JPS58194848A - 抗生物質マイコプラネシンｄの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新抗生物質マイコプラネシンＤおよびその誘導
体に関するものである。

現在まで、マイコプラネシンおよびその誘導体（特開昭
５４−１６０３０２号、同５６−６５８５３号）。

マイコプラネシンＢおよびその誘導体（特開昭５６−１
４０９５７号）並びにマイコプラネシンＣ（特開昭５６
−１４２２５０号）が知られている。

本発明者らは兵庫県洲本布の土壌から分離した放線菌Ａ
　４１０４２株が新抗生物質マイコグラネシンＤを生産
することを新たに見出した。

そして、更に研究をすすめた結果。

（Ｉ］ で示されるマイコシラネシンＤおよびその誘導体が、細
菌特に結核菌に対して極めて強い抗菌力を有しているこ
とを見い出した。

従って、マイコプラネシンＤおよびその誘導体はこれら
の細菌に起因するヒトおよび動物の　　　　、゛。

疾病の予防あるいは治療に用いられる。

上記式中、Ｒは水素原子。

α−ケトブチリル−Ｎ−メチルバリル基またはα−ハイ
ドロキシブチリル−Ｎ−メチルバリル基 を示す。

マイコプラネシンＤはＲがα−ケトブチリル−Ｎ−メチ
ルバリル基で示される化合物である。

以下Ｒがα−ハイドロキシ−ブチリル−Ｎ−メチルバリ
ル基で示される化合物を化合物叩とし。

Ｒが水素原子のときの化合物を化合物（社）と略称する
。

マイコグラネシンＤを生産する放線ｍ　Ａ　４１０４２
株の形態学的特徴および生理学的性質は例えば特開昭５
４−１６０３０２号に記載されており、アクチノプラネ
ス・エスピー（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅａ　ａｐ　）　
Ａ４１０４２と命名されている。

本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されてお９．その微生物受託番号は微工研菌寄第４５０
４号である。

マイコプラネシンＤの生産菌については、放線菌の諸性
質は一定したものでは々く、自然的。

人工的に容易に変化することは周知の通）であり１本発
明で使用し得る菌株はアクチノプラネス属に践する。マ
イコプラネシンＤを生産する菌株すべてを包含するもの
である。

本発明の方法における培養は一般放線菌における培養方
法に準じて行われ、液体培地で振盪培養、あるいは通気
攪拌培養によるのが好ましい。培地成分としては放線菌
の栄養源として公知のものが使用され、たとえば炭素源
としてブドウ糖、アラビノース、ガラクトース、マンノ
ース、シュクロース、マルトース、デキストリン、澱粉
、グリセリンなど、又は大豆油、トウモロコシ油、綿実
油などの植物性油脂、チキンオイル、ラード、魚油など
の動物性油脂も用いられる。窒素源としては、大豆粉、
落花生粉。

綿実粉、魚粉、コーン・スチープ・リッカー。

オートミール、スキムミルク、ペプトン、肉エキス、生
イースト、イーストエキス、カザミノ酸、硝酸ソーダ、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどが、又無機塩
としては１食塩、塩化カリ、燐酸塩、炭酸マグネシウム
、炭酸カルシウム、塩化カルシウムが使用される。更に
必要に応じて硫酸第一鉄、硫酸鋼、硫酸マグネシウム、
硫酸亜鉛、塩化コバルトなどの微量金属塩が添加される
。液体培養に際してはシリコン油、植物油、界面活性剤
などが消泡剤として適宜使用される。培地のｐ）（は中
性附近、培養温度は２０〜３０℃１％に２８℃前後が好
ましい。

培養の経過に伴って培養液中に生産されるマイコプラネ
シンＤの力価はミコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙ
ｃｏｂａａｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉａ　）　Ａ
ＴＣＣ６０７株を被検菌とするカップ検定法によって定
量される。通常３〜５日間の培養でマイコプラネシンＤ
の生産量は最高に達する。

マイコプラネシンＤは培養液中の液体部分および菌体部
分の両方に存在する。培養終了後。

菌体その他の固形部分をけいそう土を濾過助剤とする濾
過操作、あるいは遠心分離によって液体部分と分離する
。その菌体部分又は炉液あるいは上清中に存在するマイ
コプラネシンＤはその理化学的性質を利用することによ
り抽出、精製することが出来る。

菌体部分のマイコグラネシンＤは水と混和する溶媒たと
えばメタノール、エタノール、イソグロノ９ノール、ア
セトンなどを加えて抽出することが出来る。その抽出液
は溶媒全留去した後。

水と混和しない溶媒、たとえば酢酸エチル、メチルイソ
ブチルケトン、クロロホルム、メチレンクロライドなど
の溶媒に抽出される。涙液部分のマイコプラネシンＤも
これらの水と混和しない溶媒で抽出し、菌体部分からの
マイコプラネシンＤ抽出液と合併して濃縮し、溶媒を留
去してマイコプラネシンＤの粗抽出物とすることが出来
る。また、菌体とＦＷ（または上清）部分に分離するこ
となく、培養液に直接上記の水と混和する溶媒を加えて
マイコグラネシンＤ′ｆｃ抽出し、濾過後、濃縮により
溶媒を留去し、上記の水と混和しない溶媒で抽出するこ
とも可能である。

更にこのマイコグラネシンＤを精製する方法としては、
このような理化学的性質を有する物質を精製するのに用
いられるすべての方法が適用されるが、吸着剤を用いる
方法、向流分配を行う方法が好ましい。吸着剤としては
、アルミナ、シリカゲル、セファデックス、セルロース
などが使われる。特にシリカゲルを担体とするカラムク
ロマトグラフィーが好適であり、溶媒としては、メタノ
ール、酢酸エチル、クロロホルムなどを適当な割合で混
合して用いられる。

又、更に純度の高いマイコグラネシンＤｆ、得るために
はシリカゲルあるいは各種逆相カラムクロマトグラフィ
ー用担体を利用した高速液体クロマトグラフィーが効果
的である。

化合物（Ｉｆ）は一般的に使用できる還元剤たとえばＮ
ａＢＨ４，ＬｉＡｌＨ４，ＮａＢＨ３ＣＮによシ、オる
いは水素気流中・９ラジウム−炭素、酸化白金などの触
媒の存在下、有機溶媒又は水−有機溶媒中でマイコシラ
ネシンＤを処理することにより得られる。又、化合物（
ＩＩ）は微生物又は動物起源の酵素標品を用いてもマイ
コプラネシンＤから誘導することも可能である。

化合物（１■）は化合物（Ｉｔ）あるいはマイコプラネ
シンＤを種々の無機酸又は有機酸で、有機溶媒又は水−
有機溶媒混合液中で加水分解することにより得られるが
、特に３〜５Ｎの塩酸中、室温、３〜５時間の加水分解
が良好な結果を与える。このようにして得られた化合物
（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）を含む反応液から１通常有機化
合物の分離精製に利用される方法、たとえば各釉担体を
用いたクロマトグラフィーのうちの単独又はこれらの組
み合わせ又はくり返し等により、あるいは結晶性の差を
利用することなどにより、それぞれ化合物（ＩＩ）ある
いは（ＩＩＩ）を純粋に単離することが可能である。こ
のようにして得られたマイコプラネシンＤ、化合物（１
）および化合物（ＩＩＩ）はそれぞれ次の特性を有する
。

Ａ、マイコプラネシンＤの物理化学的ならびに生物学的
性状 １）物質の色と形状二白色粉末 ２）融点：１６０〜１７０℃ ３）比旋光度、〔α］Ｄ−６０．４°（ｃ＝０．５．ク
ロロホルム） ４）元素分析値： 実測値；　Ｃ，６１，４１ｑ６；Ｈ，８，５４％：Ｎ、
１１．８２係 ５）組成式”　６２’１０４Ｎ１００１５６）分子量：
　１１９６ ７）紫外線吸収スペクトル： ５０％メタノール溶液中２０μｂ冷ｌの＃厩で測定して
ｍ１図に示した通シ末端吸収のみ。

８）赤外線吸収スペクトル： ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収ス梨りトルは第２
図に示す通シである。

９）核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム中で内部基準としてテトラメチルシラン
（ＴＭＳ）を用いて沖］定した核磁気共鳴スペクトルは
第３図に示す通シである。

１０）溶解性： メタノール、エタノール、酢酸エチル。

アセトン、クロロホルムに可溶、水に不溶である。

ｉｉ）　　呈色反応ニ ジリカダル薄層りロマトグラフィー上で。

５０％＋ｔＣ酸で茶褐色、ヨードで着色し、過マンガン
酵カリを脱色する。ニンヒドリン。

２．４−ノニトロフェニルヒドラジン陰性。

１２）アミノ酸分析： 濃塩酸：酢酸（１：　Ｉ　）、１０５℃、２０時間の加
水分解で各１モルのグロリン、クリシン、ロイシン、２
−アきノー５−メチルヘキシル酸、Ｎ〜メチルスレオニ
ア、Ｎ−メチル−ロイシン、メチルプロリン、ｆロピル
ノロリンおよび２モルのＮ−メチルプロリンが検出され
た。

１３）　　Ｒ（ｉ（シ１ｊヵｒル薄層クロマトグラフィ
＝　Ｆ２５４　＋　０．２５朋メルク社製Ａ’５７１５
）溶媒　　　Ｒ。

酢酸エチル　　　　　　　　０．１５ クロロホルム二メタノ〜ル（９５：５）　　　　０．６
３１４）抗菌スペクトルニ 各種微生物に対する最小阻止＠度（ＭＩＣ）は第１表に
示す通りである。ミコバクテリウムの場合は１０チアル
ブミン添加デユポスの液体培地による稀釈法により、３
７℃。

１週間培養後に、一般細菌に対してはハート・インフュ
ージョン寒天培地を用いた寒天稀釈法によって３７℃２
４時間後に、又カビ、酵母に対してはサブロー寒天培地
を用いた寒天稀釈法により２６℃、４８時間後にそれぞ
れ判定した。

第　　１　　表 被検菌　　　　培＊ｒ’　ＭＩＣ（μＵ／りミコバクテ
リウム・スメグマチス　Ａ’ＴｃＣ６０７Ｄ　　　　Ｏ
，０５バチルス・ズブチリス　ＰＣＩ　　２１９　　　
　　　　　　　Ｈ）４００エツシエリキ７　・：７リ　
ＮＩＨＪ　　ＪＣ−２Ｈ＞４００クレプノエラ・ニュー
モニエ　ＰＣｌ　　６０２　　　　　　　Ｈ＞４００プ
ロテウス・プルがリス　０Ｘ１９　　　　　　　　　　
　Ｈ＞４００〃　　　ミラビリス　１３３１　　　　　
　　　　　　　Ｈ＞４００シユードモナス・エルギノー
ザ　５ＡＮＫ　７３８６０　　　　Ｈ＞４００キヤンデ
イダ・アルビカンス　Ｙｕ　　１２０ＯＳ　　　＞４０
０アスペルギルス・オリゼエ　５ＡＮＫ　　１１２６２
　　　　　Ｓ　　　＞４００ペニシリム・クリソゲナム
　５ＡＮＫ　　１２７６８　　　’　　　Ｓ　　　＞４
００ピリキユラリア・オリゼ−ｒ−５ＡＮＫ　　１６９
７５　　　　　　Ｓ　　　＞４００＊ 培地Ｄ：１０％アルブミン添加デュポス液体培地Ｈニハ
ードインフュージョン寒天培地 Ｓ：サプロー寒天培地 １５）毒性： マウスに対して本物質１００安〜を腹腔内投与したが死
亡するマウスはいなかった。

Ｂ、化合物（ｎ）の物理化学的性状 １）物質の色と形状二無色、針状結晶 ２）元素分析値（ｑｂ）　：　Ｃ６１，９５，Ｈ８，８
０゜Ｎ１１．８０ ３）組成式：０６２■４１０６Ｎ１００１５％式％：１
１９８ ） ７）紫外線吸収スペクトル（メタノール）：末端吸収 ８）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　：　外ヮ阪−１
１７６０，１６７０〜１６４０ＣＴｒＬ−’９）溶剤に
対する溶解性： メタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベ
ンゼンｖｃ可ｍ、水、ｎ−ヘキサンに不溶。

１０）薄層クロマトグラフィー：Ｒ７値０．０９吸着剤
：メルク社製シリカｒルプレ−１・扁５７１５ 展開溶媒二酢酸エチル Ｃ９化合物（Ｉｌｌ）の物理化学的性状■）物質の色と
形状：無色結晶性粉末 ２）元素分析値（係）：　Ｃ，６２，５０，Ｈ，８７５
゜Ｎ、１２．５４ ３）組成式：Ｃ５２Ｈ８，Ｎ９０．。

４）分子量：９９９ ５）融点：１４０〜１５０℃ ６）比施光度、〔α］Ｄ−５３，０°（ｃ＝０．５．ク
ロロホルム） ７）　　紫外ｉ１吸収スペクトル（メタノール）−末端
吸収 ８）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　：トイ外し一ノ
１７６０．１６７０〜１６４０ｃｔＩＬ−’９）溶剤に
対する溶解性： メタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムに可
ｍ、水、ベンゼン、ｎ〜ヘキサンに不溶。

１０）薄磨りロマトグラフィー：Ｒ７仙０．１９吸着剤
：メルク社製シリカｒルプレート扁５７１５ 展開溶媒：クロロホルム：メタノール：ＮＨ４ＯＨ（９
０：１０　：１　） Ｄ、化合物（１）　、　（ＩＩＩ）の抗菌活性（最小阻
止濃度） Ａ’ｌｌ’ＣＣ６０７ 培地：１０係アルブミン添加デユア１？ス液体培地３７
℃７日目に判定。

以上から、マイコプラネシンＤおよびその誘導体は各種
細菌感染性疾患を対象とする抗酌剤。

特に抗結核剤として使用される。抗結核剤として使用す
る場合、経口または非経口により投与される。通常は経
口投与が好ましい。投与形態としては例えば錠剤、カプ
セル剤、散剤、顆粒剤環があげられる。投与量は症状８
年令１体重その他により異なるが５通常成人に対して１
日約２００　ｎｌｉ／乃至２？を１回または数回に分け
て投与するのが好ましい。必要に応じてこの投与１・は
更に増減できる。

実施例　１ マイコグラネシンＤ生産餉をグルコース１％。

グリセリン１係、オートミール０．５％、シュクロース
１％、大豆粉２％、カザミノｆｆ０．５’ｆｉ、生イー
スト１　％　、ＣａＣＯ３０，１％　（滅菌前Ｐ＋ｉ　
？、　（１）からなる種培地１００ゴを含む５００　ｍ
ｌ容坂［１フラスコ５本に接種し、２８℃、９６時間往
復振盪培養しその培養液を同一培地５００ｍ１を含む２
！容工ルレンマイヤーフラスコ８本に各々２５ｍ１ずつ
接４ホし、更に２８℃、９６時間回転振盪培養する。そ
の培養液をグリセリン０．５％、シュクロース２チ。

大豆粉１係、生イースト１％、コーンスチーグリカ−０
，５％、　ＣｏＣｌ２・６Ｉ４２００．００１　％　（
滅菌前ｐＨ７，２）よりなる培地３００！を含む６００
１容タンク２基に各々ｉ、ｓ、ｇずつ接種し、２８℃、
攪拌２００回転／分１通気量３００　Ａ／分、にて９６
時間通気攪拌培養した。

培養液（μ（７，２）６００．＃に沖過助剤としてセラ
イ）５４５（米国ジョンズマンビルプロダクトコーポレ
ーション製）を３０ｋｇ加えて濾過し、Ｆｇ４２０！と
菌体１７０ゆを含むケーキに分けた。ｐ液は等量の酢酸
エチルでマイコプラネシン、マイコプラネシンＢ、Ｃお
よびＤを含む区分を抽出し、菌体を含むケーキは８０係
アセトン水４００！にて２回抽出し、得られた抽出液７
５０ｋを減圧下アセトンを留去後、その残液を２１０！
の酢酸エチルで抽出してＦＭの酢酸エチルＭ出液と合わ
せ２．＃まで減圧下濃縮した。かくして得た濃縮液を１
！の０．０５　Ｎ　ＨＣｌ水、１％ＮａＨＣＯｓ水、飽
和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後濃縮乾固して４００
１の油状物を得た。この油状物全量を３００　ｍｌのベ
ンゼンに溶解し、あらかじめベンゼンで調製したシリカ
ダルカラム（米国マリンクロット社製、シリカゲル９ｏ
ＯＰ）に吸着させ、ベンゼンでカラムを洗浄後、各々４
！のベンゼン：酢酸エチル３：１．２：１，１：１の（
１９） 混合溶媒１次いで酢酸エチルで展開しながら５００ｗＬ
ｌずつ分画しフラクション３２まで溶出した。

マイコグラネシンＤは主にフラクション１５から２２に
溶出され、＃縮乾固することによυ１５．３１の油状物
を得た。この油状物のうち５．０？をアセトニトリル３
ｒＩＬｌに溶解し、逆相カラムクロマトグラフィーで精
製した。すなわち、メルク社Ｍ＋）クロプレツ７’ＲＰ
−８（ローパーカラムｎ）のカラムに、上記サンプルを
とがしたアセトニトリル溶液１罰を吸着後１０＋ｎｌＺ
分の流速で６５係アセトニトリル水で展開浴出した。マ
イコプラネシンＤはサンプル吸着後５１分より５７分の
間に溶出され、活性分画として６０ｄが得られた。

本生産菌が同時に生産するマイコプラネシン（特開昭５
４−１６０３０２　）は４０分から５０分の間に、およ
びマイコシラネシンＣ（特開昭５６−１４２２５０　）
は６０分から７４分の間に溶出された。更に残る２ｄの
サンプルにつ患同様の操作　　　　、”。

を２回くりかえし活性分画として合計５４０ｍ１を得た
。減圧下アセトニトリルを留去後１００ツの（２０） 酢酸エチルで抽出し抽出液を飽和食塩水で洗浄後、芒硝
で脱水し、濃縮乾固することにより。

白色粉末のマイコプラネシンＤを５６．３■得た。

芙１１１８例　２ マイコプラネシンＤ１００＃Ｉ９’ｉメタノール５　ｍ
ｌに溶解し氷冷下Ｎ１１ＢＨ４５ＴｎＱを加え１時間債
拌する。反応終了稜濃縮して酢酸エチル２０ｍ１を加え
た後、飽和食塩水１０〃＋？にて２回洗浄し、芒硝で脱
水後、濃縮乾固し少蓄−のアセトニルに溶解して室温に
放置しておくと化合物（１１）が針状晶として７２ｍｑ
得られた。

実施例　３ 化合物（ｉｆ）　５０　ｍ９＠　４５規定塩酸−メタノ
ール１ｍ１ｔｌＣ溶解し室温（２５℃）で４時間攪拌す
る。

反応終了後減圧下でａｍ乾固を〈シかえして塩酸を除去
し、＃縮残渣を１０ｍ１の酢酸エチルに・溶解する。酢
酸エチル層をそれぞれ５　＋ｎｌの２％Ｎ　ａ　ＨＣＯ
３水１次いで飽和食塩水で洗浄し、芒硝で脱水後、減圧
下＃縮する。濃縮液を室温放置することにより化合物（
Ｉｌｌ　）が無色の結晶として２５ｍす得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はマイコプラネシンＤの紫外線吸収スーくクトル
、第２図は同物質の赤外線吸収スペクトル、第３図は同
物質の核磁気共鳴スペクトルを示す。 特許出願人　三共株式会社 代理人弁理士　樫　山　庄　治 第１頁の続き ０発　明　者　榎田竜三 東京部品用区広町１丁目２番５８　　　、号三共株式会
社醗酵研究所内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ％式％ （） （式中、Ｒは水床原子、α−ケトブチリルーＮ−メチル
   バリル基又はα−ハイドロキシ−ブチリル−Ｎ−メチル
   ・々リル基を示す。）で示されるマイコプラネシンＤお
   よびその誘導体。 ２　アクチノノラネス属に属するマイコシラネシンＤ生
   童菌を培養して前記式（Ｘ）（式中、Ｒはα−ケトブチ
   リル−Ｎ−メチルバリル基を示す。）で示されるマイコ
   グラネシンＤを単離することよりなるマイコシラネシン
   Ｄの製造法。 ３、　マイコノラネシンＤ生産菌がアクチ、ノプラネス
   ・エスピーＡ　４１０４２　（Ａｃｔｌｎｏｐｌａｎｅ
   ａ　ｌｉｐ、　Ａ４１０４２、微工研菌寄第４５０４号
   ）である特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４、抗生物質マイコグラネシンＤを還元することを特徴
   とする前記式（Ｉ）（式中、Ｒはα−・・イドレキシー
   ブチリル−Ｎ−メチルバリル基を示す。）で示される化
   合物の製造法。 ５、　抗生物質マイコプラネシンＤを還元し、得られた
   化合物を有機溶媒または水−有機溶媒混合液で酸と処理
   することを特徴とする前記式（１）（式中、Ｒは水素原
   子を示す。）で示される化合物の製造法。