JPS58158189A - β−ヒドロキシプロピオン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるβ−ヒドロキシプロピオン酸の製
造法に関する。さらに詳しくは、キャンテイダ属に属し
、アクリル酸またはプロピオン酸をβ−ヒドロキシプロ
ピオン酸に変換する能力を有し、かりβ−ヒドロキシプ
ロピオン酸脱水素酵しうる基質と接触反応させ、生成す
るβ−ヒドロキシプロピオン酸を採収することを特徴と
するβ−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関するも
のである。

β−ヒドロキシプロピオン酸は、２つの異なる官能基を
もつ化合物であるところから医薬・農薬等の合成原料と
して好都合な物質である。微生物によるβ−ヒドロキシ
プロピオン酸の製造法に関して１，３−プロパンジオー
ルを原料にして酢酸菌、あるいはＨａｎｓｅｎｕｌａ　
　属による酸化法（Ｋ、ケルステル等；バイオケミカル
・バイオフィジカル・アクタ　７１巻、３１１頁　１９
６３年、原しＤ等；アグリ力ルチュアル−バイオロジカ
ル・ケミストリー　３２巻、１’Ｌ７５頁　１９６８年
）、あるいはアクリル酸からフサリクムーメリスモイデ
スによりβ−ヒドロキンプロピオン酸に変換できた（原
１目専；ジャーナル・オプ・ファメンテーション・テク
ノロジー　５２巻、３８８頁　１９７４年）という報告
等があるが、いづｈも晶債址、収率共に低く、工業的に
利用するには難点が多いと考えられる。

木発明者等は安価なプロピオン酸等を原１！＋にし、β
−ヒドロキシプロピオン酸の微生物による生産のω［究
を行った結果、プロピオン酸資化能の強いｉ生４ｔｌの
β−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素ｆＩｒｌ性を低
下させｈば、β−ヒドロキシプロピオン酸が、１１収率
で蓄積されることを兄い出した。すなわち、プロピオン
酸資化性微生物を変異させ、β−ヒドロキシプロ″ピオ
ン酸脱水素酊未活性が規株の２分の１以下である変異株
に♂９導し、この変異とを接融反応させることによシｌ
’＋’ｊ収十でβ−ヒドロキシプロピオン酸を生産しう
ろことを見い出した。変顕株を使用する利点としてはβ
−ヒドロキシ−ｙ”ロヒオン酸の生産性の高いことであ
る。

本発明に使用するキャンデイダＬ・ハの酵母の況株とし
では、プロピオン酸資化性菌、例えばキャンテイダｅ　
／Ｌ／ゴ２ザ（Ｃａｎｄトｄａ　ｒｕｇｏｓａ　）　　
Ｉ　ＦＯ０７５０、同ＩＦＯ１５４２、同ＩＦＯ０５９
１、キャンテイダＯバラプシロシス（ＣａｎｄｉｄａＰ
ａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ　）　Ｉ　Ｆ　０　０７０８お
よび天然から分離したキャンテイダ属ＶＣ％するプロピ
オン酸資化性菌もこｈに含まれる。

ｉｊ−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性の低−ド
した菌株をつるために変異を利用する。変異には人工変
異と自然変異とがあシ、いづれも利用しうるが、通常は
変異効率の良い人工変異が利用される。人工変異の方法
としてＸ線照射、紫外線照射、Ｔ線処理およびＮ−メチ
ル−Ｉ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）な
どの変異誘起剤による処理が用いられる。例えば、具体
的な例として本発明者等がβ−ヒドロキシプロピオン酸
脱水素酵素活性の低い株を得るために行なったＮＴＧに
よる変異の方法の一例を示すと次のとおシである。たた
し、目的とする性質の変異株が得らｈｔば良いのであっ
てこの方法に限定されるものではない。

保（ｆ用スラント（キャンデイダ・ルゴーザＩＦ０　０
７５０）よシ１白金耳をグルコース４０ｇ１（ＮＨ４）
２ＨＰＯ４１３ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４７ｇ、、Ｍｇ家）４
・７Ｈ２００，８ｇ、　ＺｎＳＯ４７Ｈ２０６０ｍ＋ｆ
、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０９０ｑ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０
５ｑ、ＭｎＳＯ４・４　Ｈ２０１０’ｆ　％　Ｎ　ａ　
Ｃ／！　　ｏ、　１　ｇ　％　　ピオチンｌｑ１チアミ
ン２〜、水１１！　−、ｐ　Ｈ７，２の組１戊からなる
Ｓ培地３０屑ｔを５００肩を容フラスコに入れ接種し、
３０°Ｃ１２０時間振とう培養した。その培養液１．５
ｍｌを０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、
０．５勢／ｎｔｔＮＴＧ溶液３肩ｌに懸濁し、４°Ｃ１
６０分放置した。その後、ｊｉ′ｉｉじ緩衝液で３回洸
浄し、次の組成からなる固型平板Ｃ培地（グルコース２
０ｇ１イーストエキス５ｇ、肉エキス１０ｇ、ペプトン
ｌｕｇ、寒天２０ｇ１水１１ＸｐＨ７，０）に塗４１し
、コロニーを出ｆｆｌさせた。このコロニー−８培地の
グルコースの代りにプロピオン酸１０ｇ、寒天２０ｇを
加えたｐＨ７，０のＰ培地にレプリカした。このＰ培地
上で生育不良な菌株（プロピオン酸非資化性菌）を選ん
だ。この様な方法で得たプロピオン酸非資化性菌を実施
例ＩＶｃ示す条件で培養反応を行ない、β−ヒドロキシ
プロピオン酸高１農度蓄積株を選んだ。この様にして選
択した変異株は、いづれも親株に比べβ−ヒドロキシプ
ロピオン酸脱水素酵素活性が捨しく低下しておシ、すべ
て本発明に利用できる。上記酵素活性は本発明者の一人
であ−る長谷用がアグリ力ルチャル・バイオロジカル・
グミストリー３ｕ　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　　４５巻
、２８９９頁（１９８１）１”報告しているβ−ヒドロ
キシイソ醋酸脱水素酵素活性測定と同様な条件で基質を
β−ヒドロキシイソ酪酸の代シにβ−ヒドロキシプロピ
オン酸を用いねば実施できる。

本発明を実施するため、上記の方法で得た変異株の例と
してキャンティダ・ルゴーザＫＴ８２０１株がある。こ
の変異株の菌学的性質としては第１表に示す如く親株と
殆んど差は認められないが、プロピオン酸資化性、β−
ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性およびβ−ヒド
ロキシイソ酪酸脱水素酵素活性に著しい差が認められる
。０１Ｌ本発明での変異株の性質でβ−ヒドロキシイソ
醋酸脱水素酵素の活性の低いことは必須条件ではない。

表　　１ 術院微生物工業研究所へ微生物保管釜ｊモ申請書受理番
昭第　１１０号として寄託しであるー。

本発明におけるβ−ヒドロキシプロピオン酸のＬ　例り
ばプロピルアルコール、プロピオンアル□デヒド等の中
から選ばれた基質と炭素源、窒素源、無極塩類および適
当な栄養源を含む培地中で上記の微生物を好気的に培養
する方法、または予め適当な培地で微生物を培養し得た
培養液そのまま、あるいは菌体のみを集め、適当な熱板
塩等を含む液に懸濁したものに、上記プロピオン酸等の
基質を添加し、好気的に接触１反応させ、β−ヒドロキ
シプロピオン酸を１積させる方法等がある。また多量に
β−ヒドロキシプロピオン酸を蓄積させるためには、培
養徒手あるいは菌体との接触反応時に該微生物が利用し
つるエネルギー源を補給する意味から、グルコースまた
はグリセロースまたはエタノールまたは酢酸等の適当な
利用しうる炭酸源を添加するのが好ましい。

本発明に使用する培地はグルコース、グリセリン博の炭
素源、アンモニア、尿素、硫安、ペプトン、カザミノ酸
等の無機、有機の含窒素化合物の生育に必要な無機塩類
、更にビオチン、チアミン等のビタミン類、その池必要
に応じて通常微生物の培養に用いられる種々の栄養源を
適宜配合して用いることができる。

培養は殺菌した培地に菌を接種し、２０〜４５°Ｃの温
度でｐＨを６〜９に保ちツク１〜１０日間、通気攪拌培
養、振とう培養などで好気的に行なう。

培養の初期は菌体の生育が行なわれ、その後β−ヒドロ
キシプロピオン酸の生産が行なわれる。β−ヒドロキシ
プロピオン酸の生産時、更にプロピオン酸等の基質とグ
ルコース等前記のエネルギー源を補給すれば効率よく、
多量にβ−ヒドロキシプロピオン酸を蓄積させることが
できる。また目的によっては上記微生物の静止菌体、あ
るいは各種ポリマー等を用いて固定化した菌体を使用す
ることもできる。

培養物または静止菌体反応液よシβ−ヒドロキシプロピ
オン酸を回収するには、通常のヒト°ロキシカルポン酸
の回収に用いられる手段を用いることができる。例えば
、菌体除去後のβ−ヒドロキシプロピオン酸含有液をａ
縮し、硫酸でｐＨ２とし、エーテル、酢酸エチル等で抽
出し、溶剤を除去すればβ−ヒドロキシプロピオン酸を
得ることができる。

以下実施例によシ本発明を具体的に説明するが、本発明
は実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース４０　ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４１３ｇ、。

ＫＨ２ＰＯ４７ｇ、　ＭｇＳＯ４，・７Ｈ２００，８ｇ
、　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０６０ｑ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ
２０９０１１９、ＣｕＳＯ４”５Ｈ２０５，Ｉｆ、Ｍｎ
ＳＯ４・４Ｈ２０１０１１ｇ、ＮａＣ１０，１ｇ、イー
ストエキス５ｇｓ　プロピオン酸２０ｇ（１１当シ）か
らなる培地をカセイソーダでｐＨ７，２とし、３０ｔｘ
ｔを５００＋ｇ／容フラスコに入れ殺菌後、キャンディ
ダ・ルゴーザＩＦＯ０７５０゜およびその変異株ＫＴ８
２０１株を接種し、３゜’０２８間、振トり培養した。

ｐＨｌｄ　Ｎ　ａＯＨテア、　０に維持した。培養終了
後、生成したβ−ヒドロキシプロピオン酸をガスクロマ
トグラフィー（長谷用等；ジャーナル・オグ・ファーメ
ンテ−ジョン・テクノロジー誌（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　ＦｅｒｍｅｎｔａｎｔｉｏｎＴｅｃｂｎｏｌｏｇＹ　
）　５９巻、２０３頁　１９８１）で定量したところ表
２の如き結果を得た。

表　　２ 変異株を上記条件で多量に培養した培養液１１を集め、
遠心分Ｎ１．によって菌体除去後、上侍を減圧下２００
ｍ／までに濃縮し、硫酸でｐＨ２，５とした。これを酢
酸エチル５００ｍ１！で３回抽出した。

芒硝で脱水後、溶剤を減圧除去し、油状の黄褐色物を２
５ｇ得た。このものをベンゼンで調製したシリカゲルカ
ラム（ワコーゲルＣ−２００，，１４Ｘ　３０　ｃｍ　
）　ＶＣ負荷し、ベンゼン：アセトン（３：ｌ）で〆出
し、β−ヒドロキシプロピオン酸含有画分を集め、溶剤
を減圧下除去した結果、無色油状のβ−ヒドロキシプロ
ピオン酸１４．３ｇを得た。

木物質のＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、元素分析
、−屈折率等を測定したところβ−ヒドロキシプロピオ
ン酸の文献値と一致し、本生成物はβ−ヒドロキシプロ
ピオン酸と同定された。

実施例２ 実施例１に示した培地よりプロピオン酸を除いた培地３
０ｔｘｔを５００ｍ１容フラスコに入れ殺菌後、変異株
ＫＴ８２０１を植菌し、３０°Ｃで２４時間振とう培養
した。この培養液各々にアクリル酸６００＃、プロピル
アルコール６ｏｏｗｇ、プロピオンアルデヒド１５０岬
添加し、支にグルコースを９００ｑ＋添加し、ｐＨをカ
セイソーダで７．０に合わせた。そして３日間培養した
。なおｐＨは毎日７．　ＯＫ合わせ、かクグルコースを
１．２ｇづつ添加した。培養終了後、生成したβ−ヒド
ロキシプロピオン酸をガスクロマトグラフィーで分析し
た結果表３の結果を得た。

表　　　３ 実施例３ 実施例１で用いた培地（但し、プロピオン酸は５０ｇ添
加）に変異株ＫＴ８２０１を接種し、３０°ＣでｐＨを
７．０に維持しながら４日間機ぷり培養した。培養開始
後２８，５４．７６時間目にエネルギー源としてグルコ
ース１ｇ−！たはグリセロール’ｇ’−４たは２８ｊ３
６，５４，６２．７６時間毎にエタノール　０．３．Ｈ
ｌ、まへは酢酸０．３ｍｌを添加した。培養終了後、β
−ヒドロキシプロピオン酸の生成量を測定したところ表
４の結果を得た。

特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士　　浅　野　真　−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）キャンデイダ属に属す微生物で、アクリル酸また
   はプロピオン酸をβ−ヒドロキシプロピオン酸に変換す
   る能力を有し、且つβ−ヒドロキシプロピオン酸脱水素
   酵素活性の低下した変異株をアクリル酸またはプロピオ
   ン酸あるいは該微生物がプロピオン酸またはβ−ヒドロ
   キシプロピオン酸に変換しうる基質と接触反応させ、生
   成するβ−ヒドロキシプロピオン酸を採取することを特
   徴とするβ−ヒドロキシプロピオン酸の製造法。
2. （２）変異株かキャンデイダ・ルゴーザから誘導された
   微生物である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）変異株の有するβ−ヒドロキシプロピオン酸脱水
   素酵素活性が親株に比べ２分のｌ以下であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項記載の製造法
   。
4. （４）該微生物がプロピオン酸またはβ−ヒドロキシプ
   ロピオン酸に変換しうる基質が、プロピルアルコール、
   プロピオンアルデヒド、プロピオンアミド、無水プロピ
   オン酸である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
5. （５）微生物を栄養培地で培養し、得た培養液にプロピ
   オン酸あるいはアクリル酸あるいは該微生物がプロピオ
   ン酸またはβ−ヒドロキシプロピオン酸に変換しうる基
   質を作用させる特許請求の範囲第１項記載の製造法。
6. （６）プロピオン酸、アクリル酸あるいは該微生物がプ
   ロピオン酸またはβ−ヒドロキシプロピオン酸に変換し
   うる基質う１１トチｉφ暢÷化合吻幡添加した培地で培
   養することにより、微生物をプロピオン酸、アクリル酸
   あるいは該微生物がプロピオン酸に変換しうる基質に作
   用させる特許請求の範囲第１項記載の製造法。
7. （７）微生物を栄養培地で培養し、得た培養液から、微
   生物菌体を分離して菌体懸濁液を調製し、それをプロピ
   オン酸、アクリル酸、あるいは該微生物がプロピオン酸
   まだはβ−ヒドロキシプロピオン酸に変換しうる基質に
   作用させる特許請求の範囲第１項記載の製造法。
8. （８）微生物とプロピオン酸またはアクリル酸または該
   微生物がプロピオン酸またはβ−ヒドロキシプロピオン
   酸に変換しうる基質との接触反応時に、該微生物が利用
   しうるエネルギー源を補給する特許請求の範囲第１項記
   載の製造法。
9. （９）微生物が利用しうるエネルギー源が、グルコース
   、クリセロール、エタノール、マタハ酢酸である特許請
   求の範囲第８項記載の製造法。