JPH11509406A

JPH11509406A - 核酸の無転写増幅方法

Info

Publication number: JPH11509406A
Application number: JP9502399A
Authority: JP
Inventors: ヒムラー，ゴットフリート; シュレーデラー，トーマス
Original assignee: ヒムラー，ゴットフリート; シュレーデラー，トーマス
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-06-13
Publication date: 1999-08-24
Also published as: ATA100795A; AT402203B; WO1997000330A3; US6033881A; ATE195976T1; CO4480062A1; WO1997000330A2; EP0833942A2; AU5887296A; AR002470A1; EP0833942B1; ZA965019B; DE59605824D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸または配列を、増幅の前に少なくとも部分的にそれらの独立した鎖に分け、および／または転写し、反応混合物が、増幅される核酸または配列の末端の塩基配列に対して本質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、特定の条件において、核酸合成のための出発点および／または化学ビルディングブロックを形成することができ、形成される増幅生成物に組込まれる、酵素による核酸または核酸配列の無転写増幅方法に関する。ビルディングブロックからの生成物そのものが再び、増幅される核酸または配列に対応する。オリゴヌクレオチドビルディングブロック、おそらくは鋳型または他の化学ビルディングブロックから形成された反応生成物が、オリゴヌクレオチドビルディングブロックと再び一工程で反応し、この反応が実質的に等温で実施される。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の無転写増幅方法［発明の分野］本発明は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術（遺伝子工学）の分野に関する。本発明は、核酸の簡素化されたin vitro合成を可能にする。本明細書に記載の方法は、プライマー依存性のＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ−およびＲＮＡ−リガーゼによる核酸の増幅に特に適用できる。本発明は、分子生物学、医学的診断、環境および法廷のための分析に無数の用途を有する。本発明は、それによって核酸および核酸配列が、それぞれ、一本鎖へと少なくとも部分的に分離され、および／または転写される可能性がある、酵素を用いた、核酸および核酸配列それぞれの、等温の、転写に基づかない増幅方法に特に関する。増幅は、増幅しようとする核酸または核酸配列の相補的な鎖の末端の配列に基本的に相補的な配列を有する、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドビルディングブロックを酵素的に組込むことによって進行し、その際、ビルディングブロックの生成物自体が、増幅しようとする核酸および核酸配列に相当する。［技術の現状］核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに核酸配列のin vitro増幅は、それぞれ、多くの用途があり、また、様々な方法で実施され得る（本明細書での増幅とは、実質的な増幅、すなわち、出発材料の倍増を上回るそれを意味する）。ポリメラーゼ活性によるＤＮＡの増幅の原理は、Kleppe et al.，J.Mol．Biol ．56:341 (1971)に詳細に記載されている。それによれば、酵素によるＤＮＡ合成の出発点としてオリゴヌクレオチドを用いるため、この合成の生成物は、さらに合成するための鋳型として用い得る。この原理によれば、相補的核酸鎖を、合成の一つ一つの段階の間に反復的に分離しなければならない。米国特許第4,683,202 号明細書は、この原理の具体化を記載している。適用される温度については、特に二つの方法を区別し得る：温度変化を、増幅温度と変性（鎖の分離）温度との間でサイクルさせることによる方法であって、その際、核酸または核酸配列は、増幅段階の前に、一本鎖へと基本的に完全に分離しなければならない。他方の増幅方法は、等温で働く。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、第一の群の温度サイクル法に属し、ここでは、温度を周期的変化に付すような反応で、核酸配列を指数関数的に増幅することができる。そのような増幅には、通常、熱安定性ポリメラーゼが用いられる［例えば、それぞれ、Saiki et al.，Science 230:1350-1354 (1985)； Saiki et al.，Science 239:487(1988)］。米国特許第4,683,195 号明細書[Mullis et al.]によれば、温度サイクル法では、適切ないかなる変性の方法によっても、増幅段階に続いて鎖分離を実施することができ、該方法は、化学的、物理的、または酵素的であってよい。参照された文書では、物理的な鎖分離の方法が好適とされ、例えば、完全な変性（＞９９％）、すなわち２本の一本鎖に分離されるまで、核酸を加熱する。代表的な熱変性は、９０〜１０５℃の温度で実施され、一般に、０．５〜３分間持続する。好適な温度は、０．５〜３分間の９０〜１００℃である。熱不安定性酵素を用いるときは（米国特許第4,683,202 号明細書）、熱による鎖分離のそれぞれの後で、新しい酵素を加えなければならない。熱安定性酵素を用いることによって、酵素添加のために温度サイクルを中断することが不要になる。この方法は、温度サイクル装置によって「同時に」実施される。温度サイクル法の群のもう一つの方法は、例えば、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 88:189-193 (1991)でのF．Barany による、いわゆるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）であって、この方法は、ＰＣＲにおけるように、出発核酸の非線形増幅へと導き、やはり、周期的な温度変化が増幅温度と変性温度との間で進行し、熱安定性リガーゼを酵素として用いる（国際公開特許第90/01069号公報およびヨーロッパ公開特許第320308号公報）。ＬＣＲの特別な形態が、「間隙充填ＬＣＲ」であって、この方法では、リガーゼに加え、ポリメラーゼを用いる。そのような反応では、ポリメラーゼ反応の生成物だけをリガーゼの基質として用いる(米国特許第5,427,930)。僅かに異なる特性を有するいくつかの類似の酵素を一つの反応に用いて、ただ１種類の酵素だけでは達成できない特別な結果を達成してもよい。長いＤＮＡの延長の増幅は、そのような反応の例である［W.M. Barnes，Proc．Natl．Acad．S ci．USA，91:2216-2220 (1994)］。一方、等温法、例えば自己持続連続反応（self sustained sequencereaction ）（３ＳＲ）のようなそれは、従来から周知である［例えば、E．Fahy et al.， PCR Meth．Appl．1:25-33 (1991); D．Kwoh et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 86:1173-7 (1989);国際公開特許第88/10315号公報（T.R．Gingeras ら）；ヨーロッパ公開特許第0 329 822 号公報（H.I．Miller ら）；およびJ．van Brunt ，Bio/Technology 8:291-4 (1990);米国特許第5,409,818 号、第5,399,491 号および第5,194,370 号明細書］。これらの方法は、共通して、等温で実施できるが、増幅段階が転写（それぞれ、ＲＮＡからＤＮＡへ、およびＤＮＡからＲＮＡへ）を介して実施されるため、異なるいくつかの酵素（例えば、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、ＲＮＡポリメラーゼ）を増幅に必要とする。もう一つの短所は、使用される熱安定性酵素がないため、やはり、従来の等温法は、また、低い特異性を有する。ＲＮＡ生成物が結果物である場合には、もう一つの短所は、操作がより困難である（サイズ分別は、ＤＮＡについてのように簡単ではない）ことである。利用できる汚染制御システムもない。下記の参考文献は、それぞれ特定の酵素系（制限エンドヌクレアーゼ、Ｑβレプリカーゼ）を用いる、核酸および核酸配列の増幅のさらなる代替的な方法を記載している：G.T．Walker et al.，Proc．Natl．Acad．Sci. USA 89:392-6 (199 2)；米国特許第5,356,774 号明細書（V.D．Axelrodら）；およびP．Knight，Bio /Technology 7:609-10 (1989)。国際公開特許第90/10064号公報および第91/03573号公報は、核酸の等温増幅に φ２９ファージの複製起点を用いることを記載している。いわゆる鎖置換増幅（米国特許第5,455,166 号明細書および第5,422,252 号明細書）は、相補的核酸の鎖の一方の置換を一定の領域（反応混合物中のプライマーおよび特定のエンドヌクレアーゼによって規定される）で開始するが、同時に、新たな相補鎖を合成する、ポリメラーゼの鎖置換活性に基づく。簡単な等温鎖置換増幅法が、ヨーロッパ公開特許第0 676 476 号公報に記載されている。この方法では、ポリメラーゼである１種類の酵素のみを要するにすぎない。しかし、増幅には、１鎖あたり少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド、すなわち全部で４種類のオリゴヌクレオチドを必要とする。ＰＣＲの特別な形態は、nested ＰＣＲである（例えば米国特許第5,340,728 号明細書、ヨーロッパ公開特許第0 519 338 号公報、米国特許第4,683,195 号明細書、同第5,314,809 号明細書）。ＰＣＲのもう一つの特別な形態は、ＲＴ−ＰＣＲであって、ＲＮＡの鋳型を最初にｃＤＮＡへと転写する。逆転写酵素活性はもとより、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す酵素も用いることができる（例えば米国特許第5,322,770 号明細書）。これらの方法は、すべて、研究にそれらの適所があるが（ＰＣＲは、最新の分子生物学研究室になくてはならない）、複雑であり、要求が非常に過酷であるため、定型的方法として記載されることは殆どない。また、これらの方法には、装置や試薬の高い費用がつきものであるが、それは、特に温度サイクルには、高価な高性能サーモスタットが必要であり［R．Hoelzel，"Trends in Genetics" 6:2 37-238 (1990);またはU．Linz, Biotechniques 9:286-292 (1990)を参照されたい］、一方、等温法には、高価な酵素を用いなければならないからである。定義：等温（的）：「実質的に等温（的）」および「基本的に同じ温度」とは、商業的サーモスタットの逸脱の範囲での、与えられた温度からの逸脱を意味する。出発材料：本発明による方法では、精製または未精製形態での核酸または核酸配列は、すべて、用いるオリゴヌクレオチドビルディングブロックに特異的である核酸配列を基本的に含む（または含むと想定される）ならば、出発材料として用いてよい。本発明による方法には、一本鎖または二本鎖形態でのＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなどを包含する）を用いてよい。その上、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを鋳型として用いてもよい。これらの核酸種の混合物も、以前の増幅から得られる核酸と同じく用いてよい。そうして、以前の増幅におけると同じであるか、または異なるオリゴヌクレオチドを用いて、それを増幅してよい。増幅しようとする特異的な核酸または核酸配列は、より大きい分子の一部であっても、または、分子が核酸全体の特異的配列に相当するようなものであってもよい。増幅しようとする配列が純粋な形態であることは、必要でなく、複合した混合物の破片（例えばゲノムの一部）であってもよい。このゲノム自体も、生物学的サンプル（例えば細胞または組織）の部分にすぎなくてもよい。出発核酸または核酸配列は、それぞれ、一つ以上の特定の核酸配列（同一であっても、異なってもよい）を含んでよい。したがって、増幅の方法は、大量の特定の核酸を製造するのに適するばかりでなく、出発核酸または核酸配列のいくつかの下位配列を、一つの反応容器中で同時に増幅するのに用いてもよい。増幅反応の前に一本鎖に分離されて（変性されて）いてよい核酸は、異なる入手源、例えばpBR322のようなプラスミド、クローニングしたＤＮＡまたはＲＮＡ、化学的に合成したＤＮＡまたはＲＮＡ、あらゆる起源（例えば、細菌、酵母、真菌、ウイルスおよび細胞小器官；または植物、動物もしくはヒトのような高等生物）の天然のＤＮＡまたはＲＮＡから得てよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば血液、体液、植物の液汁、培地または組織から、多数の手法によって抽出してよい［例えば、"Molecular Cloning．A Laboratory Manual"，J．Sambrook et a l.，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，New York (1988)を参照されたい］。組織または細胞の非抽出部分を用いてもよい。原則として、本発明による方法を用いて、いかなる特定の核酸を増幅してもよい。化学ビルディングブロック：本文書中では、用語「化学ビルディングブロック」は、核酸の酵素的合成に用いられるか、または用いてよいようなもの、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチド（例えば、リボオリゴヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）を意味する。修飾されたビルディングブロック、例えば、ビオチンなどのような一定のマーカー、またはリン酸基のような反応性の基を有するブロックを用いてもよい。例えば、ヌクレオチドやヌクレオシド、およびそれらの誘導体の一部のような、より小さいビルディングブロックを用いてもよいと考えられる。オリゴヌクレオチドビルディングブロック：用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの誘導体を含む、天然に産するか、または合成による分子について用いられる。塩基内、またはオリゴヌクレオチドのバックボーン内に修飾があってもよい（例えば、ペプチド核酸、ヘキソースリン酸など）。オリゴヌクレオチドの実際の大きさは、いくつかの要因に依存するが、該要因は、また、オリゴヌクレオチドのそれぞれの用途または機能に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成しても、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−配列の調製またはクローニングによって生産してもよい。オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、化学ビルディングブロックとして本発明で用いられるオリゴヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、核酸、核酸配列またはオリゴヌクレオチドであって、適当な条件下（すなわち、酵素の影響、例えばさらなるオリゴヌクレオチドビルディングブロックのような、必要な化学ビルディングブロックの存在、ヌクレオチド三リン酸、緩衝条件、例えば pH、イオン強度、補因子など）、および適切な温度で、核酸の合成のための化学ビルディングブロックとして役立ち得る。オリゴヌクレオチドビルディングブロックと鋳型との間の相補的塩基配列の数に関しては、特定の核酸配列の両端の、増幅するのに充分な数の塩基が基本的に知られていることが必要なだけであるため、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドビルディングブロックを合成し得るが、うち少なくとも一つは、それぞれの相補的鎖とハイブリダイズさせてよい。配列上の相対的位置は、一つのオリゴヌクレオチドビルディングブロックによって（ポリメラーゼで触媒される増幅で）か、または二つのオリゴヌクレオチドビルディングブロックによって（リガーゼを介して触媒される反応で）形成される生成物が、鋳型として、それぞれの他方のオリゴヌクレオチドビルディングブロックの酵素による伸長にか、またはそれぞれの他のオリゴヌクレオチドビルディングブロックのための結合（リガーゼで触媒される反応で）に役立ち得るように、好むままに選ばれる。オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、天然の供給源、例えば制限消化されたＤＮＡに由来するか、あるいは、化学的に合成し、および／または酵素によって生成してよい。オリゴヌクレオチドビルディングブロックの厳密な長さは、いくつかの要因、例えば温度、鋳型配列などに依存する。オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、一般的には１５〜４０塩基の長さを有するが、より短くても、より長くてもよい。概して、より短いオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、効率的な反応のためには、より低い温度を要する。いずれにしても、本発明による方法に用いられるオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、増幅しようとするそれぞれの特異的配列に実質的に相補的でなければならない。オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、そのそれぞれの鋳型鎖に厳密に相補的である必要はない。例えば、反応すべきオリゴヌクレオチドビルディングブロックの外側末端に、非相補的ヌクレオチド配列および／またはマーカー（例えばハプテンもしくは酵素）を付加することが可能である。転写：転写は、ＤＮＡ鎖を鋳型として用いることによって、ＲＮＡ鎖を構成する過程である。転写の特別な場合は逆転写であって、ここでは、ＲＮＡ鎖を鋳型として用いて、ＤＮＡ鎖が生成（構成）される。本説明での「転写」は、一核酸種（ＲＮＡまたはＤＮＡ）からそれぞれの他の核酸種（ＤＮＡまたはＲＮＡ）へと導く過程を意味する。鋳型：それぞれの相補鎖の合成のための基盤として役立ち得るあらゆる核酸または核酸配列を、「鋳型」という。出発核酸ばかりでなく、中間体および反応生成物も鋳型になり得る。（突然）変異：（突然）変異は、核酸の塩基の内容の変化である。存在する塩基は天然の塩基であってよく、相違は、塩基の欠失、交換または付加であってよい。その上、核酸の塩基組成は、実質的に同じであってよく、変化は、分子の化学的修飾に関連してよい。上記の形式の組合せであってもよい。酵素：酵素は、通常は、化学反応を触媒するポリペプチドであるが、酵素として用い得るその他の分類群の化合物（例えばＲＮＡ、合成重合体）に酵素活性を見出すことが可能である。「酵素」は、類似の特性を有する異なる酵素の混合物を含むとも理解される。ヘルパーオリゴヌクレオチド：ヘルパーオリゴヌクレオチドは、化学反応を改善するが、そのような反応に化学ビルディングブロックとしては用いられない、オリゴヌクレオチドである。反応生成物：反応生成物は、酵素活性によって付加された化学ビルディングブロックから生成された、核酸の二本鎖分子である。反応生成物は、部分的に鋳型よりなってもよい。［発明の要約］本発明は、増幅の前に、必要ならば、核酸または核酸配列を、それぞれ、一本鎖へと少なくとも部分的に分離し、および／または転写し、反応混合物が、増幅しようとする核酸または核酸配列の末端の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含有し、該オリゴヌクレオチドが、適切な条件下で、核酸合成のための出発点および／または化学ビルディングブロックを形成してよく、かつ形成しようとする増幅生成物へと構成され、その際、これらのビルディングブロックからの生成物自体が、増幅しようとする核酸または核酸配列に相当する、酵素を用いる核酸または核酸配列の、それぞれ転写を含まない増幅の方法であって、場合により鋳型を用い、かつ場合によりさらなる化学ビルディングブロックを用いて、オリゴヌクレオチドビルディングブロックによって形成した反応生成物を、再びオリゴヌクレオチドビルディングブロックと一段階で反応させ、該反応を実質的に等温で実施することを特徴とする、増幅の方法に関する。［発明の詳細な説明］ＰＣＲ、ＬＣＲまたは３ＳＲのような慣用の方法の公知の短所を克服すること、および簡単で費用効果的な、上記の種類の方法を提供することが本発明の目的である。この任務は、本発明に従って、実質的に等温の方法を実施すること、およびただ１種類のみの酵素を用いることによって、解決される。そのような等温法では、増幅は進行するが、核酸または核酸断片は、二本鎖のままである、すなわち増幅しようとする相補的な核酸の塩基対間の水素結合は、殆ど完全なままである。言い換えれば、このことは、増幅の間、相補的な核酸および核酸断片は、それぞれ二本鎖として存在することを意味する。すべての反応物、ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチドビルディングブロック、生成物、鋳型および酵素は、相互に、および他のすべての反応化合物に関して定常状態の平衡にある。反応条件、および特に反応温度は、本発明によれば、増幅生成物も好ましくは二本鎖であるように選ばれる。反応機序は未だ明らかではないが、入手できるデータ、および実験の結果によれば、本発明による方法では、オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、それぞれ二本鎖形態の出発核酸および核酸断片に既に加えられていると考えられるが、これは、そのような機序に関する従来からの見解と矛盾する。そのため、核酸もしくは核酸断片の、または、反応が進行するならば、反応の中間生成物の、ＰＣＲ、ＬＣＲ、３ＳＲなどのような慣用の方法に不可欠である、一本鎖への強制的分離は不要である。通常の方法は、反応中間生成物のそれらの一本鎖への分離に、次いで、これらの一本鎖とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づく。しかし、本発明による方法は、オリゴヌクレオチドが、与えられた温度で出発材料および増幅生成物と、それぞれ一段階で反応し、酵素による接触作用の結果、増幅生成物がこれらの反応生成物から再び生じるという意外な観察に基づく。最新の方法との基本的かつ重要な相違は、ＰＣＲまたはＬＣＲ、および関連する方法では、熱変性によって一本鎖が調製されて、オリゴヌクレオチドに一本鎖の鋳型を与え、次いで、それにプライマーおよびオリゴヌクレオチドビルディングブロックがハイブリダイズするということである。しかし、本発明の方法では、動的平衡が存在するときは、反応成分を過剰に加えるならば、反応生成物を優位にすることができるという事実を活用する。この種の反応は、鎖侵入（または鎖交換(exchange))と呼ばれ、本発明の先順位出願の出願日以後に、Ｄ型ＤＮＡについて記載されている［M．lyer et al.， J．Biol．Chem．270:14712 (1995)］。しかしながら、鎖侵入は、ＤＮＡの最も一般的な形態であるＢ型のＤＮＡでは観察できなかった。本発明では、Ｂ型の核酸らせんを熱によって不安定化するため、意外にも、鎖交換反応を生じ易くなる。鎖交換反応を改善するペプチドも、記載されている［D.R．Corey，J．Am．Che m．Soc.，9373(1995)］。本発明では、そのようなペプチド配列も用い得る。鎖交換反応を改善するために、ペプチド核酸を用い得ると考えられる［M．Iyer et al.，J．Biol．Chem．270:14712 (1995)］。したがって、一本鎖ではない分子が鋳型として提示される、本発明による方法では、オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、そのような等温反応においてそれ自体で二本鎖の増幅生成物と反応して、新たな不完全な反応物を与え、次いで、それが、直ちに、それぞれの酵素、および他のすべての反応相手と自触媒作用によって反応して、新たな増幅生成物を与える。本発明による方法のために、異なる酵素を単独でか、または組合せて用いてよい。ポリメラーゼを用いるならば、合成は、オリゴヌクレオチドビルディングブロックの３’末端で始まり、鋳型沿いに５’末端への方向に進行する。プライマーの５’末端で合成を開始し、３’末端への方向に進める酵素が存在できると思われる。そのような酵素も、本発明による方法に用い得ると思われる。オリゴヌクレオチドビルディングブロック依存性ＲＮＡポリメラーゼを酵素として用いることも企図できると思われる。リガーゼを用いるならば、概して部分的には、末端にリン酸基を有するオリゴヌクレオチドビルディングブロックを用いる。特定の増幅を得るために、類似の酵素の混合物、または異質の酵素の混合物を一反応に用い得ることも考えられる（例えば、２種類またはそれ以上の異なるポリメラーゼ、もしくはポリメラーゼとリガーゼ）。特定の核酸または核酸配列は、この特定の配列（またはその一部）を鋳型として含む、核酸含有サンプルを用いることによって生成する。ポリメラーゼを用いる場合に、生成しようとする核酸または核酸配列がＤＮＡであるならば、用いて好ましい４種類のヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰである。反応に必要なオリゴヌクレオチド濃度は、変動幅があり得るが、通常、（モル比で表して）鋳型の濃度より高い。大幅なモルの過剰は、通常、反応を改善する。場合により、本発明による方法の最初の段階は、核酸の変性（鎖分離）または転写であってよく、その結果、反応温度へのその後の冷却の際に、鋳型鎖、オリゴヌクレオチドビルディングブロック、場合によりヌクレオチド三リン酸と、それぞれの酵素、好ましくはポリメラーゼおよびリガーゼとの広範囲の接触が可能である。未だ反応液中にないならば、選んだ酵素、および必要とされる化学ビルディングブロックを反応混合物に加え、次いで、適切な反応温度にする。反応条件、特に反応温度は、増幅生成物と化学ビルディングブロックとの間の動的平衡の利点を生かすことによって、鎖分離なしの増幅が可能になるように選ぶ。用いられるオリゴヌクレオチドは、それらの相補的結合部位に向って、二本鎖形態の増幅生成物中に直接ハイブリダイズし、こうして二本鎖形態の増幅生成物をジッパーのように開くと考えられる。特異性のため、通常は、オリゴヌクレオチドビルディングブロックの計算上の鎖解開始温度(Schmelztemperatur)より高い、特定の反応温度を選ぶ。オリゴヌクレオチドビルディングブロックの鎖解開始温度は、異なる方法で算出してよいが、最適の増幅温度は、他の多くの要因（例えば、緩衝液のイオン強度、オリゴヌクレオチドビルディングブロックの濃度、鋳型の長さおよび塩基組成など）に依存する。オリゴヌクレオチドビルディングブロックを、鋳型上で互いにできるだけ近くに位置させる結果、好ましくは、増幅生成物が、用いたオリゴヌクレオチドの長さの合計と、同じ大きさを有すること、すなわちそれより実質的に大きくはならないことが、好都合である。本発明によれば、本発明の方法に用いるためのオリゴヌクレオチドビルディングブロックを含有する試薬キットも提供されるが、オリゴヌクレオチドビルディングブロックと、期待される生成物との鎖解開始温度の差は、２５℃以下、好ましくは２０℃以下、より好ましくは１５℃以下である。オリゴヌクレオチドビルディングブロックと、期待される生成物との鎖解開始温度の差が１０℃以下、好ましくは５℃以下であるならば、特に好ましい。診断の方法のためには、オリゴヌクレオチドビルディングブロックの塩基配列が、標的配列の少なくとも一部に厳密に相補的であるならば、最良である。本発明による方法の利点は、特に、温度サイクルの必要がないため、高価な機器類の必要がなく、標準化するのが容易であり、より大量の反応（１mlまたはそれ以上）を実施することができ、そして最後に、僅か１種類の酵素が必要であるにすぎないということにある。本発明による方法は、当然、ＰＣＲおよびＬＣＲのような慣用の方法はもとより、関連する方法の際にも用いてよい。そうして、増幅段階の温度は、用いるオリゴヌクレオチドの計算上の鎖解開始温度より高いのが好ましい。本発明の多くの特別な形態、例えばnested状のそれ、すなわち、外部のプライマービルディングブロックによる最初の増幅があり、その後、増幅生成物の一部をさらに増幅することがあり得ると考えられる。一つの反応管内での逆転写による増幅の結合も、可能である。増幅生成物の検出は、原則として、ＰＣＲにおけるのと同様に実施してよい。蛍光法は特に適すると思われるが、これは、標識した１または２種類のオリゴヌクレオチドビルディングブロックのエネルギー移動［T．Foerster，Discuss．Fa raday Soc.，27:7 (1959)］または蛍光分極に基づく。標識した化学ビルディングブロックを増幅の際に組込んでおき、この組込みを蛍光測定または発光測定によって検出する蛍光法を用いてもよいと考えられる。ここで、本発明による方法を、いくつかの実施例を用いて説明することにするが、これらの実施例にのみ拘束されるわけではない。実施例１：線状一本鎖ＤＮＡの増幅本実施例は、一定の一本鎖ＤＮＡ分子をin vitroで酵素によって増殖させるのが可能であることを示す。２本の相補的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドビルディングブロックを用いて、二本鎖生成物を形成する。増幅温度と変性温度との間の反応温度の一般的な反復的変化は皆無である。詳細に説明されない手法および方法はすべて、遺伝子工学または分子生物学の方法の収集書に記載されている、標準的手法である[例えば"Molecular Cloning．A Lab oratory Manual"; Sambrook et al.; Cold Spring Harbor Laboratory Press，N ew York (1989); ISBN 0-87969-309-6]。１．１．反応混合物：反応混合物５０μｌを、それぞれ、ピペットで０．５ml反応管（Eppendorf，S afe-Lock）に移した。反応混合物は、下記の組成を有した：１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２０mMのトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）２mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ（PROMEG A，Wisc.、米国）０．１w/v ％のTriton X-100（SERVA,ドイツ国）１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックｕ６７６： 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggC-3' 10pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロック1755: 5'-dCgCCgAAAATgACCCAgAgCgCTgCCggCACCTgTCCTACgAgTTgCATg-3' １fmol 鋳型-DNA: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCCATgCAACTCg-TAggACAggTgCC ggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3' オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ鋳型は、CODON genetic system（Weiden/See 、オーストリア国）より購入した。鋳型ＤＮＡを加えない反応混合物を、負の対照として役立てた。次いで、反応混合物に、鉱油（Sigma、Ｍ−３５１６）１００μｌを重ね、Per kin Elmer CetusのGeneAmp ＰＣＲシステム９６００というサーモスタット上で８４℃に加熱した。反応温度に達したとき、２単位の酵素Deep Vent_R（exo^-）というＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs 、米国）を混合物に加えた。次いで、増幅の速度論を確認するため、個々の試料および負の対照を８４℃で異なる時間インキュベートした。それぞれ１０μｌの反応混合物を、２％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムでの染色、およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。増幅生成物は、ＤＮＡの大きさの標準との比較によって、ただ１本の帯域として特定できた。１．２．増幅の時間的経過：この単一反応混合物の生成物を、電気泳動の後に定量した。定量は、単一反応混合物の連続希釈と、これらの希釈物の相互およびＤＮＡ標準との比較によって実施した。この分析の結果を表１に示す。１．３．増幅生成物の分子クローニングおよび配列決定：増幅の後、反応混合物をフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、次いで、エタノールを用いてＤＮＡを沈澱させた。乾燥したＤＮＡを、１mM のＡＴＰと、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehringer Mannheim) とを１０μｌの最終体積中に含有するリン酸化緩衝液(Boehringer Mannheim)中で３７℃で１時間インキュベートした。次いで、滅菌蒸留水１．５μｌ、１M のＭｇＣｌ₂１．５μｌ、１mMｄＮＴＰ（それぞれ２５０μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ）１μｌおよびクレノウ酵素１μｌ（２単位）を混合物に加え、再び３７℃で１時間インキュベートした。反応混合物を、調製用アガロースゲルで分離し、ＤＮＡの帯域をゲルから精製し、連結反応に用いた。SmaIで消化し、脱リン酸化した生成物のプラスミドベクター（pBluescriptIISK+、Stratagene）内での連結反応を、標準的手法によって実施した。受容能を有する大腸菌ＭＣ１０６１という細菌での形質転換の後、細菌コロニーのいくつかを、配列決定のためのプラスミドＤＮＡの調製用に選んだ。Ｍ１３配列決定用およびＭ１３逆配列決定用プライマー（COD0N 遺伝学システム）でクローニングした生成物の配列決定を、DyeDeoxy Termination法（Applie d Biosystems）に従って、配列決定装置ＡＢＩ３７３Ａを用いて実施した。増幅生成物の配列は下記のとおり読取れた： 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCCATgCAACTCgTAggACAggTgC CggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3'(プラス鎖) および 3'-dCTCggAAgTTgggTCAgTCgAggAAggCCACCCgCgCCCCggTACgTTgAgCATCCTgTCCACg gCCgTCgCgAgACCCAgTAAAAgCCgC-5'(マイナス鎖) こうして、増幅生成物は、２種類のオリゴヌクレオチドビルディングブロックによって規定される配列に厳密に対応することが示された。実施例２：線状二本鎖ＤＮＡの増幅本実施例は、特定の二本鎖ＤＮＡ分子を、変性段階なしに酵素を用いてin vit roで増幅するのが可能であることを示す。２本の相補的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、増幅温度と変性温度との間の反応温度の通常の反復的変化を避けつつ、二本鎖生成物を完全に形成する。２．１．反応混合物：反応混合物５０μｌを、それぞれ、ピペットで０．５ml反応管（Eppendorf，S afe-Lock）に移した。反応混合物は、下記の組成を有した：１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２０mMのトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）２mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ（PROMEG A，Wisc.、米国）０．１％(w/v)のTriton X-100（SERVA, ドイツ国）１０pmolのオリゴヌクレオチド構成素材ｕ６７６： (5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggC-3') 10pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロック1755 (5'-dCgCCgAAAATgACCCAgAgCgCTgCCggCACCTgTCCTACgAgTTgCATg-3') １fmol 鋳型-DNA: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCCATgCAACTCgTAggACAggTgC CggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3' 3'-dCTCggAAgTTgggTCAgTCgAggAAggCCACCCgCgCCCCggTACgTTgAgCATCCTgTCCACg gCCgTCgCgAgACCCAgTAAAAgCCgC-5' 鋳型ＤＮＡを加えない反応混合物を、負の対照として役立てた。次いで、反応混合物に、それぞれ、鉱油（Sigma 、Ｍ−３５１６）１００μｌを重ね、Perkin Elmer CetusのGeneAmp ＰＣＲシステム９６００サーモスタット上で８４℃に加熱した。反応温度に達したとき、２単位の酵素Deep Vent_R（exo^- ）というＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs 、米国）を混合物に加えた。次いで、試料および負の対照を８４℃でさらに１４時間インキュベートした。２．２．可視化それぞれ１０μｌの反応混合物を、２％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムでの染色、およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。増幅生成物は、ＤＮＡの大きさの標準との比較によって、ただ１本の帯域として特定できた。実施例３：二本鎖ＤＮＡの一部の増幅本実施例は、増幅しようとするＤＮＡは、より大きいＤＮＡ片の一部、特にプラスミドの一部であってよいことを示す。制限エンドヌクレアーゼNarI(Boehringer Mannheim)を用いて線状化したプラスミドpUC19 を、鋳型ＤＮＡとして役立てた。用いたオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、下記のとおりであった： M13rev(-48)(5'-dAgCggATAACAATTTCACACAggA-3')および M13iso(5'-dggCgTAATCATggTCATAgCTgTT-3') 反応混合物５０μｌを、ピペットで０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）に移したが、反応混合物は、下記の内容を有した：１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２０mMのトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）２mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ０．１w/v ％のTriton X-100 １０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＭ１３ｒｅｖ（−４８）１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＭ１３ｉｓｏ１ngの鋳型ＤＮＡ。負の対照のために、上記と同じであるが、鋳型ＤＮＡを省いた違いを有する混合物を、ピペットで計り取った。次いで、反応混合物を鉱油（Sigma 、Ｍ−３５１６）１００μｌで覆った。反応混合物をサーモスタットで９５℃に１０分間加熱し（GeneAmp ＰＣＲシステム９６００、Perkin Elmer Cetus）、７０℃に冷却した後、２単位のDeep Vent_R（exo^-）ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs )を、各混合物に加えた。次いで、試料および負の対照を７０℃でさらに１４時間インキュベートした。各混合物１０μｌを２％アガロースゲルで分離した。増幅生成物は、ＤＮＡの大きさの標準との比較によって、単一帯域として特定することができ、臭化エチジウムによる染色、およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。実施例４：ウイルス特異的ｃＤＮＡ配列の増幅によるＲＮＡウイルスの検出本実施例は、本発明による方法での鋳型として、ｃＤＮＡを用い得ることを示す。特異的な固定化抗体を用いて、ＲＮＡウイルス（ブドウ扇状葉ウイルスgrap evine fanleaf virus 、ＧＦＬＶ）を未精製植物抽出物から単離する。次いで、熱および洗剤処理によってウイルスＲＮＡを遊離させ、特異的オリゴデオキシヌクレオチドを用いて逆転写させる。次いで、ｃＤＮＡを等温で増幅する。４．１．特異的血清による表面の被覆ＧＦＬＶ血清（Bioreba，Basel、スイス国；０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液、 pH９．６中に１：５００に希釈）１２０μｌを、プラスチックの反応管（０．５ml；Multi-Technology，Salt Lake City、米国）にピペットで計り入れ、次いで、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＴＰＢＳ（１３７ mMＮａＣｌ、２．７mMＫＣｌ、１０mMリン酸ナトリウム；０．１w/v ％のTween 20；pH７．４）で管を３回洗浄した後、ＰＢＳ（１３７mMＮａＣｌ、２．７mMＫＣｌ、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）で２回洗浄した。４．２．プレコートした反応管内でのサンプルのインキュベートブドウの葉のサンプル(Vitis vinifera cv．French Colombard)を、ＧＦＬＶ −ＥＬＩＳＡ（Bioreba 、スイス国）を用いて、ＧＦＬＶによる感染について試験した。プレコートした各管に、感染および非感染ブドウの葉の抽出物それぞれ１００ μｌをピペットで計り入れ、４℃で２時間インキュベートした。次いで、ＴＰＢＳで３回、およびＰＢＳで２回、抗体を洗浄した。４．３．用いたオリゴヌクレオチドビルディングブロック：オリゴヌクレオチドビルディングブロックは、ブドウ扇状葉ウイルスの被覆タンパク質遺伝子の一部を増幅する。 "3'-BINE":5'-dCTAgAgTgggAAACTggTTC-3' (EMBL Accession Nr.X16907，塩基 3543-3562) "GFLV5'-ENIB":5'-dgTCCAggCTTTAgCTTTTATggTA-3' (EMBL Accession Nr.X16907，塩基 3519-3542)４．４．逆転写：各反応管に、ＲＴ緩衝液(５０mMトリスＨＣｌ、pH８．３、７．５mMＭｇＣｌ₂ )２０μｌを、追加の１mMｄＣＴＰ、１mMｄＡＴＰ、１mMｄＧＴＰ、１mMＴＴＰ、２０pmolの「３’−ＢＩＮＥ」オリゴヌクレオチドビルディングブロック、１０単位のＲＮアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）、１０単位の酵素であるＡＭＶ逆転写酵素（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）、および０．５％Triton X-100とともにピペットで計り入れた。反応混合物を６５℃で１０分間、次いで４２℃で１０分間インキュベートした。４．５．１．Deep Vent_R(exo^-)ＤＮＡポリメラーゼによる等温ＤＮＡ増幅それぞれの反応混合物に、ＰＣＲ緩衝液［１０mM(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２０mMトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）、２mMＭｇＳＯ₄、０．１w/v％のTriton X-100］８０μｌを、追加の２０pmolのオリゴヌクレオチド「３’−ＢＩＮＥ」、２０pm olのオリゴヌクレオチド「ＧＦＬＶ５’−ＥＮＩＢ」および４単位のDeep Vent_R （exo^-）ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)とともにピペットで計り入れた。反応混合物を軽質鉱油(Sigma)７０μｌで覆い、直ちに６８℃に加熱し、この温度で１６時間インキュベートする。４．５．２．Taq ＤＮＡポリメラーゼによる等温ＤＮＡ増幅それぞれの反応混合物に、ＰＣＲ緩衝液［１０mMトリスＨＣｌ、５０mMＫＣｌ、１．５mMＭｇＣｌ₂（２０℃でpH８．３）］８０μｌを、追加の２０pmolのオリゴヌクレオチド「３’−ＢＩＮＥ」、２０pmolのオリゴヌクレオチド「ＧＦＬＶ５’−ＥＮＩＢ」および５単位の酵素Taq ＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer Ma nnheim)とともにピペットで計り入れた。反応混合物を軽質鉱油(Sigma)７０μｌで覆い、直ちに６８℃に加熱し、この温度で１６時間インキュベートする。４．６．結果：それぞれの反応混合物１０μｌを、電気泳動によって２％アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウムによる染色、および蛍光励起によって、反応生成物を可視化した。感染した植物材料を有するサンプルの場合、結果は可視帯域であって、帯域の長さは、４４塩基対に達した（ＤＮＡ標準の「５０塩基対ラダー」、USB，Ohio との比較による）。非感染植物からの植物抽出物を有するサンプルは、電気泳動で帯域を示さなかった。実施例５：ゲノムＤＮＡのgen 領域の増幅本実施例は、等温ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡのgen 領域を増幅するのが可能であることを示す。５．１．ゲノムＤＮＡの調製：細胞系Ａ−４９８（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ４４、ヒト腎臓癌腫）のＤＮＡを標準的方法に従って調製した。この調製物を鋳型ＤＮＡとして用いた。５．２．オリゴヌクレオチドビルディングブロック： appr:5'-dgCCTAATTCTCTCATAgTCTTAATTCCCAC-3' appl-iso:5'-dAggTAggTAAACTTgACTgCATgTTTCCAA-3'５．３．反応：反応混合物１００μｌを０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock、ドイツ国）にピペットで計り入れたが、反応混合物は下記の組成を有した：１０mMの(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ２０mMのトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）２mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ５μM のビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim）０．１w/v ％のTriton X-100 １０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックａｐｐｒ１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックａｐｐｌ−ｉｓｏ５μg の鋳型ＤＮＡ。負の対照として、上記と同じ混合物であるが、鋳型ＤＮＡを省いた違いを有する混合物を、ピペットで計り取った。次いで、反応混合物を鉱油（Sigma 、Ｍ− ３５１６）１００μｌで覆った。次いで、混合物を９８℃で１０分間加熱し、次いで６８℃まで冷却し、その後２単位の酵素Deep Vent_R(exo^-)ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を混合物のそれぞれに加えた。その後、サンプルおよび負の対照を６８℃で１４時間さらにインキュベートした。５．４．反応の解析：次いで、各反応混合物９０μｌを、スロットブロット装置（Hoefer Scientifi c;ＰＲ６００ Slot Blot）を用いてニトロセルロース膜（Hoefer Scientific In struments，ＴＭ−ＮＣ２）上にスポットし、その後、膜を真空オーブン中で８０℃に３０分間加熱した。次いで、５w/v ％の脱脂乳粉末（Fixmilch mager、オーストリア国Maresiより）を加えたＰＢＳ中で、膜を室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄した。ＴＰＢＳへのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ結合体（Amersham、英国、１：１０００希釈）とともに、室温で３０分間さらにインキュベートした後、ＰＢＳでの５段階の洗浄を後続させた。次いで、０．１M 炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．６へのニトロ−ブルー−テトラゾリウム (０．２mg/ml)および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル＝ホスフェート(０．２mg/ml)、４mMＭｇＣｌ₂で展色した。３０分の展色時間の後、ヒトゲノムＤＮＡを含有する反応では、スポットに鮮明な青色を認めることができるが、負の対照は全く色を示さない。反応混合物のそれ以上の分析は、多少の非特異的反応生成物を示したため、特異的増幅の量は、厳密に決定できなかった。下記の反応条件下では、ゲノムＤＮＡからの増幅をはるかに特異的に実施することができた（反応混合物５０μｌ）：２０mMのトリスＨＣｌ（pH８．８）５mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ１００μM のｄＮＴＰ類０．１w/v ％のTriton X-100 １０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックａｐｐｒ１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックａｐｐｌ−ｉｓｏ１０ngの鋳型ＤＮＡ９６℃で２０分の変性、この間に、２単位のDeep Vent_R(exo^-)ＤＮＡポリメラーゼの添加、その後、７７℃で１時間のインキュベート。生成物は、電気泳動の後、単一帯域として明らかになる。実施例６：点突然変異の検出本実施例は、本発明による方法によって、点突然変異を検出するのが可能であることを示す。６．１．オリゴヌクレオチドビルディングブロック： "3'-BINE": 5'-dCTAgAgTgggAAACTggTTC-3' "GFLV5'-ENIB": 5'-dgTCCAggCTTTAgCTTTTATggTA-3' "GFLV5'-ENIBmut": 5'-dgTCCAggCTTTAgCTTTTATggTC-3'６．２．鋳型：合成オリゴヌクレオチドを鋳型として役立てた。２種類のオリゴヌクレオチドは、第２４位のただ１個の塩基が異なる： BA: 5'-GTCCAGGCTTTAGCTTTTATGGTAGAACCAGTTTCCCACTCTAG-3' IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIIIIIIIIIII BC: 5'-GTCCAGGCTTTAGCTTTTATGGTCGAACCAGTTTCCCACTCTAG-3'６．３．反応混合物：反応混合物５０μｌを、０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）にピペットで計り入れたが、反応混合物は下記の組成を有した：１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２０mMのトリスＨＣｌ（２５℃でpH８．８）２mMのＭｇＳＯ₄ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ０．１w/v ％のTriton X-100 １０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロック３’−ＢＩＮＥ１０pmolのビルディングブロックＧＦＬＶ５’−ＥＮＩＢ、または１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＧＦＬＶ５’−ＥＮＩＢｍｕｔ約１fmolの鋳型ＤＮＡ（ＢＡまたはＢＣ）。負の対照として、上記と同じであるが、鋳型ＤＮＡを省いた違いを有する反応混合物を、ピペットで計り取った。次いで、反応を鉱油（Sigma 、Ｍ−３５１６）１００μｌで覆った。混合物を、サーモスタット（GeneAmp ＰＣＲシステム９６００、Perkin Elmer Cetus）で９５℃に１０分間加熱し、次いで７０℃に冷却し、２単位のDeep Vent_R（exo^-）ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を加えた。その後、試料および負の対照を６８℃でさらに１４時間インキュベートした。各混合物１０μｌを２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムによる染色、およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。ＤＮＡ長さ標準との比較によって、増幅生成物は、単一の帯域として特定することができた。結果を表２に要約する：実施例７：線状一本鎖ＤＮＡの増幅本実施例は、特定の一本鎖ＤＮＡ分子の酵素によるin vitro増幅は、たとえその長さが、両オリゴヌクレオチド構成素材の長さの合計より大であっても、可能であることを示す。ここでは、２本の相補鎖に結合する２種類のオリゴヌクレオチドビルディングブロックを用いて、反応温度を変えることなく、二本鎖分子を形成する。７．１．反応混合物：反応混合物５０μｌを、０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）にピペットで計り入れたが、反応混合物は下記の組成を有した：５０mMのＫＣｌ１０mMのトリスＨＣｌ（２０℃でpH８．３）１．５mMのＭｇＣｌ₂ それぞれ２００μM のＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ１０pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックｕ６７。 (5'-dCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCg-3') 10pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロック174 (5'-dCgCTgCCggCACCTgTCCTACgAgTTgCATgA-3') １fmol 鋳型-DNA: 5'CAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCATgACTATCgTCgCCgCACTTATgACTg TCTTCTTTATCATgCAACTCgTAggACAggTgCCggCAgCg-3' 鋳型ＤＮＡの添加なしの反応混合物を、負の対照として役立てた。オリゴヌクレオチドビルディングブロックおよびＤＮＡ鋳型は、CODON genetic sy stemによって化学的に合成された。次いで、反応混合物を鉱油（Sigma 、Ｍ−３５１６）１００μｌで覆い、Perkin Elmer CetusのGeneAmp ＰＣＲシステム９６００サーモスタットで８４℃に加熱した。反応温度に達した後、５単位の酵素Ta q ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を混合物に加え、次いで、１種類の試料、および負の対照を、増幅の時間的経過を評価できるよう、８４℃で様々な期間にわたってさらにインキュベートした。各混合物１０μｌを２％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。ＤＮＡ標準との比較によって、増幅生成物を単一の帯域として特定することができた。実施例８：鋳型依存性ＤＮＡ連結反応による特定のＤＮＡ配列の検出８．１．オリゴヌクレオチドおよび鋳型：すべてのオリゴヌクレオチドビルディングブロックおよび鋳型ＤＮＡは、CODO N genetic systemより購入した。オリゴヌクレオチドＡおよびＤは、５’末端で化学的にリン酸化する。オリゴヌクレオチド： A:5'-pdTTgTgCCACgCggTTgggAATgTA-3' B:5'-dAgCAACgACTgTTTgCCCgCCAgTTg-3' C:5'-dTACATTCCCAACCgCgTggCACAAC-3' D:5'-pdAACTggCgggCAAACAgTCgTTgCT-3' 鋳型DNA: 5'-dTACATTCCCAACCgCgTggCACAACAACTggCgggCAAACAgTCgTTgCT-3' 反応混合物：２０mMトリスＨＣｌ（pH７．５）、２０mMＫＣｌ、１０mMＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴＴ０．１％ＮＰ−４０（洗剤）、０．１mMのｒＡＴＰオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：各１pmol 鋳型（反応あたり１００fmol）鋳型ＤＮＡなしの負の対照。反応混合物(１９μl)を７０℃に加熱し、次いで、４単位(１μl)のPfu ＤＮＡリガーゼ（Stratagene、米国）の添加によって、反応を開始した。反応を７０℃ で６０分間実施した。インキュベート後、反応混合物を数分間、室温まで冷却させた。次いで、反応混合物それぞれ１０μｌを、ゲル電気泳動によって分析した（４℃で０．５倍のＴＢＥ緩衝液への２％標準ＥＥＯアガロース、および５V/cm 、１０分の予備実施）。結果：本発明による記載の混合物は、２５サイクル後のリガーゼ連鎖反応（９２℃− ２０秒；６０℃−２０秒；Stratagene ＬＣＲキット）と同じ結果を与えた。実施例９：ｃＤＮＡの逆転写、およびその後の等温増幅によるＨＩＶ I ＲＮＡの検出非感染性ＲＮＡを、ＨＩＶＩ標準ベクターからin vitroで転写し、次いで希釈物として、特定のＲＮＡの検出を特徴付けるのに用いた。ｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写の後、等温ＤＮＡ増幅は、アガロースゲル電気泳動によって検出できるＤＮＡ断片を生じた。検出限界は、０．００１アトモル未満である。９．１．in vitro転写によるＲＮＡの生成 in vitro転写のための出発材料は、ベクターpBH10であって、約９kbpのＨＩＶ I ｃＤＮＡがSacI部位で組込まれている[Hahn et al.，1984，Nature 312:16 6]。このベクターを、標準的手法を用いて増幅し、精製し、BglIによる制限消化によって線状化した。ＳＰ６というＲＮＡポリメラーゼによる転写は、ＨＩＶ配列の約５０塩基上流にあり、下流の次のBglI 部位まで延伸する特異的プロモーター領域でこうして線状化されたベクターに対して開始される。したがって、得られる転写体は、クローニングされた完全なウイルス配列に加えて、多重クローニング部位から上流の５０塩基とともに残余ベクターから下流の１，４７０塩基を含む（pBH10 はpSP64 、Promega 、米国の誘導体である）。こうして転写されたＲＮＡの長さは、約１０，２００塩基であり、分子量は約３，０６０，０００ダルトンである。９．２．反応混合物 in vitro転写のために、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）による処理によって、すべての溶液およびプラスチック物品をＲＮアーゼ活性から解放した。水またはそれぞれの水溶液への０．１体積％という濃度のＤＥＰＣによって、室温で終夜反応させ、反応しなかったＤＥＰＣは、１２１℃で１２０分間オートクレーブ処理することによって破壊した。反応混合物１００μｌは、下記の組成を含む：線状化したベクターpBH10／BglI０．５μg それぞれ１mMのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ（Boehringer Mannhei m 、ドイツ国）４０単位のＲＮＡsin というＲＮアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）２０単位のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）１０倍に濃縮した反応緩衝液（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）１１μｌ。この混合物を３７℃で１４時間インキュベートした。次いで、５０単位のＤＮａｓＩを加え、３７℃で２時間インキュベートした。０．５MＥＤＴＡ溶液（pH８．０）の添加によって、ＥＤＴＡおよび濃度を２０mMで水平化し、混合物を６５℃に１０分間加熱した。続いて、３M 酢酸ナトリウム０．１容およびエタノール２．５容による２回のエタノール沈澱を実施した。−２０℃で３０分以内の沈澱の形成の後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離を実施し、ペレットを７０体積％エタノール５００ μｌ中で洗浄した。第二の沈澱の後、２５μｌに減らした体積の水に再溶解した。転写体の濃度を光度測定によって決定した。本実施例に用いたＲＮＡサンプルは、１００倍の体積への希釈の後、２６０nmの波長で水に対して０．０９２の吸光係数を示した。したがって、希釈しなかった溶液中の一本鎖ＲＮＡの、０．４ μg/μｌの濃度を推定することができる。得られたサンプルは、５μｌのアリコートとして、−２０℃で２ケ月間まで貯蔵した。９．３．等温増幅によるＨＩＶＩ配列を有するＲＮＡの検出検出は、ウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、およびその後のＤＮＡの等温増幅を含む。本実施例では、オリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｕ６９９で逆転写を開始する。増幅は、このオリゴヌクレオチドビルディングブロックと、第二のオリゴヌクレオチドであるＨＢ１０１Ｌ７２５との間で進行する。必要とされる装置は、０．５℃の精度で定常温度を有する加熱ブロック、または相当する水浴、ならびにアガロースゲル電気泳動のための標準的装置である。９．４．反応混合物ウイルス配列を有する転写体を、希釈範囲が１μｌあたり１フェムトモル〜０．００１アトモルとなるように、氷冷水で希釈した。希釈物は、その使用の直前に調製した。それぞれ１μｌのＲＮＡ希釈物を、逆転写混合物７μｌを収容する０．５mlエッペンドルフ反応管中で形質転換した。サンプルとともに、逆転写のための８μｌの体積は下記の組成を有した：１０mMのトリスＨＣｌ緩衝液（pH８．８）５０mMのＫＣｌ４mMのＭｇＣｌ₂ ０．６w/v ％のTriton X-100（Sigma Chemicals 、米国）それぞれ０．５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（PROMEG A 、米国）８pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｕ６９９６０単位のＲＮＡsin（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）２単位のＡＭＶ逆転写酵素（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）。反応混合物を軽質鉱油（Sigma Chemicals 、米国）５０μｌで覆い、サーモサイクラー（Trioblock TBl 、Biometra、ドイツ国）で下記のプログラムに付した：６５℃で１０分間、４２℃に保つ。４２℃で２０分後、エッペンドルフ管をサーモサイクラー上に放置し、増幅混合物２５μｌを無作為に加えた。次いで、反応混合物を７２℃で９時間インキュベートした。増幅混合物：２０mMのトリスＨＣｌ緩衝液、pH８．９１０mMのＫＣｌ１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４mMのＭｇＣｌ₂ ０．１w/v ％のTriton X-100（Sigma Chemicals 、米国）それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）１pmol/μｌのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｌ７２５０．８pmol/μｌのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｕ６９９２５μｌあたり０．７５単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannh eim 、ドイツ国）用いたオリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置（Applied Biosys tems、米国）で、下記の配列を用いて合成した： HB101U699 5'-dAgC CAT gCA AAT gTT AAA AgA gAC CA-3'および HB101L725 5'-dCCC ATT CTg CAg CTT CTT CAT TgA-3' 増幅したＤＮＡ溶液を、電気泳動を用いて、標準的条件で分析した。それぞれ２０μｌの反応混合物に、ローディング緩衝液４μｌを加え、０．５倍のＴＢＥ緩衝液への２％アガロースゲル中で、５Ｖ／cmで分離した。ゲル上のＤＮＡを、臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。０．５×ＴＢＥ緩衝液ローディング緩衝液４５mMトリス４０w/v ％ショ糖４５mMホウ酸０．０５w/v ％ブロモフェノールブルー１mMＥＤＴＡその結果、図１は、列２〜８での５０塩基対長の単一帯域の外見を示すが、それらは、ＨＩＶ−Ｉ配列を有する１fmol、１００amol、１０amol、１amol、０．１amol、０．０１amolおよび０．００１amolのＲＮＡの希釈段階での１fmol（列２）〜０．００１amol（列８）のＲＮＡの量に相当する。列１および１０は、サイクル的な熱変性（「ＰＣＲ」）によるＤＮＡ増幅からの５０および８３塩基長の参照帯域を示す。希釈に用いた水１μｌから作成した盲検対照は、列９および１１にある。列１２は、逆転写酵素である酵素なしの盲検増幅からの結果を示し、列１３は、Taq ＤＮＡポリメラーゼを加えない盲検対照を示す。実施例１０：固相での等温ＤＮＡ増幅を用いたＤＮＡの検出一方は、プラスチック表面に固定化され、相補的な他方は、溶液中に遊離している２種類のオリゴヌクレオチドの間で、標的ＤＮＡ断片を等温的に増幅する。検出のために、固定化生成物を、標識したプローブとハイブリダイズさせた。標識は、免疫学的手段によって検出する。１０．１．固相でのＤＮＡの等温増幅：等温ＤＮＡ増幅のために、オリゴヌクレオチドＨＢ１０１７２５ｂｉｏを５’ 末端でビオチン化し、ストレプトアビジンで被覆したマイクロプレート（Xenopr obe 、Xenopore、米国）上へと固定化し、５０pmolのオリゴヌクレオチドを１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳＥ．ＴＷ緩衝液に希釈し、１時間緩慢に攪拌した。ＰＢＳＥ．ＴＷ２５０μｌでの８回の洗浄によって、結合しなかったオリゴヌクレオチドを除去した。１×ＰＢＳＥ．ＴＷ、pH７．４は：８mMのＮａ₂ＨＰＯ₄ ２mMのＫＨ₂ＰＯ₄ １３７mMのＮａＣｌ３mMのＫＣｌ１．５mMのＥＤＴＡ０．１w/v ％のTween 20（Merck 、ドイツ国）を含有する。洗浄したプレートを、１ウェルあたり２００μｌの１×増幅緩衝液を用いて、７２℃で３０分間平衡させた：１×増幅緩衝液：２０mMのトリスＨＣｌ緩衝液、pH８．９１０mMのＫＣｌ１０mMの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２mMのＭｇＳＯ₄ ０．１w/v ％のTriton X-100（Sigma Chemicals 、米国）。増幅反応のために、この増幅緩衝液を１ウェルあたり１００μｌの増幅混合物で置き換え、検出しようとする断片を３種類の異なる希釈物に、それぞれ１μｌの溶液として加えた。マイクロタイタプレートを振盪し、蒸発に対抗してプラスチックシール（Nunc、デンマーク国）で覆い、７２℃で１５時間インキュベートした：増幅混合物：それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Boehri nger Mannheim 、ドイツ国）１pmol/μｌのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｕ６９９１００μｌあたり１．５単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannh eim 、ドイツ国）を含有する１×増幅緩衝液。用いたオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、ＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems、米国）で、下記の配列を用いて合成した： HB101U699:5'-dAgC CAT gCA AAT gTT AAA AgA gAC CA-3'; HB101L725bio: 5'-dCCC ATT CTg CAg CTT CTT CAT TgA-3',5'末端でビオチン化; 検出オリゴ：５′末端で６−カルボキシフルオレセイン標識した、 5'-dgTT AAA AgA gAC CAT CAA TgA ggA Ag-3',１０．２．固相に固定化された増幅ＤＮＡの検出増幅後に、マイクロタイタプレートをＰＢＳＥ．ＴＷで３回洗浄し、ハイブリダイゼーションのために同じ緩衝系で予め条件を整えた：０．１mg/ml の直前に変性させたニシン精子ＤＮＡ（Boehringer Mannheim 、ドイツ国）をＰＢＳＥ．ＴＷに溶解し、１ウェルあたり２００μｌの条件調整液を３０分間加え、５００ rpm での攪拌下、５０℃でインキュベートした。ハイブリダイゼーションのために、１ウェルあたり１００μｌの条件調整液を１ウェルあたり５pmolの検出オリゴとともに用いた。上記の条件下で３０分のハイブリダイゼーションの後、プレートを、５０℃でのＰＢＳＥ．ＴＷ２５０μｌで１０分間の洗浄を５回実施した。免疫学的検出のためには、１ウェルあたり２５０μｌの、ＰＢＳＥへの３％カシトーン（casitone）（Difco 、米国）（遮断液）でプレートを遮断した。室温で３０分の遮断の後、遮断液で１：２０００に希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（DAKO、デンマーク国）に結合させた抗フルオレセインイソチオシアネート抗体とともに、ウェルをインキュベートした。ＰＢＳＥ．ＴＷで５回の洗浄の後、各ウェルに、ペルオキシダーゼ基質（Immu noPure、Pierce、米国）１１０μｌを加え、２５分間インキュベートした。４規定硫酸１１０μｌで酵素反応を停上した後、吸光度の差を４５０nmで測定した。事前のＤＮＡ増幅なしのハイブリダイゼーション後の抗体結合体の消衰を減じた後、下記の結果が得られた：１０．３．データの解釈鋳型の最初の量と相関させて、吸光度の差の増加を測定した（第１、２、３および４行を参照されたい）。本発明による方法は、固相上の少量の鋳型を等温的に増幅することができる。得られた値の意義を立証するため、追加の盲検対照を実施した。Taq ＤＮＡポリメラーゼの省略下での（第５行）、およびTaq ＤＮＡポリメラーゼなし、かつオリゴヌクレオチドＨＢ１０１Ｕ６９９なしでの（第６行）不完全な盲検対照は、それぞれ、最大量の鋳型の使用（１fmol）に基づいており、鋳型なしの完全な反応の盲検対照（第４行）より低い。したがって、得られた結果（第１、２、３、４行）は、増幅およびハイブリダイゼーションからのヌクレオチド成分による干渉量と重なり合うことはない。実施例１１：部分的に重複するオリゴヌクレオチド対を用いる等温増幅によるＤＮＡの検出この実施例は、部分的に重複する本発明の等温ＤＮＡ増幅の有用性を実証する。塩基配列が部分的に重複するオリゴヌクレオチドの組合せを使用して、オリゴヌクレオチドに相同性である標的ＤＮＡにおける領域の重複により、両方のオリゴヌクレオチドの合計の長さよりも短い長さの断片を増幅した。１１．１．オリゴヌクレオチドビルディングブロックオリゴヌクレオチドをＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザ(Applied Biosystems ，USA)上で合成した。配列は以下のとおり： HIVLAP1 5'-dAAT AgT AAg AAT gTA TAg CCC TAC CAg CAT-3'および HIVLAP2 5'-dTTT Tgg TCC TTg TCT TAT gTC CAg AAT-3' 増幅に際し、２個の３’末端塩基（下線）が重複する情報を形成するようなオリゴヌクレオチドどうしを選択した。増幅生成物は、オリゴヌクレオチドＨＩＶＬＡＰ１が先頭にある鎖に配列を有していた。 5'-dAAT AgT AAg AAT gTA TAg CCC TAC CAg CAT TCT ggA CAT AAg ACA Agg ACC AAA A-3' 等温増幅に用いた鋳型は、これらのオリゴヌクレオチドを用いてＨＩＶ−Ｉ− ｃＤＮＡからサイクル熱変性増幅（ＰＣＲ）によって製造された二本鎖ＤＮＡ断片であった。プラスミドｐＢＨ１０(Hahn et al.，1984，Nature 312:166)がこの反応の鋳型として働いた。この鋳型の希釈物１μｌを増幅配合物（以下参照）３３μｌと混合し、軽質鉱油（Sigma Chemicals，USA）５０μｌでオーバレイし、７０℃で１５時間インキュベートした。増幅混合物２０mMトリス−ＨＣｌ緩衝剤、pH８．９１０mMＫＣｌ１０mM（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２mMＭｇＳＯ₄ ０．１％(w/v)Triton X-100（Sigma Chemicals，USA）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Boehringer Mannheim，Ger many）各０．２mM ０．２pmol/μｌオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＩＶＬＡＰ１０．２pmol/μｌオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＩＶＬＡＰ２３３μｌあたり０．５単位Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim ，Germany）増幅したＤＮＡ溶液を標準条件下で電気泳動によって分析した。反応混合物各２０μｌを試料緩衝剤４μｌで処理し、０．５倍ＴＢＥ緩衝液中、２％アガロースゲル中５Ｖ／cmで分離した。臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析によってＤＮＡをゲル上で可視化した。０．５×ＴＢＥ緩衝剤試料緩衝液４５mMトリス４０％(w/v)ショ糖４５mMホウ酸０．０５％(w/v)ブロモフェノールブルー１mMＥＤＴＡ電気泳動は、１０fmolの鋳型量で、増幅したＤＮＡの強いバンドを示し、１fm olの鋳型量で、充分に検出可能な生成物のバンドを示したが、水を盲対照として使用した場合、バンドをまったく示さなかった。長さ５０塩基の標準に比較して僅かに遅い泳動速度により、形成された生成物の正しい長さ（５５塩基）を推定した。実施例１２：逆転写ののち、修飾オリゴヌクレオチドを用いるｃＤＮＡの等温増幅によるＨＩＶ−１ＲＮＡの検出非感染性ＲＮＡをＨＩＶ１標準ベクターからインビトロ転写し、特定のＲＮＡ検出系の特性決定に使用した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写したのち、等温ＤＮＡ増幅によってビオチン化ＤＮＡ断片を得た。形成した断片をストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタプレートに結合させ、蛍光標識プローブとでハイブリダイズし、抗フルオレセイン抗体酵素結合体によって検出した。ＲＮＡの検出限界は０．１amol未満であった。１２．１．インビトロ転写によるＲＮＡの製造この工程は実施例９の９．１および９．２に記載されているが、この実施例でも変更せずに使用した。１２．２．ＨＩＶ１配列を含むＲＮＡからの核酸の等温増幅この工程は実施例９の９．３および９．４に記載されているが、二つの変更を加えて使用した。１２．２．１．等温増幅に使用する第二のオリゴヌクレオチドビルディングブロックを５’末端でビオチン化した。ＢＨ１０１Ｌ７２５ｂｉｏ１２．２．２．ウイルス配列を有する転写生成物の二つの希釈物を製造し、実験に使用した。１０amol/μｌおよび０．１amol/μｌ使用するオリゴヌクレオチドビルディングブロックをＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザ（Applied Biosystems，USA ）上で合成した。配列は以下のとおり： HB101U699:5'-dAgC CAT gCA AAT gTT AAA AgA gAC CA-3'および HB101L725Bio:5'-dCCC ATT CTg CAg CTT CTT CAT TgA-3', ５′末端でビオチン化検出プローブ：５’−ｄｇＴＴＡＡＡＡｇＡｇＡＣＣＡＴＣＡＡＴｇＡｇｇＡＡｇ−３’，５’末端の６−カルボキシ−フルオレセイン−標識（６−ＦＡＭ Amidite を用いる合成、Applied Biosystems，USA）１２．３．固相における増幅ＤＮＡの検出ビオチン化ＤＮＡ生成物の結合のため、ストレプトアビジンを添加したマイクロタイタプレート（Xenoprobe，Xenopore，USA）をＰＢＳＥ．ＴＷで２回洗浄した。増幅したＤＮＡ溶液を９容量部のＰＢＳＥ．ＴＷ緩衝液で希釈し、ＰＢＳＥ．ＴＷ１００μｌ中この溶液１μｌを５分間煮沸することによって変性した。マイクロタイタプレートの各ウェルに、変性溶液の全１００μｌをピペットで移し、５０rpm で３０分間振とうした。プレートをＰＢＳＥ．ＴＷで２回洗浄し、検出オリゴとでハイブリダイズさせた。その後、ハイブリダイゼーションおよび抗体反応によってＤＮＡ断片を検出する方法の以下の工程は、実施例１０の１０．２に記載されているが、以下の三つの方法で変更して使用した。１２．３．１．検出プローブの濃度をウェルあたり２．５pmolにした。１２．３．２．西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗フルオレセインイソチオシアネート抗体の希釈を１：５，０００にした。１２．３．３．ペルオキシダーゼ基質における発色のインキュベーション期間を８０分にした。１２．４．データの解釈鋳型の出発量に相関して増大する消衰差を計測した。記載する方法は、ビオチン化によって修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックを生成物に組込みながら、少量の核酸を等温増幅するのに使用することができる。増幅したＤＮＡは、修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックが必要であるいかなる検出方法によっても検出しやすい。この実施例では、増幅したＤＮＡをビオチン基によって固相に結合し、ハイブリダイゼーションによって定量した。盲対照は、以下のように説明することができる。ライン３は、ＲＮＡ鋳型だけが除かれた最も完成したブランクを表す。ライン４はライン３に対応し、さらにTaq ＤＮＡポリメラーゼを除くが、ライン１、２および３の値に対し、１０倍の量の増幅反応が使用された。ライン５および６は、抗体−ペルオキシダーゼ結合体ありのハイブリダイゼーションおよび抗体−ペルオキシダーゼ結合体なしのハイブリダイゼーションの検出からの盲対照を特徴付ける。実施例１３：修飾されたオリゴヌクレオチドを用いる等温増幅による配列特異的ＤＮＡ検出ビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して標的ＤＮＡを等温増幅し、形成した断片を、ハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドを添加したマイクロタイタプレート上に捕捉した。修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックに結合するストレプトアビジン−酵素結合体を用いて、増幅したＤＮＡの検出を実施した。１３．１．修飾されたオリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡの等温増幅等温増幅の鋳型は、熱変性増幅（ＰＣＲ）により、ヒトＤＮＡからオリゴヌクレオチドビルディングブロックＡｐｐ１３０およびＡｐｐｒ３０によって製造しておいたＤＮＡ断片であった。２０、２および０．２fmol/μｌの鋳型希釈物を製造し、各１μｌを増幅配合物５０μｌに添加した。配合物を鉱油（Sigma Chemicals，USA）５０μｌでオーバレイし、サーモサイクラ（TB1，Biometra，Germany）中、７７℃で９０分間インキュベートした。増幅混合物２０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液、pH８．８２mMＭｇＳＯ₄ ０．１％(w/v)Triton X-100（Sigma Chemicals，USA）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Promega，USA）各０．２mM ０．２pmol/μｌオリゴヌクレオチドビルディングブロックＡｐｐｌ３０ｂｉｏ０．２pmol/μｌオリゴヌクレオチドビルディングブロックＡｐｐｒ３０ Deep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼ（NEB，USA）５０μｌあたり２単位使用するオリゴヌクレオチド構成単位をＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザ（Ap plied Biosystems，USA ）上で製造した。配列は以下のとおり。 Appl30Bio:5'-dAgg TAg gTA AAC TTg ACT gCA TgT TTC CAA-3'; ５′末端でビオチン化、 Appl30:5'-dAgg TAg gTA AAC TTg ACT gCA TgT TTC CAA-3', Appr30:5'-dgCC TAA TTC TCT CAT AgT CTT AAT TCC CAC-3',および AppCap:５′末端で化学的にリン酸化した、 5'-dgTC TTA ATT CCC ACT Tgg AAA CAT gCA-3', １３．２．固相における増幅ＤＮＡの検出増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションによってマイクロタイタプレートの表面で捕捉した。このために、捕捉したオリゴヌクレオチド（ＡｐｐＣａｐ、上記参照）のプレートに対する化学カップリングを実施した。カップリング手順第二級アミノ基を有するマイクロタイタプレート（CovaLink NH，Nunc，Denma rk）に、イミダゾール緩衝液（０．１M Ｎ−メチルイミダゾール、pH７．０）５０μｌ中、ウェルあたり５pmolのオリゴヌクレオチドビルディングブロックＡｐｐＣａｐを添加した。イミダゾール緩衝液中２％(w/v)１−エチル−３−（３− ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド溶液５０μｌの添加によってカップリングを開始し、室温で３時間振とうした。その後、０．４N ＮａＯＨおよび０．２５％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムで６回洗浄し、ＰＢＳＥ．ＴＷ緩衝剤で６回洗浄したのち、蒸留水で３回洗浄することにより、プレートを浄化した。１×ＰＢＳＥ．ＴＷ、pH７．４は、以下を含有するものであった。８mMＮａ₂ＨＰＯ₄ ２mMＫＨ₂ＨＰＯ₄ １３７mMＮａＣｌ３mMＫＣｌ１．５mMＥＤＴＡ０．１％(w/v)Tween 20（Merck，Germany）検出反応：変性したばかりのニシン精子ＤＮＡをＰＢＳＥ．ＴＷに溶解し(０．１mg/ml)、ウェルあたりこの溶液１７０μｌを、５０℃、５００rpmで１５分間振とうしながらインキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションに備えてプレートを事前に状態調節した。ハイブリダイゼーションのために、増幅したＤＮＡ溶液を、５分間煮沸することによって変性した。ウェル１個に対し、新しい状態調節溶液１００μｌ中に変性溶液１μｌを使用した。５０℃、５００rpm で振とうしながら１２０分間のハイブリダイゼーションののち、プレートを、５０℃で１０分間、ＰＢＳＥ．ＴＷ２００μｌで３回洗浄した。等温増幅の生成物のこうして固定されたビオチン化鎖の検出のため、プレートを、室温で１０分間、ＰＢＳＥ．ＴＷ中１．５％のカシトン（Difco，USA）ウェルあたり１５０μｌで遮断し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Amersham，UK）で３０分間インキュベートした（遮断溶液中１：２０００）。プレートをＰＢＳＥ．ＴＷで６回洗浄し、染色溶液１００μｌ中で９０分間発色させた。４０５nmでの消衰差を光度測定的に測定した。染色溶液５０mMトリス．ＮａＯＨ、pH１０１５０mMＮａＣｌ２mMＭｇＳＯ₄ ７mM４−ニトロフェニルホスフェート結果１３．３．データ解釈鋳型の量に相関して増大する消衰差を計測した（ライン１、２、３）。本明細書に記載する本発明の方法は、ビオチン化によって修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックが生成物に組込まれる少量の核酸の等温増幅を実施することができる。したがって、増幅したＤＮＡは、修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックを要するいかなる検出反応にも利用することができる。この実施例では、ストレプトアビジンと結合したマーカ酵素（アルカリホスファターゼ）が、増幅したＤＮＡのビオチン化に結合する。増幅したＤＮＡの検出の特異性は、盲対照４および５によって保証された。これらの対照においては、鋳型なし、かつDeep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼなしの盲増幅（ライン４）および増幅配合物を添加しない盲ハイブリダイゼーション（ライン５）が、最低計測値よりも有意に低い消衰差を示した（ライン３）。実施例１４：１時間以内の本発明の方法の増幅速度この実施例は、短い反応時間内で可能である高い増幅速度を示す。２種の独立したオリゴヌクレオチド／鋳型の組合せを使用した。組合せ１：オリゴヌクレオチドビルディングブロック "APPR30":5'-dAgg TAg gTA AAC TTg ACT gCA TgT TTC CAA-3' "APPL30":5'-dgCC TAA TTC TCT CAT AgT CTT AAT TCC CAC-3' および、以下の配列 5'-dAgg TAg gTA AAC TTg ACT gCA TgT TTC CAA gTg ggA ATT AAg ACT ATg AgA gAA TTA ggC-3' を有する鋳型「ＡＰＰ」（合成二本鎖ＤＮＡ）片を使用した。組合せ２：オリゴヌクレオチドビルディングブロック "synth1":5'-dTAg gTT ACT TAg CAT TCT CCA CTT AgA CgA-3 "synth2":5'-dCTA gAg ATA TTg TTC CAT ACA gAT CCC AgT-3 および、以下の配列 5'-dTAg gTT ACT TAg CAT TCT CCA CTT AgA CgA ACT ggg ATC TgT ATg gAA CAA TAT CTC TAg-3 を有する鋳型「Ｓｙｎｔｈ」（合成二本鎖ＤＮＡ）片を使用した。反応配合物（５０μｌ）２０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．８５mMＭｇＳＯ₄ ｄＮＴＰ、各１００μM ０．１％(w/v)Triton X-100 オリゴヌクレオチドビルディングブロック、各０．２μM それぞれのビルディングブロックに適合する鋳型：種々の配合物に異なる量、２００amol、２０amol、２amolの鋳型を加えた。鋳型ＤＮＡを加えなかった反応配合物は盲対照として働いた。１４．１．反応反応配合物を７７℃に加熱し、鉱油／軽質でオーバレイし、反応あたり２単位のDeep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼ（NEB，USA）の添加によって反応を開始した。７７℃で１時間後、数分のうちに反応管を室温に冷却し、その１０μｌをゲル電気泳動で分析した（０．５倍トリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中％標準ＥＥＯ−アガロース、４℃および５Ｖ／cm、予備泳動１０分間）。適合する鋳型を加えたすべての試料反応配合物は６０bpで有意なバンドを示した。負の対照はバンドを示さなかった。実施例１５：種々の長さの直鎖状二本鎖ＤＮＡの増幅この実施例は、特定のオリゴヌクレオチド対を用いて、異なる長さの鋳型配列を増幅する可能性を示す。反応配合物：反応配合物５０μｌを０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）にピペットで移した。反応配合物は以下の組成を示した。 20mM Tris-HCl(pH8,8 ．25℃) 2mM MgSO₄ 各々250μM TTP,d GTP,d ATP,d CTP 0,1％(M/V)Triton X-100 10pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロックu676: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggC-3' 10pmol オリゴヌクレオチドビルディングブロック1755 5'-dCgCCgAAAATgACCCAgAgCgCTgCCggCACCTgTCCTACgAgTTgCATg-3' 20fmol 鋳型-DNA 種々の配合物における鋳型ＤＮＡとして、以下の二本鎖合成ＤＮＡを使用した：「ｉｓｏ２」、「ｉｓｏ２＋１」、「ｉｓｏ２＋５」（配列は付録を参照）負の対照は、鋳型ＤＮＡなしの反応配合物であった。そして、反応配合物を鉱油（Sigma M-3516）１００μｌでオーバレイし、Perk in Elmer Cetus Gene Amp PCR System 9600 サーモスタット上で８４℃に加熱した。反応温度に達したのち、酵素Deep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）２単位を配合物に加えた。試料および盲対照を８４℃で１４時間さらにインキュベートした。結果の可視化配合物を標準条件下で電気泳動によって分析した。反応配合物２０μｌを試料緩衝液４μｌで処理し、０．５倍ＴＢＥ緩衝液中２％アガロースゲル中５Ｖ／cm で分離した。ゲル上のＤＮＡを臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５mMトリス、４５mMホウ酸、１mMＥＤＴＡ）試料緩衝液：４０％(w/v)ショ糖、０．０５％(w/v)ブロモフェノールブルー結果電気泳動は、生成物に対応する高さで、鋳型「ｉｓｏ２」を有する試料の場合に有意なバンドを示し、鋳型「ｉｓｏ２＋１」を有する試料の場合に弱いバンドを示し、鋳型「ｉｓｏ２＋５」を有する試料の場合に非常に弱いバンドを示した（形成された生成物の正しい長さは、標準ＤＮＡである米国Biochemicals，Ohio ，USA の５０塩基対のはしごに比較することによって推定した）。鋳型なしの反応配合物はバンドを示さなかった。実施例１６：修飾されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックを用いる等温増幅によるＨＩＶ−１配列の検出この実施例は、標識されたオリゴヌクレオチドビルディングブロックの使用による、特異性配列の増幅を示す。増幅生成物が２種の異なる標識を担持するよう、両方の特異性オリゴヌクレオチドビルディングブロックが異なる標識を担持した。一つの標識（ビオチン）は、第二の標識（蛍光）によってさらなる検出を受けやすいよう、産物を固相に固定するためにだけに使用した。特異性標的分子の一連の希釈物により、一定範囲の産物の量が鋳型の初期量に比例することが示された。使用するオリゴヌクレオチドをＡＢＩ３９２ＤＮＡシンセサイザ(Applied Bio systems，USA)上で調製した。配列は以下のとおり： HB101U699FAM:フルオレセイン-5'-dAgC CAT gCA AAT gTT AAA AgA gAC CA-3 'および HB101L725Bio:ビオチン-5'-dCCC ATT CTg CAg CTT CTT CAT TgA-3' 使用された鋳型は、以下の配列を有する合成二本鎖ＤＮＡであった： 5'-dAgCCATgCAAATgTTAAAAgAgACCATCAATgAAgAAgCTgCAgAATggg-3'反応配合物反応配合物５０μｌを０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）にピペットで移した。反応配合物は以下の組成を有するものであった。２０mMトリス−ＨＣｌ（２５℃でpH８．８）５mMＭｇＳＯ₄ ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ、各２００μM ０．１％(w/v)Triton X-100 １０pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｕ６９９ＦＡＭ１０pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロックＨＢ１０１Ｌ７２５ｂｉｏ鋳型ＤＮＡ負の対照のため、上記と同じ、ただし鋳型ＤＮＡを除いた反応配合物をピペットで移した。そして、反応配合物を鉱油（Sigma M-3516）１００μｌでオーバレイし、サーモスタット（Gene Amp PCR System 9600、Perkin Elmer Cetus）上で７４℃に加熱した。そして、酵素Deep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼ(N ew England Biolabs)２単位を加え、９０分間インキュベートした。各反応配合物１０μｌを２％アガロースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析によって可視化した。ＤＮＡ長さ基準との比較により、増幅生成物を単一バンドとして同定することができた。マイクロタイタプレートにおける固相検定による検出ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタプレート（Xenoprobe ，Xenopore，USA）をＰＢＳで洗浄した。次に、ＴＰＢＳ中に１：１０、１：４０および１：４，０００に希釈しておいた増幅反応の単一試料１００μｌをウェルにピペットで移し、室温で２５分間振とうした。続いて、プレートをＴＰＢＳで３回洗浄した。希釈結合体（抗フルオレセイン−アルカリホスファターゼ、Boehringer Mannheim，Germany、ＴＢＳ中１：１０，０００）１００μｌを各ウェルに加えた。定速で攪拌しながら室温で１時間インキュベートしたのち、プレートを再びＴＰＢＳで３回洗浄した。さらに１回ＰＢＳで洗浄したのち、染色溶液(LumiPhos plus，Lumigen，USA)１００μｌを各ウェルに加えた。３０分間インキュベートしたのち、ルミノメータ(Lucy 1，Anthos,Austria)を用いて発光を計測した。負の対照からノイズを計測した。結果実施例１７：プライマーを用いる切断されていないプラスミドからの切片の増幅、増幅生成物は、２個のオリゴヌクレオチドビルディングブロックの塩基の合計よりも長い直鎖状になっていないプラスミドｐＵＣ１９が鋳型ＤＮＡとして働いた。以下のオリゴヌクレオチド構成単位を使用した。 pUC19:20U1897(5'-dAgTAgTTCgCCAgTTAATAg-3')および pUC19:18L1926(5'-dgTAgCAATggCAACAACg-3') 反応配合物５０μｌを０．５ml反応管（Eppendorf，Safe-Lock）にピペットで移した。反応配合物は以下の組成を有するものであった。２０mMトリス−ＨＣｌ（２５℃でpH８．８）５mMＭｇＳＯ₄ ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ、各２００μM ０．１％(w/v)Triton X-100 １０pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロックｐＵＣ１９：２０Ｕ１８９７１０pmolオリゴヌクレオチドビルディングブロックｐＵＣ１９：１８Ｌ１９２６１ng鋳型ＤＮＡ負の対照として、上記と同じ、ただし鋳型ＤＮＡを除いたことが異なる反応配合物をピペットで移した。そして、反応配合物を鉱油（Sigma M-3516）１００μ ｌでオーバレイした。配合物をサーモスタット（Gene Amp PCR System 9600、Pe rkin Elmer Cetus）上で７４℃に加熱したのち、酵素Deep Vent_R（exe^-）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）２単位を加え、１時間インキュベートした。反応配合物１０μｌを２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色およびＵＶ蛍光分析ののち可視化した。ＤＮＡ長さ基準との比較により、増幅生成物を単一バンドとして同定することができた。付録 iso2: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCCATgCAACTCgTAggACAggTgC CggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3' 3'-dCTCggAAgTTgggTCAgTCgAggAAggCCACCCgCgCCCCggTACgTTgAgCATCCTgTCCACg gCCgTCgCgAgACCCAgTAAAAgCCgC-5' iso2+1: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCACATgCAACTCgTAggACAggTg CCggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3' 3'-dCTCggAAgTTgggTCAgTCgAggAAggCCACCCgCgCCCCgTgTACgTTgAgCATCCTgTCCAC ggCCgTCgCgAgACCCAgTAAAAgCCgC-5' iso2+5: 5'-dgAgCCTTCAACCCAgTCAgCTCCTTCCggTgggCgCggggCAAAAACATgCAACTCgTAggACA ggTgCCggCAgCgCTCTgggTCATTTTCggCg-3' 3'-dCTCggAAgTTgggTCAgTCgAggAAggCCACCCgCgCCCCgTTTTTgTACgTTgAgCATCCTgT CCACggCCgTCgCgAgACCCAgTAAAAgCCgC-5'

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月１１日【補正内容】３．増幅に使用されるポリメラーゼが逆転写酵素活性をも示す、請求項２記載の方法。４．ポリメラーゼに加え、リガーゼを酵素として増幅に使用する、請求項２または３記載の方法。５．増幅に使用される酵素がリガーゼである、請求項１記載の方法。６．使用されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１個を、適当な担体、例えばプラスチック面に固定する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。７．使用されるオリゴヌクレオチドの鎖解開始温度よりも高い温度で増幅を実施する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．オリゴヌクレオチドをできるだけ鋳型に近づける、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。９．ヘルパーオリゴヌクレオチドを増幅の改善に使用する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。１０．オリゴヌクレオチド配列が鋳型配列の少なくとも一部に正確に相補的である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。１１．人間または動物の体の外での診断方法に用いるための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法の用途。１２．オリゴヌクレオチドと目的産物との間の鎖解開始温度の差が２５℃を超えず、好ましくは２０℃を超えず、特に好ましくは１５℃を超えない、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法に使用するための、オリゴヌクレオチドを含有する試薬キット。１３．オリゴヌクレオチドと目的産物との間の鎖解開始温度の差が１０℃を超えず、好ましくは５℃を超えない、請求項１２記載の試薬キット。１４．核酸の様々な増幅方法における増幅工程としての請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法の用途。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月２８日【補正内容】請求の範囲１．核酸または核酸配列を、場合によっては、増幅の前に少なくとも部分的に１本づつの鎖に分け、および／または転写し、反応配合物が、増幅させる核酸または核酸配列の末端の塩基配列に対して実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、適当な条件下、核酸合成のための出発点および／または化学ビルディングブロックを形成してもよく、形成させる増幅生成物に組込まれ、これらのビルディングブロックからの生成物そのものが核酸または核酸配列に対応する、酵素による核酸または核酸配列の指数関数的な無転写増幅方法において、オリゴヌクレオチドビルディングブロック、場合によっては鋳型および場合によってはさらなる化学ビルディングブロックによって構成された反応生成物が、オリゴヌクレオチドビルディングブロックと再び一工程で反応し、反応が、反応生成物の二本鎖形態を不安定化する温度で実施され、前記温度が実質的に等温に維持され、ポリメラーゼを酵素として使用するとき、ポリメラーゼが鎖置換活性を示すことを特徴とする方法。２．増幅に使用される酵素がポリメラーゼである、請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸または核酸配列を、場合によっては、増幅の前に少なくとも部分的に１本づつの鎖に分け、および／または転写し、反応配合物が、増幅させる核酸または核酸配列の末端の塩基配列に対して実質的に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、適当な条件下、核酸合成のための出発点および／または化学ビルディングブロックを形成してもよく、形成させる増幅生成物に組込まれ、これらのビルディングブロックからの生成物そのものが、増幅させる核酸または核酸配列に対応する、酵素による核酸または核酸配列の無転写増幅方法において、オリゴヌクレオチドビルディングブロック、場合によっては鋳型および場合によってはさらなる化学ビルディングブロックによって構成された反応生成物が、オリゴヌクレオチドビルディングブロックと再び一工程で反応し、この反応が実質的に等温で実施されることを特徴とする方法。２．増幅に使用される酵素がポリメラーゼである、請求項１記載の方法。３．増幅に使用されるポリメラーゼが鎖置換（displacement）活性を示す、請求項２記載の方法。４．増幅に使用されるポリメラーゼが逆転写酵素活性をも示す、請求項２または３記載の方法。５．ポリメラーゼに加え、リガーゼを酵素として増幅に使用する、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。６．増幅に使用される酵素がリガーゼである、請求項１記載の方法。７．使用されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１個を、適当な担体、例えばプラスチック面に固定する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．使用されるオリゴヌクレオチドの鎖解開始温度よりも高い温度で増幅を実施する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。９．オリゴヌクレオチドをできるだけ鋳型に近づける、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。１０．ヘルパーオリゴヌクレオチドを増幅の改善に使用する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。１１．オリゴヌクレオチド配列が鋳型配列の少なくとも一部に正確に相補的である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。１２．人間または動物の体の外での診断方法に用いるための、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法の用途。１３．オリゴヌクレオチドと目的産物との間の鎖解開始温度の差が２５℃を超えず、好ましくは２０℃を超えず、特に好ましくは１５℃を超えない、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法に使用するための、オリゴヌクレオチドを含有する試薬キット。１４．オリゴヌクレオチドと目的産物との間の鎖解開始温度の差が１０℃を超えず、好ましくは５℃を超えない、請求項１３記載の試薬キット。１５．核酸の様々な増幅方法における増幅工程としての請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法の用途。