JPH0236352A - ４’―ヒドロキシアセトアニリドを含有するイミダゾールロイコ染料組成物，診断キットおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、イミダゾールロイコ染料および特定量の４′
−ヒドロキシアセトアニリドを含んでなる色素供給性組
成物に関する。また、該組成物から構成される診断試験
キットにも関する。本発明は、診断方法において有用で
ある。

〔従来の技術〕

医業では、生物学的流体、細胞または組織中に存在する
生物学的および化学的物質の迅速かつ正確な検出または
定量に関する調査および診断方法の必要性が依然として
存在する。例えば、生物学的検体における薬剤、ホルモ
ン、ステロイド、ポリペプチド、ヌクレオチド、プロス
タグランジン、蛋白質、炭水化物または感染性生物体（
細菌、カビまたはウィルス）の存在は、適切な診断また
は処置のために正確かつ迅速な方法で測定されねばなら
ない。

例えば、特定のストレプトコッカス４−ｃｏｃｃｕｓ）
属に属するようなダラム陽性菌に分類される生物体は、
ヒトの病原体として知られている。

例えば、グループＡの生物体は、主にＢ型溶血性肺炎、
■紅熱、リウマチ熱、心臓病続発症、糸球体腎炎、敗血
性咽喉痛および産褥感染症を引き起こす原因となる。ス
トレプトコッカスＡにより生ずる感染力の深刻な作用の
ため、その存在を早い段階で診断することが重要であり
、そうすることで適切な処置方針をとることが可能とな
る。多くの場合、診断試験は数時間または少なくとも３
０分程度までかかる。この限定された待時間でさえも、
開業医が、多くの待機している患者を持つ多くの事例で
は我慢されないであろうし、患者自身も相当な出費、不
便または不安なしには診断を待つことはできない。

診断上の測定方法を提供する目的で、測定される生物学
的または化学的物質（本明細書では「標的リガンド」ま
たは単に「リガンド」という）と受容体（前記物質と特
異的に反応またはパインディングする分子）との間の特
異的パインディング反応を利用する前記物質の単離量定
について多種多様な方法が案出されてきた。リガンドと
その対応する受容体との間の前記反応は、特異的パイン
ディング反応として既知である。そのリガンドと受容体
のいずれかが抗体であるとき、反応は免疫反応として既
知である。かかる反応には１種以上のリガンドまたは受
容体が関与し得る。

前記のような反応は、いろいろな方法で検出される。一
般に、特異的パインディング反応に関与する１以上のも
のが検出され得るように標識される。すなわち、それが
本来的に検出可能であるか、または検出可能な成分（例
えば、酵素、放射性同位体、色原体または蛍光助剤）が
何等かの方法でそれらに組み込まれたものが選ばれる。

最近では、検出可能な成分として酵素を利用するアッセ
イ（例えば、ＥＬＩＳ＾）が多数存在する。これは、一
定の場合に、アッセイに必要な備品が最小限ですむ点で
便利であり、ならびに感度が改善されているからである
。

発明の名称「低ｐｉ蛋白質または炭水化物を含んでなる
特異的パインディング組成物ならびに診断試験キットお
よび使用方法」の−ａｒｒｅｎ　ＩＩＩおよび５ｎｙｄ
ｅｒによる本出願と同日付出願（１９８８年６月１３日
に出願された米国特許出願第２０６．２５７号に対応す
る）明細書は、感度に影響を及ぼすことなくアッセイの
バックグランドを低下させるために特異的バインディン
グ種と共に低ｐｌ値蛋白質の使用を記載する。この発明
は、当該技術分野におけるアッセイの大幅な改良を行っ
ている。しかしながら、低濃度のリガンドを効果的に検
出するアッセイとして低いバックグランドに加えより一
層の高感度が必要なことがわかった。このことは、リガ
ンドが病原体であって疾病の早期検出が緊急を要する場
合に特に重要である。

特開昭６３−２９２４７号公報は、ペルオキシダーゼま
たはペルオキシダーゼで標識されたりガント類縁体とロ
イコ染料との組み合わせにおいてフェノールまたはアニ
リンの使用を記載する。フェノールまたはアニリン（例
えば、４′−ヒドロキシアセトアニリド）は、色素の形
成を促進する電子移動剤として使用されている。その組
成物には、少なくともｏ、ｏｏｔミリモル濃度、好まし
くは０．１〜１０ミリモル濃度のフェノールまたはアニ
リンが使用されている。その出願は、４′−ヒドロキシ
アセトアニリドまたは他のフェノール類がロイコ染料か
ら色素形成速度を高めるのでアッセイがより一層迅速に
なることを示唆する。より多量のフェノールが使用され
るほど色素形成速度がより迅速になる。その上、そこに
記載されるアッセイの特質のため、フェノールとロイコ
染料はペルオキシダーゼで標識されたりガントとの組み
合わせで使用されている。

［発明が解決しようとする課題］ 一般に、アッセイで低濃度の抗原を検出するには高濃度
のペルオキシダーゼで標識された抗体が必要である。ま
た、迅速かつ高感度アッセイでは、色素形成の全体を通
じた反応速度を最高にするために十分量の酵素が供給さ
れ、最高の複合化速度を達成するように高濃度で通常使
用される。残念ながら、これらの高濃度の標識された抗
体は、感度にとって逆効果となり得る高いバックグラン
ドを与える。バックグランドは、抗原の存在に由来しな
い不要な色素のシグナルである。

さらに、ロイコ染料からの色素形成速度を高める（そし
てアッセイをより迅速にする）ために特開昭６３−２９
２４７号公報に示唆されるように４′−ヒドロキシアセ
トアニリド濃度を高めると、高いバックグランド水準を
もたらす。

従って、感度に逆効果を及ぼさないか、バックグランド
を高めることなく、低濃度の抗原を検出しそしてアッセ
イ時間を短縮するために、酵素で標識された抗体の量を
増加することが望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、実質的にペルオキシダーゼを有しないかま
たはペルオキシダーゼで標識された特異的バインディン
グ種である色素供給性組成物であって、イミダゾールロ
イコ染料および２．５ミリモル濃度未満の量で存在する
４′−ヒドロキシアセトアニリドを含んでなる組成物に
より解決される。

この組成物は、また、ペルオキシダーゼで標識された特
異的バインディング種およびペルオキシダーゼに対する
基質を含んでいてもよい診断試験キットに含めることが
できる。

さらに、Ａ、リガンドを含むことが予測される生物学的
検体試料を、少なくとも１つがそのリガンドに対する受
容体であって、同一または相違する特異的バインディン
グ種がペルオキシダーゼで標識され、その標識された種
と前記リガンドまたはそのリガンドに対する受容体と反
応する特異的パインディング種１以上と接触させ、特異
的バインディング種とりガントのペルオキシダーゼで標
識された反応生成物を形成する工程、ならびにＢ。

ペルオキシダーゼに対する基質の存在下で、実質的にペ
ルオキシダーゼを有しないかまたはペルオキシダーゼで
標識された特異的バインディング種である色素供給性組
成物であって、イミダゾールロイコ染料および２．５ミ
リモル濃度未満の量で存在する４′−ヒドロキシアセト
アニリドを含んでなる組成物と前記反応生成物とを接触
させることにより標識された反応生成物を測定する工程
、から成るリガンドの測定方法も開示される。

〔態　様〕

本発明は、ヒトまたは動物宿主に由来する生物学的検体
における標的リガンドの存在を迅速に検出するのに使用
することができる。前述したように、このリガンドはそ
の場で特異的に反応して複合体を形成する対応の受容体
が存在するすべての化学的または生物学的な物質であり
得る。限定されるものでないが、代表的なリガンドとし
ては、蛋白質（例えば、酵素、抗体および抗原蛋白質な
らびにそれらの断片）、ペプチド、ポリペプチド、ヌク
レオチド、炭水化物、植物レクチン、毒素、ハプテン、
薬剤、ウィルス、カビおよび細菌ならびにそれらの構成
要素、さらに当業者に既知の他の物質が挙げられる。例
えば、本発明は、クラミジア属に属する菌性（Ｃｈｌａ
ａ＋ｙｄｉａｌ）またはゴノコッカス属に属する菌性（
Ｇｏｎｏｃｏｃｃａ　Ｉ）またはヘルペス抗原の検出に
有用である。本発明は、特にストレプトコンカス属に属
する菌性（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｃｏｃｃａ　ｌ　）抗原
、例えばストレプトコツカス属に属する菌ＡＢ、Ｃまた
はＧグループ生物体から抽出される炭水化物の検出に有
用である。最も具体的には、本発明によればストレプト
コツカス属に属する菌性（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ
）　Ａ抗原が検出可能である。

限定されるものでないが、これらをアッセイすることが
できる生物学的試料としては、全血またはその成分（血
清もしくは血漿）、咽喉または口腔に由来する唾液また
は粘液、涙液、を髄液、糞便、尿、膣分泌液、精液、ヒ
ト組織または器官の抽出物ならびにヒト乳汁が挙げられ
る。これらの検体は、適当な手段を使用して集めること
ができる。例えば、ストレプトコツカス属に属する菌性
抗原の検出では、一般に咽喉用綿棒がアッセイされる。

本発明の限定的な態様は、イミダゾールロイコ染料を含
む色素供給性組成物中に２．５ミリモル濃度未満の４′
−ヒドロキシアセトアニリドが存在し、この組成物が実
質的にペルオキシダーゼを有しないかまたはペルオキシ
ダーゼで標識された特異的パインディング種である。「
実質的に有しない」とは、ペルオキシダーゼ量がほんの
痕跡量しかないかまたはペルオキシダーゼで標識された
物質が存在することを意味する。この標識された種はア
ッセイで個別に使用するために提供される。

本発明で使用される４′−ヒドロキシアセトアニリド量
は、アッセイ感度および総合的な動力学的性質を最高に
し、かつアッセイにおいて低いハックグランドを与える
目的で使用されるペルオキシダーゼで標識された種の量
に応じて変えることができる。好ましい量は、０．５〜
２ミリモル濃度である。ストレプトコツカス属に属する
菌に由来するＡ抗原に対するアッセイで使用するための
好ましい量は、０．５〜１ミリモル濃度である。他のリ
ガンドに対するアッセイは、異なる好ましい量を使用し
てもよい。

色素供給性組成物において有用なロイコ染料は、ペルオ
キシダーゼおよびそれに対する基質の存在下で色素を供
給し得るイミダゾール染料である。

得られる染料は、一般に電磁スペクトルの可視領域（通
常、４００〜７００ｒｖ＋）で検出可能である０本発明
で有用なイミダゾールロイコ染料は、ジアリールイミダ
ゾールまたはトリアリールイミダゾールロイコ染料のい
ずれかである。数多くのを用な化合物が、従来技術、例
えば米国特許第４，０８９，７４７号明細書、ヨーロッ
パ特許公開第１２２，６４１号および特開昭５８−４５
５５７号公報で知られている。

次式 （上式中、Ｒ＋、ＲｚおよびＲ３は、相互に独立して有
機基、例えば、それらの少なくとも１つが炭素原子数１
８までのオルトもしくはパラ−ヒドロキシ置換アリール
基であり、その他の２つの基が、炭素ベース電極を使用
する標準カロメル電橋に対するサイクリック・ボルタメ
トリーにより測定される場合に一７０ｍＶ〜＋１００ｍ
Ｖの範囲内にイミダゾール酸化電位を有するように選ば
れるアリール基を表す）で示されるトリアリールイミダ
ゾールが特に有用である。酸化電位の測定は、既知の電
気化学的方法（例えば、Ｓａｗｙｅｒら、ハ匹旦髭旦旦
Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｓ　、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４、を参照）に従って行うことが
できる。

本明細書で使用される「アリール」の語は、芳香族炭化
水素基、例えば、フェニル、ナフチルまたはアンスリル
、トリル、キシリルおよび他の置換芳香族基を包含する
ことを意味している。炭素原子数は、核皮素原子の総数
ならびに置換基のそれらをいう、Ｒ’、Ｒ”およびＲ３
基の少なくとも１つは、オルソまたはパラ位に電子供与
性置換基、例えば、アルキルオキシ基（−ＯＲ）　　（
ここでＲは、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基（
例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、し−ブ
チル基、ヘキシル基、クロロメチル基またはメトキシメ
チル基）を表す〕、あるいはジアルキルアミノ基（アル
キル基は前述に定義したような基）を有する。Ｒ’、Ｒ
”およびＲ３基は、酸化により適当な染料を供給するの
にイミダゾール核と電子的に調和し得る１以上の他の置
換基を有することができる。有用なトリアリールイミダ
ゾール化合物についての詳細は、米国特許筒４．０８９
，７４７号明細書（前述）に示されている。

特に有用なロイコ染料は、次の群から選ばれる。

２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
　−４、５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾー
ル、 １−　（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）
−４、５−ジフェニルイミタソール、２（３−ブロモ−
５−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）　−４、５−
ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾール、 ４．５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）２−（４
−ヒドロキシフェニル）イミダゾール、４．５−ビス（
４−ジメチルアミノフェニル）２−（４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）イミダゾール、 ２−（４−ヒドロキシフェニル）−４、５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾール、および ４．５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）２−（４
−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾ
ール。

本発明の組成物で利用されるロイコ染料の量は、どのよ
うに組成物が使用されそして標的リガンドが何かに応じ
て広範に変えることができる。−最に、それは、１０−
”−１０−’モル濃度で存在する。

色素供給性組成物は、必要により他の試薬、緩衝剤（例
えば、組成物をｐＨ４〜９に緩衝化する）またはキレー
ト剤を含むことができる。例えば、それはペルオキシダ
ーゼに対する基質を含むことができる。一般に、それは
過酸化水素であるが、当業者に既知の量で他の過酸化物
を利用してもよい。さらに、組成物は、ロイコ染料を安
定化する水溶性または水分敵性ポリマーを含むこともで
きる。特に有用なポリマーは、ビニルピロリトンボ′リ
マー、アクリルアミドポリマー、アクリル酸ポリマー、
メタクリル酸ポリマー、ポリエチレングリコールおよび
ポリアミンから成る群から選ばれる。好ましい色素供給
性組成物は、以下の例１に具体的に示す。

本発明のアッセイは、ペルオキシダーゼで標識された特
異的バインディング種を使用して実施される。この種は
、前述のような標的リガンドのごとき他の化学的または
生物学的化合物と特異的に反応するすべての生物学的ま
たは化学的化合物であってよく、そしてそれに対して適
当な状態でペルオキシダーゼが付着され得る。標識され
た種はリガンドとまたはりガントに対する受容体と反応
性を有し得る。殆んどの態様において、標識された種は
、抗原に対する抗体であるか、または他の抗体に向けら
れる抗体である。別のアッセイでは、抗体または抗原（
競合的パインディングアッセイの場合）を検出する目的
で抗原またはハプテンが標識される。限定されるもので
ないが、代表的な特異的パインディング種としては、抗
体、抗原物質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド
、ハプテン、薬剤、ホルモン、アビジンもしくはその誘
導体、ビオチンもしくはその誘導体、レクチンもしくは
その誘導体および当業者に既知の他の物質が挙げられる
。特定の標的リガンドまたは受容体が特異的にパインデ
ィングする種はどのようなものが利用し得るかについて
は、当業者に容易に明らかとなろう。

アッセイで使用されるペルオキシダーゼで標識された特
異的バインディング種の量は、標的リガンドに応じて変
えることができる。しかしながら、−ｉ的にそれは、１
〜５０、好ましくは７〜２０ｎ　ｇ　／　ｍｌであろう
。

ペルオキシダーゼで標識された種は、既知の方法を使用
して調製することができる。幾つかは市販されている。

一般に、特異的バインディング種とペルオキシダーゼの
接合体は、酵素を誘導体化し、酵素誘導体を精製し、抗
体とその誘導体を反応させ、次いで得られる接合体の精
製および特性決定により調製される。多くの方法が次の
文献に記載されている：　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ、Ｅｕｒ
　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　１ｆｌｌ。

３９５（１９７９）　、Ｎａｋａｎｅら、Ｊ、Ｈｉｓｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　ａｎｄＣｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
　　　２２．１０８４（１９７４）、ならびにＡｖｒａ
ｍｅａｓ、　　Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ、Ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｌ
、、５０．　１１６９（１９６８Ｌ本発明の色素供給性
組成物は、特異的パインディング反応の有無または量を
検出するためにペルオキシダーゼで標識された試薬が使
用されるすべての免疫アッセイで使用することができる
。例えば、アッセイは、免疫メトリックアッセイ（また
、「サンドイッチ」アッセイとして既知）、競合的パイ
ンディング、直接的もしくは間接的付着アッセイおよび
当業者に既知の他のアッセイであり得る。各アッセイは
、当該技術分野でよい例示があるのでこれ以上の説明は
不要であろう。有用なアッセイは、溶液あるいは診断試
験装置、分析要素、試薬ストリップまたは他の有用な製
品において実施することができる。

例示の目的で、本説明の残りは捕集および濾過手段のよ
うな微多孔質膜を使用するストレプトコンカス属に属す
る菌に由来する抗原のようなリガンドに対するアッセイ
に向けられる。一般に、かかる膜はアッセイで使用され
る全ての試薬および流体を受は取りそして保持し得る診
断試験装置中に組み込まれるが、本発明はこれらの特殊
なアッセイまたは態様に限定されないことを理解しなけ
ればならない。

米国特許第３，８２５，４１０号、同３，８８８，６２
９号、同３．９７０，４２９号および同４，４４６．２
３２号明細書に記載されるものを含む各種の試験装置が
当該技術分野で既知である。特に有用な装置は、特願昭
６３−２３４６９２号および同６３−３１６５３７号明
細書に記載されている。

より具体的には、生物学的検体試料および適当な試薬を
それぞれに収容することができる１以上の試験ウェルを
有する水不溶性シェルを含んでなる。

シェルは、ガラス、高分子材、セラミック、繊維材、セ
ルロース材および当該技術分野で既知の他の材料のごと
きいずれかの有用な水不溶性材料から調製することがで
きる。

好ましい態様では、試験装置が検体試験結果ならびに正
対照および負対照の結果を与えるように設計される３種
類の試験ウェルを有する。各試験ウェルは、それらの中
に取り付けられる微多孔質製品を有する。他の試験装置
は、特開昭６３−２２３５６３号明細書に記載されてい
る。有用な試験装置の他の変形物は、当業者の日常活動
の範囲内に入るであろう。

−ａ的、本発明の方法は、標的リガンドを含むことが予
測される生物学的検体試料を少なくとも１つがそのリガ
ンドに対する受容体であって、同一または相違する特異
的バインディング種がペルオキシダーゼで標識された１
以上の特異的バインディング種と接触させることにより
実施される。

標識された種とりガントは直接的または間接的に複合化
され得る。

また、標識された種は、リガンドおよび相互に結合する
他の特異的バインディング種１以上を介してそのリガン
ドと二次的に複合化されてもよい。

この接触は、標的リガンドと対応する受容体分子との間
にペルオキシダーゼで標識された反応生成物をもたらす
。

この接触は、いずれかの適当な方法により行うことがで
きるが、検体を試験装置中で前記種と混合するのが好ま
しい。

この接触の前後または同時に、この反応が標識された種
とりガントとの直接的または間接的反応を妨害しない限
り、標的リガンドまたは特異的バインディング種を他の
特異的バインディング種と複合化することもできる。幾
つかのアッセイでは、単一のペルオキシダーゼで標識さ
れた受容体を用いてアッセイが実施される。別のアッセ
イでは、リガンドに対する２以上の受容体が使用され、
その１つは標識される。かかる態様には免疫メトリック
アッセイが含まれ得る。標識されていない受容体は、不
溶化されるかまたはアッセイの遅い時点で不溶化されて
もよい。別法として、リガンドを固体支持体に直接付着
し、次いで標識された受容体と反応させるか、または標
識されていない受容体と反応させた後、その最初の受容
体に対するペルオキシダーゼで標識された受容体と標識
されていない受容体を反応させる直接的なパインディン
グアンセイであってもよい。

次に、アッセイで形成される標識された複合体は、ペル
オキシダーゼおよび基質（例えば、過酸化水素）の存在
下で染料を供給し得る本発明の色素供給性組成物を添加
する適当な方法で検出される。得られる色素は、視覚的
に観察されるか、適当な分光光度計を使用して測定され
得る。

本発明の診断試験キットは、本発明の色素供給性組成物
ならびにペルオキシダーゼで標識された特異的バインデ
ィング種および適当なペルオキシダーゼの基質を含む。

これらのキット要素は、適当な手段でパッケージされ、
液体または固体試薬のバイアルまたはボトルを区分して
入れることができるある種のキャリヤー中に入れること
ができる。さらに、この方法を実施する上で有用な次の
ものを１以上それに含めてより：試験装置、抽出試薬（
アッセイに先立ってリガンドを抽出しなければならない
場合）、洗浄液、希釈剤、さらなる受容体分子およびア
ッセイに使用することが当業者に既知の他の試薬。試薬
は、乾燥状または適当な溶液状で供給することができる
。キットの非反応性要素として、説明書、・混合容器、
撹拌器およびピペットなどを含めることができる。

以下の例は、本発明の実施例の代表的なものであるが、
本発明を限定することを意図しない。

〔材　料〕

特異的パインディング組成物は、抗ストレプトコッカス
へのペルオキシダーゼで’ｒＭ　ｉ６された接合体を含
むように調製された。この接合体は、市販の免疫精製ラ
ビットポリクロナル抗体およびＹｏｓｈ　ｉ　ｔａｋｅ
　ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　即−、３９５
（１９７９）に記載される方法による旧１ｅｓ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来のワサビペルオキシダーゼを使
用して調製した。

この接合体を、スクシニル化カゼイン（ｐｉ　４．５．
０．５〜１．５重量％）、０．１モル濃度の４−モルホ
リノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐｌ＋７．５）、１０
ミリモル濃度の４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび
防腐剤０．０１重量％と混合した。

スクシニル化カゼインは、カゼインと等重量のコハク酸
無水物を２５°Ｃで４時間反応させ、次いで透析により
精製して調製した。

使い捨て試験装置の試験ウェル中にＬｏＰｒｏｄｙｎｅ
＠ナイロン微多孔質膜を取り付け、Ｆｌｕｏｒａｄ　Ｐ
Ｃ１３５界面活性剤（０，０５ｇ　／　ｒｒＯで前処理
した。

１列１　二□［：；；；、−］；；；］！；ｌ−二Ｗ□
Ｍ本は−、本発明の好ましい色素供給性組成物の調製を
説明する。ロイコ染料溶液は、２−（４−ヒドロキシ−
３，５−ジメトキシフェニル）−４゜５−ビス（４−メ
トキシフェニル）イミダゾールを用い次のように調製し
た。

リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中２０％の
ポリ（ビニルピロリドン）溶液に固体ロイコ染料（０，
１％溶液調製を目的とする）を溶解した。次に、リン酸
ナトリウム溶液中過酸化水素（１０ミリモル濃度）、４
′−ヒドロキシアセトアニリド電子移動剤（０，７ミリ
モル濃度）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸キレ
ート剤（１０マイクロモル濃度）含有溶液に前記ロイコ
染料溶液を添加し、最終濃度１％のポリ（ビニルピロリ
ドン）および０．００５％のロイコ染料を調製した。

これらの例は、生物学的検体中のストレプトコッカスＡ
抗原を検出するために本発明の方法において例１の組成
物の使用を例示し、その使用を４′−ヒドロキシアセト
アニリドの量が著しく多いい場合のアッセイと比較する
。

例２では、本発明の接合体組成物およびロイコ染料が、
様々な接合体インキュベーション時間において対照の接
合体および色素組成物との比較に使用された。

ストレプトコッカスＡ抗原は、培養生物を添加する前に
酸性共試薬（ａｃｉｄｉｃ　ｃｏｒｅａｇｅｎｔ）に水
性亜硝酸ナトリウムを混合する標準的亜硝酸抽出を使用
してグループＡストレップ培養物（Ｇｒｏｕｐ　Ａ　５
ｔｒｅｐｃｕｌｔｕｒｅ）から得た。次に抽出液体に過
剰の緩衝剤を添加することにより中和した。グループＡ
炭水化物抗原は、酸性エタノールおよびアセトンを使用
し、上澄を廃棄し次いで０．８５％の生理食塩水にペレ
ットを再懸濁することにより得た。ラムノースの濃度は
、Ｄｉｓｃｈｅおよび５ｈａｔｔｌｅｓ、　Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、。

１ｉ、５９５〜６０３　（１９４８）の方法により測定
された。

この濃厚物を、７５ミリモル濃度のエチレンジアミン四
酢酸中にクエン酸（１０ｄ、１．２モル濃度）、亜硝酸
ナトリウム（１２０μ！、８モル濃度）および４−モル
ホリノプロパンスルホン酸緩衝液（１２０ｙ、２モル濃
度、ｐＨ８）を含んでなる抽出試薬で再懸濁した。

前述の微多孔質膜を、２つの使い捨て試験装置の各３つ
の試験ウェルに組み込んだ。コポリ〔スチレン／ｍおよ
びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン
］ビーズ（グリシン緩衝液（０，１モル濃度、ｐ）１８
．５）中５重量％のポリ（アクリルアミド）および０．
０００５重量％の蛍光増白剤を含有する固体１％の懸濁
液２μ！〕から成る特異的パインディング試薬分散体を
、検体試験ウェルとして扱われる試験ウェル中の膜中央
部に添加した。このビーズに、ストレプトコッカスＡ抗
原に対する免疫的に精製されたラビットポリクロナル抗
体を共有結合させた。

負対照とみなされる第二の試験ウェルは、ポリ（アクリ
ルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）および蛍光増
白剤と混合したラビットガンマ−グロブリン（１重量％
）を付着した同一のポリマービーズの乾燥分散体（２μ
りを含ませた。この分散体は、膜の中央部に適用された
。

正対照とみなされる第三の試験ウェルは、ポリ（アクリ
ルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）中の前記試薬
の乾燥分散体（２ＩＩｌ）、蛍光増白剤およびストレプ
トコンカスＡ抗原２０ｎｇ／ｍ１を含ませた。この分散
体は、膜の中央部に適用された。

抗原抽出液（０、６２ｎ　ｇ　／　ｍｌ）　２００　ｍ
ｌを、検体試験ウェルだけに添加してｌｔＨ＆した。

前述の接合体を含有（５ｎ　／　ｍｌ　）する第１溶液
（４０ＩＩＩ）および同じ接合体を含有（１５Ｉ！ｇ／
Ｉｎ１）する第２溶液（４０ＩＪｆ）を個々の使い捨て
装置に添加し、膜を通して排液した。

次に、それぞれの使い捨て装置を室温で３０秒、６０秒
および１２０秒インキュベーションした。

リン酸ナトリウム緩衝？＆　（０，１モル濃度、ｐＨ７
，２）中デシル硫酸ナトリウム（７０ミリモル濃度）を
含む洗浄液を、すべてのウェルに通用し、腋を通して排
液した。

５ミリモル濃度の４′−ヒドロキシアセトアニリドと共
に前述のロイコ染料組成物を含む第１の色素供給性組成
物（１２０ｊ１１）を、第１．の接合体溶液を含む試験
ウェルに添加した。同じ染料および０．７ミリモル濃度
の４′−ヒドロキシアセトアニリドを含む第２の色素供
給性組成物（１２０ｕりを、第２の接合体溶液を含む試
験ウェルに添加した。

各組成物は、膜を通して排液した。

次に、それぞれの使い捨て装置を室温で２分間インキユ
ヘーションし、膜上に形成される色素を反射率について
測定して透過濃度（ＤＴ）に換算した。結果を次の第１
表に示す。

第一一り一表 ＊　　接合体量：４′−ヒドロキシアセトアニリド量 ＊＊　バックグランド＝０．００７ これらの結果は、対照とほぼ同じシグナルを得るのによ
り短いインキュベーション時間でよいので、本発明がよ
り迅速なアッセイを与えることを示す。さらに、２分間
のインキュベーション後、本発明は対照と同じく低いバ
ックグランドを示すが、相当高い感度を有していた。

例３では、染料インキュベーション時間を変化させた。

抗原濃度を２．５ｎｇ／ｍ、使用される接合体量を、対
照アッセイ対本発明のアッセイについて３　ｔｔｇ　／
　ｍ１対９　ｎ　／　ｍｌとし、２分インキュヘーシヨ
ンした後に洗浄工程を実施し、洗浄工程後室部で染料イ
ンキュベーションを３０秒、６０秒および１２０秒実施
する以外は例２の方法を繰り返した。

アッセイの結果を次の第■表に示す。

＊　　接合体量：４′−ヒドロキシアセトアニリ　　ド ＊＊　バックグランド＝０．００７ これらの結果は、高いシグナルを得るのにより短いイン
キュベーション時間でよいので、本発明がより迅速なア
ッセイを提供することを示す。さらに、２分インキュベ
ーション後、本発明は対照と同様に低いバンクグランド
を示すが、相当高い感度を有していた。

（発明の効果） 本発明は、色素供給性試薬としてイミダゾールロイコ染
料を使用し、標識としてペルオキシダーゼを使用する場
合、標的リガンドに対して高感度で正確なアッセイを提
供する。このアッセイは、特にストレプトコツカス属に
属する菌に由来する抗原、例えばストレプトコッカスＡ
抗原の検出に有用である。

アッセイにおいて、感度は著しく高められるにもかかわ
らず、アッセイのバックグランドは非常に低く維持され
る。この結果は、通常、ロイコ染料と共に使用されるか
なり低い濃度４′−ヒドロキシアセトアニリドにより達
成された。例えば、Ｗａｒｒｅｎ　ｍらによる本出願と
同日出願（対応する米国特許出願第２０６　、２５７号
）明細書（前述）の記載によれば、４′−ヒドロキシア
セトアニリドが５ミリモル濃度で使用されている。Ｗａ
ｒｒｅｎらは、色素供給反応を促進する目的で相当多量
のフェノールを供給する特開昭６３−２９２４７号公報
における説を追試している。

本発明までは、高感度アッセイを得るには多量のフェノ
ール（例えば、４′−ヒドロキシアセトアニリド）が必
要であると信じられている。

驚くべきことに、４′−ヒドロキシアセトアニリド量を
前述の文献で示される相当多量のものから減少させ、ペ
ルオキシダーゼで標識された特異的バインディング種を
増加させた場合、染料形成の総合的な動力学的性質、標
識された特異的バインディング種の複合化性およびアッ
セイ感度はバックグランドの上昇を伴うことなく高めら
れることを見い出した。

このことは、前記文献が感度を高めるために４′ヒドロ
キシアセトアニリドの高濃度を使用することを説示すの
で予期できない。さらに、その従来技術では、バックグ
ランドを低下させるためにペルオキシダーゼで標識され
た種が低濃度に維持されている。当業者は低濃度の４′
−ヒドロキシアセトアニリドと高濃度の標識された種は
、感度を低下させそしてバックグランドを高めると予測
するであろう。このようなことは、本発明で生じなかっ
た。

４′−ヒドロキシアセトアニリド濃度を５ミリモノ濃度
から、例えば、０．７ミリモル濃度への減少は、色素形
成速度を容認できないほど遅くするばかりでなく、また
容認できない、はどアッセイ時間が長くなるであろうと
予測された。４′−ヒドロキシアセトアニリドの減少に
関連してペルオキシダーゼで標識された種が増加され、
高感度、迅速かつ低いバックグランドアッセイを提供す
るので、前記の状態は生じなかった。本発明は、１０分
以内に、−ａ的は５分未満で実施され得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、実質的にペルオキシダーゼを有しないかまたはペル
   オキシダーゼで標識された特異的バインディング種であ
   る色素供給性組成物であって、イミダゾールロイコ染料
   および２．５ミリモル濃度未満の量で存在する４′−ヒ
   ドロキシアセトアニリドを含んでなる組成物。 ２、実質的にペルオキシダーゼを有しないかまたはペル
   オキシダーゼで標識された特異的バインディング種であ
   る色素供給性組成物であって、イミダゾールロイコ染料
   および２．５ミリモル濃度未満の量で存在する４′−ヒ
   ドロキシアセトアニリドを含んでなる組成物から構成さ
   れる診断試験キット。 ３、Ａ、リガンドを含むことが予測される生物学的検体
   試料を、少なくとも１つがそのリガンドに対する受容体
   であって、同一または相違する特異的バインディング種
   がペルオキシダーゼで標識され、その標識された種を前
   記リガンドまたはそのリガンドに対する受容体と反応す
   る特異的バインディング種１以上と接触させ、特異的バ
   インディング種とリガンドのペルオキシダーゼで標識さ
   れた反応生成物を形成する工程、ならびに Ｂ、ペルオキシダーゼに対する基質の存在下で、実質的
   にペルオキシダーゼを有しないかまたはペルオキシダー
   ゼで標識された特異的バインディング種である色素供給
   性組成物であって、イミダゾールロイコ染料および２．
   ５ミリモル濃度未満の量で存在する４′−ヒドロキシア
   セトアニリドを含んでなる組成物と前記反応生成物とを
   接触させることにより標識された反応生成物を測定する
   工程、から成るリガンドの測定方法。