JPS5820273B2

JPS5820273B2 - クレアチンの定量方法及びそのキツト

Info

Publication number: JPS5820273B2
Application number: JP51085167A
Authority: JP
Inventors: 勝鈴木; 成正齋藤; 俊夫木下
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1976-07-19
Filing date: 1976-07-19
Publication date: 1983-04-22
Also published as: JPS5311091A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は液中、特に血清中あるいは尿中のクレアチンの
定量方法及びそのキットに係るものである。

現在臨床医学の分野においては、血清、尿中のクレアチ
ンを定量して腎蔵疾患や筋肉疾患の診断等を行なってい
るが、これらの定量法はクレアチンをクレアチニンに酸
加熱処理で変化させ、酵素を用いないヤツフエ反応に基
いている。

しかしながら上述の反応は非特異的であり、誤差が大き
くその信頼性も低いため、クレアチンを分解する酵素に
よる定量法の開発が期待されている。

この様な実情に鑑み、本発明者等は迅速かつ正確なりレ
アチンの定量法を確立すべく鋭意研究を重ねた結果、本
発明を完成させた。

即ち本発明は、クレアチンを含む液にクレアチン・アミ
ノジヒドロラーゼ及びザルコシン・デヒドロゲナーゼの
２種の酵素を順次又は同時に作用させるか、若しくはク
レアチン・キナーゼ阻害剤の存在下に順次又は同時に作
用させてホルムアルデヒドを生成せしめ、該ホルムアル
デヒドを発色測定することを特徴とするクレアチンの定
量法であり、更にこれら定量法のキットを含むものであ
る。

以下本発明を具体的に説明する。

本発明はクレアチンを含む液にクレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼ（以下酵素Ｉという）及びザルコシン・デヒ
ドロゲナーゼ（以下酵素…という）の２種の酵素をクレ
アチン・キナーゼ阻害剤の存在なしに、若しくは存在下
に作用させてホルムアルデヒドを生成せしめ、このホル
ムアルデヒドを発色測定することによりクレアチンを定
量するのであるが、この反応機構は以下に示す如くであ
る。

クレアチン十Ｈ２０町尿素＋ザルコシンザルコシン＋Ｈ２０”’−！ホルムアルデヒド＋グリシ
ンこれら２種の酵素、即ち酵素Ｉ及び酵素■はいかなる起
源のものでも良く、例えば微生物を培養して得られた酵
素、あるいは動物臓器（ねずみの肝蔵）から得られたも
の等があげられるが、特に。

フラボバクテリウム属、ミクロコツカス属、またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物から選ばれた微生物を
培養して得られた酵素を用いることが好ましい。

そしてフラボバクテリウム属に属する菌株の具体例とし
ては、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ）Ｕ−１８８（微工研菌寄第２９２２号）
ＡＴＣＣ３１２００）等、ミクロコツカス属に属する菌
株の具体例としては、ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｕｓ１ｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ３
９８等、コリネバクテリウム属に属する菌株の具体例と
しては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）Ｕ−４１（微工研菌寄第２９２３号）ＡＴ
ＣＣ３１２０１）等が挙げられる。

上記したフラボバクテリウムＵ−１８８（以下Ｕ−１８
８株という）は、本発明者等が腐植土壌中より新たに検
索して得た菌株で、その菌学的性質は以下に示す通りで
ある。

なお菌学的性質は概ねマニュアル・オブ・マイクロバイ
オロジカル・メソツヅ（１９５９年、マグロ−・ヒル・
ブック・カンパニー社出版）記載の方法に準拠した。

他の菌の菌学的性質についても同様である。

ａ形態顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で３０℃、４８時間培養） ■ 細胞の形および大きさ：０．５〜０．７Ｘ１．５〜１．７ミクロンの桿菌である
。

■ 細胞の多形性の有無：生活環に伴う多孔性は認められず、単独もしくは２連の
ものがある。

■ 運動性の有無：周毛性鞭毛（３〜７本）を有し、無定方向に激しく運動
する。

■ 胞子の有無：形成せず。

■ ダラム染色性：陰性。

■ 抗酸性：陰性。

ｂ各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天斜面培養３０℃、４８時間の培養で直径２〜３ｍｍの円形コロニ
ー、表面は凹凸状、周縁鋸歯状の集落を形成する。

コロニーの色は淡黄上包である。■ 肉汁寒天斜面培養３０℃、４８時間培養で拡幅状に良く生育する。

コロニーの色は淡黄褐色で鈍い光沢があり、非水溶性の
色素を生成する。

■ 肉汁液内培養３０℃、２４時間の静置培養で上層部に薄い膜を形成し
、多量の沈澱物を形成する。

■ 肉汁ゼラチン穿刺培養（２０°Ｃ，１〜４０日間静
置培養）表面ないし上層部に良く生育するが、液化は認められな
い。

■ リドマスミルク３０℃、１〜１４日間静置培養で全く変化が認められな
い。

すなわちリドマスの還元はなく、ｐＨ６，８の中性で凝
固化、ペプトン化も認められない。

■ バレイショ培地３０℃で４８時間静置培養したが、生育はほとんど認め
られなかった。

Ｃ生理的性質 ■ 硝酸塩の還元二強く還元する。

■ 脱窒反応：なし。

■ ＭＲテスト：陰性。

■ ＶＰテスト；陰性。

■ インドールの生成：生成しない。

■ 硫化水素の生成：生成する。

■ デンプンの加水分解二分解しない。

■ クエン酸の利用：利用しない（ＫｏｓｅｒおよびＣ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地を併用）０■ 無機窒素源
：利用しない（アンモニウム塩、硝酸塩）。

［相］色素の生成：非水溶性の黄土色の色素を生成す
る。

０ウレアーゼ：生成しない。

［相］オキシダーゼ：生成する。

０カタラーゼ：生成する。

■ 生育の範囲最適生育条件＝２５〜３５℃、ｐＨ７〜９、好気性。

生育可能な条件：好気性ないし僅かに通性嫌気性、５〜
４０℃で生育可能であるが、５０℃ではほとんど生育しない（肉汁振盪培養）。

生育可能なｐＨ域は６〜１１．８０℃で３０分間の加熱
で死滅する。

［相］酸素に対する態度：好気性。

＠０−Ｆテスト（ＨｕｇｈＬｅｉｆｓｏｎ法によ
る）：陰性。

０牛乳の凝固：凝固しない。

［相］各炭素源の利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、蔗糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デンプン、ラフィノース、デキストリン、イヌリン、グリコーゲン、繊維素などの炭素源より酸性酸およびガス生成は倒れも認められない。

ｄ生理的特異性Ｕ−１８８株はクレアチニンおよび／またはクレアチン
の存在下でクレアチン・アミジノヒドロラーゼ、クレア
チニン・アミドヒドロラーゼおよびザルコシン・デヒド
ロゲナーゼを同時に誘導的に生産する強力な活性を有す
る。

培養経過にともない培養液中に尿素が分解されずに残り
、培養液はアルカリ性になってアンモニアを生成する。

なお、酸素生産、尿素の生成およびアンモニアの生成は
クレアチニンあるいはクレアチンの除去された通常の栄
養培地では認められない。

上述のＵ−１８８株の諸性質をバーヂーズ・マニュアル
・オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジイ第８版（
１９７４年）の分類と対比すると、Ｕ−１８８株はフラ
ボバクテリウム属に属するものであると判定されるが、
種にいたっては公知菌種の何れの種にも該当しないと判
定されるこ吉により、Ｕ−１８８株は新菌種に属するも
のと認められる。

その理由は次の通りである。Ｕ−１８８株はダラム陰性
、好気性の無胞子桿菌で通常栄養培地で黄土色の色素（
非水溶性）を生成すること、周毛性鞭毛を有し運動性が
あること、さらに炭素源よりの酸生成、ガス生成共に認
められず、リドマスミルクも変化しないことより、フラ
ボバクテリウム属（ＧｅｎｕｓＦｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）に所属するものである。

しかもＵ−１８８株の分離源は海水ではなく、土壌由来
のものであること、運動性を有し３７℃で良く生育する
こと、さらに食塩の要求性はなく、硝酸塩を還元して亜
硝酸を生成することからフラボバクテリウム・ライゲン
ス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｊｎｍｒｉｇｅｎｓｅ
）に近縁と目される６しかるに下記第１表に比較したように、生成される色素
は、黄土色の非水溶性のもので培養条件により色の変化
はなく、ゼラチンを液化しないこと、グルコースは勿論
、他の炭素源より酸生成およびガス生成共に認められな
いこと、さらにバレイショ培地に生育しないことにより
フラボバクテリウム・ライゲンスと種を異にし新種と判
定される。

なおフラボバクテリウムＵ−１８８は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第２９２２号（ＦＥＲＭ−
Ｐ、％２９２２）として寄託されている。

次に前記コリネバクテリウムＵ−４１（以下Ｕ−４１株
という）は、本発明者等が腐植土壌中より新たに検索し
た菌株で、その菌学的性質は以下に示す通りである。

ａ形態顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で３０℃、６時間培養） ■ 細胞の形および大きさ：０．３〜０．５Ｘ１．Ｏ〜１．３ミクロンの短桿菌であ
る。

■ 細胞の多形性の有無：生活環にともなう多形性有り
。

■ 運動性の有無：無（周鞭毛なし）。

■ 胞子の有無：無。

■ ダラム染色性：陽性。

■抗酸性：陰性。

ｂ各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養３０℃、４８時間の培養で直径２龍の円形コロニー、表
面はなめらかで周縁もなめらかな集落を形成する。

コロニーの色は鈍い黄色である。■ 肉汁寒天斜面培養３０’Ｃ，４８時間の培養で糸状に良く生育する。

コロニーの色は淡黄色で非水溶性色素を生成する。

■ 肉汁液内培養３０℃、２４時間の静置培養で薄い菌環を形成する。

■ 肉汁ゼラチン穿刺培養（２０℃、１〜４０日間の静
置培養）ロート状に液化する。

■ リドマスミルク（３０℃、１〜１４日間静置培養）
リドマスが還元されて赤く変色する。

ｐＩ（７，９で凝固化はしないが、ペプトン化は見られ
る。

Ｃ生理的性質 ■ 硝酸塩の還元二還元する。

■ 脱窒反応：無。

■ ＭＲテスト：陰性。

■ ＶＲテスト：陰性。

■ インドールの生成：生成しない。

■ 硫化水素の生成：生成する。

■ デンプンの加水分解：分解する。

■ クエン酸の利用：利用する（ＫｏｓｅｒおよびＣ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地を併用）。

■ 無機窒素源：利用しない（アンモニウム塩、硝酸塩
）。

［相］色素の生成：非水溶性の淡黄色の色素を生成す
る。

０ウレアーゼ：生成しない。

０オキシダーゼ：生成する。

［相］カタラーゼ：生成する。

０生育の範囲最適生育状件：２５〜３５℃、ｐＨ６〜９、好気性。

生育可能な条件：好気性ないし僅かに通性嫌気性、５〜
４０℃で生育可能であるが、４５℃ではほとんど生育しない（肉汁振盪培養）。

［相］酸素に対する態度：好気性。

＠０−Ｆテスト（ＨｕｇｈＬｅｉｆｓｏｎ法）陰性。

０牛乳の凝固：凝固しない。

［相］各炭素源の利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、蔗糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デンプン、ラフィノース、デキストリン、イヌリン、グリコーゲン、繊維素などの炭素源より酸生成およびガス生成は何れも認められない。

ｄ生理的特異性Ｕ−４１株はクレアチニンおよび／またはクレアチンの
存在下でクレアチン・アミジノヒドロラ−ゼ、クレアチ
ニン・アミドヒドロラーゼおよびザルコシン・デヒドロ
ゲナーゼを同時に誘導的に生産する強力な活性を有する
。

なお酵素生産、尿素の生成およびアンモニアの生成はク
レアチニンあるいはクレアチンの除去された通常の栄養
培地では認められない。

上述のＵ−４１株の諸性質をバーヂーズ・マニュアル・
オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジイ第７版（１
９５７年）および第８版（１９７４年）の分類と対比す
ると、Ｕ−４１株はコリネバクテリウム属に属するもの
であると判定されるが、種にいたっては公知菌種の何れ
の種にも該当しないと判定されることにより、Ｕ−４，
１株は新菌種に属するものと認められる。

その理由は次のとおりである。

Ｕ−４１株は生活環にともなう多孔性が認められ、ダラ
ム染色は陽性で陰性になることがない無胞子桿菌で通常
栄養培地に生育すること、５０℃以上で生育出来ないた
め耐熱性を有さないこと、さらにセルロース分解能を有
しないことより、コリネバクテリウム属に属するものと
判定される。

しかもＵ−４１株の分離源が動物質由来のものでなく二
また硝酸性を還元して亜硝駿を生成し、かつゼラチンを
液化することから、コリネバクテリウム０ラサイ（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｔｈａｙｉ）に近
縁と目される。

しかるにＵ−４１株は土壌より分離した菌株であり、植
物性病源菌でなく、しかも第２表に示すように、ゼラチ
ンを強く液化し、また炭素源を利用しないことより、コ
リネバクテリウム・ラサイ種とは著しく異なるので、新
菌種に属するものと判定される。

なおコリネバクテリウムＵ−４１は工業技術院。

微生物工業技術研究所に微工研菌寄第２９２３号（ＦＥ
ＲＭ−ＰＡ２９２３）として寄託されている。

次に前記ミクロコツカス・ルテウスＡＴＣＣ３９８につ
いては、ジー・ジエー・フッカ−（Ｇ。

Ｊ、Ｈｕｃｋｅｒ）４２６（インターナショナ
ル、ブリティン・バクテリオロジイーノーメンクラチ
ャー・アンド・タフソノミー（Ｉｎｔｅｒｎ、Ｂｕｌ
ｌ、Ｂａ−ｃｔｅｒｉｏｌ、Ｎｏｍｅｎ、ａｎｄＴ
ａｘｏｎ、）、２（３）：８８（１９５２）：１に記
載がされており、さらに本菌株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅＣｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）に寄託され〔・アメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクションカタログ・オブ・ストレインズ８版（
１９６８）第２１頁〕、分譲可能となっている。

上述した菌株を用いて酵素Ｉ及び酵素■を生産するには
、通常の固体培養法でも良いが、なるべく液体培養法を
採用するのが好ましい。

本発明に用いられる培養培地の組成は、例えば酵母エキ
ス、ペフトン、肉エキス、コーンステイブリカーあるい
は大豆もしくは小麦麩の浸出液等の１種以上の窒素源に
、燐酸第１カリ、燐酸第２カリ、硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸
マンガン等の無機塩類の１種以上を加え、さらに必要に
より糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いら
れる。

本発明においてはクレアチニン、クレアチン、ザルコシ
ンもしくはこれらの混合物の存在下で、前記菌株を培養
すれば良いのであるが、例えば上記培地に予じめクレア
チニン、クレアチン、ザルコシンもしくはこれらの混合
物を含有させたものに、該菌株を接種して培養を行って
もよく、または培養開始後５時間以内にクレアチニン、
クレアチン、ザルコシンもしくはこれらの混合物を培地
に添加して培養を行っても良い。

この際クレアチニン、クレアチン、ザルコシンもしくは
これらの混合物を前述の培地に添加する量は、培地総量
に対し０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは０．１〜
１．０％（Ｗ／Ｖ）である。

なお培養培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当で
ある。

また培養温度は２５〜３７℃、好ましくは３０℃前後で
培養時間は２５〜３７℃、好ましくは１５〜３６時間、
通気攪拌深部培養または振盪培養等により好気的に培養
するのが好ましＧ）。

この様にして培養した培養物中には酵素Ｉ及び酵素■が
生成蓄積されるので、該培養物から各酵素を分別採取す
る。

培養物より各酵素を採取するには通常の酵素採取手段を
用いて得ることが出来る。

例えば培養終了後、培養物を遠心分離等して菌体を集め
、洗滌菌体を高圧分散、超音波破砕、摩砕処理等して本
酵素を抽出するか、またはリゾチム等の溶菌酵素を作用
させるか、あるいはトルエン等の存在下に自己消化させ
る等の手段により酵素を菌体外に排出させた後、濾過、
遠心分離等の操作で固形部分を除去し、可溶性区分を凍
結乾燥して粗酵素標品を得る。

かくして得られた粗酵素標品より本酵素を精製するには
、有機溶剤、硫安塩析、あるいは必要によりストレプト
マイシン硫酸塩、硫酸マンガン等で除核酸し、次にＤＥ
ＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチル・セル
ロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セファデック
ス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデックス、ス
ウェーデン国ファーマシア社製）、ＱＡＥ−セファデッ
クス（スウェーデン国ファーマシア社製）等のイオン交
換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、またセファ
デックスＧ−１００、セファデックスＧ−２００（スウ
ェーデン国、ファーマシア社製入セファロース６Ｂ（ス
ウェーデン国、ファーマシア社製）等を用いるゲル濾過
法、およびハイトロキシルアパタイト（米国、バイオラ
ンド社製バイオゲルＨＴ）を用いる吸着溶出法、および
ポリアクリルアミド・ゲル等を用いる電気泳動等を適宜
選択、組合わせて実施することにより、高度に精製され
た各酵素標品を得ることが出来る。

上記精製手段により得られた各精製酵素の理化学的性質
を以下に記載する。

（５）酵素Ｉ（クレアチン・アミジノヒドロラーゼ）（
１）作用及び基質特異性本酵素はクレアチンを加水分解して尿素とザルコシンす
る作用を有し、クレアチンに対する施〔ミカエリス（Ｍ
ｉｃｈａｅｌｉｓ）定数〕値は４．０Ｘ１０−２モル
（３７℃、ｐＨ７，７）であり、クレアチニンに対して
は全く作用しない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲至適ｐＨは７．７にあり、安定ｐＨ範囲は５．０〜９．
０である。

（３）力価の測定法０．１モル・クレアチン溶液０．８ｒｎｌに、０．３
モル燐酸緩衝液（ｐＨ７，７）０．１ｍｌ及び任意な
濃度の本酵素液０．１ｒｕｌを加え、３７℃で１０分
間反応させたのち、これに２％（Ｗ／Ｖ）Ｐ−ジメチル
アミノベンズアルデヒド溶液（２ｇのパラ・ジメチルア
ミノベンズアルデヒドを９９．５％エタノール１００Ｔ
Ｌｌに溶解し、さらに濃塩酸１５ＴＬｌを添加し全量を
蒸留水で倍量にしたもの）２ｍｌを添加し、２５℃、３
０分放置後、光電比色計により４３５ｍμにおける吸光
度値（０，Ｄ、値）を測定した。

なお予じめ作成した尿素の検出曲線よりその生成量を調
べておき、３７℃で１分間当り１マイクロモルの尿素を
生成する酵素量を１単位とした。

（４）作用適温の範囲２０〜４５℃の範囲内にあり、特に３７°Ｃ付近が最適
である。

（５）ｐＨ，温度等による失活条件ｐＨ１０以上で失活し、温度は５０℃、１０分間で完全
に失活する。

（６）阻害、活性化及び安定化Ｐ−ＣＭＢ、塩化水銀で阻害され、グルタチオン（還元
性）、Ｌ−システィン塩酸塩、２−メルカプトエタノー
ルで安定化する。

（７）精製方法培養物に硫酸マンガン、珪藻土を加えて濾過し、除核酸
、除菌し、その濾液を０．１モル食塩および１ミリモル
の２−メルカプトエタノールを含む０．０５モル燐酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に透析したのち、該透析内液を上記
緩衝液で緩衝化したＤＥＡＥ−セルローズを充填したカ
ラムに通過させ（この場合、吸着区分はクレアチニン・
アミドヒドロラーゼ活性を有する）、その非吸着区分（
本酵素活性を有する）を前もって上記緩衝液で緩衝化し
たＤＥＡＥ−セファデックスに吸着させ、これを０．１〜
０．５モルまでの食塩濃度匂配溶出法で溶出すると、本
酵素が０．２〜０．３モルの範囲で溶出される。

次いでこの区分を濃縮したものをセファロース６Ｂのカ
ラムに通過させ、上記緩衝液で溶出して本酵素の活性区
分を分取し、これを濃縮したのち凍結乾燥し本精製酵素
粉末を得る。

（８）分子量本酵素の分子量は、マントリウスの方法（Ｐ。

Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、９６
、５９５（１９６５））に基づき、セファデックスＧ
−２００（５ｅｐ−ｈａｄｅｘＧ −２００）（
スウェーデン国、ファーマシア社製）を用いて測定した
結果、５℃ｐＨ８，０の０．０５モル−燐酸緩衝液（０
，１モル食塩と１ミリモルの２−メルカプトエタノール
を含む混合液）中で、約６万である。

上述の如く、本酵素はその酵素化学的、物理化学的性質
より公知の何れのクレアチン・アミジノヒドロラーゼと
も異なる新らしいりＶアチン・アミジノヒドロラーゼと
考えられる。

（Ｂ）酵素ＩＩ（ザ゛ルコシン・デヒドロゲナーゼ）（
１）作用及び基質特異性本酵素はザルコシンを加水分解してホルムアルデヒドと
グリシンに対する作用を有し、ザルコシンに対する艙〔
ミカエリス（Ｍｉｃｈ−ａｅｌｉｓ）定数〕値は１．
６Ｘ１０−”モル（３７℃、ｐＨ’７．７）であり、
クレアチニンあるいはクレアチンに対しては全く作用し
ない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲至適ｐＨは７．５〜８．０にあり、安定ｐＨ範囲は６．
０〜９．０である。

（３）力価の測定法０．１モル・ザルコシン溶液１．０ｍｌに、０．１モル
燐酸緩衝液（ｐＨ７，７）０．５ｍｌ及び任意な濃度
の本酵素液０．５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応
させたのち、これに０．１規定の塩酸１ｍｌを添加し反
応を中止させる。

この混合液０．２ｍｌに水１．８ＴＬｌを加え−さらに
５％硫酸水素カリウム溶液１ｍ１１０．５％ＭＢＴＨ
（３−メチル−２−ベンゾチアゾロン・ヒドラゾン）１
ｍＡを加え、良く混合後、室温に１時間放置する。

放置後、２％硫酸第二鉄アンモニウム１ｍｌを加えて良
く混合し、室温に３０分間放置し、その後光電比色計に
より６５０ｍμにおける吸光度値（０，〕値）を測定す
る。

なお予め作成したホルムアルデヒドの検量曲線よりその
生成量を調べておき、３７℃で１分間当り１マイクロモ
ルのホルムアルデヒドを生成する酵素量を１単位とした
。

（４）作用適温の範囲３０°Ｃ〜３７℃の範囲内にある。

（５）ｐＩ（、温度等による失活条件ｐＨ９，５以
上ｐＨ０，５以下で失活し、温度は４５℃、１０分間で
完全に失活する。

（６）阻害、活性化及び安定化Ｐ−ＣＭＢ、２−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡの阻
害はない。

（７）精製方法培養物より遠心分離等により集菌した菌体を超音派破砕
を行った後、遠心分離等の手段で固形部分を除去する。

可溶性区分の硫安飽和度０．３〜０．７で塩析される酵
素を遠心分離して集め、該酵素を０．０５Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ８，０）で溶解させて同じ緩衝液に対して透析す
る。

透析後、該透析内液を予め上記緩衝液緩衝化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースを充填したカラムに吸着させ、これを０
．０〜０．６モルまでの食塩濃度匂配溶出液で溶出させ
ると、吸着されたクレアチニン・アミドヒドロラーゼが
先に溶出され、次いで本酵素ザルコシン・デヒドロゲナ
ーゼが食塩濃度０．３モル付近で溶出される。

次いでこの区分を濃縮したものをセファロース６Ｂのカ
ラムに通過させ、上記緩衝液で溶出して本酵素の活性区
分を分取し、本精製酵素を得る。

上記の如き酵素Ｉ及び■をクレアチンを含む液に作用さ
せるのであるが、作用条件としてはｐＨ６，０〜９．０
、温度３０〜３７℃、好ましくはｐＨ７，５〜９．０、
温度３５〜３７℃の条件で、３０〜１２０分間作用させ
る。

ｐＨの調整には各種緩衝液、例えば０．３Ｍ程度の燐酸
緩衝液を用いることが出来る。

酵素Ｉ及び■は順次に作用させても、同時に作用させて
もいずれでもよく、また使用酵素量はクレアチン含有量
あるいは酵素の軸値によって異なるが、通常酵素■が１
単位以上、酵素■が０．１単位以上である。

またクレアチンを含む液中にクレアチン・キナーゼが存
在すると、クレアチン量に応じた量のホルムアルデヒド
が生成されず、正確に定量することが出来ないことがあ
るので、この様な場合には酵素を作用させる際にクレア
チン・キナーゼ酵素活性阻害剤、例えばエチレンジアミ
ン４酢酸（ＥＤＴＡ）等を存在させることにより、クレ
アチンコクレアチン・リン酸相互変換が停止し、正確な
りレアチン量を求めることが出来る。

存在させるＥＤＴＡの量は０．１ｍＭ程度で充分である
。

こうしてクレアチンを含む液に酵素Ｉ及び■を作用させ
ると、クレアチンが前述の反応機構により最終的にホル
ムアルデヒドとグリシンに分解されるので、このホルム
アルデヒドを通常の発色方法、例えばリン酸二アンモニ
ウム１０ｇ、アセチルアセトン０．２ｍｌ、蒸溜水１
００ＴＬ１１リン酸でｐＨ６，５に調整の発色試薬を
、上記酵素反応液に適宜量添加し発色させると黄色に発
色するので、この発色した液を光電比色計で吸光度（４
１０ｍμ）を測定し、予め求めておいた検量線からクレ
アチンの量を定量することが出来る。

更に本発明は液中のクレアチンを定量するキットを提供
するものであり、以下これを具体的に説明する。

本発明によるクレアチン定量用キットは酵素■及び■を
含む酵素量と、ホルムアルデヒド発色試薬系とから成る
キット（以下キット■という）及び酵素１．ＩＩ及びク
レアチン・キナーゼ阻害剤を含む系とホルムアルデヒド
発色試薬系とから成るキット（以下キット■という）で
ある。

キットＩに於ける酵素系は粉末状、液状いずれの形状で
もよく、粉末状の場合該酵素系は粉末酵素１．Ｉｔ及び
酵素作用を行なわしめるに適当なｐＨ６，０〜９，０を
与える緩衝剤、例えば燐酸緩衝剤、あるいはトリス・塩
酸緩衝剤から成る。

また液状の場合には酵素１１ ■を緩衝液、例えば０．
３Ｍ程度の燐酸緩衝液、あるいはトリス・塩酸緩衝液に
溶解してｐＨ６，０〜９．０に調整しておけばよい。

酵素濃度は使用者が定量時に緩衝液で稀釈して用いる形
態、あるいはたのまま直接用いることが出来る形態によ
って異なるが、要は定量時に酵素Ｉが１単位以上、酵素
■が０．１単位以上あれば充分である。

ホルムアルデヒド発色試薬系はホルムアルデヒドを発色
させる試薬であればどの様なものでもよく、例えばリン
酸二カリウム１０ｇ、アセチルアセトン０．２ｍｌ、
蒸溜水１００ｍ１から成る試薬をリン酸でｐＨ６，５に
調整した試薬を挙げることが出来る。

キラｔ−ｎに於ける酵素系は、キットＩの酵素系にクレ
アチン・キナーゼ阻害剤を加えたものであって、クレア
チン・キナーゼ阻害剤としては、ＥＤＴＡ等が好適に使
用出来る。

ＥＤＴＡ等の使用量は、反応液中最終濃度として０．１
ｍＭ程度である。

キットＨに於けるホルムアルデヒド発色試薬系は、キッ
トＩのそれと全く同じ試薬系を用いることが出来る。

尚キットＩ及び■は冷暗所特に５°Ｃ以下に保存するこ
とが好ましい。

以上詳細に説明した如く、本発明は液中のクレアチンを
正確かつ迅速に定量する方法及びそのキットを提供する
ものであって、特に臨床医学に於ける腎臓及び筋肉疾患
の診断等に有効に用いることが出来るものである。

以下に実施例を示す。

実施例１第３表に示す反応液を３７°Ｃで３０分間及び１２０分
間反応させ、この反応液に第４表に示す発色試薬を３ｍ
ｌ添加し、３７℃に１時間放置して発色させた。

発色後光型比色計（日立１３９型）を用い、波長４１０
ｍμで吸光度を測定した。

その結果を第５表に示す。

第３表反応液クレアチン溶液（１０１ｎ９７１００ｍ１）０．
２ｍｌｍｌ前液（０，３Ｍ）０
．１ｍｌ酵素１（１，３単位）、酵素１１（０，１単位
）混合液※ ０．１ｍｌ ※各酵素共フラボバクテリウムＵ−１８８（微工研菌寄
第２９２２号）を培養して得たものである。

第４表発色試薬リン酸二アンモニウム１０ｇアセチ
ルアセトン０．２ｍｌ蒸溜
水１００ＴＬｌリン酸
でｐＨ６，５に調整以上の結果から明らかな様にｐＨ７，５〜９，０の条件
が最適であるが、ｐＨ７，５以下でも反応時間を長くす
ることにより充分にクレアチンを分解し、液中のクレア
チン量を極めて正確に定量することが出来る。

実施例２第６表に示す如く、反応液中にクレアチン溶液と血清の
両者を含む液Ａ１クレアチン溶液の代りに蒸溜水を用い
た液Ｂ１血清の代りに０．８５％の食塩溶液を用いた液
Ｃを調整し、これらの反応液を３７℃、３０分間反応さ
せ、この反応液に実施例１で用いたと同様の発色試薬３
ｍｌを添加し、３７°Ｃに１時間放置して発色させた。

発色後実施例１に記載したと同様にしてその吸光度を測
定して反応液中のクレアチンを定量した。

これらの定量結果から後記の式によりクレアチンの回収
率を求めめた。

その結果を第７表に示す。

クレアチン・キナーゼを含有する液中のクレアチンを定
量する場合に、クレアチン・キナーゼ阻害剤としてＥＤ
ＴＡを添加すれば、より正確にクレアチンを定量するこ
とがわかる。

実施例３キットＩ（イ）酵素系（各酵素ともフラボバクテリウムＵ−１８
８（微工研菌寄第２９２２号）を培養して得たものである。

）酵素１１単位酵素■ ０，２単位０．３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，７）１ｒｕｌに溶解（Ｄ）発色試薬系リン酸アンモニウム１（１アセチルアセトン０．２ｍｌ蒸溜水１００ＴＩｌｌリン酸でｐＨ６，５に調整上記の如きキットを用いて尿中のクレアチン量を定量す
るには、尿１ｍｌに酵素混合液ＩＴＬｌを添加し３７℃
、３０分間反応させ、次いで発色試薬３属を添加し、３
７℃、１時間の発色を行ないその吸光度（４１０ｍμ）
を測定する。

同時にクレアチンの標準液を反応、発色させた液の吸光
度を求め、この吸光度との比から尿中のクレアチンを定
量することができる。

実施例４キット ■（各酵素ともミクロコツカス・ルテウス（Ａ
ＴＣＣ３９８）を培養して得たものである。

）（イ）酵素系酵素Ｉ１５３単位・酵素ｎ４０単位ＥＤＴＡ１０ｍＭ０．３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，７）１０ｄに溶解（ロ）発色試薬系リン酸二アンモニウム１０ｇアセチルアセトン０．２属蒸溜水
１００ｍｌリン酸でｐ）（６，５に調整上記の如きキット■を用いて血清中のクレアチンを定量
するには、酵素系の混合液を０．３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７，７）で１０倍に稀釈し、この稀釈液０．２ｍｌを血
清０．２ｍｌに添加し３７℃、３０分間反応させ、反
応終了後発色試薬３ＴＬｌを添加し、以下実施例３に記
載したと同様の方法で血清中のクレアチンを定量するこ
とが出来る。

Claims

【特許請求の範囲】１クレアチンを含む液にクレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼ及びザルコシン・デヒドロゲナーゼを順次又は同
時に作用させるか、若しくはクレアチンキナーゼ阻害剤
の存在下に順次又は同時に作用させてホルムアルデヒド
を生成せしめ、該ホルムアルデヒドを測定することを特
徴とするクレアチンの定量方法。２クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン
・デヒドロゲナーゼをｐＨ６，Ｑ〜９．０、温度３０℃
〜３７℃の条件で作用させる特許請求の範囲第１項記載
のクレアチンの定量方法。３クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン
・デヒドロゲナーゼがフラボバクテリウム属、ミクロコ
ツカス属、またはコリネバクテリウム属に属する微生物
から選ばれた微生物を倍養して得られた酵素である特許
請求の範囲第１項記載のクレアチンの定量方法。４フラボバクテリウム属、ミクロコツカス属、及びコ
リネバクテリウム属に属する微生物がそれぞれフラボバ
クテリウムＵ−１８８（微工研菌寄第２９２２号、ＡＴ
ＣＣ３１２００）、ミクロコツカス・ルテウス（ＡＴＣ
Ｃ３９８）、コリネバクテリウムＵ−４１（微工研菌寄
第２９２３号、ＡＴＣＣ３１２０１）である特許請求の
範囲第４項記載のクレアチンの定量方法。５クレアチン・キナーゼ阻害剤がエチレン・ジアミン
・４酢酸（ＥＤＴＡ）である特許請求の範囲第１項記載
のクレアチンの定量方法。６クレアチン・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン
・デヒドロゲナーゼを含むか、又はこれらの酵素と共に
クレアチン・キナーゼ阻害剤を含む酵素系と、ホルムア
ルデヒド発色試薬系とからなるクレアチン定量用キット
。