JPS584799A - 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は完成（ｍａｔｕｒθ　）ソーマチンの各種対立
遺伝子形を暗号化するＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列
を包含するクローニング媒質、および転換された微生物
におけるそれらの使用に関する０ ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍ
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｄａｎｉｅｌｌｉｉ　）　　の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より１６００倍甘く、分子基準では
ショ糖より１０５倍甘い。西部社会において、ショ糖の
とり過きは多くの健康問題を起こしている。

それ故にショ糖の代りに低カロリー甘味料を用いる多く
の試みがなされている。しかしこれらの幾つかはありう
る副作用からみて最近禁止された。

従って、天然の低カロリー甘味料に対する、そしてこの
ような甘味料の経済的製造法に対する要求がある。分子
生物学における耀近の進歩は特別な真核生物タンパク質
を暗号化する構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、
前記遺伝子を形質転換された宿主細胞中で表現させ、そ
れにより望むタンパク質を生産することを可能にした。

自然の状態でタンパク質をそれらの未修飾形で暗号化す
る真核生物由来の多くの遺伝子は組換えＤＮＡ分子にそ
のま″＞適用できない。それは自然の遺伝子は伝令ＲＮ
　Ａ　（ｍＲＮＡ）　　に金談れていないイントロンと
呼ばれるＤＮＡ配列を含むからである。これらイントロ
ンに置かれた情報はｍＲＮＡの翻訳過程前に真核生物細
胞中に移される。本発明者が知る限り、細菌はこのよう
なイントロンをＲＮＡレベルで除去することができず、
それ故に真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞
に使用できる前にＲＮＡレベルでこれらイントロン上に
置かれた遺伝情報を除去する必要がある。

ｍＲＮＡレベルでイントロンを除去する能力を有する微
生物宿主細胞において、自然の遺伝子を原理上適用でき
るが、それはこれらが前記微生物宿主細胞中で有効であ
るレギユロンの支配下に撫かれる限りにおいてである。

本発明においては、真核生物由来の、特に植物由来の遺
伝情報を微生物の特に細菌の宿主細胞中で表現が効果的
に起こるような状態で導入する組換えＤＮＡ技術を使用
する。

本発明をよりよく理解するため、記述中で用いた最も重
要な用藺を定義することにする。

レギユロンはプロモーターとオベレー・ター領域からな
るＤＮＡ配列である。

構造遺伝子は鋳型（ｍＲＮＡ）　　を通して特別なポリ
ペプチドに特治のアミノ酸配列を暗号化するＤＮＡ配列
である。

プロモーターはＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のため
結合するレギユロン内のＤＮＡ配列である。

オペレーターはリルッサータンパク質が結合し、従って
ＲＮＡポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するのを
妨げるレギユロン内のＤＮＡ配列である。

誘導物質はリプレッ廿−タンパク質を不活性化し、オペ
レーターを自由にし、そしてＲＮＡポリメラーゼをプロ
モーターへ結合させて転写を開始させる物質である。

完成ソーマチンとは完全に修飾されたタンパク質（佐吠
Ａ　）の対立遺伝子形の一つを意味する。

クローンニング媒質　適当な宿主細胞への転換後自己複
製を許すＤＮＡ配列（完全なレプリコン）を包含する非
染色体二本鎖ＤＮＡシラスミドまたはファージ。

ファージまたはバクテリオファージ　適当な細菌宿主細
胞中で複製できる細菌性ウィルス。

解読わ（ｍＲＮＡ　　レベルでコドンからポリペプチド
への同右の翻訳が起こるようなわくへ３個ひと続きのヌ
クレオチド（コドン）の集合−（／列　　遺伝子からＲ
ＮＡをつくる過程。

ｓｙ　　ｍＲＮＡからポリペプチドをつくる過程。

表現　ポリペプチドをつくるため構造遺伝子により受け
る過程。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの過
程の結合である。

完成ソーマチン遺伝子とは、完全に処理された（完成し
た）形でソーマチンの種々な対立遺伝子を暗号化する伝
令ＲＮＡの部分と正確に同じ情報含有榴（コドンの配列
順序）を有する二本ｄｌＤＮＡ配列を意味する。便利さ
だけの理由でａｓ　Ｄ　Ｎ　Ａの一本鎖だけを本文なら
びに図面に示した。

対立遺伝子形をコード化する構造１−伝子（１１）　　
前記構造遺伝子の表現を調節する特別なりＮＡ配列 を包含する組換えプラスミドが提供される。これら特別
なりＮＡ配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何
れかからなる。特に適当な誘導可能レイユロンはディー
、ブイ、ゴデル（Ｄ、Ｖ、　Ｇｏｅ−ａａｅｌ）等、Ｎ
ａｔｕｒｅ　２８１　、５４４−５４８　（１９７８）
により記述された二重１ａｃ　ＵＶ　５系からなる。

目８　　　埒叩　　　宥ご　　　まに　　　目ギ　　　
目８Ｉ　　開部　　恣べ　　焔舅　　トｘ　　差回路？
　　　１屍　　　部ｌ　　　シ炬　　　汐１　　　首足
１騎　　ＢＲＥ２　　　日Ｍ　　　Ｈｉ　　　円革韮　
　ａＦ　　　ＥＭ　　　閂Ｈ■　　窪目罐８　　　目６
　　　沼６　　　固６　　　にｉ　　　路定臣８　　　
四ご　　　臣８　　　吊と　　　≦淀　　　臣と■　　
ＥＨＷｆｌ、ｊｆｌ　　　短墓　　斃諸円詫　　　汐炬
　　　罐８　　　目８　　　＝わ　　　架ギ鰭躍　　　
日？　　　自己　　　餌８　　　旨８　　８８−日　　
　　　−（Ｊ　　　　　　Ｅ−１−υＥ−切Ｈ山Ｑのト
　　　じυ　　　Ｈ＜　　　　＜Ｃり　　　　自ト　　
　〉じ６Ｍ　　　ｉ４０　　５５　　　間両　　計　　
畳墓■　　１　　■　　已屍　　岬ｉ：ｉ　　　！ｉ’
：論乏　　　目８　　　目上　　　垢８　　　目６　　
　目８畦　　畦　　：；：ｊ　　　Ｂ　＊　　　ｉｊ　
ｕ　　　：；　３ツＨ出躍 ８＜　　　く。　　　襲藁　　　日ミ　　　目躍　　　
日ギ目自　　　目８　　　目８　　　目８　　　に８　
　　深炬ビ く 足 畦　　Ｉ　　ｌ　　■ 口承　　　わｇ　　　潤百　　　謳ビ ｐＣりｕ　　　　　　　Ｏｃｐ　　　　　　　Ｚ○目目
　　　むｔ　　　に８　　　埒訃 Ｉ認　　　に旨　　　Ｃ２朗其 １　　開扉　　ｉｆ、Ｅ　　　ｍＵ 瞑Ｏ臼Ｑ　　　部じ　　　−じ 自Ｏφ＜＜＜　　　　　　　じじ む？　　　円屍　　　≦１　　　臣８ ≦淀　　　≦淀　　　園ビ　　　誤８ ＱＱ　　　　　　ｕＵ　　　　　　山Ｅ−１ｕｈ目目　
　　まに　　　まに　　　田藁 げ乾　　■　　複属　　珪 −Ｑ　　　　　　削Ｕ　　　　　　部じ　　　　　　Ｌ
Ａ〇−ト　　　エυ　　　国Ｑ　　　工Ｏ ト１＜Ｅ−１＜ωトドく Ω−Ｏ切Ｕ　　　　　　部０　　　　　　ηＱψ　く ｇｃｔｖ　　　　　　　（ＪＥ−１ｈｅ　　　　　　　
ｈ＜１　　翻　　■　　Ｉ ＜リ　　　　　　へＥ＠　　　　　　氏Ｕ　　　　　　
ψじ　　　　　　く。

ミ８　　　埒百　　　固定　　　シ坏　　　罐８む？　
　　埒叩　　　臣８　　　冑百　　　目躍ＱＯω（Ｊ　
　　　＋ｏ　　　　りａ　　　　ｏｈ瓢８　　　む已　
　　目８　　　目８　　　臣８罐旨　　　≦Ｕ　　　瞭
８　　　ゴ？　　　看８＞Ｑ　　　　ｃ＋Ｌｖｕｈ　　
　　＞Ｑ　　　　（ＪＥ−１目８　　　目８　　　シ矩
　　　にｉ　　　圧目ＯＵ　　　　　　−〇　　　　　
　２■　　　　　　部ト　　　　　　−ト瓢８　　　目
８　　　ｌ８　　　（支）浣　　　円躍責ｅＭ　　ＥＮ
ｉＨ苺ｌ　芥と　巨ｄ属＃　　　　　　　　　　　　　
　　　特開昭５８−４７９９（４）栖吹Ａは（完成）ソ
ーマチンのアミノ酸配列と長 ＤＮＡ配列を示す。ａ−ＡＢはソーマチン遺伝子におけ
る対立型変異を示す。

もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ。

リ　−　（’Ｆ　、　　Ｌｅｅ　　）　　　等、　　Ｊ
’、　　Ｍｏｌ、　　　Ｂｉｏｌ、　　１２１　　、　
１９５〜２１７　（１９７８）　　およびケイ、バート
ラン１（Ｋ。

Ｂｅｒｔｒａｎｄ　）等、ＥｉＣｉｅｎＣ８１８９，２
２〜２６　（１９７５）により記述されたトリプトファ
ン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファン
系を修正して第１図記寸・！、の一層適当な系を得た。

この修正された系においで、トリプトファン　アツテニ
ュエータータンパク質をコード化する情報は除かれる一
カリポソーム結合部位を保っている。

本発明による絹換えプラスミドはバタテリオファージＭ
１３、ｆｌのｆｄ、の遺伝子■ｌｌの　修正タンパク顎
／リボンーム結合部位からなるＤ　Ｎ　Ａ配列を包含す
る〔ビー、エム、ジー、エフ、ファンウエーセ゛ンビー
ク（Ｐ　０Ｍ　、　Ｇ　、　Ｆ　、　　ｖａｎ　Ｗｅｚ
ｅｎｂｅｅｋ）等、　Ｇｅｎ８１１．１２９〜１４８　
（１９８０）　）、そしテコノものは本出舶者の知る限
り真核生物遺伝子の表現１ に未だ使われていない。

本発明による絹換えプラスミドにおいて、レギユロンは
構造遺伝子に的接結合するこさもあれば、ヌクレオチド
順序ＣＡＴ　（Ｎ）ｎＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧ　
（式％式％ よびＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＯの何れかで
あるか、たたし二本鎖構造にもいてＮとＮ′は同転対称
構造が存在する。ようなものであることを条件とする）
からなるＤ　Ｎ　Ａ　リンカ−を含む新親出発コドンお
よびＥｃ　ｏＲエニー位を介して間１号的に結合するこ
さもある。

回転対称構造とはＮが例えばＡにより表わされる１礪合
、Ｎ′は相袖的地基Ｔにより表わされねばならないこと
を音吐する。

ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との間の１１０
序ＡＡＴＴが除去されたとき表甲の収量が白土するとい
うことになる。

本発明による完成（完全に修飾された）ソーマチンの各
種対立遺伝子形を暗月に直す構造遺伝子を含む微生物ク
ローニング＃質が得られ、種々なソーマチンが幾つかの
工程を実行することにより生産されるが、そのうぢ最も
本質的なものは次の通りである： ｎｌ　　ソーマチンの伝令ＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）の学
齢およ精製、 ｆ２１　　このｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ（ｄｅＤＮＡ
）への転換、 （３）　　ポリーｄｏ尾を有するｄｓＤＮＡの組立て、
（４＋　　７１８　　ＤＮＡ−ポリーａＣ分子のエンド
ヌクレアーゼＰｓｔニー開裂およびポＩＪ　−ｃｌＧ−
尾プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａへの加入、（５）
　　転換とクローン選択、 （６１ＲＮＡ／ＤＮＡ　交雑および生体外翻訳による挿
入部の性質の決定、 Ｔ７１ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の分析による挿入部の性
質の二１チェック、 （８）完成の完全に修飾されたソーマチンを暗号化する
ＤＮＡを製造、 （９）％別な転写８組節ＤＮＡ間列を包含するプラスミ
ドの組立て、およびＤ　Ｎ　Ａ　−ＩＪンカーおよびＤ
ＮＡ−プライマーの化学的合成、 （Ｈｌ・　構成的または誘導可能レギユロンおよび結ば
れたソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立て、
および該プラスミドによるＥ　、ｃｏｌｉ　　の転換、 ０１）前記組換えフ０ラスミドを含むＪ　ｃｏｌｉ細胞
の培養、およびソーマチンの検出と単離。

下肥の詳細な記述は本発明を印明するものである。

痔を液体窒素下で粉砕する。フェノールでのタンパク制
柚ｌ：）Ｉ後、ケイ。ニス、カービイ（Ｋ、Ｓ。

Ｋｉｒｂｙ　）　（１９６５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　９６．２６６〜２６９、ニー、ライ−がビス（Ｕ、
　Ｖｌ／ｉｅｇｅｒｓ　）およびエッチ、ヒルッ（Ｈ，
Ｈ１］ｚ　）　ＦＫＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２３　。

７７〜８２により記述された手順に従いＬｉＯ４による
ＲＮＡの選択的沈殿を行なう。伝令ＲＮＡを含むポリ−
Ａをオリゴ−ｄ、Ｔ−セルロースカラム上に何回か通す
ことにより回収し、このメツセンジ４ ヤー混合物からソーマチン−暗号化ｍＲＮＡをポリアク
リルアミドデル電気泳動により単離する。これをエッチ
、アビブ（Ｈ，Ａｖｉｖ　）およびビー、レーダー（Ｐ
、　Ｌｅｄｅｒ　）　（１９７２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａａ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、　Ａ、６９．１４０８〜１４１２およ
びジエー、ダブリュー、ディピース（Ｊ、Ｗ、　Ｄａｖ
ｉｅｓ　）およびビー、カエスベルグ（Ｐ、　Ｋａｅｓ
ｂｅｒｇ）　（１９７３）、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、１２．
１４３４〜１４４１により記述されたように小麦胚系で
ｍＲＮＡの翻訳によりチェックする。

２、　ソーマチンｍＲＮＡから二本＠　Ｄ　Ｎ　Ａへの
変換精製ソーマチンｍＲＮＡをジー、エヌ、プエル（Ｇ
、Ｎ、　Ｂｕｅｌ　）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、
２５３．２４７１〜２４８２　（１９７８）により記述
された手順に従い、ＡＭＶ逆伝写で複写して一本鎖ＤＮ
Ａ分子をつくる。こ（１：）　ｃＤＮＡ　をその拶ニー
、アール、ディビス（Ａ。

Ｒ，Ｄａｖｉｓ　）　％、Ｇｅｎθ１０．２０５〜２１
８　（１９８［１）により記述された手順に従い、１５
　ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　−ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変える。この二本鎖ＤＮＡ捨写のループ構造を
８１−ヌクレアーゼ消化により除く。

１　ベ ロ　ポリ−６０尾を有する二本Ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａの組立て
望む長さのＤＮＡ分子はアール、ロイチョウ１ζフリイ
（ＲｏＲｏｙｃｈ、０ｕｄｈｕｒｙ　）等、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　３．８６６〜８７
７　（１９７６）により記述された手順に従い、ポリア
クリルアミドヶゞルー電気泳動、ケゝルからの抽出、お
よび末端トランスフェラーゼによるボＩＪ　ｄｏでの尾
部結合により得られる。

４　プラスミドｐＢＲ３２２におけるｄｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ
　−ｄ。

分子の統合 フ０ラスミドｐＢＲ３２２をβ−ラクタマーーＶ遺伝子
にある識別部位のところでプラスミドを開裂する制β１
・・エンドヌクレアーセ゛’　Ｐｅｔ工　で処理し、そ
の後ｐＢＲろ２２の直線化されたＤＮＡＫポリ−６０尾
を末端トランスフェラーゼ゛により供給する。このボＩ
Ｊ　−ｄ、０尾をつけたＤＮＡ分子をアニールしてポリ
ーｄＧ尾をつけたプラスミド１）ＢＲ３２２とする。

５、転換およびクローン選択 このようにして得たプラスミドをｃａｃｔ２−処理Ｅ、
　Ｃ０１１細胞に転移させる。転換後交雑プラスミＩ　
′Ｊ ドＤ　Ｎ　ｌ＞分子を含む細胞なテｉ・ラサイクリンに
対する耐性に基づき選択する。陽性コロニイをエッチ、
シー、パーンポイム（ＨｌＯ，Ｂ１．ｒｎｂｏｉｍ　）
　　およびジエイ、ドリイ（Ｊ、　ＤＯｌｙ）　、　Ｎ
ｕｃｌ、ｅｉｃ　Ａｃ１ｃ１．８Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　
７．１５１３〜１５２３　（１９７９＞により概述され
た迅速シラスミド抽出法と単離されたＴ）　Ｎ　Ａのエ
ンドヌクレアーゼＰｓｔ−■−消化との組合わせにより
大きい挿入部を有するシラスミドに対してふるい分目す
る。

選ばれたクローンから１０μｇのプラスミドＤＮＡが単
離され、後にこれをジアゾテートを付けた（　、Ｄ　Ｂ
　Ｍ　）紙円板に固定する。不動化されたシラスミ１Ｄ
ＮＡ分子を、Ｄ　Ｎ　Ａ挿入部の性質を測定するため、
ジエイ、ジー、ウィリアムス（Ｊ。

Ｇ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）等、Ｃｅ１１．１７．９０
３〜９１３（１９７９）により概述されたように交雑／
試験管内翻訳法に用いる。

７゜　Ｄ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａ配列分析による挿入部（１
１）の性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム（ＡｌＭ、　Ｍａｘａｍ　）およびダシリュ
ー、ギルバート（Ｗ、Ｇ１１ｌ）＋３ｒｔ　）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　ＥｎＺ７ｍ０１０ｇ７．編集者エル、グ
ロスマン（Ｌ、１ＧｒＯｓｓｍａｎ　）およびケイ、モ
ルディプ（Ｋ６Ｍｏ１−ｄａｖｅ）、ニューヨーク、ア
カデミツク　プレス、１９８０年６５巻（１）、４９９
〜５６０頁に概述された化学分解法により、またジエイ
、マート（Ｊ、　Ｍａａｔ　）およびニー、ジエイ、エ
ッチ、スミス（Ａ、Ｊ、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ　）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

５、４５６７〜４５４５　（１９７８）により概説され
たジデオキシ／ニック翻訳法により行う。ソーマチンｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報は
ディ、ジム？−７（Ｄ、　Ｚｉｍｍｅｒｎ　）　および
ビー。

カエスベルグ（Ｐ　、Ｋａｅｓｂｅｒｇ　）、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ。

Ａａａｄ、Ｓｃｉ、Ｄ、８．Ａ、７５．４２５７〜４２
６１　（１９７８）により概説、されたように、連鎖停
止阻害剤存在下に、ソーマチンｍＲＮＡ鋳型上でのＡＭ
’Ｖ−逆トランスクリゾターゼによるゾライマー付は合
成によって１　日 間接的に誘導された。このスクリーニングは、就中ソー
マチンｍＲＮＡ　　の殆ど完全な複製を含むシラスミド
１）ＵＲ１００を与える。

ニー、ジエイ、エッチ、スミス、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｌ
ａａ　Ｒｅ５０．６．８３１〜８４８　（１９７９）に
より概説されたｐＵＲ１００のエキソヌクレアーゼ川処
理により、才たはビー、グローネンボーン（Ｂ、Ｇｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎ）およびジエイ、メツシング（Ｊ０Ｍθ
ｓｓｉｎｇ　）、Ｎａｔｕｒｅ２７２．２７５〜２７７
　（１９７８）　Ｋ　、、ｌ：すＲＮ’ｉｔすしたＭ１
３におけるクローニングにより一本４ＪＤＮＡが得られ
る。ソーマチンｍＲＮＡと同じ極性を有する一本鎖ＤＮ
Ａを、プライマーとして役立つ化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチド（５′）ｐＴＯＡＧＧＯＡＧＴＡＧＧＧ
ｃＡ□Ｈ（３’）を用いる相補的ＤＮＡ合成のための鋳
型として用いた。二本Ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａの熱変性後、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチド（５’）　ｐＧＯＯ
ＡＯＣＴＴＯＧｏＨ（ｆｆ）　　をプライマーとして使
用するこきにより相補的ＤＮＡがＤＮＡ合成のだ　Ｑ めの鋳型として役立つ。次にこの二本鎖ＤＮＡを８１ヌ
クレアーゼで処理する。完成ソーマチン遺伝子の組立て
を第２図で説明する。

９ａ、　、ＯラスミドｐＵＲ２ｒ］１０組立て二重１ａ
ｃレギユロン（ｌａｃ　ＵＶ　５　）　　を包含する２
８５塩基対を含む断片をｐＫＢ　２６８の制限エンドヌ
クレアーゼＢａｏ　Ｒ工開裂により得る〔ケイ、バンク
マン（Ｋ、Ｂａｃｋｍｈｎ　）およびエム、ブタシュン
（Ｍ、Ｐｔａｅｈｎｅ　）、０８１１１３．６５〜７１
（１９７８）　）。

コノ断片をｐＢＲ３２２ＤＮＡ　ノＲｃｏＲＩ部位に結
紮する。右方向に１ａＯレギユロンを有するシラスミド
Ｄ　ＩＪ　Ａ　（第４図）をＪ　ｃｏｌｉ　　ＲＮ　Ａ
ポリメラーゼの存在でＢｃｏＲ工により部分的に開裂さ
せる。制限エンドヌクレアーゼ　ヒンｌ’　ｌ開裂部位
から最も遠いＢｃＯＲＩ開裂部位が優先的に攻撃される
。直線化されたＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースデル電気泳動により精製し、’Ｉ”４　ＤＮＡ
−リが−ゼによる結紮により環状にし、その後Ｅ、コリ
ーの転換に用いる。テトラサイクリン耐性転換体から正
しい構造（第６図）を有するｐＵＲ７ ２０１が得られる。

９ｂ、プラスミドｐＵＲ３０１の組立て約５１０塩基対
のＤＮＡ断片が、ｐｔｒｐ　ＥＤ　５の制限エンドヌク
レアーゼＨ１ｎｆ工開裂により得られた〔アール、ニー
、ハルレーウエル、　（Ｒ，Ａ。

Ｈａｌｌｅｗｅｌ　）およびニス、エムテージ（Ｓ　、
　Ｔｉ！ｍｔａｇｅ　）、Ｇｅｎθ９．２７〜４７　（
１９８０）　）。この断片をＦｉ、　ｃｏｌｉＲＮＡポ
リメラーゼ存在下制限エンドヌクレアーゼＴａｑ工で開
裂させる。ｔｒｐレギユロンにおけるＴａｑ　Ｘ部位〔
ケイ、パートランド（Ｋ、Ｂｅｒｔｒａｎａ　）等、　
５ｉｅｎｃｅ、　１８９．２２〜２６　（１９７５）お
よびエフ。

リー（ＩＰ、Ｌｅｅ　）等１．ｒ、　１ａｏ１．Ｂｊ、
ｏｌ、　ｔｌ、１９５〜２１７　（１９７８）により記
述〕を選択的に保護し、このようにしてｔｒｐレギユロ
ン（第１図）からなる２６４塩基対を含む断片を得る。

次にこの断片を１３１　　ヌク１／アーゼで処理し、ｍ
ｃｏＲニリンカー（５′）ｐＧＧＡＡＴ　Ｔ　ＯＯｏｕ
　（３’）で鈍端結紮し、Ｅｃ　ｏＲ工で切断し、その
後ｐＢＲ３２２の　ＦｉｃｏＦｔニ一部位でクローニン
グゝする。

正しい方向にあるｔｒｐ　Ｌ／ギュロンを有するプラス
ミドｐＵＢ　３００　（第１図）を単離した。Ｈｌｎａ
　１部位から最も遠いＢｃｏＲニー開裂部位をエチジウ
ムプロミドの存在下ＥｃｏＲ工によるｐＵＲ３ＱＱ　Ｄ
ＮＡの部分開裂によりそしてＳ１ヌクレアーゼ処理によ
り除去する。線状１１　ｔＪ　Ａ分子をＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼにより再環化する。テトラサイクリン耐性転換体
から第１図に概説された構造をもつｐＵＲ３０１が得ら
れる。

９ｃ、プラスミドルＤ式４０１の組立て２６９塩渣対を
含む断片（ＤＮＡ配列１１２８〜１３７９）を制御ｌ−
，エン１？ヌ々レアーゼＴａｑ工および↓（ａｅ　ｌｉ
を用いる’ＲＦＭ１３ＤｎＡ（ビー、エム、シー、エフ
、ブイ、ウエーゼンビーク（Ｐ。

Ｍ、　Ｇ、　Ｆ、Ｖ、Ｗｅｚｅｎｂｅｅｌｃ　）等、Ｇ
ｅｎｅ　１１．１２９〜１４８（１９８０）　）の消化
により得、そのＴａｑ　Ｉ部位を１４．　ｃｏｌｉ　　
Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼを用いる４Ｖｊａ　ｆＭ反応に
より鈍端とし、断片をその後制限醇索Ｍｎｌφ工で部分
消化する。この部分的生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
およびＳ１ヌクレアーゼの連続作用で処理し、その後Ｅ
ｃｏＲニーリンカ−（５’）ｐｌＪＧＭＴＴＯＯ□Ｈ０ （６′）で鈍端結紮し、次にＥｃｏＲ工で処理し、そし
てｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位で結紮する。制限酵素
分析およびＤＮＡ配列分析により、ＦｉｃＯＲＩ開裂部
位が１４１６遺伝子’％ｌ１ｌｌ　ＤＮＡ配列のリポソ
ーム結合部位を丁度越えて位置するシラスミドが得られ
る。

本発明者等はＭ１３　　レギユロンを有するシラスミド
（ヌクレオチド１１２８からヌクレオチｒ１２９１〜１
２９７）が表現に適したレギユロンであることを見出し
た。Ｈｌｎｄ　１部位から最も遠いＥｃｏＲ工開裂部位
はｐＵＲ３０１に対して本質的に記述したようにしで除
かれる。ｐＵＲ４０１の完全な組立てを第４図に示す。

９（１，ＩＪンカーおよびゾライマーの化学的合成オリ
ボデキシヌクレオチドの合成は５’−ｏ−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−３’−０−２，２゜２−トリクロ
ロエチル−２−クロロフェニルホスフェートをデオキシ
ヌクレオシド−３’−０−２゜２　、２−　トＩＪ　ク
ロロエチル−２−クロロフェニルホスフェートとのカッ
シリングにより行なわれる。

ホスホトリエステル法として知られるこの方法は１、　
１ 〔ジエイ、エフ、エム、ド、ルーイ（、Ｔ、Ｆ＋Ｍ、（
ｌθＲｏｏｉｊ　）等、Ｒｅａｌ、　Ｔｒａｖ、　Ｏｈ
ｉｍ、Ｐａｙｓ　−Ｂａｓ匝、５６７〜５４８　（１９
７９）ＶＬより記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチ
ル基の間装除去とそれに続＜２．４．６−ドリイソプロ
ビルベンセ゛ンスルホニルー６−ニトロ−１，２，４−
トリアゾールの助けを用いる実際のカップリング反応を
含む。

デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシ
グアノシンにおけるアミン基はそれぞれベンゾイル基、
４−メトキシベンゾイル基およびベンゾイル基により＆
［する。末端ヌクレオシドの３′−ヒドロキシ基の保護
にはベンゾイル基が用いられる。最後の段階ですべての
保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアンモニウムおよ
び績アンモニア水との反応により除去される。

リンカ−（５’）ｐＯＡＴＧＡＡＴＴＯＡＴＧ□Ｈ（３
’）の組立ての一例を第５図に示す。

６ ８に記載のソーマチン暗号づけＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
りが一ゼを用いて合成Ｆｉｃ　ｏＲエニーンカ−（５′
）ｐＯＡＴ（Ｎ）ｒｌＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧｏ
Ｈ（３つにより針部結紮し、ＦｉｃｏＲＩ　テ開裂し、
ソノ後プラスミドｐＵＲ２ｏ１、ｐＵＲ３０１およびｐ
ＵＲ４０１のＥｃ　ｏＲエニー裂部位に結紮し、第６図
に示したような方向でソーマチン暗号づけ挿入部を有す
る組換えシラスミドを、Ｅ。

Ｃ０１１の転換およびテトラサイクリン剛性転換体の選
択後に単離した。上記プラスミドにおいて、化学的に合
成されたリンカ−に由来するＡＡＴＴ順序はエチジウム
プロミドの存在下ＫｃｏＲＩを用いるシラスミドの開裂
により削除でき、線状部分はアガロースデル電気泳動に
より単離され、Ｓ１ヌクレアーゼで処理され、そしてＴ
４１Ｊガ一ゼ作用により再環化される。

ＡＡＴＴの削除後に得られるシラスミドは制限酵素分析
により検出された。

１１、組換えプラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養
−−２−−１−１“−一−−□−−−−−−−□−一−
−−−一一一−−−□□−−□□とソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと完成ソーマチン
遺伝子との間のリンカ−にＡＡＴＴ配列を有する、ある
いは有しないフ０ラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ５
３０またはｐＵＲ５４０を含むＥ、　ｃｏｌｉ細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養する。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するか、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これら条件下でシラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ
５３０またはｐＵＲ５４０の何れかを含む細胞は相当な
量の完成ソーマチンを生じた。タンパク儒ソーマチンの
存在は、定性的にはＳ、Ｄ、Ｓ、ｉ、Ｉ′気泳動により
また甘味に関する生理学的試験により、そして定量的に
は酵素結合した免役吸収剤分析（ＥＬＩＳＡ）により実
証された。

次のプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ　菌体はＡＴＯ
Ｃ！　　に寄託されている。

ｐＵＲ５２０−ＡＴＯＯ３９０１４ ｐＵＲ５２２−ＡＴＯＯ３９０１６ ｐＵＲ５２３−ＡＴＯＯ３９０１７ ６ ｐＵＲ５３１−ＡＴＯＯ３９０１５゜

【図面の簡単な説明】

第１図は１）ＵＲ３０１への転換とその構造を示した図
であり、第２図は完成ソーマチンを暗号化するＤＮＡ配
列の組立てを示し、第６図はｐＵＲ２０１の構造を示し
、第４図はプラスミドｐＵＲ４０１の完全な組立てを示
し、第５図はＤ　Ｎ　Ａ、　ＩＪンカーの組立てを示し
、第６図はシラスミドｐＵＲ５２０、ｐＵＲ５３０およ
びｐＵＲ５４０の組立てを示す。 代理人　　浅　利　　　皓 ７ 第１頁の続き ０発　明　者　ルツボ・エデンス オランダ国マースルイス・アル ベルト・シュバイッードレーフ ９ ０発　明　者　ロベルト・クロック オランダ国ブラールデインゲン ・ヴイルゲンドレーフ２９ ０発　明　者　ジャン・マート オランタ国モンスター・モレン ストラーセ２ 昭和５７年　り月　７７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第２００８０３　号 ２、発明の名称 ＤＮＡ配列 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所 氏名　　ユニリーバ−ナームローゼ　ペンノートシャー
プ（名　称） ４、代理人 電　話　（２１１）　３６５１　（代表）氏　名　　　
　（６６６９）　　浅　　村　　　　　皓５、補正命令
の日付 昭和Ｓ７年　０月３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 図面の浄書　（内容に変更なし） ８、補正の内容　　別紙のとおり 明細書の浄書（内容に変更な〜しａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ’ｌｌ　　４ｍ＝宍ＡおよびＢＫ紀戦の守成ソーマチ
   ンの種々な対立遺伝子形を暗号化するＤＮＡ配列。 （２）　　完成ソーマチンの種々な対立遺伝子形を暗号
   化するＤＮＡ配列および誘導可能な才たは構成的なレギ
   ユロンからなる構造遺伝子の表現、を調節する特別なり
   ＮＡ配列を包含する絹換えプラスミド。 （３）構造遺伝子の衣用をｉ周部する特別なりＮＡ配列
   が二重１ａｃ　Ｕ　Ｖ　５糸からなる誘導可能なレギュ
   ローンを包含する第２拍記載の絹伸えグラスミド（＠６
   １シ１記載のシラスミドｐＵＲ５２０）。 （４）　　構造遺伝子の表現を調節する特別なりＮＡ配
   列が修正されたトリプトファン系を包含する第２項記載
   の組換えプラスミド（第６図記載・Ｖのプラスミ　ド　
   ｐＵＲ５３０）　。 （５）模造遺伝子の表現を調節する特別なり　Ｎ　Ａ配
   列が修正されたＭ１３遺伝子■糸を包含する第２項記載
   の組換えグラスミド（第６図記載の）０ラスミ　ド　ｐ
   ＵＲ５４０）　　。 （口　構造遺伝子をレギユロンのＢｃｏ　Ｒ工部位へヌ
   クレオチド配列（５’　）ｐｃＡＴ（Ｎ）ｎＧＡＡＴＴ
   Ｏ（Ｎ’）ｎＡＴＧｏＨ（３’）　（式中、ｎ　＝Ｑ、
   １．２才たはろであり、Ｎ　オヨヒＮ　’はヌクレオチ
   ドＡ、Ｔ、ＧまたはＣの伺イ１かであるか、たたし二本
   鎖４（〆、造中の１９とＮ’は回転対イシ］＼栴造が存
   在するようなものであることを孝、ｒｌ−とする）を有
   するＢｃｏＲＩ処理Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪンカーを経て結合
   させる第１項から第５項のいずれか１ｍに記載の組換え
   フ０ラスミド。 （７）　　ヌクレオチド配列（５’）ｐＯＡＴ（ＩＪ　
   ）ｎ　ＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧＯＩ＞（６つ（式
   中、ｎ　＝　Ｑ、１，２またはろであり、ＮおよびＮ′
   はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧｉたはＣの何れかであるか、
   ただし封およびＮ′は二本鎖構造において回転対称構造
   が存在するようなものであることを条件とする）を有す
   るＩ）　Ｎ　Ａ−リンカ−〇 （８）　　第１項から第７項までのいずれか１項に記載
   のプラスミドを包含する少なくさも一つの微生物からク
   ローニングされた細菌培養物。 （９）　　レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
   カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しにＩ）ＵＲ
   ５２０を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞を包含する細菌培養物。 Ｑｔｊ　　レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
   カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しに、ｐＵＲ
   ５３０を含むＪ　Ｃ０１ｉ細胞を包含する細菌培養物。 （１ト　　レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
   カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しに、ｐＵＲ
   ５４０を含むＥ、Ｃ０１ｉ細Ｉ泡を包含する細菌培養物
   。 ０２、第１項から第１１角までのいずれか１角に記載の
   プラスミドを橡生物のクローニング媒愉中に添加し、転
   換された細胞を培養し、前記細胞により生産された′ソ
   ーマチンを学齢するこさを特徴とする、ソーマチンの製
   造法。