JPS5845557A - 過酸化水素定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は過酸化水素定量用試薬Ｋかんする。

過酸化水素の検出および定量は、従来から種々の分野で
さまざまな方法で行われているが、臨床−検査の分野に
おいて、その重畳性は、ここ数年来とみに増している。

すなわち生体液試料中の成分に酵累を作用させ、生成す
る過酸化水素を測定し、当該成分を定量する方法が広く
行われている。このことは、生体液中の微量成分である
グルコース、コレステロール、尿酸、リン脂質、中性脂
肪、遊離脂肪酸等の測定を容易にし、臨床診断等に利用
することで、その有効性が十分に立証されている。

このような過酸化水素の検定及び定量法に用いられてい
る試薬は、過酸化水素をノ譬−オキシダーゼまたはパー
オキシダーゼよつ作用を有する物質の存在下で反応させ
、発色あるいは発螢光に導くことが可能な水素供与体を
含むもので、それらについては数多くの開発がなされて
いる。大別すると、 （１）　　酸化還元色素を用いる方法で、還元型の色素
を酸化し発色させて測定する方法。例えば、還元型２．
６−シクロルフエノールインドフエノール、ロイコマラ
カイトグリーン等がある。

（２）　　酸化縮合による発色を測定する方法。例えば
、４−メトキシナフトールを用いそれ自身の酸化縮合に
よる発色を測定する方法、またデベロッパーとして、４
−アミノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチ
アゾロンヒドラゾンな用い、カップラーとしてアニリン
系化合物あるいはフェノール系化合物を用い両者の間で
酸化縮合を行わせ、その際の発色を一定する方法がある
。

しかし、これらの方法は、いずれも完全なものではなく
、＊に生体液中成分の測定においては、感度、安定性、
測定波長、水溶性、毒性の点でいずれかの欠点を持って
いる。

本発明者等はこれらの欠点を除くべく種々研究を重ねた
結果こパーオキシダーゼの存在下で高感度、長波長で測
定可能な、さらに発色の安定性がよく、しかも水溶性で
ある発色剤を合成した。これＫより分散剤等を用いるこ
となく均一な水溶液の調製が可能となり、しかも酵素活
性に対し影響のない再現性の良い試薬を開発し、本発明
を完成した。

本発明に従って、次の一般式で表わされる化合物、ある
いはその塩を発色剤として含有することを特徴とする液
体中の過酸化水素定量用試薬： （ここでＲ１は−Ｈ，−０ＣＲ，、−ＣＨ。

Ｒ”　バーＣＨｓ　、　−Ｃｔ　Ｉｓ Ｒ畠は−ＰＣＢ、丸５ｏｓＨまたは ＋ＣＨ２＋ｎＣｏｏｌ（でｎ　＝　１〜３を表わす）が
提供される。

本発明における発色剤化合物は一般式に示す通り、スル
ホン酸基または、カル？キシル基を有するトリアリール
イミダゾール誘導体であるが、これに類似のトリアリー
ルイミダゾール染料前駆体が公開特許公報昭５３−２６
１８８に開示されている。しかし、当該公報から明らか
な通り当該トリアリールイミダゾール染料前駆体にはス
ルホン酸基またはカルがキシル基を有する化合物は全く
含まれていない。しかも、当該公報に記載の化合物は水
に対して不溶または難溶性物質であり、水浴性の具体的
物質名は示されていない。

一般的に過酸化水素の存在または生成する試料は水浴液
の状態で反応さ尋る方法をとるのが大部分であり、その
定量用試薬も取扱い上水溶液が好ましい。また液体と固
体を反応させる方法より、液体と液体を混合し反応させ
る方法がより迅速でしかも再現性が喪好であるといえる
し、本発明者等が水溶性を重視した所以である。

本発明の化合物は極めて水溶性がよく、さらに過酸化水
素と反応して生成する色素の極大吸収波長が６１０　ｎ
ｍ　であるので、測定に際し短波長和吸収のある物質、
例えばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けない。

また、その分子吸光係数が４〜６万ｅＲ″／−ｏＩ　Ｍ
／ｌであるので微量成分の定量には効果的である。

本発明の化合物は一般に周知の次の方法で合成すること
ができる。

例えば、 （１） １２０〜１２５ｃつ阜 ４時間 ＫＦ／ジオキサン ＣｔＣＦＩ、　ｃｎ、　ｓｏ、α αＣＭ、ＣＨ，８０，Ｆ　　　　（２）（ＣＯα）。

の合成工程を経て得られた。

次Ｋ、本発明化合物の水溶性について、類似のトリアリ
ールイミダゾール染料前部物質の一部と比較した試験結
果を表−ＩＫ示す。

表−１より明らかなように、２　、３　、４　、５゜６
，７は水溶性であり、その反応生成物の色調も安定であ
った。過酸化水素の検出又は定ｉｌＫ際し、本発明化合
物を用いる場合の緩衝液のｐｎは約６ないし８．５の範
囲内が適当で、例えば、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝
液、クエン酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、トリス緩衝
液、グリシン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マ
クイルパイン緩衝液、グツド緩衝液等を用いることがで
きる。

グルコースを測定する場合は、グルコースオキシダーゼ
とパーオキシダーゼを作用させ、ｐｎ　６〜７のリン酸
塩緩衝液中で行うことが好ましい。

コレステロールを測定する場合はコレステロールオキシ
ダーゼとパーオキシダーゼヲ作用させ、ｐＨ６〜７のリ
ン酸塩緩衝液中で行うことが好ましい。

リン脂質を測定する場合は、ホス７オリノぐ−ゼＤとコ
リンオキシダーゼおよびノや−オキシダーせを作用させ
、ｐ１１８のトリス緩衝液中で行うことが好ましい。

中性脂肪を測定する烏合はリポプロテインリパーヤとグ
リセロキナーゼとＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ
、およびパーオキシダーゼを作用させｐＨ７のグツド緩
衝液中で行うことが好ましい。

遊離脂肪酸を測定する場合は、アシルＣｏＡシンセター
ゼとアシルＣｏＡオキシダーゼ、および／々−オキシダ
ーゼを作用させｐＨ６〜８のグツド緩衝液中で行うこと
が好ましい。

尿酸を測定する場合はウリカーゼと／ｆ−オキシダーゼ
を作用させ、ｐＨ６〜７のホウ酸塩緩衝液中で行うこと
が好ましい。

また、コリンエステラーゼ活性モ、ペンソイルコリンを
基質とし、コリンオキシダーゼとパーオキシダーゼを作
用させて８Ｉ１１定することが可能で島本。

次ＫｉＪ！施例により本発明を説明する。

（１）　　試薬：　７０　ｍ　ｍｏｌ／Ｌホウ酸塩緩衝
液（ｐＨ６）に／ぐ−オキシダーゼを０．５Ｕ／ｄ、本
発明化合物（Ａ４（表−１参照＞　５０μｍｏｌ／１ｌ
ｆｃなるように調製した。

（２）試料液：市販、過酸化水累水を用い２．０゜１．
６　ｅ　ｌ−４ｅ　Ｏ０８ｇ　Ｏ−４ｍ　ｍｏｌ／ｌに
なるように水で希釈調製した。

（３）操作：試薬３．０−と試料液のそれぞれを２０μ
を加え、３７℃で５分間加温し、波長６１０　ｎｍ　の
吸光度を測定した。

（４）　　結果：第１図から明らかなように過酸化水素
の検量線は良好な直線性を示した。また呈色の安定性も
十分であった。

実施例２　尿酸の定量： （１）　　原理：尿酸にウリカーゼを作用させ定量的に
生成する過酸化水素をパーオキシダーゼと本発明化合物
を用いて測定しその値から尿酸を定量する。

（２）　　試薬：　７０　ｍ　ｍｏｌ／ｌホウ酸塩緩衝
液（−６）Ｋウリカーゼ０．２Ｕ／ｄ、／＃−オキシダ
ーゼ０．５Ｕ／ｓｄ、本発明化合物Ａ４５０μｍｏｌ／
ｌの濃度になるよう調製した。

（３）　　操作：試薬３．ＯｄＫ血清２０μｔを加え、
３７℃で１５分間加温し、波長６１０　ｎｍの吸光度を
測定した。

別に作製した検量線を用いて尿酸を定量した。

（４）検量線の作製：尿酸を水［ｆｆ！解し、１．５゜
Ｌ２　＊　０−９　＠　０−６　＊　Ｏａ３　ｍ　ｍｏ
１／Ｌ　Ｋなるよう尿酸試料液を調製した。

これを用い血清の場合と同様に操作し夫々の吸光度を測
定し第２図の検量線を得た。これは良好な直線性を示し
た。また試薬は使用上十分な保存安定性のあることが確
關され九

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬を用いる過酸化水素は 測定の検量線を示し、第２図Ｐ本発明の試薬を用いる尿
ｆＩＩ測定の検量線を示す。 ′ｃＪｌｌ田 逍蘇４しに宛ｌ（ルームノ ｚＢ 瓜献１（、、、、Ｊ／ｌ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の一般式で表わされる化合物あるいはその塩を
   発色剤として含有することを特徴とする液体中の過酸化
   水素定量用試薬。 （ここでＲ１は−Ｈ，−ＱＣ島、−Ｃ為Ｒ２は−σ馬、
   へＣ，Ｉ’ｌ。 Ｒｊ　ハ＋ＣＨｔ　＋、　８０ｓ　Ｈｆ　？、＝　ｉｔ
   ＋ＣＨ１＋ＩＣ０ＯＨでＨ＝＝　ｌ　〜３を表わす）
2. （２）物質に作用し、最終的に過酸化水素を生成する一
   連の反応にあずかる全ての試薬成分、パーオキシダーゼ
   またはノ臂−オキシダーゼよう作用を有する物質および
   特許請求の範囲第１項に記載の化合物からなる当該物質
   の定量用試薬。