JPH11515016A

JPH11515016A - 溶融法によるペプチド含有生分解性ミクロスフェアの製造

Info

Publication number: JPH11515016A
Application number: JP9516850A
Authority: JP
Inventors: チャー，ヤンシク; チョイ，ヤング・クウェオン; パイ，チョール・ミン
Original assignee: マクロメド・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 1999-12-21
Also published as: WO1997015389A1; EP0857081B1; KR19990067014A; ATE257407T1; US5665428A; DE69631290D1; EP0857081A4; AU7479796A; EP0857081A1; CA2235602A1; KR100422391B1

Abstract

(57)【要約】ペプチド／タンパク質生分解性薬物送達デバイスを、溶媒を用いることなくポリマー溶融法によってミクロスフェアとして製造する。熱安定性ポリペプチド及び適当な低融点ブロックコポリマー混合物の溶融物を製造し、そしていずれの有機溶媒も用いることなく、空気、水又は不混和性有機流動体などの適当な流動媒体中に分散させて微小滴を形成する。その流動媒体を冷却して微小滴を凝固させてミクロスフェアにした後、集め、そして精製するか又は薬物送達デバイスとして更に加工する。これら生分解性ミクロスフェアは、インプラント用又は注射用の医薬製剤として適している。固体ミクロスフェアとして温血動物の体内に投与後、該製剤は身体から水を吸収してヒドロゲルを形成し、そこから該ポリマーを長期間にわたって継続して放出する。

Description

【発明の詳細な説明】溶融法によるペプチド含有生分解性ミクロスフェアの製造本発明は、ペプチド又はタンパク質薬物を含有する生分解性ミクロスフェア及びそれらの製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は、ペプチド又はタンパク質薬物を含有する生分解性ミクロスフェア及びそれらを製造するための溶融法に関する。本発明は、以下で詳細に記載される比較的低い融解温度の熱可塑性生分解性ヒドロゲルの使用によって可能になる。それは、ペプチド及びタンパク質が低水性又は非水性環境において優れた固体状態安定性を示すという発見、そして更に、ある種の熱可塑性ポリマー系内に埋封された固体タンパク質が、水性溶液中の他の同一の条件下でのそれらの挙動と比較した場合に優れた安定性を示すという発見に基づく。本発明は、更に、この目的のために特別に設計された適当な低融解温度生分解性ポリマーを用いることによっていずれの有機溶媒も用いることなく生分解性ミクロスフェアを製造する方法に関する。発明の背景及び先行技術の要旨多数の合成及び天然ポリマーは、インプラント、マイクロカプセル、及びミクロスフェア及び／又はナノスフェア（nanospheres）などの制御された薬物送達システム（ＤＤＳ）のマトリックスとして利用可能であることが知られている。これらポリマーのいくつかは、非生分解性の、例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳＴ）、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリエチレン−無水マレイン酸コポリマー及びポリアミドである。非生分解性ポリマーの場合、これらポリマーのいずれかを利用した薬物保有ポリマー性インプラント又はペレットは、放出期間の終りに除去される必要がある。除去の必要性及びそれに関係した問題をなくすために、生分解性又は生物腐食性（bi oerodible）ポリマーを基剤とする制御薬物放出ポリマー性デバイスを開発するのが望ましいことが判った。生分解性ポリマーの使用は、薬物排出後にそのデバイスを投与部位から除去することを不要にする。生分解性ポリマーは、制御された様式で予め決められた期間にわたって in vivo で分解するように設計されうる。このような徐放性製剤で用いるのに適当な生分解性ポリマーは、他にも充分に記載されており、ポリ（ｄ,ｌ−ラクチド）、ポリ（ｄ,ｌ−ラクチド−co−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）及びポリ（アミノ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ酸無水物及びポリアルキルシアノアクリレートが含まれる。これらポリマーは、水性の生理学的環境におかれた場合、酵素的又は非酵素的加水分解によって徐々に分解される。ポリマーの in vivo 分解の主なメカニズムは加水分解であり、この場合、酵素もまたある役割を果たしうる。加水分解に影響を与える重要な因子には、透水性、化学構造、分子量、形態、ガラス転移温度、添加剤、及びｐＨ、イオン強度、インプラント部位などの他の環境因子が含まれる。薬物を生分解性ポリマーマトリックス中に取り込む様々なマイクロカプセル封入技術は、当該技術分野において教示されている。これらの典型的なものは、（ａ）乳化及びそれに続く有機溶媒蒸発による相分離（Ｏ／Ｗエマルジョン、Ｗ／Ｏエマルジョン及びＷ／Ｏ／Ｗエマルジョンなどの複合エマルジョン法を含む）；（ｂ）コアセルベーション相分離；（ｃ）溶融分散；（ｄ）界面堆積；（ｅ）in situ 重合；（ｆ）噴霧乾燥及び噴霧凝固；（ｇ）エアーサスペンジョンコーティング；及び（ｈ）パンコーティングである。米国特許第4,652,441号で例示されたように、Ｗ／Ｏ/Ｗ（水／油／水）ダブルエマルジョン水中乾燥法は、ペプチド及びタンパク質などの水溶性親水性薬物のマイクロカプセル封入に一般的に用いられる方法である。しかしながら、この手順は、ミクロスフェアの製造及びそれらの使用において様々な技術的問題を与える。例えば、薬物及び用いられるポリマー、例えば、ポリ乳酸ポリマーの他に、ゼラチンなどの第三成分が存在すべきであるという必要条件がある。サブミクロンのオーダーのミクロスフェアを得ることは困難であり、そして三層（Ｗ／Ｏ／Ｗ）構造に起因して薬物のカプセル中への取り込み率は低い。更に、ミクロスフェアの薄いポリ乳酸壁に対する損傷又は壁の破壊によってもたらされる破裂作用で開始するミクロスフェアからの薬物の不安定な放出がある。米国特許第5,100,669号は、生理活性物質を含有するポリ乳酸型ミクロスフェア及びそれらを製造する方法を記載している。それは、活性物質がその活性を損なうことなくミクロスフェア中に均一に取り込まれることができ且つ活性物質を１週間を越える長期の間に徐々に放出できるという点で好都合である。この特許では、親水性生理活性物質及び疎水性ポリ乳酸が分子の大きさで均一に混合されているミクロスフェアの製造が示されている。オリゴマーポリラクチド並びにペプチド及びタンパク質を含めた種々の薬物のためにアセトニトリル−水混合液又は氷酢酸などの補助溶剤を用いることにより、活性物質は活性を損なうことなくミクロスフェア中に均一に取り込まれ且つ有意な初期破壊を伴うことなく徐放性が達成されうる。しかしながら、ミクロスフェアを得るためには、有機溶媒の使用を必要とする。米国特許第4,526,938号は、ポリペプチド薬物の継続的放出のための担体として、５,０００の最小重量平均分子量を有する両親媒性で非架橋の分岐又はグラフトブロックコポリマーの使用を開示している。ポリラクチドなどの疎水性ブロック成分は生分解性であり、そしてポリエチレングリコールなどの親水性ブロック成分は、生分解性であってよいし又はそうでなくてよい。このようなコポリマー組成物は、水性の生理学的タイプの環境におかれた場合、水を吸収してヒドロゲルを形成することができる。有機溶媒の使用は必要とされるが、それはポリペプチドを変性しうる。米国特許第4,745,160号は、１,０００の最小重量平均分子量を有し且つ水中に自己分散できる同様のタイプのコポリマーを開示している。このようなコポリマーは、ポリペプチド薬物製剤の徐放性にも有用である。この特許における剤形は、コポリマーとペプチド薬物との混合物の分散液を凍結乾燥して粉末を得ることによって得られる。次に、その粉末を加熱及び加圧して、圧縮成形によって剤形を製造する。 Hutchinson（ＷＯ93/24150号）は、少なくとも１の塩基性基を含有するペプチドから誘導された陽イオン及びカルボキシ末端ポリエステルから誘導された陰イオンから成る塩を教示している。そのポリエステルは、ヒドロキシ酸から誘導されたもの、又はジオール及び／又はポリオールとジカルボン酸及び／又はポリカルボン酸との重縮合生成物から選択される。典型的には、このポリマーは、ポリマー鎖につき１の末端カルボン酸基を有するｄ,ｌ−ラクチド／グリコリドコポリマーである。このような塩の製造方法及び長期放出医薬組成物としてのそれらの使用方法もまた開示される。典型的には、ペプチド及びカルボン酸ポリマーを氷酢酸中で混合し、そして凍結乾燥させる。次に、凍結乾燥生成物をジクロロメタンに対して加え、そして溶液流延して薄膜を得る。次に、Hutchinsonは、押出並びに圧縮及び射出成形などのポリマー溶融加工技術でのその薄膜の使用を記載しており、この場合、インプラントの製造において高温（好ましくは、１００℃ 未満）を用いてポリエステル−薬物塩を溶融する。このような固体剤形は、微粉砕又は錬磨によって微粒状形態まで小さくすることができる。Hutchinsonは、ポリマーの疎水性／親水性成分及び薬物不相溶性並びに分散又は凍結乾燥技術で種々の溶媒を用いるミクロスフェアの形成に関係した他の問題について優れた考察を包含し、したがって、参照により本明細書中に組み入れられるものとする。欧州特許出願第025870 A2号は、一方のブロックがポリ（アルキレンオキシド）であり且つ他方のブロックがグリコール酸エステル／トリメチレンカーボネートであるＡＢＡ又はＡＢブロックコポリマーから製造された薬物送達システム（ＤＤＳ）を記載している。それは、実験室規模押出機において６０〜１１５℃でのポリマー及び生物活性物質の同時押出を記載している。活性物質の比率は、１〜５０％ｗ／ｗであるように選択されるが、好ましくは、２５〜５０％ｗ／ｗである。直径１.５ｍｍ繊維を長く切断することができるし若しくは２０メッシュスクリーンを介して極低温粉砕して、射出されうる粒子を与えることができるし、又はその繊維を直接的にインプラントすることができる。米国特許第4,438,253号は、ポリグリコール酸とポリオキシエチレンなどのヒドロキシル末端ポリ（アルキレングリコール）とのエステル交換に続いて、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートを付加して重合度を更に増加させることによって得られたマルチブロックコポリマーを記載している。それら物質は、外科用製品及び加水分解可能なモノフィラメント繊維を製造するのに用いられた。ポリラクチドポリマーからのポリペプチドの放出は、しばしば、有意の誘導期間の後に起こり、その期間中はポリペプチドが放出されないし、又は多相であって、デバイスの表面からの初期破裂放出、ポリペプチドがほとんど若しくは全く放出されない第二期、及びポリペプチドの残りの大部分が放出される第三期を含む。この問題を解決し又は少なくとも最小限にし、そして放出プロフィールを改善するために様々な試みがなされてきた。一つの方法は、乳酸とグリコール酸とを共重合させて、ポリ（ラクチド−グリコリド）コポリマーを形成することである。もう一つは、ポリラクチドポリマー中に封入されたペプチドと、他のポリマー又はコポリマー中に封入された同様のペプチドとを混合することである。これらの方法は両方とも、製造及び投与の際に制御することが難しく、そして所望のペプチド放出速度を達成することに完全に成功していない。放出速度の問題を解決する一つの試みは、米国特許第5,330,768号で示されている。この特許は、ポリラクチドなどの生分解性疎水性ポリマーと、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）の界面活性剤ブロックコポリマーなどの非イオン性親水性コポリマーとを物理的に配合することによって製造された分解性ポリマーマトリックスを開示している。タンパク質又はペプチド薬物は、機械的混合によって又は溶媒若しくは溶融流延によってポリマーブレンド中に取り込まれる。伝えられるところによれば、水性溶液中においてこれらポリマーブレンドはポリマー骨格内にゲル様構造を形成し、これが、純粋なポリラクチドポリマーと比較して長期のタンパク質放出及び最小限の初期タンパク質放出を与える。しかしながら、ポリマーブレンドがミクロスフェアとして製造される場合、ダブルエマルジョンを用いる改良溶媒蒸発技術が用いられ、これは、周囲大気中に蒸発するに違いない塩化メチレンなどの溶媒の使用を必要とする。ミクロスフェアとしてのコポリ（ｌ−乳酸−ｂ−オキシエチレン−ｂ−ｌ−乳酸）（ＬＰＬＡ−ＰＥＯ−ＬＰＬＡ）及びコポリ（ｌ−乳酸−co-グリコール酸 −ｂ−オキシエチレン−ｂ−ｌ−乳酸−co−グリコール酸）（ＬＰＬＧ−ＰＥＯ −ＬＰＬＧ）から成るＡＢＡトリブロックコポリマーからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のin vitro 放出は、Youxin ら，J．Controlled Release 32（1994） 121-128によって研究された。しかしながら、そのミクロスフェアは、塩化メチレンなどの有機溶媒を用いるトリプルエマルジョン技術によって製造された。タンパク質の継続的放出は、このようなＡＢＡトリブロックコポリマーの組成を調整することによって得ることができる。疎水性ポリエステル中への親水性ＰＥＯブロックの導入は、有効な水分吸収を促すはずであり、そして更に、ペプチド及びタンパク質などの水溶性薬物に対して特に、非経口送達システムの浸透性を増加させるはずである。分子量減衰も質量減少も、このようなＡＢＡブロックコポリマーにおいては、ミクロ相隔離システム中への水の急速な浸透によって加速される。ＰＥＯ含量及びポリエステル比率に応じて、分解速度を調整できる。ＡＢＡブロックコポリマーのマトリックスからのポリペプチドの放出は、膨潤したマトリックス中での薬物の拡散によって、更には、マトリックスの分解によって制御される。インプラント可能なポリマー性薬物送達システムは、かなり前から知られている。R.L.Dunnら'，米国特許第4,938,763号及び同第5,278,202号で開示されたものなどのＡＢＡ型コポリマー製剤の独特の側面は、製剤化された場合に、それらが、２２／２３ゲージ針を用いて注射可能な液体コンシステンシーを維持するという事実である。いったん水性液と接触すると、コポリマー網状構造はその液を吸収し且つゲルマトリックスの中に固定される。トリブロックコポリマー組成物全体を、何日間、何週間又は何か月間の範囲の分解時間を有するように操作することができる。用いられるポリマーブロック、すなわち、ポリマー種類、分子量、相対比率等に応じて、適当なポリマーブロック成分を選択することによって分解速度を調整することができる。これらブロックコポリマーは、概して、無毒性であり且つ身体によって充分に許容され、そしてそのシステムは容易に製剤化される。薬物を含有した乳酸及び／又はグリコール酸とエチレンオキシドとのコポリマーは、容易に注射することができ、外科的手順の使用が避けられるので、それらは、生分解性インプラントへの新しいアプローチを与える。ゲルマトリックスは、インプラントと同様、注射直後に細胞外液の水性環境との接触で形成され、そして薬物の放出は、この形成されたマトリックスを介して徐々に起こる。乳酸及び／又はグリコール酸及びポリエチレンオキシドのものなどのコポリマーの in vivo分解速度は、コポリマーの構成モノマーの種々のモル比及び分子量を用いることによって制御することができる。それらの生体適合性及び生分解性もまた充分に確かめられている。いったん形成されたゲルマトリックスは、制御された方式で薬物を放出した後、容易に代謝され且つ排出される生成物へと分解される。このアプローチは、薬物送達デバイスインプラントの利点を取り入れると同時に、インプラントを投与前に入れるための又は放出完了後にそれを除去するための外科手術の必要性をなくす。しかしながら、これらコポリマーの製造における主な欠点は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド、乳酸エチル、トリアセチン及びクエン酸トリエチルなどの望ましくなく且つ時々毒性の有機溶媒の使用である。これら溶媒は、それらがポリマー成分を溶解できるし且つ水と混和性でもあるので用いられている。主としてＤＮＡ組換え技術の開発のために、ペプチド及びタンパク質薬物はますます大規模に利用可能になっている。しかしながら、タンパク質薬物の比較的短い生物学的半減期及び胃腸管中のタンパク質分解酵素によるそれらの急速な分解ゆえに、薬物有効性を最適にするためには、概して、繰返し毎日の注射が必要とされる。多数の新規ＤＤＳデバイスの中で、注射用薬物含有ポリマー性ミクロスフェア系は、ペプチド及びタンパク質の安全で且つ制御された非経口投与のための手段を提供できる。しかしながら、これら比較的高い分子量のペプチド及びタンパク質薬物の製剤及び送達は、伝統的なより小さい分子量薬物と比較した場合、それらの比較的不安定な性状のためにいくつか問題を提示し得る。ポリペプチドを医薬品としてうまく用いるためには、それらの製剤及び送達に関して安定性の問題を理解することが必須である。ポリペプチドは、それらの医薬品としての有効性の衰え又は損失をもたらすことがある種々の細胞内及び細胞間化学反応を受ける。これらには、酸化、脱アミノ化、β−脱離、ジスルフィドスクランブリング、加水分解、イソペプチド結合形成、及び凝集が含まれる。化学安定性に加えて、ポリペプチドはまた、有効な治療薬であるためにそれらの三次元構造を保持する必要がある。この本来のコンホメーションの損失は、生物学的活性の損失をもたらすのみならず、共有結合又は非共有結合凝集などの更に有害な過程に対する増加した感受性をもたらす。更に、大形のタンパク質は、低下した溶解性及び増加した免疫原性などの非経口送達に関する他の問題をもたらす。H．R．Co stantinoら，J．Pharm．Sci.，83，(1994)1662-1669“Solid-phase aggregation of proteins under pharmaceutically relevant conditions”。固体タンパク質の凝集の一因となる種々の分子経路を知ることにより、安定化への合理的なアプローチを開発することができる。最初のアプローチは、関与するメカニズムに特異的に的をしぼることである。第二のアプローチは、タンパク質中の水分活性の水準を最適水準で維持することである。これは、タンパク質を最適水和水準で貯蔵することによって、又は徐放性デバイスの場合、より低い水分活性を確保する微小環境を選択することによって達成されうる。微小環境のｐＨもまた制御することができる。固体タンパク質製剤を安定化させる第三のアプローチは、凍結乾燥されたタンパク質の物理的安定性を増加させることである。これは、疎水的相互作用によって、並びに、タンパク質の折畳みが開くにつれて増加しうる共有結合経路によって凝集を阻止するであろう。機能的生分解性ヒドロゲルミクロスフェア系を提供することは、タンパク質安定性の観点から極めて望ましい。上記のように、タンパク質の構造、機能及び安定性における水の重要な役割は周知である。典型的に、タンパク質は、大部分の水が除去された固体状態で比較的安定である。しかしながら、固体治療用タンパク質製剤は、高湿度での貯蔵時に又は徐放性デバイスからの送達中に水和することがありうる。タンパク質の安定性は、水和の増加に伴って降下する。水もまた、様々な理由で、すなわち、（ａ）水が、反応性基の増加した接近容易性をもたらすタンパク質柔軟性を増加させる；（ｂ）水が反応体の移動相である；及び（ｃ）水自体、β−脱離又は加水分解などのいくつかの有害な過程における反応体であるために、固体タンパク質凝集において有意の役割を果たすことができる。６％〜２８％の水を含有するタンパク質が最も不安定である。この水準未満では、結合水の移動度及びタンパク質内部運動は低い。この水準より上では、水移動度及びタンパク質運動は、完全な水和物のものに近づく。ある点までは、水和の増加に伴う固相凝集に対する増加した感受性が、いくつかのシステムで見られた。しかしながら、より高い水分では、希釈効果のためにあまり凝集が見られない。更に、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン及びカルボキシメチルセルロースなどの種々の官能性を有するポリマーでのタンパク質の希釈は、タンパク質の安定性を有意に増加させ且つ固相凝集を減少させる。固体状態凝集に対してタンパク質を安定化させる一つの一般的な方法は、固体製剤中の水分を調節し且つ固体タンパク質中の水分活性を最適水準で維持することである。この水準は、タンパク質の性状に依存するが、概して、「単分子層」水被覆面積より下に維持されたタンパク質は、優れた固体状態安定性を示すであろう。しかしながら、固体タンパク質が徐放性のために意図されるポリマーマトリックス中に懸濁している場合、水分活性の制御は常に簡単とは限らない。現行の食品医薬品庁要件によれば、容認しうるタンパク質薬物含有医薬品は、２年後に１０％未満の低下しか示してはならない。Cleland，J．L．及び Langer，R.， In formulation and delivery of proteins and peptides,ACS books，1994。しかしながら、上の説明から明らかであるように、マイクロカプセル封入タンパク質含有ＤＤＳデバイスを提供するための既知の手段は、いくつか積極的な特徴を与えるが、二次加工手順が複雑であり、しかも通常、マイクロカプセル封入工程中に有機溶媒を必要とする点で不都合である。更に、これら手順は、ペプチド及びタンパク質薬物の安定性に悪影響を及ぼすことがある。例えば、米国特許第4,745,160号で示されたように、ポリ乳酸コポリマーを用いてミクロスフェアを二次加工する場合、ジオキサンと水の混合物を用いる。ポリ乳酸及び／又はポリペプチドは混合物中に完全に溶解しないので、分散液が形成される。ジオキサン及び水の代わりに、氷酢酸を溶媒として用いることもできる。どちらの場合も、その分散液を凍結乾燥させて粉末を得る。次に、その粉末を、そのフィルム、シート、シリンダー又は微粉砕生成物として製造するために加熱及び加圧することができる。上記から、先行技術が、有機溶媒及び／又は圧縮成形技術を用いることなく生分解性ポリマーミクロスフェアを製剤することを教示していないのは明らかである。前記のように、多数のマイクロカプセル封入工程は、有機溶媒の使用を必要とする。特に、マイクロカプセル封入工程中に塩素化された溶媒（例えば、塩化メチレン、クロロホルム）を用いる場合、残留溶媒の毒性について若干心配がある。構造的及び薬理学的変性、並びに生物学的活性の損失は、通常、大分子量ポリペプチドが有機溶媒と接触する場合に見られる。発明の目的及び要旨本発明の目的は、マイクロカプセル封入工程中に有機溶媒の使用を必要としない工程を用いた生分解性コポリマー薬物含有ミクロスフェアを含むＤＤＳを提供することである。更に、本発明の目的は、ポリペプチドに対してかなり一般的に適用できるが、約５０℃の高温において固体状態で比較的安定であるポリペプチドに最も有用であるＤＤＳ生分解性コポリマーのペプチド薬物含有ミクロスフェアを提供することである。もう一つの本発明の目的は、１００℃未満の温度でミクロスフェアに加工することができ、したがって、熱感受性又は溶媒感受性ペプチド及びタンパク質薬物を取り込むミクロスフェアの二次加工に適しているコポリマーを提供することである。明らかになるであろうこれら及び他の目的は、ポリペプチド及び適当な生分解性ブロックコポリマー混合物の溶融物を製造して、概して均一な薬物コポリマー混合物を形成し、いかなる有機溶媒も用いることなく、その混合物を、空気、水又は油などの適当な流動媒体中に分散させて微小滴を形成した後、その流動媒体を冷却して微小滴を凝固させてミクロスフェアにし、そしてその中に均一に分散したポリペプチドを含有するそれらミクロスフェアを集めることを含む方法によって達成されうる。得られた生分解性ミクロスフェアは、インプラント又は注射可能な医薬製剤として適している。固体ミクロスフェアとして投与後、それら製剤は身体から水を吸収してヒドロゲルを形成し、そこからポリペプチドが長期間にわたって継続して放出され、同時に又は引続きコポリマーの生分解を伴う。一般的に言えば、ミクロスフェア中に担持される薬物は、約０.１〜１０重量％であり、約１〜５％の範囲が好ましいであろう。しかしながら、薬物とコポリマーとの組合せが機能的であるならば、厳密な数値制限は臨界的でない。したがって、何等かの与えられた薬物とコポリマーの組合せで、より高い薬物担持量が達成されうるならば、それは本発明の範囲内と考えられるべきである。したがって、「有効量」という用語は、溶融混合物を形成するためにコポリマー上に担持され又はそれと混合された薬物の量に関して用いられる場合、そのコポリマーが含有することができ、かつなおも許容しうるミクロスフェアを形成しうる量を意味する。ポリペプチド及び／又はタンパク質薬物のポリマー性マトリックス中への取り込み温度は、その薬物の寿命又は活性に対して極めて重要である。凍結乾燥状態のポリペプチド又はタンパク質がたとえ天然のコンホメーションであるとしても、その温度がタンパク質の融解温度（Ｔｍ）を越えるならば、なお折畳みの解除が起こりうる。固体タンパク質では、Ｔｍは水分の増加に伴って有意に低下する。言い換えれば、ペプチド／タンパク質薬物は、好ましくは、乾燥状態で及びその融点又は融点範囲未満の温度で取り扱われるべきである。本発明で記載したＡＢＡブロックコポリマーに基づく溶融ブレンド法は、これらの目標にかなう。３７℃を越えるガラス転移温度を有する、親水性ポリエチレングリコール（Ｂブロック）及び生分解性非晶質疎水性ポリマー（Ａブロック）のブロックコポリマーは、そのポリエチレングリコールＢブロックが疎水性Ａブロックを可塑化して、比較的低温で、時には周囲温度でも容易に加工されうる物質を生じるので、特に有用であることが判明した。引続きの放置で、ポリエチレングリコールブロックは結晶化して、包装、配送及び投与の目的で容易に取扱いできる強靭な硬質製品を与える。代わりに、両端ブロックが親水性であり且つ中央Ａブロックが生分解性非晶質疎水性ポリマーであるＢＡＢブロックコポリマーを用いることもできる。更に、分岐化及びグラフト化ＡＢＡ又はＢＡＢブロックコポリマーを用いることができる。発明の詳細な説明本明細書中で用いられる次の用語は、指定された意味を有するものである。「生分解性」は、薬物が全て放出された後に、ブロックポリマーが身体内で無毒性成分に破壊する又は分解することができることを意味する。「薬物」は、生物活性を有し且つ治療目的に適応される又は用いられるあらゆる有機化合物又は物質を意味するものである。「ペプチド」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド又はタンパク質薬物に関する場合、互換的に用いられるものであり、そして特に断らない限り、何等かの特定の分子量、ペプチド配列若しくは長さ、生物活性の分野又は治療的使用に関して制限されるものではない。「ポリ（α−ヒドロキシ酸）」は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）ポリマー自体、又は対応するラクチド、グリコリド若しくはラクトンなどのα−ヒドロキシ酸前駆体の開環重合から誘導されたポリ（α−ヒドロキシ酸）ポリマー若しくはコポリマーを意味するものである。本発明によれば、薬理学的に有用なポリペプチド及び薬学的に許容しうるＡＢＡ又はＢＡＢ型非架橋非晶質ブロックコポリマーを含む生分解性ミクロスフェアが、有機溶媒を用いることなく製造される。加工温度は、溶媒を用いる必要性を事実上なくする低融点ブロックコポリマーを用いることによって低下させることができる。したがって、残留溶媒について心配する必要はない。より良い薬物放出プロフィールは、圧縮成形／粉砕法技術によって製造された微粒子と比較して、このようなミクロスフェアから得られる。生分解性低融解温度ポリマー物質本発明で用いられるブロックコポリマーは、物理的手段によって架橋した生分解性ヒドロゲルである熱可塑性生分解性ヒドロゲルを形成する。好ましくは、これらは、疎水性生分解性Ａブロックセグメント間に含有された親水性Ｂブロックセグメントから構成されたＡＢＡ型低融点生分解性ブロックコポリマーである。親水性又はＢブロックは、好ましくは、約１,０００〜２０,０００の平均分子量を有するであろうが、好ましくは、約１,０００〜５,０００である。コポリマーの全分子量は、その一体性を室温で維持し、しかもなお低融点を有するために、約２,０００〜約５０,０００であるべきである。親水性Ｂブロックセグメントは、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。生分解性疎水性又はＡブロックセグメントは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）及びポリエチレンカーボネートから成る群より選択されるメンバーである。このようなポリ（α−ヒドロキシ酸）ポリマーブロックの平均分子量は約５００〜１０,０００であり、そして更に好ましくは、約５００〜３,０００である。酵素的に分解性のポリエチレンカーボネートポリマーブロックの平均分子量は約２００〜１０,０００であり、そして更に好ましくは、約２００〜３,０００である。このポリ（α−ヒドロキシ）ポリマーブロックは、好ましくは、ポリ（ｄ,ｌ −ラクチド）、ポリ（ｌ−ラクチド）、ポリ（ｄ,ｌ−ラクチド−co−グリコリド）、ポリ（ｌ−ラクチド−co−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−co−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−co−グリコール酸−co−乳酸）、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸及びそれらの二元ポリマー又は三元ポリマーから成る群より誘導されるか又は選択されるメンバーである。これらコポリマーは、生分解性で且つ生体適合性である。ポリエチレングリコール、ポリラクチド及びラクチド／グリコリドコポリマーは、食品医薬品庁によって医療使用のために認可されている。これらのような熱可塑性生分解性ヒドロゲルは、いわゆる房状ミセル型のミクロドメイン構造を有すると考えられ、すなわち、硬質セグメントのクラスターは、軟質セグメントの連続相中に分散してミクロドメインを形成していると考えられる。これらポリマーは、分子の両親媒性ゆえに、房状ミセル様構造特性を有する。このように形成された多相は、化学架橋がなくても高い物理的強度を示す。ブロックを逆にしてＢＡＢブロックコポリマーを形成することも可能である。ＢＡＢブロックコポリマーは、ＡＢＡブロックと若干似ているが、それらブロックが逆であること、すなわち、ＢＡＢ型ブロックコポリマーが、中央すなわちＡブロックを疎水性生分解性ポリマーから構成し且つ両端のＢブロックをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーとなるように合成される点で異なる。ポリ（α−ヒドロキシ酸）Ａブロックの分解経路は周知であり、そしてそれらの代謝産物は無毒性であることが知られている。ＰＥＧの親水性Ｂブロックは水溶性ポリマーであり、これは、無毒性であり且つ身体から容易に排出されることが知られている。したがって、徐放性送達剤形は、これらＢＡＢトリブロックコポリマーの使用によって製造することができ、この場合、薬物及びポリマーを一緒に溶融して溶融混合物を形成した後、それを本明細書中で記載のようにミクロスフェアに加工する。これらコポリマーは、好ましくは、約６０〜９０重量％の疎水性Ａブロックセグメント及び約１０〜４０重量％の親水性Ｂブロックセグメントを含有するであろう。更に、ＡＢＡか又はＢＡＢの薬物担持ポリマーの放出プロフィールは、更に調整することができる。例えば、追加のカルボキシル官能基は、疎水性ブロックセグメント中に取り込まれるので、このような酸性基は、ペプチド／タンパク質薬物の塩基性基と相互作用できる。例えば、カルボキシル基の取り込みは、リンゴ酸又はその誘導体を疎水性ブロック中のコモノマーとして用いることによって達成できる。したがって、より延長された徐放性は、特定の薬物−ポリマー相互作用ゆえに達成されうる。ペプチド／タンパク質薬物封入加工中に用いられる温度は、比較的低い、すなわち、約４０〜１００℃、そして最も好ましくは、約４０〜６５℃の範囲内である。したがって、本発明は、ポリペプチドに対してかなり一般的に適用しうるが、上記範囲内の温度において固体状態で比較的安定であるポリペプチドに最も有用である。多数の不安定なペプチド及びタンパク質薬物は、それらが加工中に主として乾燥（すなわち、非水性）環境中で保持されるならば、本明細書で記載の溶融封入方法を施すことができる。次のものに特に制限されるわけではないが、薬学的に有用なポリペプチドは、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ルリベリン又は黄体化ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、及びそれらの合成類似体、修飾体及び薬理学的活性フラグメント、単クローン性抗体並びに可溶性ワクチンから成る群より選択することができる。用いることができるペプチド又はタンパク質薬物に対する唯一の制限は、機能のあるものであることである。いくつかの場合、タンパク質の機能又は物理的安定性は、ペプチド又はタンパク質薬物の水性溶液に対する種々の添加剤によっても増加することができる。ポリオール（糖類を含む）、アミノ酸、コラーゲン及びゼラチンなどのタンパク質、及びある種の塩類などの添加剤を用いることができる。一定の添加剤、特に、糖類及び他のポリオールは、凍結乾燥されたタンパク質に対して有意の物理的安定性を与えることが明らかである。これら添加剤は、凍結乾燥中のみならず乾燥状態での貯蔵中にも、タンパク質を凝集から保護するのに用いることができる。例えば、スクロース及び Ficoll 70（スクロース単位を含むポリマー）は、様々な条件下での固相インキュベーション中のペプチド又はタンパク質凝集に対して有意の保護を示す。これら添加剤はまた、ポリマーマトリックス中に埋封された固体タンパク質の安定性を増加させることができる。徐放性製剤中へのスクロースの取り込みは、高温の湿潤大気中での固体状態凝集に対してタンパク質を安定化させる。ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質は、不安定なタンパク質の変性及び凝集を減少させる安定剤又は増量剤として役立つ。これら添加剤は、本発明の本溶融方法中に容易に取り込まれ得る。例えば、ポリペプチド微粒子は、上記の添加剤を含有する薬物溶液を単純に凍結乾燥するか又は噴霧乾燥することによって製造することができる。持続された薬物放出は、長期間にわたって得ることができる。その放出は、マンニトール、塩化ナトリウム等を取り込むように製剤を変更することによって更に改良することができる。タンパク質工学の開発は、ペプチド又はタンパク質の固有の安定性もまた増加させる可能性を与えることができる。このような結果として得られる工学処理又は修飾されたタンパク質は、規制の点で新規な存在物とみなされ得るが、そのことは、本発明で用いるためのそれらの適性を変化させない。修飾の典型的な例の一つは、ポリペプチドのＰＥＧ化である。ポリペプチド薬物の安定性は、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーをそのポリペプチドと共有結合させることによって有意に改良することができる。もう一つの例は、末端及び内部の付加及び欠失又は置換（例えば、システイン残基の欠失又はアラニン若しくはセリンでの置換）による１個又はそれ以上の残基の同一性又は位置に関するアミノ酸配列の修飾である。安定性におけるいずれの改良も、治療的に有効なポリペプチド又はタンパク質が、患者に対するその医薬組成物の１回の投与後に、長期間にわたって継続して放出するのを可能にする。ＡＢＡコポリマーの製造ポリ（ｌ−ラクチド）ホモポリマー（ＰＬＡ）は、約１５０〜１６０℃の融点を有する結晶性ポリマーである。他方、ＰＬＣホモポリマーは、６３℃の融点を有する半結晶性ポリマーである。したがって、融点が低い方のＰＣＬは、概して、ペプチド及びタンパク質を封入するためのＡＢＡコポリマーをより低温で製造するのにより適する「Ａ」ブロックポリマーであろう。ＰＬＡを「Ａ」ブロックポリマーとして用いるためには、更に低分子量の、好ましくは、２０００〜１５ ,０００の分子量範囲内のＰＥＧ−ＰＬＡコポリマーである非晶質ポリ（ジ−ｌ −ラクチド）の使用が必要とされる。本発明において、室温で一体性を維持し、しかもなお低融点を有するコポリマーを得るために、親水性中間「Ｂ」ブロックの分子量は、約１０００〜２０,０００の範囲に調整されるべきであり、そしてコポリマーの全分子量も、約２,０００〜５０,０００の範囲内であるように調整されるべきである。ミクロスフェアになるように適切に形成するために、加工温度での溶融コポリマーブレンドの粘度は、約１〜８０ポアズの範囲内、好ましくは、約５０ポアズ以下であるべきである。しかしながら、唯一の制限は、機能を有するものであることである。薬物／コポリマー溶融物の粘度が、本発明の態様のいずれかにしたがって形成された場合に適当な寸法のミクロスフェアの形成を可能にするならば、特定の数値の粘度読み又は範囲は制限としてみなされるべきではない。これらブロックコポリマーは、下記で例示された重合条件下（１３０℃，１０時間）において高収率（すなわち、＞９５％）で合成することができる。表１は、本発明においてミクロスフェアを製造するのに用いられる一定のブロックコポリマーの組成及びいくつかの物理的パラメーターを示すものである。ブロックコポリマーの組成及び分子量は、¹Ｈ−ＮＭＲ（Bruker 300 MHz）を用いて測定された。融点及び熱的挙動は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ７（Perkin Elmer））によって測定された。製造されたミクロスフェアの形態は、走査電子顕微鏡（Stereoscan 360(Cambridge Instruments，U.K.)）を用いることによって調べられた。コポリマーの溶融粘度は、レオメーター（Dynamic Spectrometer （Rheometrics,Inc.））を用いることによって測定された。これらポリマーの溶融粘度がどのようなものであるか分かるであろうか。実施例１ＰＥＧ−ＰＣＬブロックコポリマーの合成方法（ａ）表１のＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬブロックコポリマーを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下におけるε−カプロラクトン（ＰＣＬ）の開環重合によって製造した。分子量１０００のＰＥＧを、真空下において１２０℃で３時間撹拌し且つ加熱し、そして０.１重量％オクタン酸第一スズを触媒として加えた。オクタン酸第一スズをトルエン中で希釈し、そしてそのトルエンを真空下で除去した。規定量のε−カプロラクトンを加え、そしてその混合物を窒素雰囲気下において１３０℃で溶融重合した。その混合物を１３０℃で１０時間維持した後、冷却し、そしてクロロホルム中に溶解させた。そのクロロホルム溶液を、激しく撹拌されたメタノール又はジエチルエーテルに対して加え、そして沈殿を濾去し、真空オーブン中において室温で３時間、続いて４０℃で一晩中乾燥させた。得られた乾燥沈殿は、微粉、すなわち、約１００μｍの粒子の形であった。方法（ｂ）別の方法として、分子量１０００のＰＥＧを、最初に、ベンゼン中での共沸蒸留によって乾燥させた。ＰＥＧを回収した後、方法（ａ）の手順を行った。この場合、方法（ａ）の場合と同様の条件下においてより高いコポリマー転化率が得られた。実施例２ＰＥＧ−ＰＬＡブロックコポリマーの合成ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡブロックコポリマーを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下におけるラクチドの開環重合によって製造した。分子量１０００のＰＥＧを、真空下において１２０℃で３時間撹拌し且つ加熱し、そして０.１重量％オクタン酸第一スズを触媒として加えた。オクタン酸第一スズをトルエン中で希釈し、そしてそのトルエンを真空下で除去した。規定の分子量を有するラクチドの規定量を加えて末端ブロックを形成し、そしてその混合物を窒素雰囲気下において１３０℃で溶融重合した。その混合物を１３０℃で１０時間維持した後、冷却し、そしてクロロホルム中に溶解させた。そのクロロホルム溶液を、激しく撹拌されたメタノール又はジエチルエーテルに対して加え、そして沈殿を濾去し、真空オーブン中において室温で３時間、続いて４０℃で一晩中乾燥させた。分子量がそれぞれ１０００及び３０００のＰＬＡ末端ブロック及び１０００の中央ＰＥＧブロックを含む２種類のコポリマー、ＥＬ−３Ｌ−７−１（ＰＬＡ− ＰＥＧ−ＰＬＡ，１０００：１０００：１０００）及びＥＬ−３Ｌ−７−３（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ，３０００：３０００：３０００）が形成されたが、これらを本明細書中で更に論評する。実施例３表１のブロックコポリマーＥＣ−３Ｌ−３−１及びＥＣ−３Ｌ−３−２、及び実施例２のＥＣ−３Ｌ−７−１の溶融粘度、分子量及び融解温度間の関係を測定した。粘度は、分子量の減少又は温度の上昇に伴って減少することが判った。同様の分子量及び組成では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡブロックコポリマーが、対応するＰＣＬ−ＰＥＧ−ＰＣＬブロックコポリマーよりも高い粘度を有する。これら知見は、噴霧凝固法によるミクロスフェア製造条件の最適化に有益である。溶融法の概説：ポリペプチド又はタンパク質薬物を、適当な賦形剤又は安定剤を含む又は含まない水性溶液の凍結乾燥に続くジェット微粉砕によって又は噴霧乾燥によって、極めて微細な微粒子として製造する。ペプチド又はタンパク質薬物の低水分の安定な粉末形を提供する当該技術方法のいずれの適当な状態を用いてもよい。次に、タンパク質薬物をブロックコポリマー中に、そのブロックコポリマーの融点を越える温度で充分に混合する。薬物粉末は、ブロックコポリマー溶融物中に懸濁させることができるし又は薬物粉末及びブロックコポリマーの粒子を最初に混合した後、一緒に溶融させることができる。どちらの場合も、薬物及びコポリマーの実質的に流動性の溶融均一混合物が形成されて、溶融混合物の微小滴を形成しうる適当な低粘度を有する。この混合工程中に取り込まれるかもしれない気泡は、好ましくは真空によって除去される。溶融薬物−ポリマー混合物がいったん形成されたら、それを様々な方法で流動媒体中に分散させることができる。流動媒体が空気などの気体状態である場合、微小滴は様々な分散手段を用いることで気体環境中に分散することができる。これらの典型的なものは、空気圧噴霧ノズル、遠心押出ヘッド及び回転円板であり、これらはそれぞれ商業的に入手可能であり、そして次の説明及び実施例で更に充分に説明され且つ例示される。実施例４溶融噴霧によるミクロスフェアの製造：原型溶融噴霧器を用いて、水又は有機溶媒を用いることなくミクロスフェアを製造した。用いられた溶融噴霧器は、本質的に、押出機及び空気噴霧器の組合せであった。この原型において、入口を介して供給された溶融物質は、電動機で駆動するプランジャー（５ｍｍ直径ロッド）を用いて熱噴霧ノズル室へと直接的に押し出された。溶融薬物及びポリマー混合物が空気圧噴霧ノズル中に押し出されるにつれて、加圧され予熱された空気は、その溶融物を空気又は他の気体環境中に分散させ、そこで溶融微小滴が凝固する。実施例５遠心押出ヘッドを用いるミクロスフェアの製造：薬物−ブロックコポリマー溶融物は、シェル及び充填物質を高速で回転しているノズルから外部へ発射することによってマイクロカプセル封入に用いられたものであるところの、遠心押出ヘッド（Southwest Research Institute）を用いることによって、空気又は他の気体周囲環境中に分散させて微小滴に作られ得る。押出ヘッドの高速回転のために、粘稠なポリマー溶融物は遠心力によってノズルを介して押出され、そして小滴は空気中に分散する。実施例６回転円板を用いるミクロスフェアの製造：薬物−ブロックコポリマー溶融物は、回転円板を用いることによっても空気中に分散させることができる。ポリマー溶融物の薄層を、極めて高速で、例えば、３,０００〜１５,０００ｒｐｍで回転している円板の熱表面上で形成し、そして小さい小滴になるように破壊し且つ分散させる。薬物−ポリマー溶融物の凝固を防止するために、その回転円板は電気的に又は局部熱風若しくは赤外線（ＩＲ）照射によって加熱されるべきである。遠心押出ヘッド又は回転円板態様によって製造されたミクロスフェアの粒度は、空気圧噴霧法によって製造されたミクロスフェアの粒度よりも若干大きいかもしれない。しかしながら、これらの方法は、連続的で容易にスケールアップされるという点で同様であり、そして得られたミクロスフェアも、ペプチド及びタンパク質薬物の注射及びインプラントのみならず、経口供給などの若干の他の用途にも用いることができる。上の態様の全てにおいて、ポリマー溶融物の粘度は約２０〜８０ポアズの範囲内であったが、分散した小滴は、空気又は別の気体環境中で冷却されてミクロスフェアに硬化する。溶融ミクロスフェアから充分な熱を除去するために充分な接触時間を与えて、それらが互いに又は収集装置表面に衝突する前に凝固させる。次に、薬物−ポリマーミクロスフェアを、サイクロン又は収集コーンなどの気体環境から固体粒子を回収するための慣用的な技法を用いて集める。所望ならば、固体薬物−ポリマーミクロスフェアを、篩分け、重力分離、音波処理又は他の適当な手段によって寸法分けすることができ、そして更に、電子ビーム若しくはγ線照射によって滅菌することができる。必要ならば、その処理全体をクローズドシステム内又はクリーンルーム内で行うことができる。空気又は別の気体環境中に分散した溶融薬物−ポリマーの微小滴に代わるものとして、その分散流動体は、溶融した薬物−ポリマー混合物が可溶性でない液体でありうる。その液体は親水性か又は疎水性であることができ、そして形成された薬物含有ポリマー性ミクロスフェアは、液体連続相中の分散相になる。溶融薬物−ポリマー混合物を、そのポリマーの融点を越える温度で維持された液体に対して加える。連続相は、薬物及びポリマー双方にとって非溶媒である液体であるので、溶融薬物及びポリマー相は、音波処理又は機械的撹拌などの適当な手段によって温液中に微小滴として分散する。次に、その温液の温度をポリマーの融点未満に下げて、薬物含有ポリマー性微粒子を凝固させた後、それらを遠心分離、デカンテーション、濾過又は他の適当な手段によって集め、そして更に加工するか又は精製する。例えば、分離された粒子を、ヘキサン、ジエチルエーテル等のような適当な溶剤で洗浄して、残留する連続液相を全て除去した後、乾燥させ、そして粒度によって更に分離することができる。実施例７水中溶融分散によるミクロスフェアの製造：この態様では、溶融薬物含有ブロックコポリマーを、そのポリマーの融解温度を越えて加熱されている熱蒸留水の連続相中に音波処理によって分散させる。ミクロスフェアは、水相を適当な手段によって、例えば、氷水を用いてポリマーの融点未満に冷却することによって形成される。次に、凝固した粒子を遠心分離によって、例えば、１５,０００ｒｐｍで３０分間分離した後、凍結乾燥することができる。実施例８２％ＰＶＡ水性溶液中の溶融分散によるミクロスフェアの製造：実施例７の場合と同様の手順を、分散媒として蒸留水の代わりに２％水性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液を用いることによって行う。ミクロスフェアの形状及び形態は、水性媒体中にＰＶＡを加えることによってかなり改良される。実施例９オリーブ油中の溶融分散によるミクロスフェアの製造：熱オリーブ油を連続相として用いることを除き、本質的には、実施例７の場合と同様の手順を行う。コポリマーを、そのポリマーの融点を越えて加熱された熱オリーブ油中に音波処理によって分散させた。その分散液を氷水で冷却し、そして形成されたミクロスフェアを遠心分離によって集め、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。ジエチルエーテルを用いる洗浄工程は、ミクロスフェアの油中懸濁液を更に処理することなく直接的に注射、インプラント又は経口投与に用いる場合、省略することができる。このような場合、注射用に適した綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマシ油、ダイズ油又は水素化植物油などの滅菌油を用いることもでき、そしてその処理は、クリーンルーム又は他の滅菌環境内で行うことができる。このような場合、連続油相中のミクロスフェア濃度は、概して、約１０〜５０％ｗ／ｖの範囲内であろう。これは、ミクロスフェアを所望の濃度で形成することによってか又は好ましい注射用濃度に達するように必要に応じて油を加える若しくは除去することによって得ることができる。表２は、蒸留水、ＰＶＡ水性溶液（２ｗ／ｖ％）及びオリーブ油を媒体として用いる溶融分散法によるミクロスフェアの製造条件を示す。 ¹ “−” は、極めて不十分なミクロスフェア形成、大形凝集体を意味する² “＋” は、若干の凝集を伴う適正なミクロスフェア形成を意味する。³ “＋＋” は、不規則な形状のミクロスフェア、凝集なしを意味する。⁴ “＋＋＋”は、形成された充分な球状の分離したミクロスフェアを意味する。コポリマーのＰＥＧブロック含量が３３％である場合（ＥＣ−３Ｌ−３−２）、許容しうるミクロスフェアは形成されなかった。しかしながら、コポリマーのＰＥＧブロック含量が１４％である場合（ＥＣ−３Ｌ−４−１）、平滑表面の球状ミクロスフェアが形成された。粒度は、ＳＥＭにより、極めて狭い粒径分布で１０〜２０μｍであると測定された。オリーブ油を液状媒体として用いた場合、３３％のＰＥＧブロック含量でも充分な球状ミクロスフェアが形成された。ミクロスフェア形成の相違は、高ＰＥＧ含量を有するブロックコポリマーが、ＰＥＧ残基の親水性のために水中で充分に相分離しないという点で説明できる。もう一方で、高ＰＥＧ含量は、オリーブ油などの疎水性液体中では何の問題も引き起こさない。少量のＰＶＡを水性媒体中に加えた場合、ミクロスフェア形成は劇的に改良された。その理由は確実には分からないが、おそらくは、ＰＶＡの存在下における増加した粘度及び凝集の防止によって６５℃で形成されたエマルジョンの向上した安定性のためであった。上の実施例は、主として、ブロックコポリマーミクロスフェア自体の製造に関してきた。次の実施例は、特定のタンパク質又はペプチド薬物がブロックコポリマーと一緒に溶融法で組み合わされた前の実施例で示された技術を用いる。実施例１０ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、エアジェット微粉砕機を用いることによって粉砕して微細な微粒子にし、そしてミニサイクロン装置を用いて集める。１００ｐｓｉｇの圧力での脱湿圧縮空気を、微粉砕機作業のエアジェット源として用いる。ミニサイクロン装置に連結された容器内に集められた微粒子を供給口へと再循環させ、そしてＢＳＡの粒度が５μｍ未満になるまで微粉砕作業を続ける。実施例１で記載の粉末ブロックコポリマー（ＥＣ−３Ｌ−３−２，ＰＣＬ：ＰＥＧ：ＰＣＬ＝１０００：１０００：１０００）１０グラムを、これらＢＳＡ微粒子１グラムと一緒に混合し、そしてその混合物を実施例４で記載の溶融噴霧器中に供給する。ＢＳＡブロックコポリマーの均一混合物は、約９重量％のＢＳＡを含有して形成される。６０℃で予熱された圧縮空気（１００ｐｓｉｇ）を用いて、溶融噴霧器中での冷却による有意の粘度増加を防止する。溶融ＢＳＡ−ブロックコポリマーの小さな微小滴を空気中に分散させ且つ凝固させる。約２０μｍの平均粒度を有する凝固した小滴を、重力によってステンレス鋼プレート上に集める。実施例１１実施例１０からのＢＳＡ微粒子の試料１グラムを、実施例１のブロックコポリマー（ＥＬ−３Ｌ−３−２）粉末１０グラムと混合する。ＢＳＡタンパク質及びコポリマー粒子の混合物を、実施例４で記載の溶融噴霧器の押出機部分中に供給する。この実施例では圧縮空気を用いない。噴霧ノズルのチップを、床面から５フィート上の３ｃｍの直径を有し且つ５０００ｒｐｍで回転する円板の直上に配置する。回転円板及び押出機の部分を赤外線（ＩＲ）ランプで照明して、約６５ ℃のその部分で熱を維持し、そしてＢＳＡブロックコポリマー溶融物がノズルから出るようにその粘度増加を防止する。約８０ポアズの粘度を有する薬物ポリマー溶融物を、回転円板の表面上への流れとしてノズルヘッドから分散させる。高回転速度は、溶融物を円板表面から微小滴として周囲空間中に飛ばし、そこで、そのＢＳＡポリマー小滴は、収集用のステンレス鋼プレート上の床へと重力によって落ちながら冷却される。円板の回転速度は、薬物ポリマー溶融物の粘度及び形成される微小滴の寸法にしたがって調整することができる。より高い粘度では、同様の小滴寸法を維持するのにより高い回転速度を必要とするであろう。同様の粘度を維持しながら回転速度を増加させることは、より小さい微粒子の形成を引き起こすであろう。実施例１２この実施例は、水中溶融分散による亜鉛インスリンミクロスフェアの製造を例示する。微結晶性亜鉛インスリン（PENTEX組換えヒトインスリン亜鉛塩）及び実施例１で得られたブロックコポリマー（ＥＬ−３Ｌ−４−１，ＰＣＬ−ＰＥＧ− ＰＣＬ＝３,０００：１,０００：３,０００）粒子１０ミリグラムずつを、約５０℃で一緒にブレンドして、インスリン薬物のブロックコポリマー中均一混合物を形成する。得られた不透明素材を、６５℃まで予熱された蒸留水に対して加え且つ５.３のｐＨ（インスリンの等電点）に調整し、そしてT．K．Homomixer Mar k IIを用いて１０,０００ｒｐｍの速度で激しく均一化して、インスリンポリマー粒子の連続水相中分散液を形成する。均一化の直後に、その媒体を氷浴に移し、そして穏やかな撹拌を用いて冷却して粒子を凝固させる。凝固したミクロスフェアを、５,０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって分離した後、凍結乾燥する。実施例１３この実施例は、２％ＰＶＡ溶液中の溶融分散による亜鉛インスリンミクロスフェアの製造を例示する。微結晶性亜鉛インスリン及び実施例１２で用いられるブロックコポリマー粒子１０ミリグラムずつを、約５０℃で一緒にブレンドして、インスリン薬物のブロックコポリマー中均一混合物を形成する。得られた不透明素材を、６５℃まで予熱された２％水性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ８８モル％加水分解，分子量７,０００）溶液に対して加え且つ５.３のｐＨ（インスリンの等電点）に調整して、処理中のインスリンタンパク質の浸出を更に減少させ、そしてBranson Sonifier 250 を用いる音波処理によって激しく撹拌して、インスリンポリマー粒子の連続ＰＶＡ水性相中分散液を形成する。音波処理の直後に、その媒体を氷浴に移し、そして穏やかな撹拌を用いて冷却して粒子を凝固させる。凝固したミクロスフェアを、５,０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって分離し、蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥する。ミクロスフェア製造中の水溶性タンパク質薬物の実施例１２で示されるような水中での又は実施例１３で示されるような２％ＰＶＡ中での浸出は、欠点を与える可能性がありうる。しかしながら、水不溶性又は十分に水溶性でない塩の形のタンパク質を用いることにより、浸出を減少させる又はなくすることができ、そして薬物添加量を有意に増加させることができる。例えば、タンパク質塩形は、Ｚｎ⁺²、ＣＯ⁺³、Ｎｉ⁺²、Ｃｕ⁺²、Ｆｅ⁺²、⁺³等のような希土類金属又は脂肪酸、リン脂質等のような疎水性化合物を用いて製造することができる。実施例１４ヒトカルシトニン（分子量３，５００）１００ミリグラムを、１（ｗ／ｖ）％ゼラチン溶液１００ｍｌ中に溶解させ、そして０.２２μｍメンブランフィルターを介して滅菌濾過する。その溶液を、１２０℃の入口温度及び８０℃の出口温度を有する Buchi 小形噴霧乾燥機を用いることによって噴霧乾燥する。乾燥機のノズル本体を循環水で冷却して、カルシトニンタンパク質の変性を防止する。微粒子（１〜１０μｍの粒度範囲）を、噴霧乾燥された粒子が高温又は変性温度に長時間曝されるのを防止するために水ジャケットが付された乾燥機のサイクロン部分で集める。実施例１５実施例１４で得られたヒトカルシトニンの微細な微粒子１００ミリグラムを、実施例１のブロックコポリマー（ＥＬ−３Ｌ−３−２）粉末０.９グラムと一緒に約５０℃でブレンドして、カルシトニンタンパク質及びブロックコポリマーの均一ブレンドを得る。ブレンドされた素材を、約６０℃まで予熱された植物油連続相中に加える。カルシトニン及びコポリマーブレンドを、加熱された植物油によって溶融させた後、それを、Branson Sonifier 250 を用いる音波処理によって激しく撹拌して、カルシトニンコポリマーの熱油中微小分散を含む乳状懸濁液を形成する。その懸濁液が入っている容器を氷浴に移し、そこでその懸濁液をプロペラ撹拌機で穏やかに撹拌する。冷却すると、微小分散した小滴が凝固してカルシトニンコポリマーミクロスフェアになる。そのミクロスフェアを、３０００ｒｐｍでの遠心分離によって集め、ヘキサンで洗浄し、そして自然乾燥する。得られたミクロスフェアは、約０.９％ｗのカルシトニンを含有する。実施例１６実施例１５の手順を、懸濁媒又は連続相媒体として水素化植物油（Miglyol）を用いて繰返す。Miglyol を使用前に滅菌し、そして操作全体をクリーンルーム内で行う。音波処理及び冷却後、凝固したカルシトニンミクロスフェアを５,０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって集めた後、新鮮な滅菌水素化植物油（ Miglyol）中に再懸濁させる。懸濁液中のミクロスフェア濃度は、約２０％ｗ／ｖである。カルシトニン１.８ｍｇを含有する懸濁液の１ｍｌアリコートをバイアル中に密封し、それを油性注射剤として用いるために貯蔵することができる。実施例１７実施例１０及び１１の手順を、ジェット微粉砕された微粒子の代わりに噴霧乾燥されたＢＳＡ微粒子を用いて繰返し、そして同様の結果が得られる。剤形は当業者が容易に決定することができるが、ペプチド又はタンパク質薬物の生物活性、その分子量、溶解性、安定性を含めた多数の因子及び変数に依るであろう。したがって、全てのペプチド又はタンパク質薬物に対して適用しうる用量又は剤形に関して一般的に述べられることはないであろう。より多くのものの中で適切なのは、形成される微粒子の寸法である。注射用に油又は水中で形成された場合、その粒度は、概して、約１〜１００μｍであり、そして経口使用のためにカプセル剤又は圧縮錠剤で形成された場合、その寸法は幾分大きく、例えば、約１００〜１０００μｍであってよい。概して、噴霧乾燥、溶剤抽出沈殿、溶媒蒸発及び加圧粉砕法の先行技術方法によって製造された疎水性生分解性ポリマーのミクロスフェアからのタンパク質放出プロフィールは、ポリマーマトリックスの重量が減損する前に、すなわち、ポリマーの分解の前に大部分のタンパク質が放出されることを示している。しかしながら、本発明においてミクロスフェアＤＤＳに用いられたＡＢＡ又はＢＡＢブロックコポリマ−システムを用いる場合、より一定の徐放性を期待することができる。親水性ＰＥＧＢブロックの減少は水分を減少させ、そしてタンパク質の放出速度を低下させる。対照的に、疎水性Ａブロックの分解及びマトリックスの機械的性質の破壊は、タンパク質の放出速度を増加させる。したがって、ポリエステルＡブロックのより急速な分解は、ＰＥＧＢブロックの減少によって生じたタンパク質の放出速度の低下を補うことができるという平衡力が存在する。高分子量タンパク質でさえも、水又は生理学的水性環境中でのポリマーの膨潤のために、ブロックコポリマーマトリックスから拡散することができる。放出速度は、ブロックコポリマーのコモノマーブロックの組成、分子量及び相対比率を変更することによって制御することができるし又は最適化することができる。薬物に関しては、天然のタンパク質構造の損失は、疎水的相互作用又は反応性基の増加した暴露によって凝集を引き起こすことがある。ポリマーマトリックスに応じて、タンパク質は、デポシステムが組織部位中にインプラントされた後に又は経口摂取後に、ポリマーマトリックス内で有意の水和を受けるであろう。マトリックスを変更することによってＤＤＳ内のタンパク質の微小環境を制御することは可能である。in vitro でのポリマー本体中の水分は、結晶性ポリ（ｌ− ラクチド）ホモポリマーについては１％程度に低く、そして非晶質ポリ（グリコール酸−co−乳酸）（モル比５０：５０）では最大６０％まででありうる。マトリックス物質の選択は、デポ内の水分活性の制御のみならず、疎水性及びｐＨなどの凝集に影響を与える他の重要な因子も与えるであろう。ポリマー系内に埋封された固体タンパク質は、溶液中の他の同一条件下におけるそれらの挙動と比較して優れた安定性を示す。したがって、安定性を向上させるために天然タンパク質構造物を固体状態で維持することは概して望ましい。この安定性は、ポリマーの疎水性を増加させてデバイス内の水分を制限することによって又はデバイスの厚みを減少させることによって更に向上させることができ、それによって、より急速な溶解及び、したがってより短い水和時間が可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パイ，チョール・ミン大韓民国テジョン 305−333，ユスン− グ，アオーン−ドン，ハンビット・アパートメント 101−1701

Claims

【特許請求の範囲】１．生分解性低融点ブロックコポリマーと水溶性で耐熱性のペプチド/タンパク質薬物との混合物のミクロスフェアを製造する方法であって、（ａ）有効量のペプチド／タンパク質薬物微粒子と生分解性ブロックコポリマーとの溶融混合物を該ブロックコポリマーの融解温度を越える温度で製造し；（ｂ）該溶融混合物を連続流動媒体中に、該流動媒体中で該溶融混合物の微小滴を形成するような方式で分散させ；（ｃ）該微小滴の温度を該ブロックコポリマーの融点より低い冷却環境中で低下させて、固体ミクロスフェアを形成し；そして（ｄ）該ミクロスフェアを該連続流動媒体から分離することを含む方法。２．前記ブロックコポリマーが、約１００℃未満の融点及び約２,０００〜５０,０００の分子量を有する、請求項１に記載の方法。３．前記ブロックコポリマーが、ＡＢＡ及びＢＡＢブロックコポリマーから成る群より選択されるメンバーであり、ここにおいて、該Ａブロックセグメントが疎水性の生分解性ポリマーであり且つ該Ｂブロックセグメントが親水性ポリマーである、請求項２に記載の方法。４．前記ブロックコポリマーが、約６０〜９０重量％の疎水性Ａブロックセグメント及び約１０〜４０重量％の親水性Ｂブロックセグメントを含有する、請求項３に記載の方法。５．親水性Ｂブロックセグメントが、約１,０００〜２０,０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項４に記載の方法。６．疎水性Ａブロックセグメントが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）及びポリ（エチレンカーボネート）から成る群より選択されるメンバーである、請求項５に記載の方法。７．疎水性の生分解性Ａブロックが、約５００〜１０,０００の分子量を有するポリ（α−ヒドロキシ酸）である、請求項６に記載の方法。８．前記ポリ（α−ヒドロキシ酸）が、ポリ（ｄ,ｌ−ラクチド）、ポリ（ｌ−ラクチド）、ポリ（ｄ,ｌ−ラクチド−co−グリコリド）、ポリ（ｌ−ラクチド−co−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−co−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−co−グリコール酸−co−乳酸）、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸及びそれらの二元ポリマー又は三元ポリマーから成る群より誘導されるか又は選択されるメンバーである、請求項７に記載の方法。９．疎水性Ａブロックセグメントが、約２００〜１０,０００の分子量を有するポリエチレンカーボネートである、請求項６に記載の方法。１０．前記ブロックコポリマーが、末端の疎水性生分解性Ａブロックセグメント及び内側の親水性Ｂブロックセグメントから成るＡＢＡブロックコポリマーである、請求項６に記載の方法。１１．前記ペプチド／タンパク質薬物が、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮増殖因子、プロラクチン、ルリベリン又は黄体化ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、及びそれらの合成類似体、修飾体及び薬理学的活性フラグメント、単クローン性抗体並びに可溶性ワクチンから成る群より選択されるメンバーである、請求項６に記載の方法。１２．前記連続流動媒体が気体であり、そして前記溶融混合物を、ブロックコポリマーの融点を越える温度に維持された部材によって吐出する、請求項６に記載の方法。１３．前記部材が、空気圧噴霧ノズル、遠心押出ヘッド及び回転円板から成る群より選択される部材である、請求項１２に記載の方法。１４．前記連続流動媒体が空気である、請求項１３に記載の方法。１５．前記溶融混合物を空気圧噴霧ノズルによって吐出する、請求項１３に記載の方法。１６．前記溶融混合物を遠心押出ヘッドによって吐出する、請求項１３に記載の方法。１７．前記溶融混合物を回転円板によって吐出する、請求項１３に記載の方法。１８．前記連続流動媒体が、前記溶融混合物と不混和性の液体であり、該液体は、前記ブロックコポリマーの融解温度を越える温度で維持され、そして該溶融混合物を該液体中に、分散液を形成する手段によって吐出する、請求項６に記載の方法。１９．前記液体が、シリコーン油、オリーブ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマシ油、ダイズ油、水素化植物油、コーン油、鯨油、流動パラフィン、トルエン、キシレン及びヘキサンから成る群より選択されるメンバーである、請求項１８に記載の方法。２０．前記液体を前記コポリマーの融点未満に冷却して前記溶融混合物をミクロスフェアに硬質化させ、そして該ミクロスフェアを該液体から分離する、請求項１９に記載の方法。２１．前記ミクロスフェアを、遠心分離、濾過、又はデカンテーションによって前記液体から分離する、請求項２０に記載の方法。２２．前記液体が、滅菌した薬学的に許容しうる注射用油である、請求項１８に記載の方法。２３．前記メンバーが、オリーブ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマシ油、ダイズ油及び水素化植物油から成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。２４．前記分散液が単位剤形中に含有され且つ前記コポリマーの融点より低い温度で滅菌環境中に含有され、そして前記ミクロスフェアの前記油中における濃度が約１０〜５０％ｗ／ｖである、請求項２３に記載の方法。