CN101118234B - 引起猪断奶期腹泻和水肿病大肠杆菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子检测的基因芯片及检测方法和检测试剂盒。该基因芯片固定在固相载体上的寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及大肠杆菌主要毒力因子基因中选取的DNA片段。利用该基因芯片和设计的引物可进行检测，并可制成试剂盒。利用本发明的产品和方法可以达到检测常见的引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于流行病学研究和诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及检测方法和试剂盒，尤其涉及一种用于检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片及试剂盒。
背景技术
猪断奶期腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)和猪水肿病(porcine edema disease，ED)是两种导致仔猪死亡的重要传染性疾病，目前己成为对养猪业有重要危害的疾病。PWD常发生于断奶后至12周龄，特别在断奶后14天内易发，死亡高峰通常在4—10周龄。该病发生原因有多种，其中最主要的就是致病性大肠杆菌引起的腹泻。在发病过程中，致病性大肠杆菌产生毒素并被仔猪吸收，从而引起一系列临床症状并导致仔猪死亡。ED是仔猪一种较常见的传染病，主要发生于断奶一周左右的仔猪，是由产vero细胞毒素的大肠杆菌引起的传染性肠毒血症。PWD和ED常发生于同一个猪群，并且病原菌的毒力因子也有相同之处，都是由具有某种粘附因子并能产生一种或多种外毒素的大肠杆菌菌株引起，粘附因子可使大肠杆菌定殖于小肠。
PWD和ED相关的大肠杆菌大多属于有限的几种血清型。在一给定的区域内，血清型与一套相当恒定的粘附因子和毒素紧密相关。引起PWD和ED的大肠杆菌血清型主要有O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45、O157(Kai Frydendahl，2001)。相关的毒力因子主要有6种粘附因子包括F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin，以及5种毒素包括STap、STb、LT、Stx2e、EAST1。在丹麦，28至49日龄断奶仔猪腹泻样品中分离到的184株致病性大肠杆菌中，F18(107)和F4(K88)分别占44％和36％(Ojeniyi等，1994；Ripying等，1995)；在德国，Wittig等从PWD和ED病例中分离到的380株大肠杆菌中F18ab和F18ac(F18的两种不同亚型)分别占40％和35％，F4占14％；F5、F6、F41也相继被检出(Wilson等，1986；Harel等，1991；Ojeniyi等，1994)。Osek等(2000)从波兰致PWD病例中所分离到的46株大肠杆菌中有34株(73.9％)可产生Stx2e；另外含有STb、STap、LT、EAST1等热稳定和热不稳定肠毒素的致病大肠杆菌也被广泛的分离到(Bertschinger，1996；Nagy等，1999；Savarino等，1996；Yamamoto等，1997；Choi等，2001)。
传统的大肠杆菌血清学分型方法为免疫法，这种方法虽然操作简单，但费时费力。但由于大肠杆菌的血清型较多(目前仅按O抗原分型就有180多种)，与之对应的抗血清种类一般不全；不同的血清型之间易产生交叉反应；临床分离株常常存在从光滑型向粗糙型的转变，因而容易产生假阴性(Chitrita DebRoy等，2005)；大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难，这些缺点造成免疫学方法灵敏度低、漏检率高、准确性也差。
常规检测大肠杆菌毒力因子的方法分为检测大肠杆菌粘附因子的方法和检测毒素的方法，前者包括电子显微镜观察法，D—甘露糖抵抗血凝试验，细胞粘附试验和免疫血清学技术。后者包括动物实验、组织培养、免疫学方法(RIA，ELISA)等。这些方法操作繁琐，特异性不高，具有一定的局限性，所以现在普遍认为这些传统的血清学和毒力因子检测方法将为现代分子生物学方法取代。分子生物学方法主要包括PCR方法和近几年发展起来的基因芯片技术。PCR方法是比较成熟的方法，快速、简单、敏感，其缺点是一次检测信息量有限，不适用于对大量样品的检测，而发展中的基因芯片技术正可以弥补这些不足。
1997年7月，Affymetric，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌血清型和毒力因子的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。
通过血清分型得到的大肠杆菌的分类系统是上个世纪40年代由Kauffman首次提出的(Kauffmann，1975)。2000年，Roney用rfb-RFLP的方法对大肠杆菌分型，结果认为这种方法比血清分型更可靠(Roney S.Coimbraa，2000)。王磊教授和Reeves教授在1998年提出了糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因为O-抗原特异基因的理论(国际专利申请，WO98-AU315和WO99-AU385)。针对O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因设计引物，通过PCR方法筛选出高度特异的基因和寡核苷酸片段，可以准确高效的鉴定大肠杆菌的O-抗原血清型。如前文所述PCR方法有其局限性，而基因芯片技术可以弥补这些缺点和不足。将糖基转移酶基因或寡糖单位处理酶基因与先进的生物芯片技术相结合，我们研究出一种快速、准确、灵敏地检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌的血清型及毒力因子的方法和试剂盒，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子检测的基因芯片。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的方法。
本发明的又一目的是提供一种检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提出一种用于引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，这些寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及大肠杆菌主要毒力因子基因中选取的DNA片段。
在本发明一实施例中，上述寡聚核苷酸探针还包含从细菌16s rDNA保守区和志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段。
其中，上述主要的引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型包括O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45和O157；上述大肠杆菌主要毒力因子包括F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin、STap、STb、LT、Stx2e和EAST1。
其中，上述从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及大肠杆菌主要毒力因子基因中选取的DNA片段选自如SEQ ID NO：4-NO：55所示的碱基序列；上述从细菌16s rDNA保守区和志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段为如SEQ ID NO：1-NO：3所示的碱基序列。其中SEQ ID NO：4-NO：33所示的碱基序列为从上述8种主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因或寡糖单位处理酶基因中选取的DNA片段，SEQ ID NO：34-NO：55所示的碱基序列为从大肠杆菌主要的11种毒力因子基因中选取的DNA片段，SEQ ID NO：1所示的碱基序列为从细菌16s rDNA保守区中选取的在相关文献中已经报道DNA片段(Nadkarni等，2002)，SEQ ID NO：2-NO：3所示的碱基序列为从志贺氏菌ipaH基因上选取的DNA片段。
本发明还提出一种检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的方法，包括以下步骤：
(1)根据与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型的O-抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因序列，大肠杆菌毒力因子的基因序列以及细菌16s rDNA保守区序列和志贺氏菌ipaH基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；
(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化靶序列；
(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；
(4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。
其中，上述步骤(1)中所述主要的引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型包括O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45和O157；上述大肠杆菌主要毒力因子包括F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin、STap、STb、LT、Stx2e和EAST1。
上述步骤(1)所述的用于PCR扩增的引物为选自如SEQ ID NO：56-NO：97所示的碱基序列。其中，SEQ ID NO：56-NO：63所示和SEQ ID NO：75-NO：82所示的碱基序列为根据上述8种主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇中糖基转移酶基因或寡糖单位处理酶基因序列设计的引物；SEQ ID NO：64-NO：74和SEQ ID NO：83-NO：93为根据大肠杆菌11种毒力因子基因序列设计的引物；SEQID NO：94—NO：95为根据文献报道(Dorsch等，1992；Labrenz等，2004)选取的细菌16s rDNA保守区的上、下游引物序列；SEQ ID NO：96-NO：97为根据志贺氏菌ipaH基因序列设计的上、下游引物序列。
本发明还提出一种检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的试剂盒，其中包含有基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，这些寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因、大肠杆菌主要毒力因子基因以及细菌16s rDNA保守区和志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段。
该试剂盒还包含PCR扩增引物，这些PCR扩增引物选自如SEQ ID NO：56-NO：97所示的碱基序列的扩增引物。
该试剂盒，还可以包含杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件。
由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的检测引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测常见的引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，对于流行病学研究和诊断具有重要意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。
图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图(点阵上每一条探针的序列及其功能参见表1)。
图3A为利用本发明基因芯片的一个实施例检测8种主要的与PWD和ED大肠杆菌血清型的杂交结果，每张杂交结果图下面标出了所检测的血清型。
图3B为利用本发明基因芯片的一个实施例检测5株致病性大肠杆菌临床分离株的杂交结果图。每张杂交结果图下面标出了该分离株的编号及其所含有的相关毒力基因。
具体实施方式
为进一步说明本发明的用于检测引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一：探针的设计和制备
1.序列获得：用Artemis软件整理从GenBank公共数据库下载得到的5种O抗原血清型大肠杆菌(O8、O45、O138、O139和O157)O抗原合成基因簇序列(另外3种O141、O147、O149的O抗原合成基因簇序列已由本发明人所在单位完成测序，并已申请专利)、大肠杆菌11种毒力因子基因序列以及志贺氏菌ipaH基因序列。
2.探针设计：将上述序列导入OligoArray2.0软件中，参照该软件的使用说明进行探针的设计。
在本发明的优选实施例中，选择了71条由OligoArray2.0软件设计的探针，并通过156次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，探针SEQ ID NO：1选自细菌16s rDNA的保守区，作为正对照探针。探针编号为OA_750的探针为荧光探针，用于对点阵上的探针进行定位。探针编号为WL_4006的探针为多聚T片段，用作负对照探针。探针SEQ ID NO：2-NO：3选自志贺氏菌ipaH基因，用来区分O147与福氏志贺氏菌6型以及O149与鲍氏志贺氏菌1型(O147与福氏志贺氏菌6型以及O149与鲍氏志贺氏菌1型的O抗原基因簇序列相似性很高，故选用ipaH基因进行区分)，探针SEQ ID NO：4-NO：33选自常见引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型(O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45、O157)的O-抗原基因簇上的糖基转移酶或者寡糖单位聚合酶基因，探针SEQ ID NO：34-NO：55选自常见引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌毒力因子基因(F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin、STap、STb、LT、Stx2e、EAST1)。
表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及在检测中的作用
4.探针合成：将表1中的探针序列的5’端延长15个T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
实施例二：引物的设计和制备
1.序列获得：用Artemis软件整理从GenBank公共数据库下载得到的5种O抗原血清型大肠杆菌(O8、O45、O138、O139和O157)O抗原合成基因簇序列(另外3种O141、O147、O149的O抗原合成基因簇序列已由本发明人所在实验室完成测序，并已申请专利)、大肠杆菌11种毒力因子基因序列以及志贺氏菌ipaH基因序列。
2.设计引物：将上述序列导入引物设计软件Primer Premier5.0软件中，参照该软件的使用说明进行引物的设计。
在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合Multiplex PCR的用于扩增引起猪断奶期腹泻及水肿病的主要的大肠杆菌血清型(O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45、O157)和毒力因子基因(F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin、STap、STb、LT、Stx2e、EAST1)DNA的引物30对，为适应Multiplex PCR，经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。
表2用于大肠杆菌待测样品DNA的PCR扩增的引物序列
| 引物编号 | SEQ ID | 引物序列(5’—3’) | 扩增作用 |
| wl-5599 | NO：56 | TGTTCGTGCGATGGACC | 08orf469上游引物 |
| wl-5617 | NO：57 | TGCTTCAATTTGGCTGTT | 045wzy上游引物 |
| wl-818 | NO：58 | TGCCGACAACATTATCAA | 0138wzy上游引物 |
| wl-5589 | NO：59 | ATAACGCATCCGCCAACT | 0139wzy上游引物 |
| wl-5591 | NO：60 | TGAACCTGGGTTTACATT | 0141wzy上游引物 |
| wl-5595 | NO：61 | TTTTGCTCTTATGGAACC | 0147wzy上游引物 |
| wl-5597 | NO：62 | TTTGGTGCAGATACTCAGA | 0149wzy上游引物 |
| wl-5593 | NO：63 | TCAGCGGCTAAGTTGATT | 0157wzy上游引物 |
| wl-5619 | NO：64 | TTGTATGGCTAGTTCTTCTA | Stx2e上游引物 |
| wl-5633 | NO：65 | AGCACCTATGTGGAGTTTG | intimin上游引物 |
| wl-5631 | NO：66 | CAATAACCAATGTTCCCAAT | LT上游引物 |
| wl-5635 | NO：67 | GATAAATAAGCCAATAACCC | EAST1上游引物 |
| wl-5621 | NO：68 | GTTCATACGATTCGCTACA | F4(K88)上游引物 |
| wl-5625 | NO：69 | CACCACCATAGTAACCAAAG | F5(K99)上游引物 |
| wl-5627 | NO：70 | ACTCTCCATTCTAAGCCTT | F6(987P)上游引物 |
| wl-5623 | NO：71 | TCTGCCAAACATCTCCATA | F18(F107)上游引物 |
| wl-5629 | NO：72 | AGACTGATAAGATAAGTAGCCA | F41上游引物 |
| wl-5637 | NO：73 | ATCCCAATAGACGTATGAAA | STap上游引物 |
| wl-5641 | NO：74 | ATGTAGCCTCCATCGTAAT | STb上游引物 |
| wl-5600 | NO：75 | TATCCGAATGGGCCTTCT | 08orf469下游引物 |
| wl-5618 | NO：76 | CGTTGGCATTATCGTCTA | 045wzy下游引物 |
| wl-5588 | NO：77 | CAAACTTTACCCGACGAA | 0138wzy下游引物 |
| wl-5590 | NO：78 | CCGACTAATACGGAAACA | 0139wzy下游引物 |
| wl-5592 | NO：79 | GTACAATTATCATTGCGAGT | 0141wzy下游引物 |
| wl-5596 | NO：80 | ATAACGCCAAGTTGATTT | 0147wzy下游引物 |
| wl-5598 | NO：81 | GAACAATAGATGCGATACAA | 0149wzy下游引物 |
| wl-5594 | NO：82 | ATTTGCTCCCATGTCTCC | 0157wzy下游引物 |
| wl-5620 | NO：83 | TCAGTTAAACTTCACCTGGGC | Stx2e下游引物 |
| wl-5633 | NO：84 | TTATTGTATGACTCATGCCAG | intimin下游引物 |
| wl-5632 | NO：85 | TACTGATTGCCGCAATTG | LT下游引物 |
| wl-5636 | NO：86 | GCGAGTGACGGCTTTGT | EAST1下游引物 |
| wl-5622 | NO：87 | TTGCTACGTTCAGCGGAG | F4(K88)下游引物 |
| wl-5626 | NO：88 | GCTGAAGTAGTAAATACGC | F5(K99)下游引物 |
| wl-5628 | NO：89 | TTTGTATCAGGATTCCCT | F6(987P)下游引物 |
| wl-5624 | NO：90 | TTGTAAGTAACCGCGTAAG | F18(F107)下游引物 |
| wl-5630 | NO：91 | TGTGACTGAGGTCATCCC | F41下游引物 |
| wl-5638 | NO：92 | TACAACAAAGTTCACAGCAG | STap下游引物 |
| wl-5642 | NO：93 | GCATCCTTTTGCTGCAAC | STb下游引物 |
| wl-3110 | NO：94 | GAGTTTGATCCTGGCTCAG | 16s rDNA上游引物 |
| wl-3111 | NO:95 | CCGTCAATTCCTTTGAGTTT | 16s rDNA下游引物 |
| wl-5795 | NO：96 | TGACCGCCTTTCCGATA | ipaH上游引物 |
| wl-5796 | NO：97 | TTCTCCAGCATCTCATAYTTC | ipaH下游引物 |
3.引物合成：将表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。
实施例三：基因芯片制备——芯片点样
1.溶解探针：将实施例一中合成的探针分别溶解于50％DMOS溶液中，使探针的终浓度达到1μg/μl。
2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。
3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)放到芯片点样仪(Spotarray72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Tele chem smp3 stealty pin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点样区内阵列排布规律相同。
4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。
5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。
由图2可见，每个点样区内为15(行)×15(列)个探针点。每个位置上固定的探针的序列及其功能见表1。
实施例四：利用基因芯片快速检测大肠杆菌血清型和毒力因子
1.提取基因组：将分离到的待测大肠杆菌单菌落用LB培养基，37℃摇床180rpm过夜培养，按照常规提取普通革兰氏阴性菌基因组的方法提取大肠杆菌培养物的基因组DNA。
2.扩增靶序列：各取上述提取到的200ng/μl基因组DNA1μl加入Multiplex PCR反应混合液1、2中，其中混合液1用于扩增大肠杆菌血清型基因和16s rDNA(如果被测菌株为福氏志贺氏菌6型，可同时扩增O147wzy基因和ipaH基因以及16s rDNA；如果被测菌株为鲍氏志贺氏菌1型，可同时扩增O149wzy基因和ipaH基因以及16srDNA)，混合液2用于扩增大肠杆菌毒力因子基因和16s rDNA，PCR反应混合液1、2配方如下表3、4所示。(注：以下表3-表6中的PCR buffer、MgCl2、dNTP Mixture，Taq酶均购自TAKARA公司)
表3 Multiplex PCR反应混合液1配方(50μl体系)
注：表中wl编号的引物为表2中所列的引物。
表4 Multiplex PCR反应混合液2配方(50μl体系)
注：表中wl编号的引物为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5min，94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，回到第二步，共35个循环；
然后72℃5min，4℃20hr。
3.纯化：将上述获得的PCR扩增产物分别用纯化柱(MILLIPORE公司)纯化，具体步骤如下：
(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。
(2)25℃、1000×g离心15min，丢弃收集管。
(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入30μl的超纯水(Milli_Q)，37℃放置5min。
(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，1000×g离心2min，收集产物。
4.标记样品：取20μl纯化产物，分别加入相应的标记混合液1、2中，标记反应混合液1、2配方如下表5、6所示。
表5 标记混合液1配方(30μl体系)
注：表中wl编号的引物为表2中所列的引物。
表6 标记混合液2配方(30μl体系)
注：表中wl编号的引物为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5min，94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，回到第二步，共35个循环；72℃5min，4℃20hr。
5.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入150μl ddH2O以保持湿度。将8μl杂交液(配方如下所示)和8μl纯化产物混合均匀并加在实施例三中制备的用于检测引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，50℃水浴锅中杂交1.5h。
6.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤90sec，空气中风干。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B： 0.05×SSC
洗液C： 95％乙醇
8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro6.0
official name：575DF35
PMT Gain：600
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测8种主要的与PWD和ED相关的大肠杆菌血清型和5株致病性大肠杆菌临床分离株的杂交结果图如图3A和3B所示。
实施例五：对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测
对实施例三中制备的用于检测引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片的特异性进行鉴定如下：
用具有不同血清型和毒力因子的大肠杆菌以及其他细菌来鉴定实施例三中制备的用于引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用了233株菌(包括186株大肠杆菌和志贺氏菌O抗原的标准株、35已知血清型和毒力因子的大肠杆菌临床分离株以及12株其它种的细菌)利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。
对实施例三中制备的用于检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的基因芯片的灵敏度进行检测如下：
该基因芯片的检测灵敏度经过78次杂交实验的验证，0.1ng/ml的微量基因组DNA或者103个细菌量就可保证具有上述血清型和毒力因子的大肠杆菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。
根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>引起猪断奶期腹泻和水肿病大肠杆菌的检测方法及试剂盒
<130>6P13002-CN
<160>97
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的探针序列
<400>1
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的探针序列
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的探针序列
<400>3
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<211>38
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌08的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>4
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌08的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>5
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌08的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>6
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌045的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>7
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌045的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>8
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌045的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>9
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌045的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>10
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0138的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<213>基于大肠杆菌0138的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0138的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0138的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0139的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0139的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>16
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0139的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>17
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0139的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<213>基于大肠杆菌0141的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0141的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>24
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>25
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<400>27
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0149的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0149的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>32
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157的O-抗原基因簇设计并人工合成的探针序列
<400>33
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子Stx2e设计并人工合成的探针序列
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<211>38
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子Stx2e设计并人工合成的探针序列
<400>35
<210>36
<211>39
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子Stx2e设计并人工合成的探针序列
<400>36
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<211>39
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子intimin设计并人工合成的探针序列
<400>37
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子intimin设计并人工合成的探针序列
<400>38
<210>39
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子LT设计并人工合成的探针序列
<400>39
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子LT设计并人工合成的探针序列
<400>40
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子EAST1设计并人工合成的探针序列
<400>41
<210>42
<211>38
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F4(K88)设计并人工合成的探针序列
<400>42
<210>43
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F4(K88)设计并人工合成的探针序列
<400>43
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F5(K99)设计并人工合成的探针序列
<400>44
<210>45
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F5(K99)设计并人工合成的探针序列
<400>45
<210>46
<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F6(987P)设计并人工合成的探针序列
<400>46
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F6(987P)设计并人工合成的探针序列
<400>47
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F18(F107)设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F18(F107)设计并人工合成的探针序列
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<211>40
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F41设计并人工合成的探针序列
<400>50
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<211>40
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<213>基于大肠杆菌毒力因子F41设计并人工合成的探针序列
<400>51
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STap设计并人工合成的探针序列
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STap设计并人工合成的探针序列
<400>53
<210>54
<211>39
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STb设计并人工合成的探针序列
<400>54
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<213>基于大肠杆菌毒力因子STb设计并人工合成的探针序列
<400>55
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<211>17
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌08orf469设计并人工合成的上游引物
<400>56
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<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌045wzy设计并人工合成的上游引物
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<213>基于大肠杆菌0138wzy设计并人工合成的上游引物
<400>58
<210>59
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<213>基于大肠杆菌0139wzy设计并人工合成的上游引物
<400>59
<210>60
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0141wzy设计并人工合成的上游引物
<400>60
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147wzy设计并人工合成的上游引物
<400>61
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<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0149wzy设计并人工合成的上游引物
<400>62
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157wzy设计并人工合成的上游引物
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子Stx2e设计并人工合成的上游引物
<400>64
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子intimin设计并人工合成的上游引物
<400>65
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子LT设计并人工合成的上游引物
<400>66
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子EAST1设计并人工合成的上游引物
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<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F4(K88)设计并人工合成的上游引物
<400>68
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F5(K99)设计并人工合成的上游引物
<400>69
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F6(987P)设计并人工合成的上游引物
<400>70
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F18(F107)设计并人工合成的上游引物
<400>71
<210>72
<211>22
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F41设计并人工合成的上游引物
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STap设计并人工合成的上游引物
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<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STb设计并人工合成的上游引物
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<210>75
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌08orf469设计并人工合成的下游引物
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<211>18
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<213>基于大肠杆菌045wzy设计并人工合成的下游引物
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<213>基于大肠杆菌0138wzy设计并人工合成的下游引物
<400>77
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<213>基于大肠杆菌0141wzy设计并人工合成的下游引物
<400>79
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<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0147wzy设计并人工合成的下游引物
<400>80
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<211>20
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<213>基于大肠杆菌0149wzy设计并人工合成的下游引物
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<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌0157wzy设计并人工合成的下游引物
<400>82
<210>83
<211>21
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子Stx2e设计并人工合成的下游引物
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<211>21
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<213>基于大肠杆菌毒力因子intimin设计并人工合成的下游引物
<400>84
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<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子LT设计并人工合成的下游引物
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<210>86
<211>17
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子EAST1设计并人工合成的下游引物
<400>86
<210>87
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F4(K88)设计并人工合成的下游引物
<400>87
<210>88
<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F5(K99)设计并人工合成的下游引物
<400>88
<210>89
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F6(987P)设计并人工合成的下游引物
<400>89
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<211>19
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F18(F107)设计并人工合成的下游引物
<400>90
<210>91
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子F41设计并人工合成的下游引物
<400>91
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STap设计并人工合成的下游引物
<400>92
<210>93
<211>18
<212>DNA
<213>基于大肠杆菌毒力因子STb设计并人工合成的下游引物
<400>93
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的上游引物
<400>94
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>基于细菌16s rDNA的保守区设计并人工合成的下游引物
<400>95
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<211>17
<212>DNA
<213>基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的上游引物
<400>96
<210>97
<211>21
<212>DNA
<213>基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的下游引物
<400>97
Claims (7)
1.一种用于引起猪断奶期腹泻及水肿病大肠杆菌血清型和毒力因子检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针包含从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及大肠杆菌主要毒力因子基因、细菌16s rDNA保守区和志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段，所述DNA片段如SEQ ID NO：1-55所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型包括O149、O138、O139、O141、O8、O147、O45和O157；上述大肠杆菌主要毒力因子包括F18(107)、F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F41、intimin、STap、STb、LT、Stx2e和EAST1。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述从主要的与引起猪断奶期腹泻及水肿病相关的大肠杆菌血清型O-抗原基因簇上糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因以及大肠杆菌主要毒力因子基因中选取的DNA片段如SEQ ID NO：4-55所示。
4.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述从细菌16srDNA保守区和志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段如SEQ ID NO：1-3所示。
5.一种检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的基因芯片。
6.根据权利要求5所述的检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的试剂盒，还包含如SEQ ID NO：56-NO：97所示的PCR扩增引物。
7.根据权利要求6所述的检测引起猪断奶期腹泻及水肿病的大肠杆菌血清型和毒力因子的试剂盒，还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件。
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