DE102009053225A1 - Verfahren zur Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge im Körper eines Lebewesens - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Blutvolumens eines Lebewesens, folgende Verfahrensschritte aufweisend:
a. Entnahme einer ersten Blutprobe, von dem Lebewesen, welchem noch kein NO-Markergas zugeführt worden ist;
b. Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen NO der ersten Blutprobe mittels einer Lösung, insbesondere Zyanidlösung, welche das am Hämoglobin gebundene NO ersetzt;
c. Zuführung der freigesetzten NO-Menge der ersten Blutprobe in eine Analysevorrichtung;
d. Quantifizierung der NO-Konzentration der ersten Blutprobe und Speichern des Wertes (c1) der quantifizierten NO-Konzentration;
e. Verabreichung einer definierten Menge eines NO-Markers entweder über die Atemluft, per Injektion oder als Kapsel an das Lebewesen;
f. Entnahme einer weiteren Blutprobe nach einem vorbestimmten Zeitintervall;
g. Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen Markergases mittels einer Lösung, insbesondere Zyanidlösung;
h. Zuführung des freigesetzten Markergases in eine Analysevorrichtung;
i. Quantifizierung der NO-Konzentration der zweiten Blutprobe und Speichern des Wertes (c2) der quantifizierten NO-Konzentration;
j. Bestimmung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) aus den zuvor bestimmten NO-Konzentrationen (c1, c2) von erster und zweiter Blutprobe nach der Formel:
tHb-Menge = K1*M¹⁵NO*100*(ΔHb¹⁵NO%*K2)^-1

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge im Körper eines Lebewesens. Ferner ist das Verfahren einsetzbar für:
• • Diagnostik von Blutbildungsstörungen und Blutverlusten,
• • Überwachung von Eingriffen in den Bluthaushalt (Dialyse, Operationen, Blutspende)
• • Kontrolle einer Blutmanipulation im Sport,
• • Ermittlung von Anpassungsprozessen an unterschiedliche Umweltbedingungen,
• • Bestimmung der Lungendiffusionskapazität ohne Atemprotokoll (d. h. möglich für Messungen unter Belastung/bei Krankheit) und damit der Diagnostik von Lungenerkrankungen
• Das Blutvolumen des menschlichen Körpers kann indirekt durch Markierung seiner zellulären Bestandteile Hämoglobin und gesamte Erythrozyten oder flüssigen Bestandteile, wie Albumine, bestimmt werden. Von größerem praktischem Interesse ist die zelluläre Markierung, da hiermit alle gängigen Blutbildungsstörungen oder Veränderungen aufgrund von Außeneinflüssen ermittelt werden können. Bislang wurden als Marker radioaktive Substanzen, die in die Blutbahn injiziert wurden, oder Kohlenmonoxid benutzt, welches über die Atmung zugeführt wurde. Während im medizinisch-klinischen Bereich noch die radioaktiven Marker eingesetzt werden, wird im Bereich des Sports nahezu ausschließlich die CO-Rückatmung verwand.
• Beide Bestimmungsarten sind sehr genau, stehen aber wegen ihrer möglichen Nebenwirkungen in der Kritik. So können radioaktive Marker nur sehr dosiert und kaum wiederholt eingesetzt werden, bei der Anwendung von CO muss seine Toxizität beachtet werden, die dadurch herrührt, dass es die Sauerstofftransportkapazität herabsetzt und damit gerade bei anämischen Patienten (Blutarmut) nur bedingt eingesetzt werden kann.
• Es wäre daher ein Marker wünschenswert, der an das Hämoglobin/Erythrozyten bindet ohne dass toxische Nebenwirkungen auftreten, da es im Gegensatz von CO nicht zu einer Blockierung der Sauerstoffbindungstelle am Hämoglobin kommt. Dieser Marker könnte Stickstoffmonoxid sein, welches sich physiologischerweise im Körper befindet und an das Hämoglobin bindet. Die Erfindung beschreibt, auf welche Weise NO mit ¹⁵N-Isotop als Marker genutzt und somit die bislang verwendeten Messmethoden abgelöst werden können.
• Stickstoffmonoxid NO ist ein wichtiges Signalmolekül im Blutkreislauf des menschlichen Körpers. Das normale Isotopenverhältnis von ¹⁴N/¹⁵N beträgt 1/300. Dadurch eignet sich die Quantifizierung der ¹⁵N-Konzentration bzw. das Isotopenverhältnis im Blut als empfindlicher Indikator zur Bestimmung physiologischer und pathologischer Stoffwechselprozesse im Blutkreislauf. Für die beiden Isotope bestehen leichte Unterschiede der Reaktionskonstanten, so dass pathologische Prozesse sowie Prozesse unter Belastung zu einer messbaren Veränderung des endogenen Isotopenverhältnisses führen. ¹⁵NO, welches über die Atmung zugeführt wird und sich komplett an das Hämoglobin bindet, könnte somit als Marker für die o. g. Blutvolumenmessung genutzt werden.
• Aus der Literatur sind die chemischen Verfahren zur Freisetzung des ¹⁴N/¹⁵N aus den verschiedenen Abbau- und Reaktionskanälen im Blut, Urin sowie weiteren Körperflüssigkeiten bekannt. Das am Hämoglobin gebundene NO kann mit Hilfe einer Ferricyanidlösung freigesetzt werden. Eine Reduktion von Nitrit zu NO kann mit Kaliumiodid erfolgen. Nitrat und Nitrit können mit Vanadiumchlorid reduziert werden. Weiter kann NO aus Thiolen freigesetzt werden.
• Bei einer exogenen Applikation von ¹⁵N markierten Substanzen (¹⁵NO, ¹⁵N-markierte Substrate) reicht der Einsatz minimaler absoluter Mengen aus, um eine signifikante Verschiebung des Isotopenverhältnisses zu erreichen. Dadurch wird der Proband/Patient wenn überhaupt nur minimal gestört/beeinträchtigt.
• Die technische Aufgabe besteht darin, entweder das ¹⁴N/¹⁵N Isotopenverhältnis innerhalb einer möglichst kleinen Blutmenge oder anderer Körperflüssigkeiten oder in der exhalierten Luft empfindlich zu ermitteln. Dafür ist ein ausreichend schneller Wechsel zwischen zwei geeigneten Nachweisfrequenzen erforderlich, um sowohl die ¹⁴NO- als auch die ¹⁵NO-Konzentration abwechselnd innerhalb des nahezu identischen Gasvolumens bestimmen zu können.
• Die Umwandlung, Freisetzung und Messung der 14/15N-Komponenten in bzw. als gasförmiges Stickstoffmonoxid bietet wesentliche Vorteile gegenüber der Messung in der flüssigen Phase. Mit Hilfe empfindlicher Molekülnachweisverfahren wie Massenspektroskopie, Laserspektroskopie, etc., kann erst ein isotopenselektiver Nachweis erfolgen, der in der flüssigen Phase nicht möglich ist. Im ersten Schritt erfolgt die Umwandlung (Reduktion, Substitution) in der Flüssigkeit bzw. an der Bindungsstelle. Mit Hilfe eines Trägergases, wie Stickstoff, Edelgas, normale Luft, etc., erfolgt die Austreibung aus der Flüssigkeit. Hierbei ist eine große Oberfläche durch fein verteilte Gasblasen vorteilhaft. Einer Schaumbildung aufgrund der Proteine in z. B. Vollblut kann/muss Rechnung getragen werden. Das Molekülnachweisverfahren muss sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Selektivität besitzen.
• Ein etabliertes Verfahren für den NO-Nachweis in der Wissenschaft und für klinische Anwendungen ist der Chemilumineszenznachweis (Firmen: Siewers, Ecophys). In den letzten Jahren wurden hier die verschiedenen Freisetzungsverfahren etabliert, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können. Allerdings ist die Chemilumineszenzmethode nicht isotopomerenselektiv.
• Als isotopomerenselektives Verfahren sind aus der Literatur die Lasermagnetresonanz-(LMR)-Spektroskopie und die Faraday-Rotations-Spektroskopie bekannt.
• Die Massenspektrometrie ist ebenfalls in der Lage 14NO/15NO isotopomerenselektiv nachzuweisen. Allerdings stellt das Isotopomerenverhältnis von 1/300 zwischen 15NO und 14NO große Anforderungen an die Massenauflösung des Massenspektrometers, da die beiden Isotopomere in benachbarten Massenkanälen nachgewiesen werden.
• Mit Quantenkaskadenlasern stehen seit einigen Jahren erstmalig Festkörperlaser zur Verfügung, die ausreichende Laserleistung von Halbleiterlasern im mittleren Infrarot verfügbar machen. Die Laser weisen eine Frequenzabstimmbarkeit auf, die einen kombinierten Nachweis der 14NO- und 15NO-Isotopomere mittels Faraday-Rotations-Spektroskopie gestatten. Die Laser erfordern eine Kühlung der Abwärme mit Flüssigstickstoff. Ein Teil der Laserstrahlung (Strahlteiler) dient der Stabilisierung der Nachweisfrequenz mit einer mit NO gefüllten Referenzzelle. Der Nachweis erfolgt jeweils nur für ein Isotopomer.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der gesamten Blutmenge eine Lebewesens unter Verwendung eines NO-Markergases bereitzustellen.
• Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens nach Patentanspruch 1 ergeben sich durch die Merkmale der Unteransprüche.
• Der Kern der Erfindung besteht darin, dass das Isotopomerenverhältnis der ¹⁴N¹⁶O und/oder ¹⁵N¹⁶O-Mengen in Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin, Speichel, Sperma) oder der exhalierten Luft zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten – bezogen auf die Probennahme am Probanden/Patienten/Athleten – gemessen werden. Durch diese Vorgehensweise können Änderungen der jeweiligen NO-Mengen/Konzentrationen ermittelt werden. Selbstverständlich ist die auch mit allen anderen Isotopomeren durchführbar. Die gemessenen zeitlichen Änderungen geben Rückschlüsse auf den Ablauf von physiologischen und pathologischen Prozessen (Zeit- und Reaktionskonstanten) des gesamten NO-Metabolismus. Diese Prozesse werden von Transport- und Verteilungsprozesse innerhalb des Körpers überlagert.
• Dabei werden alle möglichen Erscheinungsformen bzw. Bindungsmöglichkeiten des NO und seiner Abbauprodukte im Stoffwechsel (NO gebunden an Hämoglobin NOHb, gelöstes NO, Thiole, Nitrat, Nitrit, etc.) berücksichtigt. Die unterschiedlichen Metabolite im NO-Stoffwechsel können aus den Körperflüssigkeiten selektiv über chemische Reaktionen, wie sie in der Literatur bekannt sind, freigesetzt werden. Eine Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen NO erfolgt in einer Ferricyanidlösung. Für Nitrit erfolgt die Reduktion zu NO in einer Kaliumjodid Lösung (KI + HCl Gemisch). Nitrat und Nitrit wird in einer Vanadiumchloridlösung (V(III)Cl₃ + HCl Gemisch bei ca. 90°C) freigesetzt. Um z. B. die Nitratmenge einer Probe zu bestimmen, muss demnach die Differenz der freigesetzten NO-Mengen einer Kaliumjodid- sowie einer Vanadiumchlorid-Lösung gemessen werden. Der Transport des freigesetzten NO aus der jeweiligen Lösung in die Nachweiszelle erfolgt durch einen kontinuierlichen Gasstrom. Hier bietet sich als Trägergas Luft oder Edelgas, Fluss 100 ml/min–2 l/min an. Je nach Fragestellung kann auch die Ermittlung der freigesetzten NO-Menge nur eines Reaktionskanals ausreichen. Die Bestimmung des Blutvolumens kann z. B. ausschließlich über die Freisetzung des 15NO aus NOHb mit einer Ferricyanidlösung erfolgen. Die freigesetzte NO Menge wird quantifiziert und mit dem Zeitstempel der Probennahme versehen.
• Dadurch erhält man Zeitreihen von NO-Konzentrationen in der jeweils untersuchten Körperflüssigkeit. Wenn die Kinetik des zu untersuchenden Prozesses über Vorversuche ermittelt wurde, reicht die Bestimmung der NO-Mengen zu zwei Zeitpunkten aus und man kann die Reaktions- und Zeitkonstanten von Entstehungs- oder Abbauprozessen bestimmter Stoffwechselreaktionen des NO-Metabolismus quantifizieren. Dadurch lässt sich eine Vielzahl physiologischer Informationen ermitteln bzw. pathologische Veränderungen des NO-Metabolismus erfassen. Bei der Bestimmung des Blutvolumens sind alleine die Zeitkonstanten des Bindungsvorganges des 15NO Markergas an das Hämoglobin, die Verteilung des NOHb im Körper und der natürliche Abbau des NOHb im Blut ausschlaggebend. Der Bindungsvorgang des NO an das Hämoglobin ist nicht limitierend und erfolgt verglichen mit den beiden anderen Prozessen instantan. Die beiden übrigen Vorgänge überlagern sich und bewirken nach der Einatmung des 15NO-Markergases die Ausbildung eines maximalen Plateauwertes bevor die Abbauprozesse ein Sinken der NOHb-Konzentration im Blut bewirken. In Vorversuchen werden an einer Anzahl von Probanden/Athleten/Patienten Blutproben in einem engen Zeitraster (30–60 Sekunden Abstand zwischen den Entnahmen) entnommen und die zeitliche Kinetik der 15NOHb-Änderung quantifiziert. Die Quantifizierung erfolgt wie oben beschrieben durch eine Zugabe der Blutprobe (100 μl–1 ml) in eine Ferricyanidlösung (Glasbehälter mit ca. 10–50 ml Ferricyanidlösung).
• Veränderungen des Isotopomerenverhältnisses liegen unterschiedliche Reaktionskonstanten 14N16O zu 15N16O im Körper zugrunde. Bei exogener Gabe markierter Substanzen (15N16O als Gas, 15N-markiertes Substrat, 15N-markierter NO Donor) können die exogenen 15NO-Quellen von den endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopomerenverhältnis anhand der Veränderungen des Isotopomerenverhältnis 14NO/15NO in der Blutprobe unterschieden werden. Eine Stimulierung oder Inhibierung der endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopomerenverhältnis durch exogene 15NO-Applikation kann ebenfalls durch eine Veränderung des Isotopomerenverhältnisses in der Blutprobe ermittelt werden Diese Wechselwirkungen sind insbesondere für die Untersuchung von Wirkstoffen relevant. Eine Markierung kann direkt durch Gabe eines 15NO-Donors, z. B. 15N-Molsidomin, oder über die Gabe eines markierten Substrates bzw. einer Vorläufersubstanz, z. B. 15 L-Arginin erfolgen. Die Quantifizierung des Effektes erfolgt wieder über die Verschiebung des Isotopomerenverhältnisses in der z. B. Blutprobe.
• Außerdem gestattet der Einsatz von markiertem 15N16O oder 15N-markierte Substrate/Donoren eine Verringerung der applizierten Substanzmenge. Bei geringer absoluter Menge ändert sich das Isotopomerenverhältnis bereits stark.
• Bei exogener Applikation ist der erste Zeitpunkt in der Regel der Zeitpunkt vor Verabreichung.
• Bei einer Erhöhung der Anzahl der Blutproben bis hin zu einer nahezu kontinuierlichen Entnahme kann die zeitliche Kinetik der beobachteten Prozesse detaillierter aufgelöst und quantifiziert werden. Entscheidend ist die Anzahl der Proben innerhalb der relevanten Prozessdauer, z. B. Verteilungsprozess nach Einatmen von 15NO-Markergas, allergische Reaktion, Infektion, etc.. Die Prozessdauern können sich stark unterscheiden. Um das nicht-lineare Verhalten quantifizierbar zu machen, sollten jedoch mindestens 12–15 Einzelproben über die gesamte Prozessdauer genommen werden. Mit ausreichend hoher zeitlicher Auflösung lässt sich die Dynamik der zugrunde liegenden Prozesse über Zeitreihenanalyse ermitteln.
• Bislang war die Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens teilweise mit Risiken und legalen Problemen behaftet. Die Erfindung ermöglicht eine minimalinvasive Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens durch ein prinzipiell körpereigenes Tracergas, welches in sehr geringer Menge über die Atmung zugeführt wird. Dadurch ist die Anwendbarkeit der Methode auf alle Patientenkollektive und auf gesunde Probanden ohne gesundheitliches Risiko gewährleistet, was bislang nicht der Fall war. Die Technik erlaubt neue bisher nicht bestimmbare Analysen des NO Metabolismus, der NO Bildung, der NO Verteilung und der Wechselwirkung zwischen verschiedenen endogenen und exogenen NO Quellen.
• Nachfolgend wird eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung des Blutvolumens erläutert.
• Zur Bestimmung des Blutvolumens wird nach einer ersten Blutprobennahme eine bestimmte Menge des Markergas (15N16O) inhaliert. Das NO bindet an das Hämoglobin und über die Veränderung der 15NOHb Konzentration lässt sich die Hb-Menge bestimmen. Hierfür ist einerseits die maximale NO-Menge, die an das Hämoglobin binden kann, erforderlich. Die maximale Menge, die an das Hämoglobin binden kann, wird im Rahmen eines Projektes zur Bestimmung des Blutvolumens ermittelt werden. Hierfür wird eine Blutprobe mit NO gesättigt. Die Quantifizierung der freigesetzten NO Menge aus der gesättigten Probe gestattet eine Ermittlung der maximalen gebundenen NO-Menge. Andererseits ist der Zeitpunkt der zweiten Probennahme entscheidend, da sich das NO mit einer bestimmten Zeitkonstante (Transport im Körper) verteilt, so dass die zweite Blutprobe beim Erreichen der maximalen NOHb Konzentration genommen wird. Wie oben beschrieben wird in Vorversuchen die Zunahme und im weiteren Verlauf die Abnahme der NOHb-Menge im Blut bei Probanden gemessen. Hierfür ist ein enges Zeitraster für die Blutentnahmen erforderlich. Bei den ersten Messungen zur Bestimmung des Blutvolumens mit 15NO wurde die 15NOHb-Menge zu der aus der CO-Rückatmung bekannten Zeit bis zur Einstellung des entsprechenden maximalen COHb-Wertes durchgeführt. Eine systematische Ermittlung der Zeitspanne bis zum Erreichen eines Plateauwertes für das 15NOHb erfolgt ebenfalls im nächsten Jahr. Bei der Bestimmung des Blutvolumens reicht auch eine Messung des freigesetzten 15NO anstelle des Isotopomerenverhältnisses aus. Die Freisetzung des 15NO erfolgte aus 1 ml Vollblut.

Claims (5)

1. Verfahren zu Bestimmung des Blutvolumens eines Lebewesens, folgende Verfahrensschritte aufweisend: a. Entnahme einer ersten Blutprobe, von dem Lebewesen, welchem noch kein NO-Markergas zugeführt worden ist; b. Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen NO der ersten Blutprobe mittels einer Lösung, insbesondere Zyanidlösung, welche das am Hämoglobin gebundene NO ersetzt; c. Zuführung der freigesetzten NO-Menge der ersten Blutprobe in eine Analysevorrichtung; d. Quantifizierung der NO-Konzentration der ersten Blutprobe und speichern des Wertes (c1) der quantifizierten NO-Konzentration; e. Verabreichung einer definierten Menge eines NO-Markers entweder über die Atemluft, per Injektion oder als Kapsel an das Lebewesen; f. Entnahme einer weiteren Blutprobe nach einem vorbestimmten Zeitintervall; g. Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen Markergases mittels einer Lösung, insbesondere Zyanidlösung; h. Zuführung des freigesetzten Markergases in eine Analysevorrichtung; i. Quantifizierung der NO-Konzentration der zweiten Blutprobe und speichern des Wertes (c2) der quantifizierten NO-Konzentration; j. Bestimmung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) aus den zuvor bestimmten NO-Konzentrationen (c1, c2) von erster und zweiter Blutprobe nach der Formel: tHb-Menge = K1·M¹⁵NO·100·(ΔHb¹⁵NO%·K2)^–1 wobei K1 = aktueller Luftdruck·760 – 1·(1 + (0.003661·aktuelle Temperatur)) M¹⁵NO = ¹⁵NO_adm – (¹⁵NO_{system+lunge(nach Rückatmung)} + ¹⁵NO_{ausgeatmet(nach Rückatmung)}) ΔHb¹⁵NO% = (c2 – c1)/c2 [Differenz zwischen dem basalen Hb¹⁵NO und dem Hb¹⁵NO nach ¹⁵NO Rückatmung] K2 = (ml¹⁵NO·(gHb)^–1) maximale ¹⁵NO Menge pro Gramm Hämoglobin ¹⁵NO_adm = Menge des applizierten ¹⁵NO Markergas ¹⁵NO_{System+Lunge(nach Rückatmung)} = ¹⁵NO Konzentration im Spirometer·(Spirometervolumen + Residualvolumen der Lunge) ¹⁵NO_{ausgeatmet(nach Rückatmung)} = ¹⁵NO Konzentration nach Rückatmung·alveoläre Ventilation·Zeit
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennahmen der beiden Blutproben wie beschrieben erfolgt, und dass diese Blutproben anschließend gelagert werden und die Analyse zeitlich und/oder räumlich getrennt durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als NO-Markergas die verschiedenen Isotopomere des Stickstoffmonoxids verwendet werden (15N16O, 15N18O, etc.).
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Verfahrensschritt e) anstelle eines 15NO-Markergases ein 15N-markierter NO-Donor, ein 15N markiertes Substrat des NO-Stoffwechsels oder 15N-markierter Metabolit des NO-Stoffwechsels verabreicht wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Ermittlung der nicht-linearen Zusammenhänge der physiologischen Prozesse zwischen der beschriebenen ersten und zweiten Blutprobennahme weitere Blutproben nimmt und deren NO-Konzentrationen bestimmt.