖結合ヘモグロビンが非糖結合ヘモグロ
ビンよりもはるかに多くハプトグロビン−セファロース
に結合したことが明らかである。

例５ 例３に記載した方法でヘモグロビン含有試料を製造する
が、この場合糖結合ヘモグロビンの（２３） 割合を○から１００％に高める。その都度試料に亜ニチ
オン酸すｌ−ＩＪウム５　ｍｇ、イノシツトヘキサホス
ファート５×１０−　モル／１及びＮ−プチルイソシア
ニ１５×１０　モル／１を加えかつ例３に記載したよう
に更に処理する。ハプトグロビン製剤として例３と同様
にして得られた。但し製剤１１当りヘモグロビン１．７
Ｘ１σ８モルの結合能力を有するハプトグロビン−セフ
ァロース製剤を使用する。第３図に全ヘモグロビン含量
に対する糖結合ヘモグロビンの百分率と相関関係にある
得られた吸光度をプロットした。

第３図に示した標準曲線を用いて、本例に記載した方法
による試料中の糖結合ヘモグロビンの未知含量を測定す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は糖結合ヘモグロビンもしくは非糖結合ヘモグロ
ビンを添加した後の・・ブトグロビン溶液の螢光強さの
低下を示す曲線図、第２図は糖結合ヘモグロビンとイノ
シツトヘキサホスフ（２４） アートもしくは非糖結合ヘモグロビンとイン／ットヘキ
サホスファートを添加した後のハプトグロビン溶液の螢
光強さの低下を示す曲線図、第３図は金ヘモグロビン含
量に対する糖結合ヘモグロビンの百分率とハプトグロビ
ンに結合したヘモグロビンとの相関関係を示す曲線図で
ある。 （２５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、初めに血液試料の化学的又は物理的処理により糖結
   合ヘモグロビン又は非糖結合へモグビンと非糖結合ヘモ
   グロビンとの分化を実施し、引続いて糖結合ヘモグロビ
   ンの割合を測定して血液試料中の糖結合ヘモグロビンを
   測定する方法において、糖結合ヘモグロビンと非糖結合
   ヘモグロビンとの分化をノ・シトグロビンを用いて行な
   うことを特徴とする糖結合ヘモグロビンの測定法。 ２、糖結合ヘモグロビンと非糖結合ヘモグロビンとの分
   化を好適な緩衝系及び／又は糖結合ヘモグロビン及び／
   又は非糖結合へモグロビンにおいて配座変化を惹起する
   物臀１種又は数種の存在において実施する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３　糖結合ヘモグロビン及び／又は非糖結合ヘモグロビ
   ンにおいて配座変化を惹起する物質としてアロステリッ
   クエフェクタ部位に結合作用を有する化合物及び／又は
   ヘム結合配位子を使用する特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 牛、　アロステリックエフェクタ部位に対して結合作用
   を有する化合物としてイノシットヘキザホスファ−）、
   ２．３−ジホスホグリセラート又はメリト酸を使用する
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、　ヘム結合配位子としてアルキルイソシアニｒ１酸
   素、−酸化炭素又は−酸化窒素並びにフルオリＰ１ア、
   ）ｒ１シアニＰ又は水を使用する特許請求の範囲第３項
   記載の方法。 ６、　ハツトグロビンがヘモグロビンに対して２〜５０
   倍の過剰量で存在する特許請求の範囲第１項〜第５項の
   いずれか１項に記載の方法７．初めに血液試料の化学的
   又は物理的処理により糖結合ヘモグロビン又は非糖結合
   ヘモグロビンを赤血球から遊離し、次にヘモグロビンを
   メトヘモグロビンに変換してよく、その後、糖結合ヘモ
   グロビンと非糖結合ヘモグロビンとの分化をハプトグロ
   ビンを用いて実施し、引続いて糖結合ヘモグロビンの割
   合を測定して血液試料中の糖結合ヘモグロビンを測定す
   る方法を実施するための試薬において、赤血球を溶血さ
   せる薬剤、好適な緩衝系及び遊離の又はキャリア結合の
   ハプトグロビンを含有し、かつアロステリックエフェク
   タ部位に対して結合作用を有する物質１種又は数種、ヘ
   ノ、結合配位子１種又は数種及び／又はイオン結合に対
   して安定化作用を有する物質を含有していてよい、糖結
   合ヘモグロビンノ測定法を実施するための試薬。 ８　ハプトグロビンを遊離形又はキャリア結合形で含有
   する糖結合ヘモグロビンと非糖結合ヘモグロビンの分化
   用試薬。