JPS5822008B2 - 猫のヘルペスウイルスのワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は猫のヘルペスウィルスのワクチンに関するもの
である。

猫のウィルス性鼻気管炎（ＦＶＲ’）は、猫に特有なヘ
ルペスウィルス性感染病である。

猫のヘルペスウィルスは代表的なものは鼻、咽頭及び気
管の上面の上皮細胞に侵入し増殖し、壊死、くしやみ、
咳及び鼻の排泄物を生じさせる。

結膜の上皮もやはり感染し、重い結膜炎となる。

稀には気管支と大きな気管支梢も感染することがある。

場合によっては舌の上皮も感染し、潰瘍的舌炎となる。

この疾病は結膜炎の発達、催涙、鼻の排泄物の増加及び
くしやみに特色がある。

猫のヘルペスウィルスはそれが最初に単離されて以来、
普通の猫集団の中に普偏的に存在することが見出されて
いる。

猫のウィルス性鼻気管炎ウィルスは、特殊なりＮＡウィ
ルス種である。

猫属（ｆａｍｉｌｙ Ｆｅ −１ｉｄａｅ）はそれから
ＦＶＲウィルスを単離するのに成功した唯一の宿主であ
る。

ＦＶＲウィルスは猫の組繊細胞内では培養することがで
きるが、他の種の組繊細胞培地、他の動物組織、受精卵
又は実験動物の如き他の組織内では成長することはでき
なかった。

このウィルスは組織培地内に特殊な細胞病変（ｃｙｔｏ
ｐａｔｈｉｃ）効果を生ずる。

また、分子内の包含体を感染した培地内で明瞭に認める
ことができる。

ＦＶＲの早期段階は体温の僅かな上昇と、くしやみ、よ
だれ及び目からの漿液の排泄である。

病気が進行するに伴い、体温が上昇し、感染した猫は元
気が無くなり、成算から大量の粘液膿が排泄されるよう
になる。

分泌物から成る皮相が成算の周囲に発達し、甲介骨及び
それ等に重なる上皮の局部的壊死が生ずる。

白血球は増加し、全白血球数は３００００〜５００００
細胞／ｃｃとなる。

最も顕著な病理学的変化は上部呼吸器に限定される。

肺炎は日和見主義的なバクテリア又はミコプラズマの作
因が存在しない限り普通発生しない。

グツトビオティック（ｇｎｏｔｏｂｉｏｔ ｉｃ）子猫
における実験は、猫のヘルペスウィルスの病原性は呼吸
器のマイクロバイアルフローラ（ｍｉｃｒｏｂ−ｉａｌ
ｆｌｏｒａ）には左右されないことを示した。

鼻の径路を介して猫のヘルペスウィルスに感染したグツ
ビオティック猫は、くしやみ、咳、鼻と結膜の排泄物、
呼吸困難、食欲不振、元気喪失及び体重減少等の特色を
示す熱の有る重い上部呼吸器感染病を示す。

鼻介骨の上皮は上皮変化の他に壊死を蒙り、鼻介骨の著
しい骨学的変化が生ずる。

猫のヘルペスウィルスは生長する骨に好んで繁殖しその
壊死を生じさせることが見出されている。

人や低級動物におけるヘルペスウィルスの感染を生殖器
感染病の一原因であるとする臨床的及び実験的証拠が多
数有り、一般化した先天性の感染が多くの断崖の種に認
められている。

実験的結果は生殖器の感染病は猫のヘルペスウィルスに
より誘起され得ることと、妊娠の後期段階で感染した子
猫のホルン（ｖｏｒｎ）から成熟牝猫における重大な先
天性の伝染した感染病を生じさせることを示す。

成熟牝猫の妊娠後期段階中の静脈内又は鼻腔内へのヘル
ペスウィルスの接種は、何れも牝猫の流産を惹き起した
。

妊娠牝猫の腟からの感染は肺炎を生じさせ、また断崖の
子猫の致命的な組織の疾病をも実験的に生じさせた。

感染した子猫は肝臓のインクルージヨンと気管支肺炎と
を患っていた。

ＦＶＲはずっと以前から猫の重大な疾病として知られ、
今日まで多大の時間と注意がこの状態に払われて来たが
、既知の如何なるワクチンもその感染を予防又は駆逐す
るのに利用することはできなかった。

本発明の目的はＦＶＲに対し猫属の種を免疫にするワク
チンを、猫のヘルペスウィルスの毒性な菌株をその抗原
性を保持しつつ弱毒状態に希釈することにより製造する
にある。

簡単に記すと本発明は、純粋な毒性の猫のヘルペスウィ
ルスを単離する段階と、ウィルスの再生産が起るように
組繊細胞培地にウィルスを接種する段階と、かくて繁殖
したウィルスをさらに他の組繊細胞培地にウィルスがそ
の抗原的性質を失うことなく弱毒性状態に希薄化される
のに充分な通過回数と条件で直列的に通す段階とを有す
る方法により製造されるワクチンに関する。

バクテリア又はウィルスの毒性即ち病原的特性を６、弱
毒性即ち非病原的状態まで希薄化即ち修整することは、
業界に周知である。

形態学及び／又は病原的特性の修整即ち希薄化は、多数
の技術によって齋らされている。

時には宿主組織内の反復的直列通過がこの微生物を希薄
□化する。

宿主組織とは異なる組織内の直列的通過は時として希薄
化につながる。

微生物に対する化学的ショック、輻射線処理、低温通過
及びその他の技術が細菌学者とウィルス学者によって用
いられ、宿主に病原体を効果的に中性化し得る抗体を生
成させる能力を保持しながら、病原学的に不活性な有機
体を製造している。

生きている微生物の抗原性の損失を伴なわない希薄化は
全く予測の付かないものであり、成る与えられた技術の
効力を決定するには経験的方法に頼るしかない。

例えば成る種のウィルスに適用できることが見出された
技術が、他のウィルスにも常に適用できるとは限らない
。

今日まで猫のヘルペスウィルスを希薄化する方法は１件
も報告されていない。

成る実験においてはウィルスは猫の組織内を１５０回も
直列に通過させても希薄化されず、最終ウィルスは非免
疫の子猫の体内に導入した場合、出発物質に劣らない活
性な毒性を有することを示した。

今や本発明者は、生長を支持し得る組繊細胞培地に猫の
ヘルペスウィルスを接種し、２３〜３３℃の著しく下げ
た温度で処理すると、ウィルスは希薄化され弱毒性とな
るがなおもその抗原的特性を保持すること、即ち感染し
易い猫の体内に導入した場合その免疫学的機構を誘起し
てウィルスの抗体を製造し、この猫はかくて次の感染に
対し免疫となることを見出した。

これは本発明の対象をなす。

本発明者は業界で標準の通常の直列通過技術を用いて、
約２３〜約３３℃の範囲の温度で約５０回通過後に、抗
原性を失うことなく、所要の弱毒性特性を発現すること
を見出した。

然し、約２５０回又は約３００回又はそれ以上の通過回
数のものも、使用することができる。

本発明の着想の第２部分として、単離したウィルスをウ
ィルスの成長を維持し得る組繊細胞培地（例えば猫の腎
臓組繊細胞培地）上で所定のウィルス力価まで培養する
段階と、この細胞培地の単層にウィルスを接種する段階
と、周知の「血小板技術（前述の細胞培地の単層を普通
のペトリ皿型容器内で、半固体栄養素溶液の下で２５℃
で、細胞の最大の変質が明瞭となるまで普通約１０〜１
２日間培養し、次いで大型の規則的形状の非膨張の血小
板と共に存在する小型の膨張した不規則形状の血小板を
選別する）」を用いる段階と、これ等の小型血小板を普
通の方法で１〜３回組繊細胞培地の単層内に通す段階と
、最大の細胞変質が生じた後このウィルスを収穫する段
階とを有する技術方法により、ＦＶＲを生じさせる毒性
の猫のヘルペスウィルスから弱毒性の抗原性ウィルスを
得ることができる。

この選択的技術を用いると、最も少い直列的通過回数で
弱毒性抗原性ウィルスが得られる。

低温培養は−だんと希薄化されたコロニー即ちウィルス
の血小板と希薄化の少いコロニーとの混合物を生成する
ということが言え、血小板技術により可能になったコロ
ニーの小型の膨張して見える不規則な血小板の選別によ
り、当初の接種物（イノキュラント）内に存在するすべ
てのウィルスを希薄化するのに必要な低温と継続的直列
通過の必要なく、−だんと希薄化されたウィルスが繁殖
するということが言えるものの如くである。

本発明のＦＶＲワクチンは外方又は内方からする非経口
的技術により、猫属の任意の種に投与することができる
。

このワクチンは液体状で鼻内、耳内、眼内、筋肉内、静
脈内、腹腟内等に投与することができる。

乾燥粉末状の場合には外方からする非径口的投与に適当
である。

この種のワクチンに通常なように、約３０００〜約２０
０００ＴＣＩＤ、。

単位が１回の投与で処方される。ＦＶＲウィルスの独特
なものと考えられる１特性は、母性の抗体の力価が高い
子猫、即ち出生後から約５週までの子猫でさえも、鼻と
眼の通路の上皮組織が猫のヘルペスウィルスに感染する
ことが見出されていることである。

この状態は、血液流内の循環する抗体がウィルスを中性
化できない場所にウィルスが上皮組織内で局在する傾向
により、存在し得ると考えられる。

かくて子猫の母性の抗体水準が低下すると、ウィルスが
拡がり、子猫は組織的に感染するようになり普通ＦＶＲ
になる。

本発明のワクチンを用いて母性の抗体で保護された子猫
は、ワクチンの耳内又は眼内投与等の外方からの非経口
的技術により、猫のウィルスの鼻気管炎感染に対して予
防接種することができる。

母性の抗体の消失後は、筋肉内、静脈内、腹腟内等の如
き非経口的又は外方非経口的なウィルスワクチンの投与
技術を用いることができる。

ワクチンの鼻内、耳内又は眼内投与は母性の抗体で保護
された子猫と成猫の何れにも有効な為、この予防接種技
術は母性の抗体が存在すると思われる若い動物のワクチ
ン接種に好ましい。

この場合母性の抗体の力価の決定は必要でない。

本発明のワクチンの製造方法の段階を次にさらに詳細に
説明する。

■、 ウィルスの単離 猫のウィルス性鼻気管炎を示す上部呼吸器病に罹ってい
る猫を、標準技術によりスワップ（ｓｗａｂｌした。

スワップからの材料を猫の腎臓組繊細胞培地内に入れ、
ウィルスに対する単種的抗血清を用いる標準的免疫学的
技術により、猫のヘルペスウィルスを単離し確認した。

２、 ウィルスの再生産 猫の腎臓の細胞を用いて組繊細胞培地を調製した。

猫の腎臓細胞を約１．２７ｃＩｒＬの深さまで覆うのに
充分な媒質を含有する猫の腎臓の細胞のトリプチナイズ
（ｔｒｙｐｔｉｎｉｚｅ） Ｌ／た懸濁液を標準的ガラ
ス製培養容器に入れた。

媒質としては牛の胎児の血清を５係含有し、１９５９年
発行のｒＳＣＩ−ＥＮＣＥＪ １３０ 、Ｐ４３２に記
述された鷲の最小必須媒質（ＭＥＭ）を用いた。

然しハンクスのバランス塩溶液中に溶解したラクトアル
ブメン水和物媒質、媒質１９９等の如き任意の標準成長
媒質を用いることができる。

培養容器を３７℃で１〜３日間培養し、その後猫の腎臓
の細胞の単層が生成した。

次いで標準の無菌的技術を用いて単離したヘルペスウィ
ルスを接種し、３７℃で２４〜７２時間培養した後、細
胞の細胞病変（ｃｙｔｏｐａ ｔｈｏｌｏｇｙ）は略々
完了し、ウィルスがそれ自身で再生産したことを示した
。

希釈技術による力価測定は、約１０６ＴＣＩＤ５ｏ／１
１Ｌｌの力価を示した。

この物質の１００ ＴＣＩＤ５ｎ／７７１１を外方非径
口的に感染し易い猫の体内に導入した。

約５〜７日内にＦＶＲ感染の代表的例の臨床的徴候が現
れ、この物質が毒性の猫のヘルペスウィルスを含有して
いたことを示した。

ＦＶＲ感染の代表的例を次のチャートに示す。

著しく若い子猫の代表的な猫の 鼻気管炎ウィルス感染のチャート 年月日 観察事項 ４８−４−２６牝猫Ｎ−５が５匹の健康そうな子猫を出
産。

母猫は正常の如く見えた。母猫の喉をスワップしたとこ
ろヘル ペスウィルスを保持していた。

４８−５−２母猫と５匹の子猫の写真を撮り、子猫の喉
をスワップした。

子猫の眼は未だ開いていなかった。

ヘルペスウィルスは子猫からは単離されなかっ た。

４８−５−１８３匹の子猫に流涙が生じ最初の臨床的徴
候が現れた。

子猫の写真を撮り、喉をスワップしヘルペスウィルスが 存在することを見出した。

４８−５−２３５匹の子猫は皆粘液膿の有る眼となった
。

４８−５−２９５匹の子猫は皆眼と鼻孔に粘液膿を有し
た。

４８−６−１５匹の子猫は皆眼と鼻孔に粘液膿を有した
。

４８−６−４５匹の子猫の眼蓋は何れも流れ出た粘液膿
により固く閉ざされた。

４８−６−５５匹の子猫の眼と鼻孔は何れも著しく充血
し、息使いは口で行ない苦し そうであった。

４８−６−８５匹の子猫は皆猫の鼻気管炎感染の極めて
苛烈な臨床的光景を呈した。

子猫の写真を撮り、喉をスワップし たところ、ヘルペスウィルスが存在 していた。

４８−６−１０１匹の子猫が死亡し、ＦＶＲによる年月
日 観察事項 死と記入された。

４８−６−１２２匹の子猫が死亡し、ＦＶＲによる死と
記入された。

４８−６−１３１匹の子猫が死亡し、ＦＶＲによる死と
記入された。

４８−６−２１１匹の子猫が死亡し、ＦＶＲによる死と
記入された。

３、希薄化 ； 標準的組織培養フラスコと前述したＭＥＭ生長媒質
とを用い、猫の腎臓の細胞の単層を調製した。

約１００ ＴＣＩＤ、ｏ／ｍｌの単離したウィルスをフ
ラスコ内に入れ、この接種したフラスコを２５℃で培養
した。

約８〜１０日径小面積の細胞変質が認められ、流体媒質
の若干を用いて第２の直列的通過を行なった。

２５℃で培養を続け、細胞の細胞病変は各直列的通過の
後毎に増大した。

約３〜５日の２５℃の培養後、約１５〜２０回の直列的
通過後完全な細胞病変に達した。

・ この希薄化は接近して行ない、約１０回の直列的通
過の後毎に感染し易い猫に約１０６Ｔ ＣＩＤ ５０７
ｆｔｔｌのウィルスを鼻内に接種した。

このようにして感染した猫は倒れも、約５０回の直列的
通過まではＦＶＲの代表的な臨床的病状を示した。

この通過回数以上では症状は次第に弱く少くなり、ウィ
ルスが低温培養条件により次第に希薄化することを示し
た。

通常の培養温度におけるウィルスの直列的通過がウィル
スの毒性に殆んど影響を及ぼさない事実を説明する為、
３５℃における６０回目と１０３回目の直列的通過の時
に採取したＦＶＲウィルスの試料を、感染し易い猫に１
０６ＴＣＩＤ５０ ／ｍｌの力価のウィルスを０．５
ｍｌの量で鼻内に投与した。

これ等の猫を注意して調べ体温を直腸的に測定した。

この一連の試験の試験データは次の第１表及び第２表に
示す通りであった。

第１表と第２表を比較するとウィルスは実際上１０３回
の通過時にも６０回の通過時と同様に毒性であり、ウィ
ルスの希薄化が仮に得られたとしても殆んど僅かである
ことを示す。

本発明の着想によるウィルスの直列的通過の効果は、次
の第３〜５表に示す通りであった。

これらの表のデータは培養温度を２５℃に保持しながら
４８回、７５回又は８５回直列に通過した後の０、５
ｍｌの１０６ＴＣＩＤ、。

ウィルスの鼻内投与の結果を夫々示す。

これ等の表のデータを検査すると、８５回の直列的通過
水準時において希薄化がなおも進行していることを示す
。

次いで、第３表、第４表及び第５表に記した如きウィル
スで接種した猫を毒性のウィルスに感染させたが、１匹
もＥＶＲを発病せず、弱毒性ウィルスはその抗原的活性
を失っていないことを示した。

４、ワクチンの製造 前述したようにして製造した希薄化したウィルスを、前
述したと同じ成長媒質を用いて大量に標準の単層の猫の
腎臓細胞フラスコ内で成長させた。

このフラスコを細胞病変が完了するまで普通３〜４日間
培養した。

次いで成長媒質を収穫し、等置部の安定化溶液と混合し
、約１０００〜約１００００ ＴＣＩＤ５０ ／ｍｌの
単位処方量に分け、各々を普通のワクチン用ガラス瓶に
入れた。

次いでこの物質をこのワクチン用ガラス瓶内で凍結乾燥
し、使用に供する為密封した。

前述の記述は猫の腎臓細胞組織上の猫のヘルペスウィル
スの培養と繁殖に就いて記したが、猫の組織から得られ
る安定な細胞ライン（ｌ １ｎｅ）を用いることもでき
る。

安定な細胞ラインは猫の組織の継続的直列的通過により
開発することができ、或いは市販の給源から得ることが
できる。

本発明で「組繊細胞培地」と称するは、猫の腎臓の細胞
又はこれから得られる安定な細胞ラインを意味するもの
とする。

簡約すると本発明は猫のウィルス性鼻気管炎用の新規な
ワクチンに関する。

本発明の製造方法は生きた毒性の猫のヘルペスウィルス
を組繊細胞培地内に導入する段階と、この培地を細胞病
変が明らかになるまで培養する段階と、かくて製造した
ウィルスの１部分を収穫し収穫したウィルスを新鮮な組
織培地内に再導入する段階と、ウィルスの組織培地内へ
の直列的通過を抗原的に活性な生きた弱毒性のウィルス
を製造するのに充分な培養温度と通過回数で繰返す段階
と、この組織培地媒質から前記ウィルスを取出す段階と
を有する。

好適な培養温度範囲は約２３〜約３３℃であり、特に２
５℃が好適である。

標準的直列通過技術を用いて約５０回の通過がウィルス
を充分に希薄化するのに必要である。

然し血小板技術を用いると所要の希薄化を−そう迅速に
齋らすことができる。

猫の組織例えば猫の腎臓の細胞組織を用いて、ウィルス
又はウィルスから得られる安定な細胞ラインを繁殖させ
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 抗原的に活性な希薄化された生きている猫のヘルペ
   スウィルスワクチンにおいて、（ａ購の腎臓の細胞から
   得られた組繊細胞培地の単層内に生きている毒性の猫の
   ヘルペスウィルスを導入する段階と、（ｂにの培地を細
   胞の病変が略々完了する迄３５℃の温度で約３〜約５日
   培養する段階と、（Ｃ）かくて製造したウィルスの１部
   分を収穫し収穫したウィルスを猫の腎臓組織から得られ
   た新たに調製した単層内に導入する段階と、（ｄ）前記
   培地を約２５℃の温度で猫の組繊細胞の少くとも１部分
   の病変が生ずるのに充分な時間培養する段階と、（ｅ）
   かくて製造したウィルスの１部分を猫の組織から得た細
   胞内に約２５℃の培養温度で少くとも５０回以上直列に
   通過させて抗原的に活性な生きている弱毒性のウィルス
   を製造する段階と、（ｆ）直列通過の最後の通過物から
   前記ウィルスを取出す段階とを有する方法により製造し
   た抗原的に活性な弱毒性の生きている猫のヘルペスウィ
   ルスの有効量を含有することを特徴とする猫のヘルペス
   ウィルスのワクチン。