JPH11509424A - 合成ｈｐｖ１１ウイルス様粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染の特徴解明に有用である一連の合成ウイルス様粒子、及び該ウイルス様粒子を用いるアッセイを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 合成ＨＰＶ１１ウイルス様粒子発明の分野 本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染の特徴解明に有用である一連の合成ウイル ス様粒子（ＶＬＰ）、及び該合成ウイルス様粒子を用いるアッセイに係わる。発明の背景 乳頭腫ウイルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ及び ウシを含めた様々な動物において起こる。乳頭腫ウイルスは上皮細胞に感染して 、通常感染部位に良性の上皮性腫瘍または線維上皮腫を誘発する。乳頭腫ウイル スは種特異的な感染物質であり、ヒト乳頭腫ウイルスはヒト以外の動物に感染し 得ない。 乳頭腫ウイルスは、感染する宿主に基づき幾つかの異なるグループに分類でき る。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は更に、ＤＮＡ配列相同性に基づいて６０を 越えるタイプに分類される（詳細はＨ． Ｐｆｉｓｔｅｒ編， “Ｐａｐｉｌｌ ｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，” ＣＲＣ Ｐｒ ｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９０参照）。乳頭腫ウイルスタイプは、或るタイプ の乳 頭腫ウイルスの感染に対する中和免疫が別のタイプの乳頭腫ウイルスに対する免 疫をもたらさない、タイプ特異的な免疫原であると考えられる。 ヒトでは様々なＨＰＶタイプが別個の疾患を誘発する。ＨＰＶタイプ１、２、 ３、４、７、１０及び２６〜２９は、正常個体と免疫抵抗性減弱個体との両方に おいて良性疣贅を誘発する。ＨＰＶタイプ５、８、９、１２、１４、１５、１７ 、１９〜２５、３６及び４６〜５０は免疫抵抗性減弱個体において扁平病変を誘 発する。ＨＰＶタイプ６、１１、３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５は性器 粘膜または呼吸器粘膜の良性コンジロームを誘発する。ＨＰＶタイプ１６及び１ ８は性器粘膜の上皮形成異常を誘発し、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、膣、外陰及 び肛門管の上皮内癌及び侵襲性癌の大部分に関連する。ＨＰＶ６及び１１は、あ らゆるコンジローム（性器疣贅）及び喉頭乳頭腫のうちの９０％を越えるものの 原因物質である。ＨＰＶタイプ６のサブタイプのうちで最も多量に存在するのは ＨＰＶ６ａである。 動物における免疫学的研究から、乳頭腫ウイルス抗原に対する中和抗体の産生 によって対応ウイルスへの感染が妨 げられることが判明した。有効な乳頭腫ウイルスワクチンの開発は乳頭腫ウイル スのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に伴う困難のせいで遅れている。有効なＨＰＶワクチ ンの開発は、適当な動物モデルが存在しないために特に遅れている。抗体による 乳頭腫ウイルスの中和はタイプ特異的で、ウイルス表面に存在するコンホーメー ション依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープに依存すると考えら れる。 乳頭腫ウイルスは小型（５０〜６０ｎｍ）で外膜を持たない二十面体ＤＮＡウ イルスで、８個以下の初期遺伝子及び２個の後期遺伝子をコードする。ウイルス ゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７並びにＬ１及びＬ２と呼称され、そ の際記号Ｅは「初期」、記号Ｌは「後期」を意味する。Ｌ１及びＬ２はウイルス キャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルス複製及び細 胞のトランスフォーメーションなどの機能に関連する。 Ｌ１タンパク質は多量に存在するキャプシドタンパク質で、５５〜６０ｋＤａ の分子量を有する。Ｌ２タンパク質は少量存在するキャプシドタンパク質であり 、５５〜６０ｋＤａの推定分子量と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって 決定された７５〜１００ｋＤａの見掛けの分子量 とを有する。免疫学的データは、Ｌ２タンパク質の大部分がＬ１タンパク質に内 在することを示唆している。Ｌ２タンパク質、特にＣ末端に位置する１０個の塩 基性アミノ酸は様々な乳頭腫ウイルス間で良く保存されている。Ｌ１ＯＲＦは様 々な乳頭腫ウイルス間で良く保存されている。 Ｌ１及びＬ２遺伝子は、動物における乳頭腫ウイルス感染の予防及び治療に用 いられるワクチンの製造に用いられている。Ｚｈｏｕ等（１９９１； １９９２ ）はＨＰＶタイプ１６のＬ１及びＬ２遺伝子をワクシニアウイルスベクター中へ クローン化し、得られた組み換えベクターにＣＶ−１哺乳動物細胞を感染させて ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製した。 細菌由来の組み換えウシ乳頭腫ウイルスＬ１及びＬ２が作製されている。組み 換え細菌タンパク質に対する中和血清は天然ウイルスと低いレベルでしか交叉反 応しなかったが、これはおそらく天然タンパク質と細菌由来タンパク質とでコン ホーメーションが相違することに起因する。 ＨＰＶ６ Ｌ１、ＨＰＶ１１ Ｌ１、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｌ１、 ＨＰＶ３１ Ｌ１またはＨＰＶ１６Ｌ２ ＯＲＦを発現させる組み換えバキュロ ウイルスを用 いて昆虫Ｓｆ９細胞に感染させ、Ｌ１及びＬ２タンパク質が作製された。ウェス タンブロット解析は、バキュロウイルス由来のＬ１及びＬ２タンパク質がＨＰＶ １６に対する抗体と反応することを示した。バキュロウイルス由来Ｌ１はＶＬＰ を形成する。 Ｃａｒｔｅｒ等（１９９１）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅの組み換え株によるＨＰＶ１６ Ｌ１及びＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質 の産生を証明した。Ｃａｒｔｅｒ等はまた、ＨＰＶ６ｂ Ｌ１及びＬ２タンパク 質の産生も証明した。ＨＰＶ６ｂ Ｌ１タンパク質は完全長Ｌ１タンパク質では なかった。組み換えタンパク質は細胞内産物及び分泌産物として産生された。組 み換えＬ１及びＬ２タンパク質の分子量は天然タンパク質のものに類似した。タ ンパク質が細胞内に発現された場合その大部分は、細胞を変性試薬の不在下に溶 解させた時不溶性であることが判明した。このように不溶性であることはタンパ ク質の精製を容易にし得るが、タンパク質の天然エピトープの分析を妨げる恐れ が有る。 酵母から分泌された組み換えタンパク質は酵母由来の炭水化物を保有すること が判明した。Ｎ末端に結合した酵母 由来のオリゴ糖の存在は天然エピトープを隠蔽しかねない。加えて、分泌された 組み換えタンパク質は分泌リーダー配列の保持など、他の改変を有する恐れも有 る。 本発明は、天然乳頭腫ウイルスタンパク質の免疫付与特性を具えた組み換え乳 頭腫ウイルスタンパク質の作製、並びに該組み換えタンパク質の作製方法及び使 用に係わる。本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染の特徴解明に有用である一連の 合成ウイルス様粒子、及び該合成ウイルス様粒子を用いるアッセイを提供する。 本発明は、中和抗体の結合に必要である、ＨＰＶ１１Ｌ１に特異的な残基の解 明（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）を含む。 ＨＰＶ１１ Ｌ１はＨＰＶ６ Ｌ１と、３８の位置に異なるアミノ酸を有し、 かつ１個の残基が挿入されている点でしか相違しない。上記２種のタンパク質の 著しい同等性にもかかわらず、ＨＰＶ１１ ＶＬＰに特異的である一団の中和モ ノクローナル抗体が発生した。本発明者は、上記アミノ酸の位置のいずれが中和 モノクローナル抗体の結合にとって重要であるかを確認した。この確認は、前記 位置のＨＰＶ１１アミノ酸残基をＨＰＶ６アミノ酸残基に置換 した一群のＨＰＶ１１クローンへのモノクローナル抗体の結合を評価することに よって行なった。 ＨＰＶ１１に対する中和モノクローナル抗体団はＮｅｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｉａ ｎｓｅｎ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｒｓｈｅｙ， ＰＡ）から入手した。この抗体団に属するモノクローナル抗 体はＨＰＶ１１特異的であり、かつＶＬＰ依存性である。個々の抗体の結合にど の位置のアミノ酸残基が影響するかという点から抗体同士の区別が可能であるが 、いずれのモノクローナル抗体に関しても位置の重複は存在する。 上記モノクローナル抗体の結合に影響する複数の残基はまとまって、ＨＰＶ１ １を中和することが知られている抗体にとってのエピトープを規定する。原則と して、ＨＰＶ６ Ｌ１の突然変異を前記残基に対応する選択的位置においてさえ 生起させれば、ＨＰＶ１１特異的な上記中和モノクローナル抗体との結合が実現 する。ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰは、ＨＰＶ１１の中和されるエピトープに対するモ ノクローナル抗体の生成に用い得る。このことは、製造したＨＰＶ１１ ＶＬＰ が中和されるエピトープを有することを 確認する放出アッセイの基礎を成す。 上記の問題はこれまで解決されておらず、この問題は本発明者の知るところで は、コンホーメーション依存性エピトープの移入の第一の証明となる。 問題の克服には二つの困難が存在した。第一に、エピトープがコンホーメーシ ョン依存性であるために、エピトープをマッピングし、ペプチドフラグメントと 結合させる通常の手段は用い得なかった。いずれの試験Ｌ１タンパク質も、ウイ ルス構造を模倣するウイルス様粒子の形成が助長されるようにして発現させなけ ればならなかった。第二に、マッピングには多数のＬ１クローンが必要であり、 従って試験ウイルスコートタンパク質を発現させる簡便な手段を実現しなければ ならなかった。 中和されるエピトープについて知らなければ、商業的に利用できるＶＬＰを確 実に製造することは困難であろう。 誘導体ＶＬＰの用途の一つに、ＨＰＶ１１に対する放出アッセイにおける試薬 としての使用が有る。ＨＰＶ６ Ｌ１を、本発明により試験で確認した位置にお いてＨＰＶ１１と一致（ｍａｔｃｈ）するように突然変異させる。このようにし て得られたＨＰＶ６誘導体ＶＬＰへのＨＰＶ１１ 中和モノクローナル抗体の結合を証明する。 上記ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰはＨＰＶ１１中和モノクローナル抗体との結合に関 する競合的結合アッセイに、製造したＨＰＶ１１ ＶＬＰと共に用い得る。モノ クローナル抗体と結合することが証明されたＨＰＶ６誘導体のみが真正物質と競 合する。 あるいはまた、ＨＰＶ６誘導体上の中和されるエピトープに対するモノクロー ナル抗体を生成させることも可能である。その場合は、製造したＨＰＶ１１ワク チンが上記抗体と結合することを証明する。発明の概要 本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染の特徴解明に有用である一連の合成ウイル ス様粒子、及び該合成粒子を用いるアッセイを提供する。図面の簡単な説明 図１は、タイプ特異性を具えたＶＬＰを過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トラン スフェクションにおいて作製することを示す。Ｓｆ９細胞をＢａｃｕｌｏｇｏｌ ｄ^TM ＤＮＡとｐＶＬ１３９３：ＣＲＰＶまたはｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１と で同時トランスフェクトした。６日後に細胞を 回収し、抽出物を調製し、ＥＬＩＳＡを本明細書に述べたように行なった。カラ ム１はＣＲＰＶ ＶＬＰ、カラム２はＨＰＶ１１ ＶＬＰ、カラム３はＳｆ９抽 出物、カラム４はバキュロウイルスＤＮＡ、カラム５はｐＶＬ１３９３：ＣＲＰ Ｖ、カラム６はｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１である。 Ａ．一次抗体をＣＲＰＶ．５Ａ腹水の１０^-5稀釈液とする。 Ｂ．一次抗体をＨ１１．Ｆ１腹水の１０^-5稀釈液とする。 図２は、過渡的トランスフェクションによって作製した免疫原物質が変性に対 して感受性であることを示す。Ｓｆ９細胞をｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ１１とＢａ ｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ＤＮＡとで同時トランスフェクトし、６日後に細胞を回収 し、抽出物を本明細書に述べたように調製した。抽出物の一部をｐＨ１０．５の ０．１Ｍ炭酸ナトリウムでの稀釈によって変性させ、室温で１時間インキュベー トした。その後、前記抽出物でマイクロタイタープレートを被覆し、乾燥した。 処理しなかった抽出物でもマイクロタイタープレートを被覆し、４℃で一晩イン キュベートした。 Ｈ１１．Ｆ１またはＨ６．Ｃ６腹水の１０^-5稀釈液を用いてＥＬＩＳＡを、「方 法」に述べたように行なった。カラム１はＳｆ９抽出物、カラム２はｐＶＬ１３ ９３抽出物である。Ａは抽出物を変性させない場合、Ｂは抽出物を炭酸塩緩衝液 で処理した場合である。 図３はＨＰＶ１１及びＨＰＶ６ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列である。これ らの配列はＥＭＢＬ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋからも入手可能である。発明の詳細な説明 本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染の特徴解明に有用である一連の合成ウイル ス様粒子（ＶＬＰ）、及び組み換えＤＮＡ技術で製造したＶＬＰの監視及び確認 に利用できる、前記合成ウイルス様粒子を用いるアッセイを提供する。 乳頭腫ウイルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ及び ウシを含めた様々な動物において起こる。乳頭腫ウイルスは上皮細胞に感染して 、通常感染部位に良性の上皮性腫瘍または線維上皮腫を誘発する。 乳頭腫ウイルスは、感染する宿主に基づき幾つかの異なるグループに分類でき る。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は更に、ＤＮＡ配列相同性に基づいて６０を 越えるタイプ に分類される（詳細はＨ． Ｐｆｉｓｔｅｒ編， “Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒ ｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，” ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉ ｎｃ．， １９９０参照）。乳頭腫ウイルスタイプは、或るタイプの乳頭腫ウイ ルスの感染に対する中和免疫が別のタイプの乳頭腫ウイルスに対する免疫をもた らさない、タイプ特異的な免疫原であると考えられる。 ヒトでは様々なＨＰＶタイプが別個の疾患を誘発する。ＨＰＶタイプ１、２、 ３、４、７、１０及び２６〜２９は、正常個体と免疫抵抗性減弱個体との両方に おいて良性疣贅を誘発する。ＨＰＶタイプ５、８、９、１２、１４、１５、１７ 、１９〜２５、３６及び４６〜５０は免疫抵抗性減弱個体において扁平病変を誘 発する。ＨＰＶタイプ６、１１、３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５は性器 粘膜または呼吸器粘膜の良性コンジロームを誘発する。ＨＰＶタイプ１６及び１ ８は性器粘膜の上皮形成異常を誘発し、子宮頸部、膣、外陰及び肛門管の上皮内 癌及び侵襲性癌の大部分に関連する。ＨＰＶ６及び１１は大部分の性器疣贅及び 喉頭乳頭腫を誘発する。 動物における免疫学的研究から、乳頭腫ウイルスキャプ シドタンパク質に対する中和抗体の産生によって対応ウイルスへの感染が妨げら れることが判明した。有効な乳頭腫ウイルスワクチンの開発は乳頭腫ウイルスの ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に伴う困難のせいで遅れている。有効なＨＰＶワクチンの 開発は、適当な動物モデルが存在しないために特に遅れている。抗体による乳頭 腫ウイルスの中和はタイプ特異的で、ウイルス表面に存在するコンホーメーショ ン依存性エピトープに依存すると考えられる。 乳頭腫ウイルスは小型（５０〜６０ｎｍ）で外膜を持たない二十面体ＤＮＡウ イルスで、８個以下の初期遺伝子及び２個の後期遺伝子をコードする。ウイルス ゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７並びにＬ１及びＬ２と呼称され、そ の際記号Ｅは「初期」、記号Ｌは「後期」を意味する。Ｌ１及びＬ２はウイルス キャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、ウイルス複製及びト ランスフォーメーションなどの機能に関連する。 Ｌ１タンパク質は多量に存在するキャプシドタンパク質で、５５〜６０ｋＤａ の分子量を有する。Ｌ２タンパク質は少量存在するキャプシドタンパク質であり 、５５〜６０ｋＤａの推定分子量と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって決定された７５〜１００ｋＤａの見掛けの分子量とを有する。 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組み換え株によるＨＰ Ｖ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１６ Ｌ２及びＨＰＶタイプ６ Ｌ１タンパク質の産生が 報告されている。組み換え酵母の培養によって任意の種及びタイプの乳頭腫ウイ ルス由来のタンパク質を大量に生産する方法を開発することは有用であろう。ま た、天然タンパク質のコンホーメーションなどの、天然タンパク質が具える免疫 付与特性を具えた乳頭腫ウイルスタンパク質を大量に生産することも有用であろ う。上記後者の達成には、Ｌ１遺伝子において生起させた多くの突然変異が既知 の特性（ＶＬＰ依存性、交叉反応性等）を具えた抗体の結合に及ぼす影響を分析 しなければならない。 天然の、または遺伝子操作したペプチド配列の機能性残基に関する経験的走査 は本質的に、多数の配列変異体を発現させてその相対的機能力を評価することに 依存する。得られるタンパク質発現レベルは自己集合するウイルス構造タンパク 質の場合特に重要となり得、なぜなら自己集合効率はしばしば濃度に依存するか らである。ウイルスの自己 集合の研究に昆虫バキュロウイルス発現ベクター系が広く用いられているが、そ の際には通常、プラーク精製した組み換えウイルスストックの単離及び展開前に 有用量の自己集合粒子を生じさせなければならない。ワタオノウサギ乳頭腫ウイ ルス及びヒトタイプ１１乳頭腫ウイルスのＬ１コートタンパク質を解析レベルで 発現させる幾つかの方策の検討において、本発明者は、昆虫細胞にバキュロウイ ルス移入ベクター及びウイルスＤＮＡでの過渡的同時トランスフェクションをた とえ短時間でも施すと、以前にプラーク精製ストックから得られた粒子と免疫学 的に区別できない集合粒子が得られることを発見した。Ｓｆ９細胞のプラスミド ／ウイルスＤＮＡ同時トランスフェクション開始から６日以内に、プレート１０ ０ｍｍ当たり少なくとも１〜２μｇの集合Ｌ１粒子を確認することができた。こ のような発現レベルは機能力の評価には十分以上であり、比較可能な哺乳動物細 胞の過渡的発現系に優る利点を幾つか有する。 ＨＰＶ感染において中和されるエピトープを明らかにするためには、ヒト乳頭 腫ウイルスサブタイプ上の、抗原タイプ特異性をもたらすアミノ酸残基を同定し なければならない（Ｎ． Ｄ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等， “Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ ｒｕｓ ｔｙｐｅ １１，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４， ｐｐ．１９３６− １９４４， １９９０）。タイプ特異的エピトープの多くはコンホーメーション 依存性であり、ＶＬＰ集合体上でしか検出され得ない。数種の動物及びヒトの乳 頭腫ウイルスの構造コートタンパク質Ｌ１は、組み換えバキュロウイルス株を介 して昆虫細胞において発現された場合効率的に自己集合することが証明されてい る（Ｎ． Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等， “Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｂａｃｕ ｌｏｖｉｒｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕ ｓ ｔｙｐｅ １１ Ｌ１ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋ ｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｒｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃ ｅ ｈｉｇｈｔｉｔｒｅｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ，” Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５， ｐｐ．２２７１−２２７ ６， １９９４）。位置特 異的突然変異誘発により生じさせた多数のＶＬＰ変異体を上記のような方法を用 いてスクリーニングすることは、組み換えファージの作製に掛かる時間及び労力 によって妨げられる。しかし、本発明者は以前、バキュロウイルス系において発 現された組み換えタンパク質は最初に行なうプラスミド及びウイルスＤＮＡでの 昆虫細胞のトランスフェクションから５〜７日以内に分泌産物としてμｇ／ｍｌ 量で検出可能であることを観察した。この観察に基づき、本発明者は、特にＢａ ｃｕｌｏｇｏｌｄ^TM（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） 系などのより効率的なバキュロウイルストランスフェクション系を用いた場合に 過渡的発現に際して、自己集合してＶＬＰを形成するのに十分な量の乳頭腫ウイ ルスタンパク質Ｌ１が集積するかどうかを調べた。高速６日過渡的トランスフェ クションプロトコルを用いて、適正に集合してＶＬＰ状となった、多くの乳頭腫 ウイルスタイプのコートタンパク質Ｌ１を作製した。ＣＲＰＶまたはＨＰＶ１１ Ｌ１遺伝子構築物で過渡的トランスフェクションを施した細胞から調製した抽 出物は、ＣＲＰＶまたはＨＰＶ１１ ＶＬＰに対して発生した、タイプ特異的で かつＶＬＰ依存性であるモノクロー ナル抗体によって認識される免疫原物質を含有した。過渡的発現物質は他のタイ プ特異的抗体と交叉反応性でなく、また認識はアルカリ変性感受性であった。こ れらの事からもＶＬＰ形成の忠実さが証明される。 ＨＰＶ１１の中和されるエピトープをマッピングするべく、ＨＰＶ１１の配列 中の残基がＨＰＶ６ｂ配列中の残基と相違する各位置においてＨＰＶ１１を突然 変異させた。突然変異によって上記各位置の残基をＨＰＶ６ｂ配列と一致させた （１３２位のチロシン挿入の影響はチロシンを除去することによって分析した） 。先に述べたＳｆ９過渡的発現系を用いて、得られた突然変異ＨＰＶ１１ Ｌ１ 遺伝子を発現させ、ＨＰＶ１１特異的なモノクローナル抗体の結合に関して解析 した。 本発明を以下の実施例によって更に詳述するが、本発明はこれらの実施例の細 部に限定されるものではない。実施例１ 試験発現構築物の作製 ＨＰＶ１１ Ｌ１構造遺伝子を臨床単離物から、公表されたＬ１配列から設計 されたプライマーを用いるＰＣＲによってクローン化した。その後、Ｌ１遺伝子 を突然変異誘 発のためにＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中へサブクローン化し 、かつＳｆ９細胞での発現のためにｐＶＬ１３９３（Ｓｔｒ−ａｔａｇｅｎｅ） 中へサブクローン化した。 Ｌ１遺伝子への突然変異の導入は、ＡｍｅｒｓｈａｍＳｃｕｌｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いて行なった。所望の突然変異の出現を配列 決定によって確認し、突然変異した遺伝子をＳｆ９細胞での発現のためにｐＶＬ １３９３中へサブクローン化した。 ＨＰＶ６ Ｌ１構造遺伝子を突然変異誘発のためにｐＡｌｔ−１（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）中へサブクローン化し、かつＳｆ９細胞での発現のためにｐＶＬ１３９３ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へサブクローン化した。突然変異を、Ａｌｔｅｒｅ ｄ Ｓｉｔｅｓ II ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を用いて発生させ、配列決定によって確認し、突然変異遺伝子をＳｆ９細胞で の発現のためにｐＶＬ１３９３中へサブクローン化した。実施例２ Ｓｆ９細胞におけるＬ１ ＶＬＰの過渡的発現 Ｓｆ９細胞を、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄトランスフェク ションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トラン スフェクションは実質的に製造元の指示に従って行なったが、その際次のような 変更を加えた。８×１０⁸個のＳｆ９細胞を１００ｍｍ径皿内で、４μｇのＢａ ｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡ及び６μｇの試験ＤＮＡでトランスフェクトした。６ 日後、細胞を回収し、ＶＬＰ産生に関して評価した。実施例３ Ｓｆ９抽出物の調製及びＥＬＩＳＡアッセイ トランスフェクションの６日後、掻き取りとその後の低速遠心とによって細胞 を回収した。細胞を３００μｌの破壊緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍトリス 、ｐＨ７．６）中に再懸濁させ、Ｆａｌｃｏｎ １２５９管内でＰＴ−ＤＡ １ ２０５／２−Ａプローブを具備したＰｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ １２００ Ｂ（Ｂ ｒｉｎｋｍａｎ）を用いて氷上で３０秒間ホモジナイズした。試料を２５００ｒ ｐｍで３分間回転させ、それによって破片をペレット化した。管を追加の破壊緩 衝液１５０μｌで洗浄し、上清を１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に集め、これをＥ ｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）で５分間再度回転さ せた。上清を集め、使用時まで４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡアッセイは典型的に は同日中に行なった。 ５μｌの抽出物をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液； ２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１％ ＢＳＡで５０μｌに稀釈し、これを ポリスチレンプレート上に播種した。プレートを４℃で一晩インキュベートした 。抽出物を除去し、プレートをＰＢＳ中の５％粉乳でブロックした。以後の洗浄 ステップは総てＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで実施した。プレートを一次抗体と共に 室温で１時間インキュベートした。一次抗体、即ちＨＰＶ１１ＶＬＰに対して発 生させたモノクローナル抗体はＤｒ．Ｎｅｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ（Ｐｅ ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から腹水ストック として入手した。この抗体は使用前にＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで１０⁵倍に稀釈 した。洗浄後、プレートを二次抗体と共に１時間インキュベートした。二次抗体 、即ちペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．から購入し、ＰＢＳ 中の１％ ＢＳＡで１０³倍に稀釈して用いた。最後の洗浄後、アルカリホス ファターゼアッセイを行ない、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。実施例４ ＨＰＶ１１走査 ＨＰＶ１１に特異的な中和されるエピトープにとって重要な残基のマッピング には、二つの条件を有利に用いる。何よりもまず、本発明者は、ＨＰＶ１１ Ｌ １に対して特異的であり、Ｌ１をＶＬＰ中に存在する場合にのみ認識する一団の モノクローナル抗体を用いた。実施例３に述べたアッセイ条件は、上記抗体が、 密接に関連するＨＰＶ６ｂＬ１ ＶＬＰに対して非交叉反応性でいられるような ものである。５種の上記のような抗体のうち、４種はＫｒｅｉｄｅｒ異種移植系 においてＨＰＶ１１を中和することが証明された（Ｋｒｅｉｄｅｒ等， Ｊ． Ｖｊｒｏｌ． ６１， ｐｐ．５９０−５９３， １９８７）。 ＨＰＶ６ Ｌ１及びＨＰＶ１１ Ｌ１は、乳頭腫ウイルスファミリー内で最も 密接に関連し合うタンパク質Ｌ１である。ＨＰＶ６ Ｌ１は５００アミノ酸残基 の長さを有する。ＨＰＶ１１ Ｌ１の長さは５０１残基である。これらのタンパ ク質Ｌ１は、ＨＰＶ１１が余分に有するアミノ酸 が１３２位に位置するようにして整列し得る。このような整列において、両タン パク質Ｌ１のアミノ酸配列は挿入を含めた３９の位置以外では総て（９２．４％ ）同等である。 本出願人は、モノクローナル抗体のタイプ１１特異性は上記３９の位置におけ る残基の相違のうちのいずれかによってもたらされると推論した。タイプ１１残 基を体系的にタイプ６残基に変更すれば、タイプ１１特異的なモノクローナル抗 体の結合親和性の喪失によって、タイプ１１応答にとって重要な残基が明らかと なろう。タイプ１１残基をタイプ６中に天然に出現する残基へと突然変異させる ことから、このような置換がＶＬＰ形成に影響する公算は小さい。 任意の特定残基が結合に及ぼす影響を測定するべく、ＨＰＶ１１と、対応する ＨＰＶ１１誘導体との両方を過渡的発現系において発現させた。ＨＰＶ１１特異 的モノクローナル抗体団を用いてＥＬＩＳＡを行ない、２種の発現産物に関して 得られた結果同士を比較した。Ｌ１産生はモノクローナル抗体Ｈ６．Ｃ６で正規 化した。Ｈ６．Ｃ６抗体はＨＰＶ１１と交叉反応性であり、エピトープは直鎖状 で、ＶＬＰ形成と無関係である。即ち、Ｈ６．Ｃ６抗体によっ てＬ１産生を評価できる。 得られた結果には二重正規化を施す。まず、試験位置に関して試験抗体対Ｈ６ ．Ｃ６抗体の吸光度比を計算する。ＨＰＶ１１に関しても同じ比を求め、この比 で試験位置に関する比を除する。このようにして得られた二重比の値が１に近け れば、試験クローンへの抗体結合とＨＰＶ１１への抗体結合との間に検出可能な 差異が存在しないことになる。１未満の二重比は、試験抗体が野生型に結合する ほどには試験クローンに結合しないことを意味する。理論上、１を越える二重比 は抗体がＨＰＶ１１よりも試験クローンの方により良く結合することを意味する 。実際にはそのような事態は観察されなかった。０．１〜０．２の比は実質的に バックグラウンドであり、抗体の突然変異ＶＬＰへの結合が検出できないことを 意味する。 ＨＰＶ１１ Ｌ１を、アミノ酸残基がＨＰＶ６とは異なる各位置において突然 変異させ、当該位置に有るアミノ酸残基をＨＰＶ６の対応する残基と一致させた 。クローンをＳｆ９細胞において、バキュロウイルス発現組み換え体を介して発 現させ、ＨＰＶ１１特異的モノクローナル抗体団の結合への影響を測定した（表 １）。表中「結合喪失」と 題した第２列に示した残基は、１種以上のモノクローナル抗体の結合にとって重 要であると看做される位置の残基である。「結合維持」と題した第１列に挙げた 残基はいずれのモノクローナル抗体の結合にも重要でないと判定される。 表１の「結合喪失」列に示したＬ１突然変異体をコードするクローンを、ＨＰ Ｖ１１：Ｇ１３１Ｓ、ＨＰＶ１１：Ｙ１３２Δ、ＨＰＶ１１：Ｙ２４６Ｆ、ＨＰ Ｖ１１：Ｎ２７８Ｇ及びＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔと呼称する。前置記号「ＨＰＶ 」は省略してもよい。 結合に影響する四つの残基は互いから著しく離隔しており、総離隔長は直鎖状 配列上で２００を上回る残基にわたる。 抗体の結合への影響は位置によって様々である。いずれかただ１種の抗体の結 合に影響する位置は三つを越えない。５種の抗体総ての結合に影響するのは２４ ６位のみである。いずれの場合も或る程度の検出可能な結合が観察される。この ことは、ＶＬＰ形成には影響が及ばないことを示している。２７８位における変 更が結合に及ぼす影響は些細であると考えられ、影響と呼ぶほどのものか疑わし いが、現時点では影響と認めておく。なぜなら、僅かな減少は再現可能だからで ある。ＶＬＰ正規化親和性比として測定した結合への影響を表２に示す。表３に は、ここに述べた研究から椎定した、ＨＰＶ１１モノクローナル抗体に関する結 合配置を示す。 ^*； 正規化親和性比＝位置Ｘ（Ａ₄₀₅Ｈ１１．Ｙ／Ａ₄₀₅Ｈ６．Ｃ６）／ ＨＰＶ１１（Ａ₄₀₅Ｈ１１．Ｙ／Ａ₄₀₅Ｈ６．Ｃ６） 実施例５ ストリッピングアッセイ ＨＰＶ１１ ＶＬＰの産生を監視し、それによって前記ＶＬＰが重要な、中和 されるエピトープを有することを確認するのに次のような競合的ＥＬＩＳＡを用 いる。ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰはモノクローナル抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１ 及びＨ１１．Ｇ５との結合に関してＨＰＶ１１ＶＬＰと競合するが、ＨＰＶ６ ＶＬＰは競合しない。このアッセイは、中和されるエピトープへの特異的でかつ 競合性の結合を証明することによって、ＨＰＶ１１ ＶＬＰ上に中和されるエピ トープが存在することを示すものである。アッセイは次のようにして実施する。 １． ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１ウェル当たり１０〜１００ｎｇの試験 バッチＨＰＶ１１ ＶＬＰを播種する。試料をＰＢＳ中の１．０％ＢＳＡ（ＥＬ ＩＳＡ緩衝液）で稀釈する。５０μｌの試料を播種する。４℃で一晩インキュベ ートする。 ２． ウェルから上清を除去する。ＰＢＳ中の５％粉乳を用いて室温で１時間ブ ロックする。 ３． ＥＬＩＳＡ緩衝液で濯ぐ。 ４． モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｆ１の稀釈液を調製する。 Ａ．漸増する量のＨＰＶ６誘導体ＶＬＰを含有する一組の稀釈液を調製する 。 Ｂ．漸増する量のＨＰＶ６ ＶＬＰを含有する一組の稀釈液を二重に調製す る。 Ｃ．ＶＬＰを添加しない稀釈液を調製する。 ５． ＥＬＩＳＡプレートのウェルに５０μｌの抗体試料を添加する。室温で１ 時間インキュベートする。 ６． 抗体を取り出し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄する。 ７． ５０μｌの適宜稀釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を添加する。室温で１ 時間インキュベートする。 ８． ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄する。アルカリホスファターゼアッセイによ って展開し、４０５ｎｍにおける値を読み取る。 ９． ４０５ｎｍにおいてＨＰＶ６誘導体ＶＬＰと著しく競合するがＨＰＶ６ ＮＬＰとは競合しない強いシグナルが検出されることによって、試験バッチのＨ ＰＶ１１ ＶＬＰ上に中和されるエピトープが存在することが証明される。実施例６ 中和の監視 ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰを用いて、ポリクローナル血清の試験バッチの中和活性 を解明する。ポリクローナル血清のバッチは、例えばＨＰＶ１１ ＶＬＰの試験 バッチによって発生させる。あるいは他の場合には、ポリクローナル血清がそれ に対して有する中和能を解明したいヒト試料を用いる。 ポリクローナル血清をＨＰＶ６ ＶＬＰで予め清澄化（ｃｌｅａｒ）する。そ れによって、ＶＬＰ依存性と非ＶＬＰ依存性との両方の交叉反応性抗体を除去す る。ＨＰＶ１１の中和されるエピトープはタイプ１１特異的であり、該エピトー プに対して発生した抗体はＨＰＶ６ ＶＬＰと共に予めインキュベートすること によって除去されない。しかし、誘導ＨＰＶ６粒子は前記抗体と結合し、例えば 標準的なＥＬＩＳＡにおいてこの結合が観察されることによって、試験血清試料 中に中和抗体が存在することが証明される。 ポリクローナル血清の試験試料を、次の手順に従って清澄化する。 １． ＶＬＰ結合抗体の総量を推定する。ＶＬＰを、抗ＨＰＶ１１モノクローナ ル抗体（数種使用可能）を用いるサンドイッチ方式でＥＬＩＳＡプレート上に固 定する。結合するポリクローナル抗体の量を、既知濃度の第二の抗ＨＰＶ１１抗 体を標準として用いて推定する。あるいは他の場合には、ポリクローナル抗体の ＩｇＧ濃度を測定し、これを全抗ＨＰＶ１１抗体の濃度と仮定する。 ２． 血清のアリコートにＨＰＶ６ ＶＬＰを、ステップ１で測定したポリクロ ーナル血清中のＨＰＶ１１抗体の量より１０倍過剰なμｇ量で添加する。 ３． 混合物を室温で一晩インキュベートし、その後５時間高速遠心（３００， ０００×ｇ）してＶＬＰ−抗体複合体をペレット化する。 ４． ここまでの手順を更に２回繰り返す。 ５． ストリップした血清をサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて結合について試験 する。ＨＰＶ６ ＶＬＰ及びＨＰＶ６誘導体ＶＬＰ（中和モノクローナル抗体と 結合）をＨＰＶ６モノクローナル抗体によって固定する。ストリップしたポリク ローナル血清はＨＰＶ６ ＶＬ Ｐと最小限にしか結合しないはずである。ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰに対する強いシ グナルはＨＰＶ１１の主要中和ドメインへの結合と、ポリクローナル血清が中和 抗体を含有することとを証明する。 Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ中和アッセイ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等， Ｊ． Ｖｉ ｒｏｌ． ６４， ｐｐ．１９３６−１９４４， １９９０； Ｃｈｒｉｓｔｅ ｎｓｅｎ等，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５， ｐｐ．２２７１−２２７ ６， １９９４）を用いて、試験血清試料の中和能を証明する第二のアッセイを 行ない得る。 １． 上述のプロトコルに従い、ただしＨＰＶ６ ＶＬＰをＨＰＶ６誘導体ＶＬ Ｐに置き換えて、ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰに対する血清を発生させ、かつストリッ プする。対照として、ＨＰＶ６ ＶＬＰでストリップしたポリクローナル血清を 製造する。 ２． 一連のポリクローナル血清稀釈液を製造し、Ｘｅｎｏｇｒａｐｈ中和アッ セイで解析して血清の中和力価を求める。 ３． ＨＰＶ６誘導体でストリップした血清及びＨＰＶ６でストリップした血清 の稀釈液の並列セットを製造し、 Ｘｅｎｏｇｒａｐｈで力価を調べる。 ４． Ｘｅｎｏｇｒａｐｈアッセイにおいて、ＨＰＶ６誘導体ＶＬＰでのストリ ップによって大部分除去されるがＨＰＶ６ ＶＬＰでのストリップによっては除 去されない中和活性の存在が確認されることにより、ＨＰＶ１１の中和されるエ ピトープに対する抗体が血清中に存在することが生物学的アッセイによって証明 される。実施例７ Ｓｆ９細胞におけるＶＬＰの過渡的発現 ＨＰＶ１１ Ｌ１構造遺伝子を臨床単離物から、公表されたＬ１配列（８、１ ７）から設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっ てクローン化した。ＣＲＰＶ Ｌ１構造遺伝子をウイルスゲノムＤＮＡからＰＣ Ｒによってクローン化した。Ｌ１遺伝子をＳｆ９細胞における発現のためにｐＶ Ｌ１３９３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へサブクローン化した。 Ｓｆ９細胞を、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄ ｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクション は製造元の指 示に従って行なったが、その際次のような変更を加えた。８×１０⁶個のＳｆ９ 細胞を１００ｍｍ径皿内で、４μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡ及び ６μｇの試験プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。特に断わらないかぎり ６日後に細胞を回収し、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイによりＶ ＬＰ産生に関して評価した（下記参照）。実施例８ Ｓｆ９抽出物の調製及びＥＬＩＳＡアッセイ トランスフェクションの６日後、細胞を回収した。細胞をプレートから掻き取 って再懸濁させ、これを低速遠心することによって細胞を集めた。細胞を３００ μｌの破壊緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍトリス、ｐＨ７．６）中に再懸濁 させ、Ｆａｌｃｏｎ １２５９管内でＰＴ−ＤＡ１２０５／２−Ａプローブを具 備したＰｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ １２００ Ｂ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて氷 上で３０秒間ホモジナイズした。試料をＧＰＲ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）において２５ ００ｒｐｍで３分間回転させ、それによって破片をペレット化した。管を追 加の破壊緩衝液１５０μｌで洗浄し、上清を１．５ｍｌ容マイクロ遠心管に集め 、これをＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）で５分間再度 回転させた。ＥＬＩＳＡアッセイを同日中に開始した。 ５μｌの抽出物をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中の１％ＢＳＡ ５０μｌで稀 釈し、これを９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ２マイクロタイタープレート（Ｄｙｎ ａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）上へ分配（ａｌｉｑｕｏ ｔ）し、４℃で一晩インキュベートした。抽出物を除去し、プレートをＰＢＳ中 の５％粉乳でブロックした。以後の洗浄ステップは総てＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ で実施した。プレートを一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。一次 抗体、即ちモノクローナル抗体ＣＲＰＶ．５Ａ及びＨ１１．Ｆ１はＤｒ． Ｎｅ ｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎから腹水ストックとして入手した。これらの抗体 はＣＲＰＶ ＶＬＰ及びＨＰＶ１１ ＶＬＰをそれぞれ認識する、ＶＬＰ依存性 でかつタイプ特異的な抗体である（Ｎｅｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，私信 ）。前記２抗体は使用前にＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで１０⁵倍に稀釈した。ＰＢ Ｓ中の１％ ＢＳＡで洗浄後、プレートを、Ｐ ＢＳ中の１％ ＢＳＡで１０³倍に稀釈して用いた二次抗体、即ちペルオキシダ ーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）と共に１時間インキュベートした。最 後の洗浄後、アルカリホスファターゼアッセイを行ない、４０５ｎｍにおける吸 光度を読み取った。実施例９ ＨＰＶ１１の中和されるエピトープのＨＰＶ６への伝達 実施例４での研究に基づき、ＨＰＶ６ Ｌ１遺伝子を、ＨＰＶ６ Ｌ１のアミ ノ酸残基１３１、２４５及び２７７がＨＰＶ１１ Ｌ１配列のものと一致するよ うに突然変異させた。加えて、残基１３１の後にチロシンを挿入し、それによっ て突然変異ＨＰＶ６ Ｌ１の長さを１残基だけ延長して５０１アミノ酸とした。 このようにして得られたクローンを６：１３１，１３２，２４５，２７７と呼称 する。本発明者は、いずれもＨＰＶ１１ Ｌ１配列との一致を期して行なった上 記四つの変更がＨＰＶ１１特異的な中和抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１及びＨ １１．Ｇ５の結合を容易にすると推測した。この推測は実のところ、次表に示し たように事実であった。 ＨＰＶ６及び誘導体に対する相対親和性値 上記結果から、４個のアミノ酸残基１３１、１３２、２４５及び２７７が中和 抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１及びＨ１１．Ｇ５との結合の部位の特異性を規 定することは明らかである。 抗体Ｈ１１．Ｈ３は、３４６位における結合への感受性を有し、かつ１３１位 における結合への感受性を有しない点で他の３種の中和抗体と区別できる。この ことは、抗体Ｈ１１．Ｈ３の結合部位はＣ末端側へ変位しているが、それでもな お他の３種の中和モノクローナル抗体の結合部位と重複することを示している。 先に規定したＨＰＶ６誘導体クローンを、３４５位に追加の変更を加えること によって更に誘導体化し、ＨＰＶ１１の配列とその３４６位において一致する誘 導体クローンを得た。このクローンを６：１３１，１３２，２４５，２ ７７，３４５と呼称する。クローン６：１３１，１３２，２４５，２７７，３４ ５はＨ１１．Ｈ３を含めた４種の中和抗体総てと結合すると推測される。データ を次表に示す。 ＨＰＶ６及び誘導体に対する相対親和性値 予測したように、上記クローンは中和抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１及びＨ １１．Ｇ５と結合し得るＶＬＰを形成した。この観察は確認されている。意外な ことに、上記クローンは抗体Ｈ１１．Ｈ３とは結合せず、このことはＨ１１．Ｈ ３との結合のためには３４５位の変更に更に別の変更も追加しなければならない ことを示している。実施例１０ 中和モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｈ３の結合 抗体Ｈ１１．Ｈ３の結合を更に追究するべく、ＨＰＶ６Ｌ１遺伝子の４３８位 にも変更を加え、それによって４３９位の残基がＨＰＶ１１ Ｌ１と一致する誘 導体クローン を得る。変更はクローン６：１３２，２４５，２７７，３４５とクローン６：１ ３１，１３２，２４５，２７７，３４５との両方に加える。それによって、クロ ーン６：１３２，２４５，２７７，３４５，４３８及び６：１３１，１３２，２ ４５，２７７，３４５，４３８を生成させる。クローン６：１３２，２４５，２ ７７，３４５，４３８は抗体Ｈ１１．Ｈ３と結合し、クローン６：１３１，１３ ２，２４５，２７７，３４５，４３８は抗体Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１１．Ｆ１、Ｈ１ １．Ｇ５及びＨ１１．Ｈ３と結合する。これらのクローンは、請求の範囲第２項 及び第３項並びに上記実施例７及び８に述べたアッセイにおいて取得可能な感受 性データの範囲を広げる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ベニンカサ，ダイアナ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ホリス，グレゴリー・エフ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 マーク，ジヨージ・イー，ザ・サード アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 次の構築物： ａ）ＨＰＶ６：１３１，１３２，２４５，２７７； ｂ）ＨＰＶ６：１３１，１３２，２４５，２７７，３４５； ｃ）ＨＰＶ１１：Ｇ１３１Ｓ； ｄ）ＨＰＶ１１：Δ１３２； ｅ）ＨＰＶ１１：Ｙ２４６Ｆ； ｆ）ＨＰＶ１１：Ｎ２７８Ｇ；及び ｇ）ＨＰＶ１１：Ｓ３４６Ｔ のうちのいずれかから作製した合成ウイルス様粒子。 ２． 組み換えＶＬＰを特徴解明する方法であって、 ａ）試験バッチＨＰＶ１１ ＶＬＰの試料をＥＬＩＳＡプレートに播種すること 、 ｂ）前記試料をインキュベートすること、 ｃ）前記試料を固定すること、 ｄ）前記試料を濯ぐこと、 ｅ）モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｆ１を稀釈して、 （１）漸増する量のＨＰＶ６誘導体ＶＬＰを含有する一組の稀釈液を調製す ること、 （２）漸増する量のＨＰＶ６ ＶＬＰを含有する一組の稀釈液を二重に調製 すること、 （３）更に、ＶＬＰを添加しない一組の稀釈液も調製すること により抗体試料を製造すること、 ｆ）抗体試料をＥＬＩＳＡプレートに添加して混合物を製造すること、 ｇ）前記混合物をインキュベートすること、 ｈ）前記混合物を洗浄すること、 ｉ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を添加すること、 ｊ）試料をインキュベートすること、 ｋ）試料を洗浄すること、 ｌ）アルカリホスファターゼアッセイによって展開し、４０５ｎｍにおける値を 読み取ること を含む方法。