JPS58154515A - 組織トロンボプラスチン調製物及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、補乳動物組繊から、所定の第璽因子−敏感性
を有する組織トロンポプラステン（ＴＰ）を製造する方
法に関する。

ＴＰとは、Ｄ工１５８９１０による、カルシウムイオン
の存在下に血漿の凝固時間を数倍短縮する哺乳動物組織
からの抽出物である。

トロン？！−１ラスチン社、凝固障害を検出する診断時
に使用される。この際使用されるテストは、クイック−
テスト（Ｑｕｉｃｋ−Ｔｅｓｔ）又はプロトロンぎン時
間テスト（ｐｒｏｔｒｏｎｂｉｎｚｅｔｔｔｅｓｔ、）
と称される。この場合、血管損傷時に現われ、最終的に
血液を凝固し、及び血管傷口を閉塞する現象を考慮して
おυ、この際、組織−ＴＰに、カルシウムの存在で禎検
患者の血液又は血漿を加え、凝血塊を形成するまで混合
する。この場合に、’ｒｐは第■因子を活性化し、この
第■因子は第×及び第Ｖ因子を介して、プロトロンビン
第厘因子からトロンビンを形成する作用をする。

トロンビンはフイブリノーゲンを分解して不溶のフィブ
リ／にし、これが湯口閉覇作用に関与する。トロンボプ
ラスチン＋カルシウムの添加の後に、凝血塊が形成する
までに経過する時間は、関与凝固因子の濃度もしくは活
！に関する尺度である。

従って　クイック−テストは、関与凝固酵素（因子）の
濃度関係に関する総括的な報告を与える。この際、同じ
クイック−値でも、個々の因子層、■、■及びＸの濃度
における壕つ九〈種々異なる関係が存在しうる。個々の
＃固因子の濃度関係のこのような変動は、例えば病理学
的変化（肝硬変、血管内凝血、ビタ（ン欠乏）により、
又は医薬品例えば経ロ抗凝固治療用Ｏクマリン酵導体に
よっても起こされうる。同じＫＭ材料を種々異なる製造
業者によるトロン−プラスチンで試験する際にはじめて
、ちがいが明白になる。このちがいは、個々の凝固因子
に対するその敏感度において一般に着るしく、同じ患者
の試料でも製造者の異なるＴＰを用いるとまったく異な
るクイック値を示すことがあｐうる。

従って、櫨々異なるトロンボプラスチンの比較可能性を
得る努力がなされている。この丸めの１方法は、所定の
因子敏感性に関する標準化である。因子敏感なＴＰを製
造する多くの方法が存在する。第１−１第Ｖ−及び第Ｘ
−因子敏感な製剤の製造は、特別な間＠を生じていない
が、第■因子敏感なトロンボプラスチンの製造時にはな
お困−がある。

トロンメゾラスチンの低い因子敏感性は、その製剤が、
なお痕跡量の凝固因子（？−れは、トロンボプラスチン
抽出に使用される組織の血液含分を介して導入される）
を含有することによると想像される。この仮定に関して
は、特にトロンボシス６へモスタシス［Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉａＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ；８ｔｕｔｔｇａｒｔ、　
１９５９　５９２〜５９９頁（１９７８年）〕に記載の
所見が存在し、これによると、先天的に第■因子を有し
ない犬の脳から、特別な第■因子敏感なトロンボシラス
チンを製造することがで畷る。

既に、特異的に第■因子敏感なトロンボシラスチンの製
法が文献に記載されている。例えは、ｔｉｐイツ特詐出
顧公告＠２５５６４９５号明細によれば、この所望の作
用効果は、組織を直接、苛性アルカリで抽出することに
より達成される。

この際、トロンはシラステンの障害は、おそらく着るし
い。このことは、この方法の便用Ｏ際に多数の助剤が、
得られゐトロンボプラスチンの安定化のために必要であ
ることからも明らかである。

もう１つの方法は、Ｂｉｏｏｈａｍ、　８ｏｏ、　Ｔｒ
ａｎｓ　８．１６６頁（１９８０）に記載されておシ、
即ち硫酸バリウムへの第■因子の吸着法である。しかし
ながら、この場合は、経験によると、トロンボプラスチ
ンは、硫酸バリウムと着るしく、共沈する。

先天的に第■因子欠乏の動物の組織からドロンボブ２ス
デンを単離することは、経費上の理由及び入手性の理由
から、産業上の用途に使用されない。

従って、公知の欠点を有せず、先に記載の要件を満たす
ように実施される、凝固因子■に対して充分なかつ規定
しうる敏感度を有するトｐンざシラスチンの製法を得る
ことが本発明の課題である。

このｖＡ＠は、本発明により、哺乳動物組織からのアセ
トン乾燥粉末を取得し、かつ塩によるこの粉末の抽出に
より凝同因子■に敏感でない組織トロンボプラスチン捩
剤を製造することにより解決され、この方法Ｖよ、カル
シウムイオン１〜２０ｍモル／ｌ’を含有し、場合によ
っては界面活性剤を含有する塩溶液で抽出を実施し、こ
の抽出物を場合によって乾燥させることより成る。

本発明において、カルシウムイオン５〜１５ｍモル／ｌ
を含有する塩溶液を抽出のために使用するのが有利であ
る。この際、カルシウム塩としては、原則的に、充分な
水溶性のカルシウム塩〃；好適である。しかしながら、
水溶性カルメン酸殊にヤ酸又は酢酸のカルシウム塩を使
用するのが有利である。

哺乳動物組織からのアセトン乾燥粉末の取得は、公知方
法で行なう。これは、例えばヒエ−マン−ブラッド・コ
アイユレーション、ヘモスタシス・アンド・トロン〆シ
ス（Ｈｕｍａｎ　Ｂ１００（１０ｏＢ１００（１０ｏａ
、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ；Ｒ，Ｂｉｇｇｓ着、Ｂ１１ＬＱｋＷ＠１１８ｏ１
ｅｎｔｉｆｉａＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏ
ｒｄ　１９７６．６６３貢）に記載されている。このよ
うなアセトン乾燥組織調製物から出発して、トロンメゾ
２ステンＯ本発明による抽出を行なうことができる。し
かしながら、トロンボプラスチンのこの特有Ｏ抽出の紡
に、組織中になお保持されている不所望の汚染物例えば
ヘモグロビンを分離する丸めに役立つ１洗浄工程を前接
続することが有利である。この前接続された洗浄工１ｍ
ヲ使用する場合、これは、約６．５〜約８の一値の緩衝
＊Ｓｔを用いて実施するのが有利である。例えば、この
洗浄は、酢酸ナトリウム緩衝液（−７，０）０．１モル
／ノを用いて、かつトロンメゾラスチン含有組織残分Ｏ
取得は、物理的方法例えば遠心分離によｐ行なうことが
できる。しかしながら、他の洗浄液も同様に好適である
。この種の前接続された洗浄工程は、いずれにせよ、ト
ロンボプラスチンの洗浄による一定の収率四スを生じさ
せる。

カルシウムイオン含有塩溶液を用いるこの特有の抽出は
、純粋なカルシウム塩溶液又は、必要量のカルシウムイ
オン童が添加された他の塩の溶液を用いて行なうことが
できる。例えば、この抽出は、所定量のカルシウムイオ
ンを適当なカルシウム塩の形で添加した生理学的食塩溶
液を用いて行なうことができる。しかしながら、他の濃
度及び他の塩も使用できる。

はぼ中性の塩を使用すれば、抽出溶液中への緩衝物質添
加は必要ではない。しかしながら、使用塩溶液の一億が
約５．５〜９の範囲以外にある場合は、はぼ中性の一一
値を確保する緩衝液を添加するのが有利である。

本発明により使用される抽出溶液中に場合によシ存在す
るもう１種の成分は、界面活性剤である。この界面活性
剤は、収率を高めることができるが、第■因子敏感性を
得る丸めには必要ではない。カチオン活性、アニオン活
性及び非イオン性の界面活性剤が好適である。好適なカ
チオン性界面活性剤の典型的な例祉、セチル−トリメチ
ルアンモニウムプロ建ドであり、アニオン性界面活性剤
の典型的な例は、没食子酸類の化合物及びその堪例えば
コール酸、デソキシコール酸等である。好適な非イオン
性界面活性剤の例は、疎水性のアル中ルーアルコール及
びアラルキル−基を有するポリエチレンオキシドエーテ
ル及び−エステルである。

界面活性剤のそれぞれの好適な量は、簡単な予備試験で
しらべることがで龜る。アニオン性界面活性剤に関する
か「す、生じるカルシウム塩の溶解度限界を越えないよ
うに配慮すべ自である。界面活性剤０．０１〜０．５重
量噂な抽出溶液に添加するのが有利であるが、より少な
い量もより多い量も使用できる。

抽出は常温又は高温で実施することができる。

高い温度で収率を高めることができるが、抽出され九ト
ロンボプラスチンＯ損害をさける丸めに、約４５℃の上
限を越えてはならない。

第■因子欠乏血漿を用いるクイック−テスト′ｆｒ実施
する際に、正常血漿を用いる同じテストの実施の際より
も着るしく長い凝固時間が認められれば、第■因子敏感
性が存在する。ここで、第■因子欠乏血漿とは、先天的
第■因子欠乏の患者から得た血漿である。

本発明の目的とする効果は、例えば、公知方法で取得し
たアセトン乾燥粉末１，１ず酢酸塩緩衝液（ｐｉ−１７
，０）で洗浄し、次いでデソキシコール酸ナトリウムｏ
、ｏ　５　％を含有する０、８５１食塩溶液で抽出する
際に示すことかで軽る。得られたＴ　Ｐ［、クイック−
テストで約１１秒の凝固時間を示し、例えば正常血漿に
比べて高いトロンボシラスチン活性金示す。正常血漿の
代りに第■因子欠乏血漿を使用すると、例えば、１８〜
２０秒の凝固時間が−められる。従って、カルシウム不
含の抽出剤を用いて抽出したトロンボプラスチンは僅か
な纂■因子敏感度を有するにすぎない。

にカルシウムイオン１０ｍモル／ｊを含有する相応する
溶液で抽出すると、遠心分ｍ後のトロンボプラスチン上
置みは、正常面ＩＩｉを用いるクイック−テストで約１
２秒の凝固時間を示すが、第■因子欠乏血漿を用いると
、４０〜６０秒０凝固時間を示す。従って、本発明によ
れば、カルシウム添加せずに抽出する公知方法の使用の
際に比べて、第■因子欠乏状１１に対する着るしく高い
感度が得られる。

この場合、％黴的に、本発明によシ製造されたドロンボ
ッラスチンにおける正常面１１に関する凝固時間は、カ
ルシウムイオン不含で抽出畜れたＩ！ＩＪ製物と比べて
、いくらが長くなる。しかしながら、このことは、第■
因子に対する敏感血漿の凝固時間と正常血漿の凝固時間
との割合として示すと、前記例でカルシウムなしに抽出
したトロンボプラスチンは、約１．６の割合を示し、こ
れに対して、本発明によね得られたトロンボシラスチン
は４．０の値を示す。

改良され九第■因子敏感性を有するトロンボシラスチン
は、１ｒｒＬモル／ｌの下限を下まわる際にも得ること
ができるが、得られる敏感度値は明白に低く、更にチャ
ージ毎に均一ではない。

本発明のもう１つの目的は、トロンがプラステン及びカ
ルシウムを含有する血漿凝固性會調節する試薬であり、
これ社、ここに記載の方法で、カルシウムイオンの存在
で製造した組織トロンボプラスチン調製物を含有するこ
とを特徴とする。このような調製物は、完全に規定され
た第■因子−敏感性を有するのが有利である。

このことは、このｍ製物に、第■因子に対して敏感でな
いトロンボプラスチン調製物を添加することによっても
達成できる。第■因子−敏感なＴＰと第■因子−敏感で
ない’ｒＰとの量を適蟲に選択することによって、各々
の所望の第■因子敏感度に調節することができる。この
ことは、特に、アセトン乾燥組織の本発明による抽出残
分Ｋ、更にカルシウムイオンを添加せずにもう一度抽出
することＫより簡単に達成できる。

この場合、第■因子敏感でないトロンホゾツメチンフラ
クションが得られる。双方のフラタＶヨンを種々異なる
量で混合することによｐ１大きい規模のＴＦ−チャージ
を製造することができ、これは所定のかつ再現可能な第
１因子−敏感性を有する。こうして、標準化及び一定チ
ャージに関する着るしい進歩性が達成される。

本発明方法の特別な１つの利点は、その簡単性及びトロ
ンざプラスチンを阻害する条件がないことである。

次に実施例につき本発＠をＩＢ！明する。

例　　１ ａ）ウサギの脳からのアセトン−乾燥粉末１０１にスー
パーセル（８ｕｐ＠ｒａｓｌ）　１０１を添加し、０．
１モルの酢酸ナトリウムー緩衝液（ｐＪ（７，０）　４
００ｔＪと共１１Ｃ５７℃で水浴中釦装置する。引続き
、１５分間２５００１で遠心分離する。沈殿を−ソ中シ
コール酸ナトリウム０．０５９１を含有する０、８５１
虐化ナトリウム溶液４００１１ｊ中に懸濁させ、３０℃
で水浴中で３０分間攪拌する。次に２５００５１で１０
分間遠心分離する。上澄みには第胃因子に敏感でないト
ロンボプラスチンか含有されている。沈殿を捨てる。

ｂ）トロンざプラスチンの抽出は、例１＆におけると同
じ条件下であるが、イ酸Ｏａ７．５ｍモル／Ｉを添加し
て行なった。第■因子−敏感なトロンがプラスチンが得
られる。

例　　２ 例１ａ及びｂで製造したトロンがシラスチン抽出物を用
いて、クイック−テストを実施する。

この反応にとってカルシウムが必要であるか秋カルシウ
ムイオンの不存在で得られた例１ａからのトロンボプラ
スチン抽出物に、後からイ酸カルシウムを７．５票モル
／ｊまで添加すべ亀である。正常な血漿として、健康な
供血者１０人より得九クエン酸塩−血漿を用い、１１Ｍ
５８９１０に記載のように、クイック−テストに関する
関連曲線を得るために使用する。第■因子欠乏血漿とし
て、市販のＤムＤ１社の先天的な第■因子欠乏血漿を使
用する。

血漿各０．１ｄ当り、３７℃に予熱したトロｙメゾラス
ヂン懸濁液各０．２１１Ｊｔ添加し、凝固開始までの時
間をシュニットが−及びグ９−ス（ｌｉｏｈｎｉｔｔｇ
＠ｒ　ａｎｄ　Ｇｒｏａ）の凝固メータ（ｘｏａｇｕｌ
ｏｍ＊ｔａｒ　；　Ｐａ、ムｍｅｌｙｕｎｇ　％　シ＊
ｍｇＯ、ＢＩＤ製）を用いて測定する。例１＆で抽出し
九テストートロンボプラスチンー懸濁液は、正常血漿で
は１０．０秒後に、第■因子欠乏血漿では１６．１秒後
に凝固すること（割合１．６）が判明した。

例１ｂでカルシウム添加下に抽出したトーンボブラスチ
ン−懸濁液は、正常血漿でａ１２ｊ秒の１第■因子欠乏
血晴では４５秒の凝固時間を示し九（割合、３．７）。

例　　３ 例１＆及び１ｂで製造したトロンボプラスチン抽出物を
、カルシウム不含抽出物のカルシウム含分７．５　ｇモ
ル／Ｉｔでの補充ｔ）＠ＶＣ，種々の割合で混合し、正
常血漿及び第■因子欠乏血漿に対する凝固時間を例２に
記載の方法で測定する。結果を第１１＆に示す。この表
は、本発明により、規定された第■因子敏感度を有する
混合物が製造できることを示している。

第　　１　　表 例　　４ 試薬の製造のために、例１ａ及び１ｂによるトロンメゾ
２ステンー懸濁液を、第■因子欠乏血漿と正常血漿に関
する凝固時間の割合が３．１になるよう表蓋で混合する
。次いで、グリシン２重量−並びにメルチオレー）　０
．０１重量−を添加し、得られる溶液を凍結乾燥させる
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　ｌｌｉ乳動物組織から、アセトン乾燥粉末を取
   得し、かつ塩溶液でこの粉末を抽出することにより、凝
   固因子である第■因子に対して敏感な組織トロン肘プラ
   スチン調製物を製造するために、Ｏａ−イオｙ　１〜２
   ０　ｍモル／Ｉｔ含有し、界面活性剤を含有するか又は
   含有しない塩溶液を用いて抽出し、この抽出物を場合に
   よって乾燥させることを特徴とする、組織トロンメデラ
   スチ／ｄ４製物の製法。 ２、　カルシウムイオン５〜１５ｍモル／ｌを含有する
   塩溶液を特徴する特許請求の範囲第１項記載の方法。 五　水溶性カルボン酸のカルシウム塩を特徴する特許請
   求の範囲第１項又は＠２項に記載の方法。 ４、　アセトン乾燥粉末を、抽出の前にｐＨ６，５〜８
   の緩衝液で洗浄する、特許請求の範囲第１項〜第６項の
   いずれかＩＪＪに記載の方法。 ５、界面活性剤０．０１〜Ｏ，Ｓ　Ｓを抽出液に添加す
   る、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記
   載の方法。 ６、＠乳ｖＪｖＩｊ組織からのアセトン乾燥粉末を、Ｏ
   ａ−イオン１〜２０ＷＬモル／Ｉｋ含有し、界面活性剤
   を含有するか又は含有しない塩溶液を用いて抽出し、こ
   の抽出物を場合によって乾燥させることによって得九組
   畿トロンボプラスチン及びカルシウム塩を含有すること
   を特徴とする、血液凝固性ｔａ節する試薬。 ７．１！に、第■因子に対して敏感でないトロンボプラ
   スチンＩｌ＃Ｉ４物を、予め定められた第■因子−敏感
   性を与えるような量で含有する、特許請求の範囲第６項
   記載の試薬。