JPH11332599A - 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH11332599A JPH11332599A JP10149749A JP14974998A JPH11332599A JP H11332599 A JPH11332599 A JP H11332599A JP 10149749 A JP10149749 A JP 10149749A JP 14974998 A JP14974998 A JP 14974998A JP H11332599 A JPH11332599 A JP H11332599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、食中毒・下痢症にかかる検査におけ
る、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣまたはＶＴＥＣ
の検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
ベロ毒素遺伝子または病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合
成領域遺伝子と選択的にハイブリダイズする配列番号１
〜９のオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。こ
れにより、本菌の病原因子の一つであるＯ１５７を産生
する菌およびベロ毒素を産生しうる大腸菌を選択的に検
出することを特徴としている。
る、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣまたはＶＴＥＣ
の検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
ベロ毒素遺伝子または病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合
成領域遺伝子と選択的にハイブリダイズする配列番号１
〜９のオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。こ
れにより、本菌の病原因子の一つであるＯ１５７を産生
する菌およびベロ毒素を産生しうる大腸菌を選択的に検
出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、食品の
品質検査、とりわけ食中毒に関する検査、もしくは下痢
症検査におけるＥＨＥＣまたはＶＴＥＣの検出・同定に
関するものである。
品質検査、とりわけ食中毒に関する検査、もしくは下痢
症検査におけるＥＨＥＣまたはＶＴＥＣの検出・同定に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】腸管出血性大腸菌症の起因菌であるＥＨ
ＥＣ（またはＶＴＥＣ）は出血性大腸炎に代表される食
中毒症状のみでなく、小児の重篤な疾患である溶血性尿
毒症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌に
もなることが認められており、近年、臨床検査では、本
菌の検出が重要視されつつある。
ＥＣ（またはＶＴＥＣ）は出血性大腸炎に代表される食
中毒症状のみでなく、小児の重篤な疾患である溶血性尿
毒症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌に
もなることが認められており、近年、臨床検査では、本
菌の検出が重要視されつつある。
【０００３】ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）にかかる検査
における主な検査材料は、患者の糞便、食品、または患
者の周辺環境から採取された水（飲料水、河川水等）で
ある。これらの検体からＥＨＥＣまたはＶＴＥＣを検出
し、同定しようとする場合、直接分離培養、一次確認培
養試験、二次確認培養試験、抗血清による凝集反応試
験、および毒素産生試験に至る操作を行わなければなら
ない。ところが、これらの培養の各段階における所要時
間は、それぞれ１８〜２４時間であり、総所要時間にす
ると３〜４日となり、非常に長時間なものとなる。した
がって、現在のＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の検査法
は、迅速性および簡便性に欠けており、実効的手段とは
なり得ていない。一方、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
血清型としては、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であり、腸管
出血性大腸菌症の８０％以上を占めることが明らかとな
っている。
における主な検査材料は、患者の糞便、食品、または患
者の周辺環境から採取された水（飲料水、河川水等）で
ある。これらの検体からＥＨＥＣまたはＶＴＥＣを検出
し、同定しようとする場合、直接分離培養、一次確認培
養試験、二次確認培養試験、抗血清による凝集反応試
験、および毒素産生試験に至る操作を行わなければなら
ない。ところが、これらの培養の各段階における所要時
間は、それぞれ１８〜２４時間であり、総所要時間にす
ると３〜４日となり、非常に長時間なものとなる。した
がって、現在のＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の検査法
は、迅速性および簡便性に欠けており、実効的手段とは
なり得ていない。一方、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
血清型としては、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であり、腸管
出血性大腸菌症の８０％以上を占めることが明らかとな
っている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
病原因子の一つであるベロ毒素の遺伝子とＯ１５７抗原
合成領域遺伝子の各々の遺伝子を検出するものである。
臨床検査、とりわけ食中毒・下痢症にかかる検査、とり
わけ、重篤な疾患を引き起こす腸管出血性大腸菌症にお
ける、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を提供すること
にある。
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣ（またはＶＴＥＣ）の
病原因子の一つであるベロ毒素の遺伝子とＯ１５７抗原
合成領域遺伝子の各々の遺伝子を検出するものである。
臨床検査、とりわけ食中毒・下痢症にかかる検査、とり
わけ、重篤な疾患を引き起こす腸管出血性大腸菌症にお
ける、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＥＨＥＣ（ま
たはＶＴＥＣ）のベロ毒素産生性大腸菌（以下、ＶＴＥ
Ｃ）、およびその大部分を占める病原性大腸菌Ｏ１５７
を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチド、また
は、ベロ毒素１型（ＶＴ１）遺伝子、ベロ毒素２型（Ｖ
Ｔ２）遺伝子、ベロ毒素２型の変異型（ＶＴ２ｖｈａ、
ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ1、およびＶＴ２ｖｐ２）の
各遺伝子、および病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領
域遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そ
のヌクレオチドの配列と相補的となるように化学合成さ
れたオリゴヌクレオチドの混合溶液である。
たはＶＴＥＣ）のベロ毒素産生性大腸菌（以下、ＶＴＥ
Ｃ）、およびその大部分を占める病原性大腸菌Ｏ１５７
を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチド、また
は、ベロ毒素１型（ＶＴ１）遺伝子、ベロ毒素２型（Ｖ
Ｔ２）遺伝子、ベロ毒素２型の変異型（ＶＴ２ｖｈａ、
ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ1、およびＶＴ２ｖｐ２）の
各遺伝子、および病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領
域遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そ
のヌクレオチドの配列と相補的となるように化学合成さ
れたオリゴヌクレオチドの混合溶液である。
【０００６】すなわち、本発明は、ＥＨＥＣ（またはＶ
ＴＥＣ）のベロ毒素遺伝子または大腸菌のＯ１５７抗原
合成領域遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして遺伝子増幅に用いている。これによって、病
原性大腸菌のうち、ベロ毒素遺伝子を有する菌、または
Ｏ１５７の血清型を有する菌のみを選択的に検出するこ
とを特徴としている。
ＴＥＣ）のベロ毒素遺伝子または大腸菌のＯ１５７抗原
合成領域遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして遺伝子増幅に用いている。これによって、病
原性大腸菌のうち、ベロ毒素遺伝子を有する菌、または
Ｏ１５７の血清型を有する菌のみを選択的に検出するこ
とを特徴としている。
【０００７】ここで、プライマーは、次の配列番号１〜
９ 配列番号１； (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３'）・・（ａ） 配列番号２； (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） 配列番号３； (５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−(３')・・（ｃ） 配列番号４； (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・（ｄ） 配列番号５； (５')ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−(３')・・（ｅ） 配列番号６； (５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−(３')・・（ｆ） 配列番号７； (５')ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−(３')・・（ｇ） 配列番号８； (５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−(３')・・（ｈ） 配列番号９； (５')ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−(３')・・（ｉ） の各配列を有する。
９ 配列番号１； (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３'）・・（ａ） 配列番号２； (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） 配列番号３； (５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−(３')・・（ｃ） 配列番号４； (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・（ｄ） 配列番号５； (５')ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−(３')・・（ｅ） 配列番号６； (５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−(３')・・（ｆ） 配列番号７； (５')ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−(３')・・（ｇ） 配列番号８； (５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−(３')・・（ｈ） 配列番号９； (５')ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−(３')・・（ｉ） の各配列を有する。
【０００８】また、上記プライマーは次の組み合わせ 組み合わせ（１）； (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３')・・（ａ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） (５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−(３')・・（ｃ） (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・（ｄ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−(３')・・（ｅ） (５')ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−(３')・・（ｇ） 組み合わせ（２）； (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３')・・（ａ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） (５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−(３')・・・・（ｃ） (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・・（ｄ） (５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−(３')・・（ｆ） (５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−(３')・（ｈ） 組み合わせ（３）； (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３')・・・（ａ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・・（ｄ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−(３')・（ｅ） (５')ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−(３')・（ｇ） (５')ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−(３')・・（ｉ） 組み合わせ（４） (５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−(３')・・・（ａ） (５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−(３')・・（ｂ） (５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−(３')・・・（ｄ） (５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−(３')・・（ｆ） (５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−(３')・（ｈ） (５')ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−(３')・・（ｉ） で用いるのが好ましい。
【０００９】遺伝子増幅は、Saikiらが開発したPolymer
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのベロ毒素遺伝子および大
腸菌のＯ１５７抗原合成領域遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応の
プライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び
１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一
連の操作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのベロ毒素遺伝子および大
腸菌のＯ１５７抗原合成領域遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応の
プライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び
１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一
連の操作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【００１０】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、選択性や検出感度および再現性から考えて、１０
塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌク
レオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでもよ
い。また、プライマーは、特に検出用として標識されて
いなくてもいてもよい。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、選択性や検出感度および再現性から考えて、１０
塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌク
レオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでもよ
い。また、プライマーは、特に検出用として標識されて
いなくてもいてもよい。
【００１１】プライマーが規定している病原性大腸菌Ｏ
１５７のＯ抗原合成領域遺伝子のヌクレオチド配列にお
ける増幅領域は、５０塩基から２,０００塩基、望まし
くは、１００塩基から１,０００塩基となればよい。鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを用いているが、この酵素の起源については９
０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持していれば、どの生物
種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９５゜Ｃ、プラ
イマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度
は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７５゜Ｃで、これを
１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って
増幅させる。
１５７のＯ抗原合成領域遺伝子のヌクレオチド配列にお
ける増幅領域は、５０塩基から２,０００塩基、望まし
くは、１００塩基から１,０００塩基となればよい。鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを用いているが、この酵素の起源については９
０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持していれば、どの生物
種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９５゜Ｃ、プラ
イマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度
は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７５゜Ｃで、これを
１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って
増幅させる。
【００１２】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＯ１５７抗原合成領域遺
伝子をもつ大腸菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィーも有効である。また、上記プライ
マーの一つをプローブとして機能させ、膜上、あるいは
その他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出
してもよい。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＯ１５７抗原合成領域遺
伝子をもつ大腸菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィーも有効である。また、上記プライ
マーの一つをプローブとして機能させ、膜上、あるいは
その他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出
してもよい。
【００１３】
【実施例】（実施例１）検体の調製 使用したＥＨＥＣ(またはＶＴＥＣ）は患者等から由来
したものであり、総計３４７株であった。各菌株をＬＢ
培地（１％トリプトン、０.５％イーストエクストラク
ト、および１％塩化ナトリウムに接種し、３７゜Ｃ、好
気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液
を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７.５（以下ＴＥ緩
衝液）で１０倍に希釈して、９５゜Ｃで１０分間の加熱
処理を行った後、これらを遠心し、その上清を検体とし
た。
したものであり、総計３４７株であった。各菌株をＬＢ
培地（１％トリプトン、０.５％イーストエクストラク
ト、および１％塩化ナトリウムに接種し、３７゜Ｃ、好
気的条件下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液
を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７.５（以下ＴＥ緩
衝液）で１０倍に希釈して、９５゜Ｃで１０分間の加熱
処理を行った後、これらを遠心し、その上清を検体とし
た。
【００１４】プライマーの合成 ベロ毒素産生性であり、かつその血清型がＯ１５７であ
るＥＨＥＣ菌株のベロ毒素遺伝子およびＯ抗原合成領域
遺伝子の塩基配列から、配列番号１〜９に示した各配列
を選び、それらと同じ配列のオリゴヌクレオチドを化学
合成した。化学合成は、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製は、Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。
るＥＨＥＣ菌株のベロ毒素遺伝子およびＯ抗原合成領域
遺伝子の塩基配列から、配列番号１〜９に示した各配列
を選び、それらと同じ配列のオリゴヌクレオチドを化学
合成した。化学合成は、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製は、Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。
【００１５】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７.０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容は次
のとおりである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容は次
のとおりである。
【００１６】10x反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris
-HCl pH8.3,15mM 塩化マグネシウム,
0.1%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を組合せて
使用した。組合せは、請求項項第３項に記載したとおり
である。
-HCl pH8.3,15mM 塩化マグネシウム,
0.1%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を組合せて
使用した。組合せは、請求項項第３項に記載したとおり
である。
【００１７】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
ポリメラーゼ（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１８】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１９】抗Ｏ１５７血清による凝集試験 使用した菌株のＯ抗原がＯ１５７であるかどうか、市販
の抗Ｏ１５７血清（デンカ生研製）を用いた菌体の凝集
試験によって調べた。凝集試験の詳細は、抗血清に添付
の使用説明書に基づいて行った。
の抗Ｏ１５７血清（デンカ生研製）を用いた菌体の凝集
試験によって調べた。凝集試験の詳細は、抗血清に添付
の使用説明書に基づいて行った。
【００２０】結果 前述したように大腸菌のＯ１５７抗原合成領域遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅するヌクレオチドの大きさは、表１のとおりに容易に
推定できる。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅するヌクレオチドの大きさは、表１のとおりに容易に
推定できる。
【００２１】
【表１】 たとえば、プライマーの組合せ（１）においては、Ｏ１
５７抗原合成領域遺伝子の増幅産物として３０５塩基
（または３０５塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れるはずである。また、ベロ毒素１型および２型の各遺
伝子の増幅産物として、それぞれ３４９塩基（または３
４９塩基対）および１１２塩基（または１１２塩基対）
のヌクレオチドが増幅されることになる。これらの推定
値と実際に増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場
合、このプライマーの組合せは、標的としている遺伝子
領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はその標的
遺伝子を有していると判断した。
５７抗原合成領域遺伝子の増幅産物として３０５塩基
（または３０５塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れるはずである。また、ベロ毒素１型および２型の各遺
伝子の増幅産物として、それぞれ３４９塩基（または３
４９塩基対）および１１２塩基（または１１２塩基対）
のヌクレオチドが増幅されることになる。これらの推定
値と実際に増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場
合、このプライマーの組合せは、標的としている遺伝子
領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はその標的
遺伝子を有していると判断した。
【００２２】すなわち、プライマーの組合せ（１）で
は、３０５、３４９、および１１２塩基（または塩基
対）の３つの増幅ヌクレオチドが検出された場合、その
被験菌株には、Ｏ１５７抗原合成領域遺伝子、ＶＴ１遺
伝子、およびＶＴ２遺伝子が備わっていると判断され、
その菌株の血清型はＯ１５７であり、ベロ毒素の１型お
よび２型を産生するものと判断される。また、３０５塩
基（または塩基対）のヌクレオチドが検出されず、かつ
ＶＴ２型遺伝子の増幅ヌクレオチドのみが検出された場
合には、血清型がＯ１５７以外のベロ毒素産生性大腸菌
であると判断される。
は、３０５、３４９、および１１２塩基（または塩基
対）の３つの増幅ヌクレオチドが検出された場合、その
被験菌株には、Ｏ１５７抗原合成領域遺伝子、ＶＴ１遺
伝子、およびＶＴ２遺伝子が備わっていると判断され、
その菌株の血清型はＯ１５７であり、ベロ毒素の１型お
よび２型を産生するものと判断される。また、３０５塩
基（または塩基対）のヌクレオチドが検出されず、かつ
ＶＴ２型遺伝子の増幅ヌクレオチドのみが検出された場
合には、血清型がＯ１５７以外のベロ毒素産生性大腸菌
であると判断される。
【００２３】検出結果を図１、２に示す。図１（Ａ）は
プライマーの組み合わせが（１）の場合の電気泳動図、
図１（Ｂ）はプライマーの組み合わせが（２）の場合の
電気泳動図、図２（Ａ）はプライマーの組み合わせが
（３）の場合の電気泳動図、図２（Ｂ）はプライマーの
組み合わせが（４）の場合の電気泳動図である。また、
図１、２の（Ｃ）は電気泳動図の各レーンを示す。
プライマーの組み合わせが（１）の場合の電気泳動図、
図１（Ｂ）はプライマーの組み合わせが（２）の場合の
電気泳動図、図２（Ａ）はプライマーの組み合わせが
（３）の場合の電気泳動図、図２（Ｂ）はプライマーの
組み合わせが（４）の場合の電気泳動図である。また、
図１、２の（Ｃ）は電気泳動図の各レーンを示す。
【００２４】図１、２より各々のプライマーの組合せ
は、それぞれ標的とする遺伝子領域のみを増幅し、それ
以外の遺伝子領域とは全く反応しなかった。すなわち、
大腸菌のＯ１５７抗原合成領域遺伝子、ＶＴ１遺伝子、
およびＶＴ２遺伝子を正しく増幅し、腸管出血性大腸菌
を正確に検出していることを示している。
は、それぞれ標的とする遺伝子領域のみを増幅し、それ
以外の遺伝子領域とは全く反応しなかった。すなわち、
大腸菌のＯ１５７抗原合成領域遺伝子、ＶＴ１遺伝子、
およびＶＴ２遺伝子を正しく増幅し、腸管出血性大腸菌
を正確に検出していることを示している。
【００２５】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび腸管出血性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大
腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を標的とするプラ
イマー、およびを腸管出血性大腸菌の病原因子の一つで
あるベロ毒素遺伝子標的とするプライマーとを組み合わ
せて使用したことにより、Ｏ１５７抗原を有する大腸菌
およびベロ毒素を産生しうる大腸菌の検出において、遺
伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、あるいは、
それ以上の数のプライマーで反応が規定されることによ
る高い選択性とが得られる。また、検出感度が高いの
で、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便で済
む。本発明における実施例では、反応時間３時間、検出
にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出にアガ
ロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸染色
法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出が行
える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認でき
るので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
よび腸管出血性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大
腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を標的とするプラ
イマー、およびを腸管出血性大腸菌の病原因子の一つで
あるベロ毒素遺伝子標的とするプライマーとを組み合わ
せて使用したことにより、Ｏ１５７抗原を有する大腸菌
およびベロ毒素を産生しうる大腸菌の検出において、遺
伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、あるいは、
それ以上の数のプライマーで反応が規定されることによ
る高い選択性とが得られる。また、検出感度が高いの
で、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便で済
む。本発明における実施例では、反応時間３時間、検出
にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出にアガ
ロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸染色
法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出が行
える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認でき
るので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
【００２６】腸管出血性大腸菌症の検査には、発見患者
の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞のな
い正確な結果が要求される。また、本発明は、腸管出血
性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大腸菌Ｏ１５７
の菌体の一部を構成している糖鎖抗原の遺伝子、および
その病原因子であるベロ毒素遺伝子を選択的に検出する
ものである。したがって、本発明により、腸管出血性大
腸菌症の起因菌の検出・決定を迅速かつ正確に行うこと
が可能となる。
の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞のな
い正確な結果が要求される。また、本発明は、腸管出血
性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大腸菌Ｏ１５７
の菌体の一部を構成している糖鎖抗原の遺伝子、および
その病原因子であるベロ毒素遺伝子を選択的に検出する
ものである。したがって、本発明により、腸管出血性大
腸菌症の起因菌の検出・決定を迅速かつ正確に行うこと
が可能となる。
【００２７】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ
【００２８】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ
【００２９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ
【００３０】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ
【００３１】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ
【００３２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ
【００３３】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ
【００３４】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ
【００３５】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；９ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ
【図１】（Ａ）；プライマーの組み合わせが（１）の場
合の電気泳動図、 （Ｂ）；プライマーの組み合わせが（２）の場合の電気
泳動図 （Ｃ）；各菌株の保持する遺伝子を示す図
合の電気泳動図、 （Ｂ）；プライマーの組み合わせが（２）の場合の電気
泳動図 （Ｃ）；各菌株の保持する遺伝子を示す図
【図２】（Ａ）；プライマーの組み合わせが（３）の場
合の電気泳動図 （Ｂ）；プライマーの組み合わせが（４）の場合の電気
泳動図 （Ｃ）；各菌株の保持する遺伝子を示す図
合の電気泳動図 （Ｂ）；プライマーの組み合わせが（４）の場合の電気
泳動図 （Ｃ）；各菌株の保持する遺伝子を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】検体中に存在する腸管出血性大腸菌（以
下、ＥＨＥＣ）症の起因菌であるベロ毒素産生性大腸菌
（以下、ＶＴＥＣ）、およびその大部分を占める病原性
大腸菌Ｏ１５７を 選択的に検出するためのオリゴヌク
レオチド、または、ベロ毒素１型（ＶＴ１）遺伝子、ベ
ロ毒素２型（ＶＴ２）遺伝子、ベロ毒素２型の変異型
（ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ1、および
ＶＴ２ｖｐ２）の各遺伝子、および病原性大腸菌Ｏ１５
７のＯ抗原合成領域遺伝子をコードするヌクレオチド配
列を標的とし、そのヌクレオチドの配列と相補的となる
ように化学合成されたオリゴヌクレオチドの混合溶液。 - 【請求項２】請求項１記載の合成オリゴヌクレオチドが
配列番号１〜９の各配列の少なくとも連続した１０塩基
以上を含むオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】請求項２記載の合成オリゴヌクレオチドを
次の（１）〜（４）のいずれかの組み合わせで用いるこ
とを特徴とする検出法。 （１）配列番号１、２、３、４、５、７ （２）配列番号１、２、３、４、６、８ （３）配列番号１、２、４、５、７、９ （４）配列番号１、２、４、６、８、９ - 【請求項４】請求項第２項又は第３項に記載された配列
のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを
鎖長反応のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチ
ド配列を選択的に増幅させることを特徴とする方法であ
って、 （１）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （２）得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖
に分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる
鎖長反応の鋳型として機能し、 （３）これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−
ションを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列
が増幅され、電気泳動、またはクロマトグラフィーで増
幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （４）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでＥＨＥＣまたはＶＴ
ＥＣの検出を行うことを含む方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10149749A JPH11332599A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| CA002272231A CA2272231A1 (en) | 1998-05-29 | 1999-05-18 | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic e. coli and detection method using the same |
| US09/313,968 US6165724A (en) | 1998-05-29 | 1999-05-19 | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic E.coli and detection method using the same |
| EP99109961A EP0976837A3 (en) | 1998-05-29 | 1999-05-20 | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic e. coli and detection method using the same |
| KR1019990018196A KR19990088425A (ko) | 1998-05-29 | 1999-05-20 | 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10149749A JPH11332599A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11332599A true JPH11332599A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=15481928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10149749A Pending JPH11332599A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6165724A (ja) |
| EP (1) | EP0976837A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11332599A (ja) |
| KR (1) | KR19990088425A (ja) |
| CA (1) | CA2272231A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE466097T1 (de) * | 1997-05-01 | 2010-05-15 | Univ Sydney | Nukleinsäure-moleküle spezifisch für bakterielle antigene und deren verwendungen |
| KR20020090257A (ko) * | 2001-05-26 | 2002-12-02 | 주식회사 서린바이오사이언스 | 수계오염지표균인 대장균군, 비병원성 대장균, ｅｈｅｃ및 ｅｔｅｃ 등의 장염유발 대장균 및 대장균ｏ-157:ｈ7을 동시검출하기 위한 멀티플렉스 ｐｃｒ용프라이머 및 그를 이용한 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 |
| CA2451498A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of salmonella sp., e. coli o157:h7, and listeria monocytogenes |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| CN101118234B (zh) * | 2006-07-31 | 2011-04-06 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 引起猪断奶期腹泻和水肿病大肠杆菌的检测方法及试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2775663B2 (ja) * | 1993-06-15 | 1998-07-16 | 株式会社島津製作所 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP1036846A3 (en) * | 1994-02-28 | 2000-10-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US5652102A (en) * | 1994-12-05 | 1997-07-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Assay for enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 by the polymerase chain reaction |
| WO1998020148A1 (en) * | 1996-11-04 | 1998-05-14 | The Regents Of The University Of California | Method for detection of pathogens in food |
-
1998
- 1998-05-29 JP JP10149749A patent/JPH11332599A/ja active Pending
-
1999
- 1999-05-18 CA CA002272231A patent/CA2272231A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-19 US US09/313,968 patent/US6165724A/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-20 EP EP99109961A patent/EP0976837A3/en not_active Withdrawn
- 1999-05-20 KR KR1019990018196A patent/KR19990088425A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR19990088425A (ko) | 1999-12-27 |
| EP0976837A3 (en) | 2003-05-21 |
| CA2272231A1 (en) | 1999-11-29 |
| US6165724A (en) | 2000-12-26 |
| EP0976837A2 (en) | 2000-02-02 |
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