JPS58220693A - 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法によるＬ−）リプドアアン（以下、ト
リプトファンと記す）の製造法に関する。

従来トリプトファンの製造法としては、トリプトファン
の前駆物質であるアントラニル酸、インドール或は３−
インドールピルビン酸よシトリブトファンを製造する方
法が知られている。

これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物質を使用
しないで、糖類等を炭素源とし、バチルス属に属しトリ
プトファンアナログに耐性を有する変異株を使用して直
接発酵法によシトリブトファンを生産する方法（特、公
明４８−１ｊ８２８、特公昭１ｓ３−３９５１７）が開
発されている。

そζで、本発明者らはバチルス属の微生物を用いて更に
糖類等の炭素源からトリプトファンを直接発酵法によシ
安価に製造する方法を開発すべく研究を行った結果、バ
チルス属の上記のようなトリプトファンアナログ耐性の
他に更にケイヒ酸あるいはヒドロケイヒ酸に耐性を有す
る微生物の中に、従来知られているものよシ更に大量の
トリプトファンを生産する能力を有する菌株があること
を見い出した。この発明はこの知見に基づいて更に研究
の結果完成されたものである。

本発明の方法で使用される変異株は、バチルス属に属し
トリプトファンアナログ及びケイヒ酸あるいはヒドロケ
イヒ酸に耐性を有し、かつトリプトファンを生産する能
力を有する微生物であル、例えば、次のような変異株が
使用される。

バチルス・ズブチリス　ＡＪ　１１９０６　　ＰＩ！！
ＲＭ−Ｐ　６５６２（５−Ｆ−Ｔｒｐ　、　Ｃ１ｎ　） バチルス・ズブチリス　ＡＪ　１１９０７　　ＦＥＲＭ
−Ｐ　　６Ｉ’ｓ　６３（’５−Ｆ−Ｔｒｐｒ、　Ｌｅ
ｕ”、　０１ｎｒ）バチルス・ズブチリス　ＡＪ　　１
１９０８　　ＦＩＲＭ−Ｐ　６５６４（５−Ｆ−Ｔｒｐ
ｒ、１Ｍ”、　０１ｎｒ）バチルス・ズブチリス　ＡＪ
１１９０９　　ＦＢＲＭ−Ｐ　　６５６５（５−Ｆ　−
Ｔｒｐｒ、　ＩＭｒ、　、　、ＨＯｌｎｒ）５−Ｆ−Ｔ
ｒｐ　　、５−７ｔ：１オロトリグトファン耐性Ｌｅｕ
−：’Ｌ−ロイシン要求性 工Ｍｒ　　：インドールマイシン耐性 ０１ｎｒ　　：ケイヒ酸耐性 ＨＣｌｎｒ　：ヒドロヶイヒ酸耐性 これら本発明で使用される変異株は、バチルス属のトリ
プト７アンアナログ耐性のトリプトファン生産菌を親株
とし、と＃に通常の変異誘導操作、例えば、紫外線照射
或はＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジ
ン（以下、ＮＧと略す。）亜硝酸等の化学薬剤処理を施
し、変異処理した菌株を親株が生育できないような量の
ケイヒ酸あるいはヒドロヶイヒ酸を含有する平板寒天培
地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによって得られる。

上記の親株としては、トリプトファンアナログ耐性の他
にトリプトファン生産に有用な性質を有するトリプトフ
ァン生産菌１例えば、Ｌ−アルギニン、Ｉ、−１）シン
、Ｌ−ロイシン４Ｌ＜ｉｔ、Ｌ−：ｙエニルアラニン要
求性のトリプトファン生産菌（％公明５３−３９５１７
号公報）、更傾はトリプトファンアナログ耐性でかつイ
ンド」ルマイシン耐性のトリプトファン生産菌（特開昭
５６−９２７９６号公報）等が使用される。具体例とし
ては次のようなトリプトファンアナログ耐性のトリプト
ファン生産菌が使用される。

バチルス・ズブチリス　ｐＴ−ｓ４５　ＰＩ！＋ＲＭ−
Ｐ１７８３（ｓ−ｐ−Ｔｒｐｒ） バチルス・ズブチリス　ＦＦＬ−５ＦＦ！ＲＭ−Ｐ１７
８６（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ＋Ｌｅｕ−） バチルス・ズブチリス　Ａ、Ｔ　１１４８３　　ＦＢＲ
Ｍ−Ｐ５２１６（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ＋ＩＭｒ） その他、本発明の変異株はバチルス属の野生株を親株と
し、奢れにケイヒ酸耐性□あるいはヒドロケイヒ酸耐性
を付与した後′トリプトファンアナログ耐性を付与する
ことによっても誘導することができる。この場合にも更
にトリプトファン生産に有用な性質、例えば、Ｌ−フェ
ニルアラニン、Ｌ−−ｙ−ロジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−
ヒスチジン等のアミノ酸に対する栄養要求性、或はフェ
ニルアラニンアナログ耐性等を付与することが望ましい
。

以下の実験例にて、本発明のケイヒ酸耐憔トリプトファ
ン生産菌のケイと酸に対する耐性度及びヒドロケイヒ酸
耐性トリグトファン生産菌のヒドロケイヒ酸に対する耐
性度を示す。

実験例 第１表に示す組成の最少培地を直径１６．５ｓｓの試験
管に４．　Ｏｔｘｌ宛分注し、１１０ｒでｉｏ分間加熱
した。これに別途フィルターで濾過（除菌）し光ケイヒ
酸（ヒドロヶイヒ酸）溶液を、第２表に示す濃度となる
ように加えて周体培地を調製した。

上記培地にケイヒ酸（ヒドロヶイヒ酸）を含まない最少
培地で２４時間培養して得られたバチルス・ズブチリ、
（ＡＪ１１９０６、Ａ：ｒ１１９０７、　ＡＪ１１９０
Ｂ及びＡＪ１１９０９Ｏ培養液を夫々各０．１ｘｔｌ宛
接種し、３ｏＣで４８時間振盪−養を行い、培養液の５
７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第２表に示す
。

グルコース　　　　　　　　　　５．Ｏｆ／）硫酸アン
モニウム　　　　　　１．ｏ〃ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　
　　　　　　８．６５　　ｔｒＭｇＳＯ，・７Ｈ，ＯＯ
，２＃ Ｆｅ５０．　　・７Ｈ，ＯＩ　Ｏ”５１／ノＭｎ８０．
−４Ｈ，０１０ｔｔ クエン酸ナトリウム　　　　　ｏ、ｓ　　ｔ７ノ※　Ｌ
−ロイシン　　　　　　ｉｏ”１膚（＊　Ｌ−ロイシン
要求株の場合のみ添加）第２表 ＦＴ１４５ （５−Ｆ−Ｔｒｐｒ）　　　　１００６４２３　６　２
ＡＪ１１９０６ （５，Ｆ、Ｔｒｐｒ、。ｉ　ｎ　ｒ）　　　　１００９
８　５３２２　１３ＦＬ−５ （５−Ｆ−Ｔｒｐｒ、Ｌｅｕ−）　　　１００５４　１
８　７　１ＡＪ１１９０７ （５，Ｆ、Ｔｒｐｒ、Ｌｅｕ−、Ｃ！１ｎｒ）　　１０
０９５５１　２１　１１ＡＪ１１４８３ （５・Ｆ−Ｔｒｐｒ、　ＩＭｒ）　　　　”°０６１２
５８２Ａ、Ｔ１１４８３ （５・、、Ｔｒｐｒ工、ｒ）　　　　１００　６２　２
１　１３　　５ＡＪ１１９０９ （５、Ｆ−Ｔｒｐｒ、　ＩＭ”、　Ｈｏｒｎす１００　
９５　５３　３２　２４本発明で使用する培地は炭素源
、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビ
タミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が
使用される。炭素源としてはグルコース、シュークロー
ス、マルトース、澱粉氷解物、糖蜜等が使用され、その
他エタノール、酢酸、クエン酸等も単独或は上記他の炭
素源と併用して用いられる。窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩、硝酸塩、尿素、ペプトン等有機或は無機
の窒素源が使用される。有機微量栄養素としてはアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有
するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解
物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求
性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添す
ることが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグ
ネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用
される。

培養は通常の培養条件下で行えば良く、ｐＨを５ないし
９、温度を２０ないし４０ｒに制御しつつ１〜４日間振
盪培養又は通気攪拌培養することによシ培養液中に著量
のトリプトファンが蓄積される。培養中にｐＨが下がる
場合には、炭素カルシウムを別殺菌して加えるか又はア
ンモニア水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。

又、有機酸を炭素源とする場合はｐＨの上昇を鉱酸又は
有機酸で中和する。

培養液からトリプトファンを採取する方法は、公知のト
リプトファン回収方法に従って行えば良く、培養液から
菌体を除去した後濃縮晶析する方法或はイオン交換クロ
マトグラフィー等によって採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 下記第３表に示した組成のトリプトファン生産用培地２
０ｔｔｌを５００ｍ１容フラスコに分注し、１１０Ｃで
１０分間加熱した後、第４表に示す微生物をそれぞれ％
スラント量植えっけ３（ｌで９６時間振盪培養した。そ
れぞれの培養液中のトリプトファン生成量は第４表の如
くであった。

グルコース　　　　　　　　８０　ｔ／〕塩化アンモニ
ウム　　　　　１０　　〃Ｋｌ、Ｐ０．　　　　　　　
　　　１　　１［０１２＃ ＭｎＥＩＯ，・７Ｈ，０１０’ｆｌ／Ｊ、Ｐｅ５ｏ、　
・４Ｈ，０１０ｔ／ カザミノ酸　　　　　　　　　　４　　＃／）Ｍｇ８０
．・７Ｈ，ＯＯ，４ｔｔ ＯａＯｏ、　　　　　　　　　　　　　４０　　１※Ｌ
−ロイシン　　　　　　　　２０　　’（７７簿（※　
Ｌ−ロイシン要求株の場合のみ添加）第４表　トリプト
ファン生成量 ＦＴ−１４５１，９０ ＡＪ　　　１１９０６　　　　　　　　　　　３．５Ｆ
ＦＬ−５４，２ ＡＪ　　　１１９０７　　　　　　　　　　　　６．５
Ａ、Ｔ　　　１１４８３　　　　　　　　　　　６．２
ＡＪ　　　１１９０８　　　　　　　　　　　８．０Ａ
Ｊ　　　１１９０９　　　　　　　　　　　　７．５％
杵出願人　味の素株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス属に属し、トリプトファンアナログ及びケイヒ
   酸あるいはヒドロケイヒ酸に耐性を有し、かつＬ　−）
   　ＩＪブト７アン生産能を有する微生物を液体培地中に
   好気的に培養し、培養液中にＬ−）リプドアアンを生成
   蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−）リ
   プドアアンの製造法。