JPS63502828A

JPS63502828A - ネコ感染性腹膜炎ワクチン

Info

Publication number: JPS63502828A
Application number: JP62501403A
Authority: JP
Inventors: バルドウィン、チャールス・エイ; スコット、フレドリック・ダブル
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション、インコーポレイテッド
Priority date: 1986-02-06
Filing date: 1987-02-05
Publication date: 1988-10-20
Also published as: AU604682B2; EP0261168A1; CA1303500C; AU7037287A; WO1987004624A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ネコ感染性腹膜炎ワクチン〔発明の背景〕この発明は、コロナウィルス（ＦＩＰＶ）誘発感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するネコ科（ｆｅｌ　１ｎｅｓ）の免疫に関する。

ネコから単離されたコロナウィルスは、２つの群、すなわちＰＩＰの原因となるウィルスおよび一時的潜在状態から重症に至る腸炎の原因となるウィルスに分けることができる。様々な単離ウィルスはすべて形態学的および抗原的に関連性が有り、ネコ類、イヌ類およびブタ類に感染する共通の種類のウィルスの株を代表すると思われる（ペダーソン等、「アトパンシーズ・イン・エクスペリメンタル・メデイシン・アンド・バイオロジーＪ、１７３巻３６５−３８０（１９８４年）参照）。

研究者によるＦＩＰに対するワクチンの開発はかなりの間実現しなかった。ペダーソン等（前出）は、ＦＩＰＶ抗体が実際にネコ属を疾患を感作し得ることを示す技術の到達水準を要約している。文献には、生きた別のウィルスにより免疫後ヴイルレントウィルスで攻撃させると、感染率を高め、潜伏期間を短くし、病気め重さを大きくすることが報告されている。

ＦＩＰＶ７９−１１４６は、ジエームズ・エフ・エバーマン（ワシントン・ステート・ユニバーシティ）により初めて単離されたウィルス株であり、特にマッカーナン等「フェリーン：プラクティス」、１１巻１６−２０（１９８１年）、ベダーソン等、前出およびペダーソン等、「アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ」、４５巻２５８０−２５８５（１９８４年）に特徴が記載されている。

米国特許第４１９５１３０号は組織培養におけるＦＩＰＶウィルスの増殖について記載しており、これを引用して説明の一部とする。

〔発明の記載〕

ネコ感染性腹膜炎ウィルスＷＳＵ　ＦＩＰＶ７９−１１４６を弱毒化すると、ネコ感染性腹膜炎（Ｆ　Ｉ　Ｐ”）に対する生の変形ワクチンを生成することができ、さらにこのワクチンは免疫能力がありかっ安全である、すなわちネコ科においてＰＩＦを誘発しないことが発見された。

この発明は、ＦＩＰからネコ科を保護する方法、安全で有効なワクチンとして用いられる非ヴイルレント弱毒化生ＦＩＰＶの製造方法および生成したワクチンに関する。

ウィルスの弱毒化は、細胞培養、好ましくは非発癌性細胞培養において、非ヴイルレント免疫ウィルスが生成されるまでウィルスの生長および弱毒化をもたらす温度で連続継代培養することにより達成される。弱毒化株によるワクチンを与えられたネコは、ＦＩＰＶのヴイルレント株により攻撃されても重い疾患にはかからなかった。

ウィルスの継代に使用される細胞培養は、例えば全胎児細胞（例、ＦＣＷＦ、フェリス・カラス全胎児）、ネコ科腎臓細胞（例、ＣｒＦＫ１クランデルネコ腎臓）、ネコ科肺細胞およびＡ−７２（イヌ腫瘍セルライン）のようにウィルスが複製される細胞培養であればよい。

好ましくは細胞培養は非発癌性細胞培養である。また米国特許第４１９５１３０号（前記）を参照されたい。

ウィルスを生長させる温度は、組織培養により継代弱毒化が起こる温度であればよい。現在好ましい温度は、最適状態に及ばない温度、すなわちネコ科の通常の体温より低温であるがウィルスの生長が起こる温度である。現在好ましい温度範囲は約り３℃〜約３５℃である。

安全な免疫弱毒化ウィルスを得るのに必要な継代数は、少なくとも部分的に使用される条件および部分的にワクチン接種されるネコ科の年令により異なる。病毒性および免疫能力に関する培養の周期的試験により容易に組織培養および温度の特定の組み合わせに関するパラメーターを測定することができる。

子ネコは成熟したネコよりもＰＩＰＶに対して感受性が強いことが発見された。

明らかな結果として、充分に弱毒化されて安全であり、成熟したネコ科を免疫化する弱毒化生ＦＩＰＶでも、まだ充分毒性があるため子ネコにおいて顕著な病気の徴候または反応の原因　′となり得る。これは実施例で後述するように弱毒化された１９継代を用いた場合に該当することが判った。しかしながら、４０継代弱毒化ウィルスは成熟したネコ科および子ネコの両方を免疫化する上で安全かつ有効であった。

一般的にすべてのネコ科に対して安全で有用なワクチンを得るのに必要な継代数は少なくとも約３５継代および好ましくは少なくとも約４０継代である。ただし、成熟したネコ科（すなわち、６箇月令またはそれ以上のネコ科）に対して安全で有用なワクチンについては少なくとも約１５継代および好ましくは少なくとも約２０継代後に得ることができる。

この発明の好ましい具体例において、弱毒化された生ＰＩＦワクチンは、約３３ ℃ないし約３５℃の温度でＣｒＰＫ中において少なくとも約４０回天然ヴイルレントウイルスＷＳＵ　ＦＩＰＶ７９−１１４６を連続継代することにより生成される。

この発明のワクチンはネコ類に抗体力価の増加をもたらす任意の経路により投与され得る。現在好ましい経路は鼻腔内または経口投与である。皮下投与もまた有効であると思われる。

実施例１実施例で使用されたウィルスは、エバーマン博士（ワシントン・ステート・ユニバージティー）により初めて単離されたＷＳＵ　ＦＩＰＶ７９−１１４６株であった。それはディビスのユニバージティー・才ブ・カリフォルニアからネイルス・ペダーソンによりコーネル・フェリーン・ヘルスφセンターに約第６継代レベルで供給された。最初の単離物は生後すぐに肺炎および胸膜炎で死亡した子ネコから製造された。電子顕微鏡によるウィルスの直接試験は、形態学的に２つの集団が存在することを示していた。観察されたヴイリオンの９５−９８％を構成する方の集団は、短い涙滴形状のペプロマ−（ｐｅｐｌｏｍｅｒ）を有する典型的ＦＩＰＶであった。他方の集団は存在するヴイリオンの約２−５％を構成し、前者より長くて球根形状のペプロマーを有していた。混合単離物が存在すると思われたため、これらの試験で使用する前に３回下記のようにウィルスをプラーク精製およびクローンした。

攻撃ウィルスとして用いられたＦＩＰＶのＵＣＤＩ株はユニバーシティ・オブ・カリフォルニア（ディビス）のネイルス・ベダーソン博士により初めて得られた。ウィルスの前歴には最少限の病気のネコをによる幾つかの継代が含まれていた。５０％肝臓懸濁液は各々の継代においてネコの死亡時に製造され、懸濁液は攻撃ウィルスとして用いられる前に一７０℃で貯蔵された。ＵＣＤ１ウィルス株は高ヴイルレント株であり、多年にわたってニーネル・フェリーン・ヘルス・センターで攻撃ウィルスとして使用されてきた。その懸濁液をエーロゾル化によりネコに与えると、−貫して特異な病変が生じた後、ネコは死亡した。

ＷＳＵ　ＦＩＰＶ７９−１１４６ウイルス株をすヘテ最初１つのセルライン、すなわちネイルス・ペダーソン博士により供給されたフェリス・カラス全胎児細胞中において育てた。これらの細胞の生長培地は、等容量のライボウィッツ（ＬＩＩＸジブコ・グランデ・アイランド社、グランデ・アイランド、ニューヨーク）およびダルベツコの修正最少必須培地（ＤＭＥＭＸジブコ）にｌＯ％胎児うし血清を含むものであった。生長培地には０．０５％ラクトアルブミンヒドロシレート（ＬＡＨＸジブコ）、１％ＭＥＭピルビン酸ナトリウムおよび１％非必須アミノ酸（ジブコ）を含む必要のあることが判った。

また抗生物質フンギシンおよびゲンタマイシン（ジブコ）も加えた。

細胞が完全な単層に生長すると、それらをはがして移した。ＦＣＷＦ細胞は不充分であり、全部の後の実験ではクランデルネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞またはＡ− ７２細胞を使用した。細胞の増殖に用いられる培地は、２０％Ｌ＋ｓ、３％０．ｌＮ−ＮａＯＨ，２％Ｌ−グルタミン（ジブコ）を含むものであった。細胞を移すために、生長培地を除去し、組織培養フラスコのサイズにより異なるが、７ｃｃ以下の粗ぶたトリプシン−バージンの燐酸緩衝食塩水を洗浄液として加えた。

３０秒後、このトリプシン洗浄液を除去し、２分の１容量のトリプシンを加えた。フラスコを３７＠で５−１０分間インキュベートした。前記の時間が経過後細胞が単−細胞中に分散すると、新しい生長培地を加えて１〜３細胞スプリツトに対して最初の容量の３倍容量とした。次いで細胞をプロトコルの要求に応じて新しいフラスコ中に分配した。

ウィルス株を生長させるために、生長培地を完全単層から除去し、細胞をＭＥＭで１回洗浄した。これを除去し、ウィルス接種物を加えた。フラスコをベルコ・ロー−プロフィール・ロッカー（ベルコ・グラス社、ニューシャーシー）上３７ ℃で１時間約２振動／分の速さで揺さぶった。１時間後、新しい生長培地を加え、フラスコを３７℃でインキュベートした。全部の培養フラスコについて細胞変性作用を毎日調べた。約６０−８０％の単層が感染すると、フラスコを一７０℃ に冷凍した。３回の冷凍／解凍サイクル後、ウィルス上清を４℃でＩＥＣ，ＤＰＲ−６０００遠心分離器（デイモン、ニーダム・ハイツ、マサチューセンタ）中２００ＯＲＰＭで遠心分離した。上清をｌｃｃ容量のアリコートに分け、−７０ ℃で冷凍した。

ウィルスをプラーク採取またはクローンするために、生長培地を６−ウェルプレート中にある全面単層から除去した。単層をＭＥＭで１回洗浄し、次いで洗浄液を除去した。ウィルスの系列１０倍希釈液（ＭＥＭ中）０．１〜０　、５　ｃｃをアユブリケートウェル中に接種した。ウィルスを３７℃で１時間ベルコ・ロッカー上に吸着させた。

１時間後、接種物を除去し、単層をＭＥＭで１回洗浄し、オーバーレイを加えた。オーバーレイは等容量の２ＸＢＭＥ（ジブコ）および１．８％アガロース（シーケムーＭＥ−ＰＭＣ社、ロックランド、メリーランド）からなるものであった。さらに、抗生物質フンギシンおよびゲンタマイシンを加えた。プラーク形成に関してプレートを毎日調べた。分離したプラークが観察された場合、クローンを１”または１１／２″２０ゲージ針の付いたツベルクリ、ン注射器を用いて採取し、ｌｃｃのＭＥＭを含むバイアルにクローンを加えた。フラスコに直ちに接種しない場合、将来の使用に備えてクローンを一７０℃で冷凍した。プラーク採取後、１０％緩衝ホルマリン溶液１リツトル当たり１グラムのクリスタルバイオレットを含む溶液でプレートを染色して検査することにより、採取したプラーク（複数も可）の中で最も純粋なのはどれかを測定した。次いで採取した単離クローンを生長させ、ウィルスをさらにクローンするために再プラーク化した。３回目のクローニング工程後、ウィルスを「純粋である」と見なし、大きなフラスコで生長させ、アリコートに分けてバイアルに入れ、将来の実験用のストック接種物として一７０℃で冷凍した。

このストック接種物は低継代ウィルス（ＬＰ）であると考えられ、継代レベル１１程度のものであった。

ウィルスをクローンした後、ＬＰウィルスを４８０ｃｉ’のローラーボトル中で（ただし３４℃）さらに数回継代した。継代レベル１Ｇにおいて大きなフラスコにウィルスを接種し、１時間連続的に回転させながら吸着させ、維持培地を加えた。細胞変性作用の割合が約７５％に達したとき、フラスコを３回冷凍および解凍した。次いでウィルスを貯蔵し、高継代ウィルス（ＨＰ）と定めた。それは継代レベル１７程度であり、プラーク精製工程以来３４℃で増殖させただけであった。またこのＨＰウィルスは温度感受性であると考えられ、ワクチンウィルスとして用いられた。

ウィルス中和試験（ＶＮ）を実施するために、血清試料を５６℃水浴中３５分間加熱不活性化した。加熱不活性化後、血清の２倍希釈液をＭＥＭ、Ｌ　１５またはＰＢＳ中で調製した。次いで等容量の１００　Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｓ。を含むウィルスを各血清試料に加えた。次いで血清ウィルス混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベージコン後、０　、２　ｃｃの血清ウィルス混合物をトリプリケートウェル中ＣＲＦＫ細胞を接種したばかりの４８−ウェルコスクープレートに加えた。ウィルス対照として、０．１ｃｃのみを各ウェルに加えた。

組織培養対照として０　、１　ｃｃの希釈液を各ウェルに加えた。次いでプレートをプラスチックバッグ中に密閉し、３７℃で４日間インキュベートした。第４日月に培地を除き、プレートをｌθ％ホルマリン含有クリスタルバイオレット染色タンク中にＩＯ分間浸した。

プレートを水でリンスし、そのまま乾燥させ、試料を滴定した。最終点の滴定濃度をウィルスの完全な中和が認められるかまたは細胞単層の完全保護が認められる最終希釈率であると見なした。

ＷＳＵ　ＰＩＰＶ７９−１１４６によりもたらされた細胞変性作用を評価するために、カバーグラスの付いた２４−ウェルプレートにおける全面単層をウィルスの１０倍希釈により接種した。１時間の吸着期間後、維持培地を加えた。その後、６時間間隔で感染したカバーグラスおよび組織培養対照カバーグラスを除去した。カバーグラスを１回ＰＢＳ中で洗浄し、メタノール中で１０分間固定した。

固定後、カバーグラスを１０分間メイーブリーンワルド染料（ハレルコ、ゲブスタウン、ニューシャーシー）で染色し、次いで２０分間１／２０希釈率のギースマ染料で染色した。次いでカバーグラスを蒸留水で２回洗浄し、アセトンで１５秒間２回洗浄し、アセトン−キシレン混合物中で脱水し、最後に１０分間純枠取キシレンに浸した。次いでカバーグラスを外し、バーマウント（フィッシャー・サイエンティフィック、フェアローン、ニューシャーシー）を用いて永続記録するために顕微鏡のスライドガラス上に載せ、検査した。

第１１コーネル継代のＦＩＰＶ７９−１１４６（計１７継代）を気管内「第１ワクチン接種」またはウィルス滴定のための攻撃ウィルスとして用いた（第１表）。低温（３４℃）での細胞培養における急速継代によりウィルスの弱毒化を行った。全部で７回の低温継代をイヌＡ−７２細胞（３継代）およびクランデルネコ腎臓細胞（ＣｒＦＫＸ４継代）において順次行った。この試験で用いられた弱毒化ウィルス（１９継代弱毒化ウィルス）は７回の低温（３４℃）ＣｒＦＫ細胞培養継代および全部で１９回の細胞培養継代によるものであった。

１４匹の６箇月令で特異病原体が存在しないネコ（リバティー・ラボ）をフィルター分離ケージ中に入れ、気管内接種により様々な用量の低継代（第１２継代）ＦＩＰＶ７９−１１４６に曙した。臨床疾患および熱の徴候についてネコを毎日モニターした。毎週ＰＩＰＶ７９−１１４６に対するウィルス中和（ＶＮ）抗体力価のための血清試料が得られた。

ウィルス滴定または「第１ワクチン接種」の結果を第１表に示す。

最少感染用量はｉｏ’プラーク形成単位（Ｐ　Ｆ　Ｕ）のウィルスであった。１０’ＰＦＵのウィルスを投与された２匹のネコの一方は接種後５６日目に感染により死亡した。ネコＱ３の場合、ＦＩＰＶ７９−１１４６ウイルスに対して血清変換し、目および胸の障害を含むＰＩＦの徴候が現れたが、このネコはエーロゾル攻撃後まで死亡しなかった。ネコＲ４はＦＩＰになり、２８日目に死亡した。

ＰＩＰＶ７９−１１４６に血清変換した３匹のネコ（ネコＮ４、ＪｌおよびＳ２）は病気の徴候を一切示さなかった。

１３４日の観察期間後、先の実験から生存しているネコに鼻腔内滴下により１０ ’、１０’またはｔｏ”ｒｃｒＤｓ。の弱毒化ＷＳＵＦＩＰＶ７９−１１４６ウイルス（第１９継代）１．：ヨルｒ第２ワクチン接種」を行った。第２ワクチン接種後の観察期間中（４９日）病気の徴候を示したネコは無かった。ワクチン接種されたネコはすべて１：６４−１：２５６の最大力価で血清変換されたワクチン接種の時点で血清陰性であった。ウィルスの用量と力価の間に相関関係は存在しなかった。再ワクチン接種の時点でＦＩＰ　ＶＮ抗体力価を示す４匹のネコのうち３匹Ｃより価の２〜４倍上昇を示した。

第２ワクチン接種の４９日後（実験の１８３８３日目ネコを低継代ＰＩＰＶ７９ −１１４６ウイルスまたはＵＣＤ、菌株の高ヴイルレント肝臓懸濁液を用いてエーロゾルにより攻撃した。この攻撃実験の実験計画および結果を第１表に列挙する。低継代７９−１１４６ウイルスはこの実験の最初の部分の気管内接種で用いられた同じストックウィルスであった。ＵＣＤ、対抗ウィルスは、最近ｌＯ学年間わたるＰＩＦを用いた多くの対抗試験で使用された高ヴイルレントウイルスのストック肝臓懸濁液であった。この試験前に、ＵＣＤ、ウィルスは、血清陽性ネコの場合１〜２週間以内および血清陰性ネコの場合３〜４週間以内に感染した殆ど１００％のネコを死亡させた。１１４６攻撃ウイルスを投与された１匹の非ワクチン接種ネコ（ネコＶｌ）は発病し、攻撃の２８日後に死亡した。ネコＱ３は、最初の接種後数週間示していた症状と似た慢性ＦＩＰの症状を示していたため、攻撃後６０日目に安楽死させた。７９−１１４６ウイルスを投与された３匹の他の抗体陽性ネコのうち１匹およびＵＣＤ、ウィルスを投与された４匹の抗体陽性ネコのうち２匹は、一時的臨床徴候（発熱、食欲不振および１例において黄だん）を示したが、これらの中で典型的臨床ＰＩＦを発病したネコは無かった。ネコＨ３（１１４６対抗）は攻撃後４−６日目に発熱し、ネコＰ　４　（Ｕ　ＣＤ　Ｉ対抗）は１１−２４日目および４３−４７日目に発熱し、周期的食欲不振を示した。ネコ５２（ＵＣＤ、対抗）の場合攻撃後８−１２日目に発熱し、８−１４日目に食欲不振を示し、１４日目に黄だん血清が検出された。

データは１９継代弱毒化ＦＩＰＶ７９−１１４６がＵＣＤ、ウィルスによる攻撃またはヴイルレント７９−１１４６ウイルスによる再攻撃に対してネコを感作しなかったことを示す。前述したように、幾つかのコロナウィルスに対する抗体がネコを感作する結果ＵＣＤ、またはある種の他のネココロナウィルスに曝露することによりさらに急性の疾患が発生すると思われるため、これは非常に重要なことである。

１回の鼻腔内ワクチン接種後ＦＩＰＶ７９−１１４６に対する実質的中和抗体力価が得られた。ＶＮ抗体力価を第２表に示した。

２８　０　０　６４　６４　０　０　１２８　３２　０　０　Ｑ７７　０　Ｑ　２５６　２０４８　０　０　２５６　５１２　０　０　０１４８　１２８　８　１０２４　２０４８　３２　３２　５１２　１０２４　１６　．３２　０１６２　１２８　６４　５１２　２０４８　６４　３２　１０２４　５１２　１２８　３２　Ｑ１６９　１２８　１２８　５１２　．１０２４　１２８　６４　５１２　５１２　１２８　６４　０１７６　２５６　１２８　５１２　２０４８　２５Ｇ　６４　５１２　１０２４　２５６　１２８　０２００　１２８　５１２　１０２４　ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ　２０４８　２０４８　５１２　２０４８　°　３２２０７　ＮＡ　２５６　１０２４　［５１２ＮＡ　５１２　２０４８　ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ２１４　５１２　５１２　２０４８　４０９６　ＮＡ　ＮＡ　２０４８　２０４８　２５６　１０２４　ＮＡ２２１　２５６　２５６　２０４８　４０９６　ＮＡ　ＨＡ　ＮＡ　２０４８　２５６　２０４８　ＮＡ２２８　５１２　５１２　ＮＡ　４０９６　ＮＡ　ＮＡ　２０４８　４０９６　ＮＡ　２０４８　ＮＡＦＩＰＶ７９−１１４６は子ネコモータリティーコンプレックス（ＫＭＣ）を患う生まれたばかりの子ネコから単離されたので、ＫＭＣはＦＩＰＶ誘発疾患であると思われ、したがってこの発明のワクチンはまたＫＭＣに対しても有効であることが考えられるため、これもこの発明の範囲内に含まれる。

実施例２成熟ネコにおける第１９継代弱毒化ウィルスによる作業（実施例１）を繰り返し、また第１９＠代弱毒化ウィルスを１２〜１６週令の子ネコにおいて試験した。

さらに７９−１１４６ウイルスについて５０継代（低温で３８）を行い、子ネコにおける第３０および第４０継代の弱毒化ウィルスの作用を測定した。

実験８５−０１−子ネコにおける７９−１１４６の第１９継代。

第３表は実験８５−０１のための実験計画、各々１２〜１６週令の子ネコにおける継代１９弱毒化ウィルスの評価を示す。Ａ群は非ワクチン接種対照として用いられ、Ｂ群には０．５１１Ｑ（１００ＯＯＯＴＣＩ　Ｄ　ｓ。）のワクチンウィルスを鼻腔内投与し、そして０群には同用量のワクチンを皮下投与した。ネコを観察し、０〜４ベース（０＝正常、１＝軽症、２＝中程度、３＝顕著、４＝重症）に基づいて臨床疾患例えば機能低下、肝臓病、食欲不振、肺炎、鼻汁、下痢の各々の徴候を評価する、標準評価方法により病気の臨床徴候について評価した。

毎日群の評価を合計し、日毎に群平均臨床評価を計算した。直腸温度を毎日記録し、ウィルス単離のため１週間に３回綿棒で咽頭の試料を採取し、ウィルス中和抗体力価測定のため毎週血清試料を頚静脈から採取した。ワクチン接種後２１６目にヴイルレントＦ　Ｉ　ＰＶ−ＵＣＤ、を用いてエーロゾルによりネコを攻撃することにした。

この実験におけるネコの個別および群平均体温を第４表に示す（Ａ、Ｂおよび０群）。個別および群平均臨床評価を第５表に示す。咽頭の綿棒による試料から得られたウィルス単離結果を第６表に示し、ウィルス中和力価を第７表に示す。

対照の非ワクチン接種対照コ（Ａ群）は実験の最初から最後まで健康であった。

温度は正常であり、病気の臨床徴候は検出されず、２７日目まで咽頭の綿棒による試料からウィルスは回収されず、７９−１１４６に対する血清におけるウィルス中和抗体力価は２８日目まで正常であった。これらの対照のうち２匹には単離効果をモニターするためＢおよび０群の子ネコの後で食物を与え、洗浄し、検温および試料採取した。

第１９継代ワクチンによりワクチンを鼻腔的接種された６匹の子ネコ（Ｂ群）のうち５匹は中程度ないし重症のＦＩＰに典型的な臨床徴候を示した。ワクチン接種後２ロ目に初めて徴候が現れ、７または８日目にピークに達し、１０または１１日目までに静まり、正常に戻った。徴候は１６日日月再び現れ、非常に重くなって２６〜３１日目には日月コは死亡するか安楽死処置を施された。１匹の子ネコ（ＨＦ５）は、２．３．４および１４日目に軽い発熱反応を示し、６〜８日目にはやや元気がなくなった。この子ネコは２次疾患を発病せず、１２０２０日目健康な状態で生存した。

ワクチンを鼻腔内投与された６匹の子ネコ全部から綿棒で採取した咽頭の試料からウィルスを単離した（第６表）。全部のネコにおいてワクチン接種後１臼目までウィルスは存在し、６日目に６匹中５匹はまだウィルスに関して陽性であったが、８日目にウィルスが存在していたのは６匹の子ネコのうち２匹だけであった。ワクチン接種後１１日月までには全部の子ネコは陰性となった。

血清におけるウィルス中和抗体力価は７日目には低く、次いで毎週の各試料では２１日目まで常に増加を示した。６匹のネコのうち４匹は２１日目と比べて２８日目には高い力価を示した。２８日目以前に１匹のネコはＰＩＦで死亡し、もう１匹のネコは低い力価を示した。

第１９ｕ代の弱毒化７９−１１４６ウイルスを皮下投与された６匹のネコ全部には、中程度ないし重症のＦＩＰの臨床徴候が現れた（第４および５表）。鼻腔内（投与）群で最初に徴候が現れてから約１日後に最初の徴候が現れたこと以外は、病気の進行は２つの群のネコの場合と類似していた。これらの子ネコの６匹全部が２次疾患を発病し、死亡するかまたはＦＩＰによる安楽死処置を施された。

実験期間中を通じてワクチンを皮下投与された子ネコから綿棒により採取した全試料からウィルスは一切回収されなかった（第６表）。

血清におけるウィルス中和力価は本質的に鼻腔内（投与）群の場合と同じであった（第７表）。

この実験においてワクチン接種された子ネコの殆どは臨床ＦＩＰを結局発病したため、対照の子ネコをヴイルレント、ウィルスで攻撃する必要は無かった。

実験８５−０２−生ｔ−タ第２１ａ代７９−１１４６゜実験８５−０１の対照ネコ（Ａ群）を用いて第２１継代のウィルス（９低温継代）の病毒性をスクリーンした。これらのネコのうち４匹を各々２匹のネコからなる２群に分けた。一方の群を非ワクチン接種対照として用い、他方の群（Ｄ群）には１．０ＲＧの生きた第２１ａ代ウィルスを皮下投与した。

Ｄ群の２匹のネコ（ＨＤＩおよびＨＧ４）には１０＠ＴＣＩ　Ｄ！。のウィルスを含む単一皮下用量のワクチンを投与した。

Ｄ群の２匹のネコの臨床応答を第４および５表に示す。応答はＢおよび０群で観察された応答と類似していた。両方のネコは１次疾患を発病し、回復し、次いでＦＩＰに典型的な２次疾患を発病した。

１匹のネコは死亡し、他方のネコには３２日目に安楽死処置が施された。

２対照には２８日目にヴイルレントＵ　ＣＤ　＋ウィルスの攻撃を与えた。両方のネコは臨床ＦＩＰを発病した。攻撃後のこれらのネコの体温を第８表に示す。

ワクチン接種後のこれらのネコの中和力価を第９表に示す。２匹の対照ネコは２１日目まで中和力価を示さなかった。第２１１ｉ代の生きたウィルスを与えられた２匹のネコは１４日目に初めて力価を示した。

実験８５−０３−子ネコにおける第３０継代の７９−１１４６゜６匹のＳＰＦ子ネコ（全部１４週退会を各々２匹の子ネコからなる３つの群に分けた。Ｅ群には１．０ｊｌ１２（１０’−１′ＴＣＩ　Ｄａ。）の第３０継代のＦ’ＩＰＶ７９ −１１４６を皮下投与した。Ｅ群には同じ容量および用量を鼻腔内投与した。Ｇ群は非ワクチン接種対照として用いられた。

ワクチン接種後のこれらの子ネコの臨床徴候および体温応答を第４および５表に示す。応答は実質的に継代■９および２１に曝露された子ネコの場合はど劇的ではなかった。両ワクチン接種群において１次疾患は軽くて持続時間も短かった。

ワクチンを皮下投与された子ネコは両方とも（ＭＧＩＳＭＥ６、Ｅ群）２次疾患を発病しなかった。ＭＢ２については２１日目に一方の肺および心臓嚢に液体が溜まって安楽死した。ＰＩＦ病変は腹膜では検出されなかった。子ネコＭＣＩは３１日目に安楽死したが、一方の肺に液体が溜まり、肺炎を起こし、また心筋症の可能性も認められた。両方のネコとも発熱し、安楽死する前に痩せ細った。

第３０継代のウィルスを鼻腔内投与された２匹の子ネコは、軽い１次疾患の症状を示しただけで、２次疾患の症状は殆ど示さなかった。子ネコＭＥ２は２．３．８．１８．２Ｉおよび３５日目に低グレードの発熱応答を示したが、７日目には１０５．２の温度を示さなかった。子ネコＭＥ３は２．９．２３．２８．３０．３２および３５日目に低グレードの発熱を示した。２次疾患段階の間毎日温度を記録したわけではないため、子ネコの発熱した日数は記録より多いと思われた。

この報告の日付現在（ワクチン接種後５４８目）、これらのネコは共にまだ生存しており、適度に健康である。それらは対照より細く、周期的に低グレードの発熱を示すが、元気で機敏で食事も取り続けている。

実験８５−０４−第４０継代のＦＩＰＶ７９−１１４６弱毒化生ウイルスと第６継代のＦＩＰＶ−ニーネル−１の比較。１４匹の１４週退会すティー・ラボＳＰＦの子ネコを、第１０表で概略を示しているように各々２匹の子ネコからなる４つの群に分けた。Ａ群は非ワクチン接種対照であり、Ｂおよび０群には弱毒化生ウィルスを鼻腔内および皮下投与した（子ネコ１匹当たり１．ＯｘＱの１：３０００希釈率の第４０ｕ代ウィルス、または１０’ＴＣｒ　Ｄｓ。）。

Ｇ群の子ネコには第６継代のＦＩＰＶのニーネル−１ＣＣＵ−１）単離物１　、Ｏｉ＋ｆ２（１０’ＴＣＩ　Ｄｓ。）を皮下投与した。

ワクチン接種後２３８目現在、弱毒化第４０継代ウィルスを鼻腔内ワクチン接種された両方の子ネコおよび対照は依然健康であり、１次疾患の徴候を呈していない。これらのネコにおいて発熱は検出されなかった。これは低継代のウィルスによる発熱応答とは明らかに対照的である。第４０継代ワクチンを皮下接種された２匹の子ネコのうち１匹は発熱しなかったが、他方の子ネコはワクチン接種後３．７および８日目に発熱し、２３日目にＦＩＰの、病状により安楽死した。

ＣＵ−１ウイルスを皮下投与された２匹の子ネコは共に３日目に低グレードの発熱を呈した。それ以外はそれらは２３日目まで健康であった。

実験８５−０５−成熟ネコにおける第！８継代のＦＩＰＶ７９−１１４６の弱毒性、有効性お上び感作特性の再チェック。４匹の成熟ＳＰＦネコ、（約４０退会）に第１８継代ｆ７）ＰＩＰＶ７９−１１４６を用いてワクチン接種した。これらのネコのうち２匹（Ｅ３、Ｚ４）は先の実験における非接種対照であったリバティー・ラボネコであり、ＦＩＰＶに対する抗体をもっていなかった。他の２匹のネコ（７３，５２）は別の実験で用いられた対照ネコであって、殆どどの子ネコもネココロナウィルスに血清変換しているコロニーから入手したものであり、これらの血清陽性ネコを感作してＦ　Ｉ　ＰＶ−ＵＣＤ、による攻撃を行った。

４匹のネコ全部がｌ：１００足らずないし１：４８００の範囲の７９−１１４６に対する抗体力価を現した。これらのネコにおいてＵＣＤ、のエーロゾルにより攻撃を行った。それらは５６日の期間発熱応答または病気の他の徴候を示すことも無く健康であった（第７表、２群）。攻撃後中和抗体力価は少し上昇したが大きな変化は無かった。

第３表−実験計画、実験８５−Ｏｌ−ＦＩ−Ｐワクチン試験ワクチ：／＝ＦＩＰＶ−１１４６継代１９（１０’・”ＴＣＩ　Ｄｓｏｌｏ。

１　ｘＱ）　希釈割合は４．５１ｇＰＢｓ中３　、５　ｘＱストックウィルス、各ワクチン接種量は０　、５　ｘＱまたは１０００００Ｔ　ＣＩ　Ｄ　Ｓ。。

攻撃　＝２１日目８ヴイルレントＦ　Ｉ　ＰＶ−ＵＣＤ、ウィルスの肝臓懸濁液を用いたエーロゾル攻撃。

ＶＮ抗体力価＝毎週。

臨床病状評価＝毎日。

綿棒により採取された咽頭試料からのウィルス単離＝ワクチン接種後１週間に３回。

検温＝毎日。

第４表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス株７９−１１４６による「ワクチン接種」後のネコの体温第４表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス昧７９−１１４６による「ワクチン接種」後のネコの体温平均　２＋５　２．８　２．９　２．４　１．９　２．フＨＧ２　Ｉｓ　４．４　３．４　４．６・１．８　２．２　３．８３．６　３．１　２．８　ＮＯ１，９Ｎｔ）第４表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス株７９−１１４６による「ワクチン接種ｊ後のネコの体温平均　０　０　０　＋５　．３　２平均　０　０　１　．５　．５　０平均　０　０　Ｌ　、５　０　０平均　ｏｏｏｏｏ。

第５表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス昧７９−１１４６による「ワクチン接種」後のネコの全臨床スコア平均　ｏｏｏｏｏ。

第５表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス昧７９−１１４６による「ワクチン接種ｊ後のネコの全臨床スコア第５表　弱毒化ネコ感染性腹膜炎ウィルス株７９− １１＝１６による「７クチン接種」後のネコの全臨床スコア平均ＮＯ４，６ＮＣ）　３．５　ＮＯ年平均Ｓ、Ｏめ５．７　つ平均３．５　５　５ｉ　フ、５１゜平均ＮＤ　聞　に　ＮＤ　、５第６表　第１９ａ代のＦＩＰＶ７９−１１４６ｔニーよる接Ｎをされｔ：ネコから綿棒により採取された咽頭の試料からのウィルス単離０＝ＣＰＥ無し。

＋＝ＣＰＥ。

Ａ−７２細胞において単離。

★左カラム＝第１細胞培養継代の結果。

右カラム２第２細胞培養継代の結果。

Ａ＝非ワクチン接種対照。

Ｂ＝ワクチン鼻腔内接種。

Ｃ＝ワクチン皮下接種。

第７表　第１９ｕ代のＦＩＰＶ７９−１１４６の７クチ７を接匝すれたネコにおけるウィルス中和抗体力価Ａ−７２細胞で試験実施ＴＣＩ　Ｄｓｏ＝４８第８表　弱毒化ＦＩＰＶ７９−１１４６によるワクチン接種され、Ｆ　ＩＰＶ− ＵＣＤ−１による攻撃が行われたネコの体温第８表　弱毒化ＦＩＰＶ７９−目４６によるワクチン接種さｈｌＦＩＰＶ−ＵＣＤ−１による攻撃が行われたネコの体温★＝肝臓ホモジネートのｌ：５０希釈液０．５〜１．Ｏｗｌ！／（ネコ）のエーロゾル攻撃。

★★＝７９８．Ｏ０Ｎ　Ｄ　＝測定せず。

Ｎ　Ａ　＝適用不可。

＋＝ネコは死亡またはＦＩＰにより安楽死。

第８表　弱毒化ＦＩＰＶ７９−１１４６によるワクチン接種ざ７−１Ｆ　Ｉ　ＰＶ−ＵＣＤ−１による攻撃が行われγニネコの体温★；肝臓ホモジネートのｌ：５０希釈液０．５〜１．０ｉＩＸ／（ネコ）のエーロゾル攻撃。

★★＝Ｔ９８．０゜Ｎ　Ｄ　＝測定せず。

ＮＡ＝適用不可。

＋＝ネコは死亡またはＦＩＰにより安楽死。

第９表　弱毒化ＦＩＰＶ７９−１１４６によりワクチン接種された後の子ネコにおけるウィルス抗体力価第１０表　実験８５−０４の実験計画。第４０継代のＦ　Ｉ　Ｐ　Ｖ　７９−１１４．６の弱毒化および第６％ｉ、代のＦＩＰＶ−ＣＵ−ＩＺ＞ヴノルレンスの評価。

１．４．．４゜皮下２９　ＮＸ３　Ｆ　ＣＣｌ１＞１２９　ＮＹＩ　Ｆ　匡Ｉ） −１１４週令９バすィー子ネコワクチ：／＝ＦＩＰＶ１１４６−Ｐ４０　力価＝（１０’−’ＴＣＩＤ５ｏＯ，ｌＩ（り、希釈率ｔ　：３　ｏ　ｏ　ｏ、ＰＢＳ中。ネコｌ四当たり１　ｍＱｏｌ　４ＤＰＶに再ワクチン接種群り、ＥおよびＦ０攻撃＝Ｆ　ＩＰＶ−ＵＣＤ− １の５０％肝臓懸濁液を用いたエーロゾル攻撃。

ＳＮ抗体力価＝毎週。

臨床病状評価＝毎日。

検温−毎日。

実験後の再滴定ストック。

ワクチン＝ＯＬ＋−１−Ｐ６　力価＝ｌｏ３１０ＴＣＩＤｓＯ１０，１１ｅ１ｘＱ／Ｃネコ）実験後回滴定。

出発（プラーク精製第１１継代）ライＡ、ＸＷＳＵ　ＩＩＰＶ７９−１１４６（ＦＩＰＶ７９−１１４６または７９−１１４６とも示す）はＡ’ｌ’ＣＣに寄託され、ＶＲ２１２５のアクセス番号を与えられた。

第１９継代ウィルスはＡＴＣＣに寄託され、ＶＲ２１２６のアクセス番号を与えられた。

第４０継代ウィルスはＡＴＣＣに寄託され、ＶＲ２１２７のアクセス番号を与えられた。

第５０継代ウィルスはＡＴＣＣに寄託され、ＶＲ２１２８のアクセス番号を与えられた。

国際調査報告１ｍｅｍａｗ、ｌａ＋　ｈａｍ＋ｔａｂ１、ｅ、ＰｃＴ／ＵＳ　８７１００２１６　２ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　１ＬＫＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）非ヴィルレント免疫性ウイルスが生成されるまで、ウイルスの生長および弱毒化をもたらす温度においてウイルスが生長する非発癌性細胞培養中でＦＩＰＶ７９−１１４６を連続継代することにより製造された修正生ネココロナウイルスワクチンを動物に接種することを含む、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）による感染からネコ科を保護する方法。
（２）連続継代が少なくとも約１５継代からなる請求の範囲第１項記載の方法。
（３）連続継代が少なくとも約４０継代からなる請求の範囲第２項記載の方法。
（４）継代温度がネコ科の正常の体温より低い温度である、請求の範囲第１項記載の方法。
（５）継代温度が約３４℃である、請求の範囲第４項記載の方法。
（６）非発癌性細胞培養がＦＣＷＦおよびＣｒＦＫからなる群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の方法。
（７）ＦＩＰＶ７９−１１４６菌株がＡＴＣＣ　ＶＲ２１２５である、請求の範囲第１項記載の方法。
（８）非ヴィルレント免疫性ウイルスが生成されるまで、ウイルスの生長および弱毒化をもたらす温度においてウイルスが生長する非発癌性細胞培養中でＦＩＰＶ７９−１１４６を連続継代することにより製造された、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）誘発感染症に対してネコ科を保護するための修正生ワクチン。
（９）連続継代が少なくとも約１５継代からなる、請求の範囲第８項記載のウイルス。
（１０）連続継代が少なくとも約４０継代からなる、請求の範囲第９項記載のウイルス。
（１１）継代温度がネコ科の正常の体温より低い温度である、請求の範囲第８項記載のウイルス。
（１２）継代温度が約３４℃である、請求の範囲第１１項記載のウイルス。
（１３）非発癌性細胞培養がＦＣＷＰおよびＣｒＦＫからなる群から選ばれる、請求の範囲第８項記載のウイルス。
（１４）ＦＩＰＶ７９−１１４６菌株がＡＴＣＣ　ＶＲ２１２５である、請求の範囲第８項記載のウイルス。
（１５）ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）誘発感染症に対してネコ科を保護するための修正生ワクチンの製造方法であって、（ａ）ウイルスの生長および弱毒化をもたらす温度において非発癌性細胞培養中でＦＩＰＶ７９−１１４６を連続継代し、（ｂ）非ヴィルレント免疫性ウイルスが得られるまで継代ウイルスを周期的に試験することからなる方法。
（１６）連続継代が少なくとも約１５継代からなる、請求の範囲第１５項記載の方法。
（１７）連続継代が少なくとも約４０継代からなる、請求の範囲第１６項記載の方法。
（１８）継代温度がネコ科の正常の体温より低い温度である、請求の範囲第１５項記載の方法。
（１９）継代温度が約３４℃である、請求の範囲第１８項記載の方法。
（２０）非発癌性細胞培養がＦＣＵＦおよびＣｒＦＫからなる群から選ばれる、請求の範囲第１５項記載の方法。
（２１）ＦＩＰＶ７９−１１４６菌株がＡＴＣＣ　ＶＲ２１２５である、請求の範囲第１５項記載の方法。