JPH1123573A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫学的凝集反応を利用した免疫学的測定方
法において、非特異反応が抑制された測定法を提供す
る。 【解決手段】 免疫学的凝集試薬と被検体の接触時に熱
変性させたアルブミンを溶液状態で共存させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非特異反応を効果
的かつ簡便に抑制して行うことのできる、抗原抗体反応
を利用する免疫学的凝集反応試薬を用いた免疫学的測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫学的凝集反応試薬は、抗原抗体反応
に伴う凝集反応を利用した代表的な試薬である。即ち、
免疫学的凝集反応試薬では、不溶性担体に特定の抗原
（又は抗体）が固定化されており、該固定化された抗原
（又は抗体）に対する抗体（又は抗原）が存在すると抗
原抗体反応により凝集が起こるため、上記の抗体（又は
抗原）が検知できる。最近は、抗原精製技術の進歩によ
り固定化される抗原や抗体として特異性の高いものが得
られるようになり、免疫学的凝集反応試薬の臨床検査に
おける応用範囲がさらに拡大している。

【０００３】上記の免疫学的凝集反応試薬を用いた免疫
学的測定方法の代表的な例としては、血液中トレポネー
マ・パリダム（Treponema Pallidum；以下ＴＰと略する
こともある）抗体の抗体価を抗原抗体反応を利用して免
疫学的凝集反応により測定する梅毒のスクリーニングテ
ストなどが挙げられる。該方法では、ウサギの睾丸等で
培養したＴＰの菌体や菌体を破砕後可溶化したものを抗
原成分として担体に担持させた試薬が抗原（ＴＰ抗原）
と抗体（ＴＰ抗体）による特異的な反応を担体の凝集と
して捕らえることによりＴＰ抗体を検出するものであ
る。

【０００４】ところが、上記方法においては、測定する
検体によってＴＰ抗体陰性にも拘わらずＴＰ抗体以外の
成分による反応、すなわち非特異反応により試薬の凝集
が引き起こされて陽性（偽陽性）を示すことがあり問題
となっている。

【０００５】この非特異反応を抑制するために、様々な
方法が検討されている。例えば、特開平４−１２２８５
８号公報には、凝集反応を促進する凝集促進剤として１
個以上のグリコシド誘導体をモノマー単位で含む水溶性
重合体を用いることで非特異反応を抑制する方法が示さ
れている。また、特開昭５８−１４４７４８号公報に
は、ラテックス懸濁液中にウシ血清アルブミン（Bovine
Serum Albumin；以下ＢＳＡと略すこともある。）ある
いはウマ血清アルブミンを添加する方法が記載されてい
る。また、特開昭５８−１４４７４８号公報には、分子
量１０００〜１００００のポリペプチドを添加すること
が記載されている。さらに、特開平８−１７６１９５号
公報には、アルブミンをアルカリ条件下で還元剤を用い
て、Ｓ−Ｓ結合を還元した後、ＳＨ修飾試薬により化学
修飾したものをブロッキング剤として用いる方法が記載
されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、免疫
学的凝集反応を利用した免疫学的測定方法においては、
ＴＰ抗体測定試薬の例において見られるように、非特異
反応により発生する偽陽性が大きな問題となっており、
該問題を解決するために様々な方法が検討されている。
しかしながら、上記のような方法では非特異反応の抑制
が未だ不充分であり、また、使用する蛋白やポリペプチ
ドの調整方法が煩雑であるという問題点があった。即
ち、本発明は、免疫学的凝集反応試薬を用いた免疫学的
測定方法に於いて、非特異反応を効果的に抑制する簡便
な手段を開発することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意努力した結果、加熱処理して熱変
性させたアルブミンを溶液状態で反応系中に存在させる
という簡便な方法で、上記非特異反応を効果的に抑制で
きることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は、抗原（又は抗体）を不溶
性担体に担持させた免疫学的凝集反応試薬と被検体とを
接触させて抗体（又は抗原）を検出する免疫学的測定方
法において、免疫学的凝集反応試薬と被検体とを溶液状
態の熱変性アルブミンの存在下に接触させることを特徴
とする免疫学的測定方法である。

【０００９】本発明の免疫学的測定方法によれば、偽陽
性などの原因となる非特異反応を簡便に抑制することが
でき、信頼性の高い測定が可能となる。この様な優れた
効果が得られる作用機構は必ずしも明確ではないが、加
熱処理によって得られる熱変性アルブミンを反応系中に
存在させることにより、非特異反応を起こす成分と熱変
性アルブミンとの間でなんらかの相互作用が起こり、非
特異反応成分がマスキングされるため、非特異的な凝集
が抑制されるものと考えられる。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の免疫学的測定方法では、
抗原（又は抗体）を不溶性担体に担持させた免疫学的凝
集反応試薬を使用する。該試薬に使用される不溶性担体
としては、抗原（又は抗体）を担持した後に、対応する
抗体（又は抗原）と抗原抗体反応を起こして凝集するも
のであれば公知の担体が特に制限されずに使用できる。

【００１１】好適に使用できる担体を例示すれば、ポリ
スチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン
−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン
−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合
体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンス
チレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重
合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等のラッテクス等の
有機高分子物質の微粒子、あるいはシリカ、シリカーア
ルミナ、アルミナの様な無機酸化物又は該無機酸化物等
にシランカップリング処理等を施し、官能基を導入した
無機粒子、ヒトＯ型血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の
粒子等が挙げられる。これら担体の中でもラッテクス粒
子を担体として使用した場合には、自動分析に適した免
疫学的凝集反応試薬が得られる。

【００１２】上記担体の粒径は特に限定されるものでは
ないが、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝集の判
別のし易さ等の観点から平均粒径が0.05〜10μmの担体
を使用するのが好適である。

【００１３】本発明で上記の不溶性担体に担持される抗
原（又は抗体）とは、それぞれ検査対象となる抗体（又
は抗原）と抗原抗体反応を起こすものであれば特に限定
されない。本発明で好適に使用される抗原又は抗体を例
示すれば、梅毒診断のためのＴＰ菌体成分由来の抗原、
Ｂ型肝炎診断のためのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢ
ｓ）の他、抗ヒトＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）抗体、抗
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体、抗β2-ミクログ
ロブリン（β2-ｍ）抗体などが挙げられる。

【００１４】抗原（又は抗体）を不溶性担体に担持させ
る方法としては、既知の方法が特に制限されずに使用で
きる。基本的な担持方法としては物理吸着法と化学的結
合法があり、担持操作の簡便性という点で物理的吸着法
が好適に使用される。

【００１５】物理吸着法では、抗原（又は抗体）を分散
させた分散液に不溶性担体を浸漬し、液中の抗原（又は
抗体）を不溶性担体に物理的に吸着させるのが一般的で
ある。このとき使用される溶媒はこれらの物質を溶解も
しくは均一に分散させるものであれば特に限定されず公
知の溶媒が何ら制限なく使用できるが、使用する抗原
（又は抗体）の生理活性を有効に保つために生理食塩
水、あるいはpHが調節された緩衝液、例えば、pH6〜8に
調節された10mMから200mM程度のリン酸緩衝液、あるい
はpH7〜9に調節された10〜200mM程度のグリシン緩衝液
やトリス緩衝液等を使用するのが好適である。また、上
記の分散液中の抗原又は抗体の濃度は特に限定されない
が、担持効率や担持の均一性の観点から1(μg-抗原又は
抗体／ml液）〜10（mg-抗原又は抗体／ml-液）となるよ
うに分散させるのが好適である。該分散液に不溶性担体
を浸漬し、抗原（又は抗体）を吸着させる条件は、使用
する不溶性担体の種類や担持させる抗体や抗原の種類ご
とに、担持効率や操作性を勘案して適宜決定すればよい
が、一般的な条件は次の通りである。

【００１６】即ち、該分散液に浸漬する際の担体の使用
量は、抗体や抗原の種類によって適宜決定すればよく、
担持効率や操作性の観点から0.001〜15%(w/v)で用いる
のが好適であり、懸濁液の形で使用するのが一般的であ
る。該分散液に担体を浸漬させる温度は担体の性質や緩
衝液の成分によって適宜選択すればよいが、一般的には
4℃〜50℃が好適に用いられる。該分散液に担体を浸漬
する時間は30分〜一昼夜行うのが一般的である。

【００１７】このようにして抗原（又は抗体）が担持さ
れた担体は、自然凝集を防いで保存安定性をよくした
り、非特異反応を抑制する目的で、さらにブロッキング
処理を行うのが一般的である。ブロッキングの方法は特
に制限されず公知の方法が使用できる。ブロッキングに
使用されるタンパクは目的とする抗原抗体反応に対して
不活性で且つ不溶性担体に吸着可能なタンパクであれば
特に限定されないが、入手し易さや経済性の点でウシ血
清アルブミンやカゼイン等が一般的に用いられる。さら
に、高感度な試薬を調整できるという点で熱変成ウシ血
清アルブミンのような変性タンパクが好適に使用され
る。

【００１８】ブロッキング処理を行った後、遠心分離な
どにより分離洗浄し、最終的に抗原抗体反応あるいは粒
子の凝集性、保存性等を勘案して適宜選択した緩衝液に
分散させて、免疫学的凝集反応試薬とする。

【００１９】本発明の免疫学的測定方法において使用す
る免疫学的凝集反応試薬は、被検体中の抗体（又は抗
原）と接触した時に起こる抗原抗体反応に伴い担体が凝
集する現象を利用した試薬であり、定性試薬としてラテ
ックス凝集試薬やマイクロタイター試薬などが、また定
量試薬としては凝集の度合いを光学的に測定するラテッ
クス定量試薬などが例示できる。また、免疫学的凝集反
応試薬は一液からなる試薬形態としてもよいし、別個に
調整した水溶性媒体に分散させて使用する二液型試薬の
形態としてもよい。免疫学的凝集試薬中には、ポリエチ
レングリコールなどの凝集促進剤、ウシ血清アルブミン
などの非特異反応抑制剤、塩濃度調整のための塩化ナト
リウム等を適宜添加してもよい。二液型試薬形態の場合
には、これらの添加剤は上記水溶性媒体に添加されるの
が一般的である。該水溶性媒体としては、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の
緩衝液が好適に使用される。

【００２０】本発明の免疫学的測定方法で使用する被検
体としては、測定対象となる抗体（又は抗原）が溶解も
しくは懸濁している可能性がある溶液であれば特に限定
されないが、生体成分由来であるのが一般的である。該
生体成分としては、例えば血液、尿、リンパ液、羊水、
随液、唾液等の体液、血管、臓器、皮膚等の細胞抽出液
等が挙げられる。

【００２１】本発明で免疫学的凝集反応試薬と被検体と
を接触させる方法は、免疫学的凝集反応試薬と被検体と
を混合することによって行われる。一液型形態の試薬で
は被検体と直接混合され、また二液型形態の場合には上
記水溶性媒体中で試薬と被検体とが混合されるのが一般
的である。

【００２２】本発明では、免疫学的凝集反応試薬と被検
体とを接触させる際に溶液状態の熱変成アルブミンを共
存させることを最大の特徴としている。

【００２３】本発明の免疫学的測定方法で使用する熱変
成アルブミンとは、熱処理によって高分子量化あるいは
会合した変性アルブミンのことを指す。熱変性アルブミ
ンの原料となるアルブミン（以下、原料アルブミンとも
いう）としては、ＢＳＡ、ウマ血清アルブミン、ヒト血
清アルブミンなどが好適に使用されるが、入手し易さや
経済性の点でＢＳＡが特に好適である。ＢＳＡの純度は
特に限定されないが、フラクションＶと呼ばれる結晶品
を使用するのが一般的である。

【００２４】原料アルブミンの熱処理は水溶液中、好ま
しくは緩衝液中で行われる。原料アルブミン及び熱処理
後のアルブミンが不溶性の沈殿物を生じない範囲であれ
ば、緩衝液の種類やpHは特に限定されず、公知の緩衝液
から経済性などを考慮して選択すればよい。本発明で好
適に使用される緩衝液を例示すれば、リン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩
衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度及びpHは10〜200m
M及び4〜11の範囲が好適である。

【００２５】原料アルブミンを熱処理して変性させる際
には、変性効率の観点から0.1〜20%(w/v)、好ましくは
0.5〜15%(w/v)の原料アルブミンを熱処理するのが好適
である。ここで、熱処理の際の温度は原料アルブミンの
高分子量化或いは会合が起こる温度であれば特に限定さ
れない。一般に、原料アルブミンの高分子量化或いは会
合の度合いは熱処理時の温度と該温度における保持時間
によって変化する。熱処理時の温度が比較的低い場合に
は有効な加熱処理体を得るためには保持時間を長くする
必要があり、又、該温度が高い場合には保持時間を短く
する必要がある。熱処理時の温度及び保持時間は、操作
性や効率等を考慮して適宜決定すれば良いが、一般的に
は３０〜８０℃の温度で０．５〜４８時間、好適には３
５〜７０℃で１〜２４時間保持すれば良い。

【００２６】以上のような熱処理をして得た熱変性アル
ブミンは、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って、熱処理前の未変性（原料）アルブミンと移動度を
比較することで高分子量化あるいは会合の度合いを確認
することができる。また、分光光度計により波長λ=280
nmにおける吸光度変化を測定することによってアルブミ
ンの変性の有無を確認することもできる。

【００２７】本発明で、免疫学的凝集反応試薬と被検体
とを溶液状態の熱変性アルブミンの存在下で接触させる
方法は特に限定されないが、被検体と熱変性アルブミン
を溶液中であらかじめ接触させた後に、免疫学的凝集反
応試薬を共存させるのが好適である。また、その際の熱
変性アルブミンの濃度は、測定対象によって異なるが、
免疫学的凝集反応試薬と被検体とが共存する溶液中の濃
度として1〜10%(w/v)とするのが、非特異反応の抑制効
果及び経済性（熱変性アルブミンの過剰使用の防止）の
観点から好適である。

【００２８】次に、本発明の免疫学的測定方法の例とし
て、免疫学的凝集反応試薬として下記甲剤及び乙剤の二
液からなるラテックス定量試薬形態を用いた例を示す
が、該例は本発明を限定するものではない。

【００２９】甲剤：下記（１）、（２）及び（３）を基
本成分とする混合液 （１）緩衝液 20〜1000mM、pH4〜12 （２）抗原（又は抗体）を担持した担体 0.005〜1.5%
(w/v) （３）塩化ナトリウム 50〜300mM 乙剤：下記（４）、（５）及び（６）を基本成分とする
混合液 （４）緩衝液 20〜1000mM、pH4〜12 （５）塩化ナトリウム 50〜300mM （６）熱変性アルブミン 1.5〜15% なお、上記緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液又はグッド緩衝液等
が使用できる。

【００３０】上記ラテックス定量試薬形態を用いた場合
の測定方法は、次のようなものである。

【００３１】先ず熱変成アルブミンを含有する乙剤で被
検体を10倍から30倍程度に希釈して5分程度静置する。
次いで甲剤を添加し、適当な波長を選択して吸光度の経
時変化を測定し、試薬の凝集状態を検知する。この時、
甲剤の使用量は抗体や抗原の種類によって異なるが、測
定時の溶液中の担体濃度が0.001〜0.5%とすることによ
り感度及び精度の高い測定が行われる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、簡単な操作により非特
異反応を抑制することができ、結果として偽陽性が少な
く極めて信頼性の高い免疫学的測定を免疫学的凝集反応
試薬を用いて行うことが可能になる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００３４】実施例１〜５ （１）熱変性ウシ血清アルブミン（熱変性ＢＳＡ）溶液
の調製 市販のＢＳＡ（Sigma製、フラクションＶ）10gを50mMグ
リシン緩衝液(pH8.6)100gに溶解した。次いで表１に示
す温度と時間でゆっくり振とうした後、4℃に冷却して
保存した。

【００３５】（２）甲剤（ＴＰ抗原担持ラテックス懸濁
液）の調製 ウサギ睾丸で培養したＴＰ菌体を破砕後可溶化した抗原
を20mMグリシン緩衝液(pH8.6)で10μg/mlとなるように
希釈してＴＰ抗原液とした。平均粒子径0.3μm、ラテッ
クス濃度5%のポリスチレン粒子懸濁液0.1mlを上記ＴＰ
抗原液0.9mlに加えて混合した。４℃で４時間静置した
後、ウシ血清アルブミンを含む水溶液2mlを添加し、さ
らに1.5時間静置した。次いで遠心分離により得られた
沈さ（ＴＰ抗原担持ラテックス）に2mlの100mM塩化ナト
リウムと0.1%アジ化ナトリウムと1%ＢＳＡを含むpH8.0
の0.1Mトリス緩衝液を加えて懸濁して甲剤を調製した。

【００３６】（３）乙剤（緩衝液）の調製 0.1M塩化ナトリウムと0.1%アジ化ナトリウムと表１に示
した濃度となる熱変性ＢＳＡ溶液と1.5%のＰＥＧ-20000
を含むpH8.0の0.1Ｍトリス緩衝液を調製して乙剤とし
た。

【００３７】（４）被検体 梅毒トレポネーマ赤血球凝集（TPHA;Treponema Pallidu
m Hemagglutination）試験及び蛍光トレポネーマ抗体吸
収（FTA-ABS;fluorescent treponemal antibody-absorp
tion）試験でＴＰ抗体陰性であることが確認されている
血清より、ラテックス定量試薬で非特異反応を起こし易
い血清を３検体用意した。

【００３８】（５）測定法 乙剤240μlに被検体10μlをガラスセル中で添加攪拌し
た後、37℃で約5分間静置した。次いで甲剤を80μl添加
して攪拌し、30秒後から200秒までの波長700nmにおける
光学密度変化量を測定し、光学密度変化量からＴＰ抗体
濃度を求めた。以上の操作には、自動分析装置ＴＢＡ−
３０Ｒ形（東芝メディカル製）を用いた。測定結果は20
U以上を陽性、20U未満を陰性として判定した。結果を表
１に示した。

【００３９】

【表１】

【００４０】比較例１ （１）試薬、検体の調製及び測定法と性能評価 熱変性ＢＳＡを用いない以外は実施例１と同様な操作で
行った。結果を表１に示した。

【００４１】比較例２〜３ （１）試薬、検体の調製及び測定法と性能評価 熱変性ＢＳＡの代わりに未変性のＢＳＡを用いた以外は
実施例１と同様な操作で行った。結果を表１に示した。

【００４２】熱変性ＢＳＡを用いることにより、非特異
反応が抑制されて３検体とも正しく陰性と判定すること
ができる。ＢＳＡを用いない系では３検体とも非特異反
応を起こして陽性（偽陽性）となった。また未変性ＢＳ
Ａを用いた場合には、３検体中２検体で非特異反応が起
こった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原（又は抗体）を不溶性担体に担持さ
   せた免疫学的凝集反応試薬と被検体とを接触させて抗体
   （又は抗原）を検出する免疫学的測定方法において、免
   疫学的凝集反応試薬と被検体とを溶液状態の熱変性アル
   ブミンの存在下に接触させることを特徴とする免疫学的
   測定方法。
2. 【請求項２】 不溶性担体がラテックス粒子であり、該
   不溶性担体に担持させる抗原がトレパネーマ・パリダム
   菌体由来の抗原である請求項１記載の免疫学的測定方
   法。