JPH1099088A - 核酸の増幅方法 - Google Patents
核酸の増幅方法Info
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- JPH1099088A JPH1099088A JP9250443A JP25044397A JPH1099088A JP H1099088 A JPH1099088 A JP H1099088A JP 9250443 A JP9250443 A JP 9250443A JP 25044397 A JP25044397 A JP 25044397A JP H1099088 A JPH1099088 A JP H1099088A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ポリアミド−核酸誘導体（ＰＮＡ）／ＤＮＡ
プライマーを用いる核酸増幅方法の改良。 【解決手段】 ３′-ヒドロキシル基を有するヌクレオ
シド単位少なくとも１個を一端にもつ１またはそれ以上
のＰＮＡ／ＤＮＡプライマー、ポリメラーゼ酵素および
通常必要な成分を用いて核酸を増幅させる方法におい
て、ポリメラーゼ酵素は熱安定性である方法。
プライマーを用いる核酸増幅方法の改良。 【解決手段】 ３′-ヒドロキシル基を有するヌクレオ
シド単位少なくとも１個を一端にもつ１またはそれ以上
のＰＮＡ／ＤＮＡプライマー、ポリメラーゼ酵素および
通常必要な成分を用いて核酸を増幅させる方法におい
て、ポリメラーゼ酵素は熱安定性である方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ／ＰＮＡプ
ライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用する新
規かつ有利な核酸の増幅方法に関する。
ライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用する新
規かつ有利な核酸の増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、相補性の標的配列（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）に天然のオリゴヌクレオチドより高い親和性で
結合するポリアミド−核酸誘導体（ＰＮＡ）が報告され
ている〔Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Rolf H.
Berg & Ole Buchardt, Science(1991) 254, 1497-1500;
ＷＯ92／20702; M.Egholmら, Nature (1993) 365, 566
-568; P. Nielsen, Bioconjugate Chem. (1994) 5, 3-
7〕。これらの、いわゆるＰＮＡでは、デオキシリボー
スホスフェート構造がポリアミドオリゴマーによって置
換されている。
ＲＮＡ）に天然のオリゴヌクレオチドより高い親和性で
結合するポリアミド−核酸誘導体（ＰＮＡ）が報告され
ている〔Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Rolf H.
Berg & Ole Buchardt, Science(1991) 254, 1497-1500;
ＷＯ92／20702; M.Egholmら, Nature (1993) 365, 566
-568; P. Nielsen, Bioconjugate Chem. (1994) 5, 3-
7〕。これらの、いわゆるＰＮＡでは、デオキシリボー
スホスフェート構造がポリアミドオリゴマーによって置
換されている。
【０００３】ＤＮＡポリメラーゼのＰＮＡはプライマー
として受け入れられず〔H. OErumら,Nucl. Acids Res.
(1993) 21, 5332-5336; D. B. Demersら, Nucl. Acids
Res.(1995) 23, 3050-5〕、したがってＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる核酸の増幅にプライマーとして使用できな
いことが見出されている。
として受け入れられず〔H. OErumら,Nucl. Acids Res.
(1993) 21, 5332-5336; D. B. Demersら, Nucl. Acids
Res.(1995) 23, 3050-5〕、したがってＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる核酸の増幅にプライマーとして使用できな
いことが見出されている。
【０００４】EP-A 0672 677およびＷＯ95／08556 に
は、特にクレノウポリメラーゼを用いる核酸の増幅にプ
ライマーとしても使用できるＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ド分子が記載されている。
は、特にクレノウポリメラーゼを用いる核酸の増幅にプ
ライマーとしても使用できるＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ド分子が記載されている。
【０００５】核酸の増幅に際し、天然のオリゴヌクレオ
チドプライマーに代えてばＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを
使用する利点は、ＰＮＡプライマーの補助によってコピ
ーされた核酸鎖がその５′−末端に５′−エキソヌクレ
アーゼに安定なＰＮＡ残基を含有することである。した
がって、反応混合物中の天然のＤＮＡおよびＲＮＡ配列
はすべて、ＰＮＡ−含有鎖が攻撃されることなく、５′
−エキソヌクレアーゼで分解することができる。
チドプライマーに代えてばＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを
使用する利点は、ＰＮＡプライマーの補助によってコピ
ーされた核酸鎖がその５′−末端に５′−エキソヌクレ
アーゼに安定なＰＮＡ残基を含有することである。した
がって、反応混合物中の天然のＤＮＡおよびＲＮＡ配列
はすべて、ＰＮＡ−含有鎖が攻撃されることなく、５′
−エキソヌクレアーゼで分解することができる。
【０００６】しかしながら、WO 95／08556に記載された
クレノウポリメラーゼ酵素によるポリメラーゼ反応は、
それに記載されたＰＮＡ／ＤＮＡプライマーが３′−末
端に少なくとも４つのヌクレオチドをもつ場合にのみ成
功するが、３′−末端に２つのヌクレオチドしかもたな
いＰＮＡ／ＤＮＡプライマーではＤＮＡポリメラーゼ反
応は成功しないのである。
クレノウポリメラーゼ酵素によるポリメラーゼ反応は、
それに記載されたＰＮＡ／ＤＮＡプライマーが３′−末
端に少なくとも４つのヌクレオチドをもつ場合にのみ成
功するが、３′−末端に２つのヌクレオチドしかもたな
いＰＮＡ／ＤＮＡプライマーではＤＮＡポリメラーゼ反
応は成功しないのである。
【０００７】カルボキシル末端にただ１個の５′−デオ
キシ−５′−アミノヌクレオシドを有するＰＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッドが、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ（クレ
ノウ・フラグメント）を酵素的ポリメリゼーションに用
いる場合、プライマーとして使用できることはEP-A 067
2 677から明らかである。
キシ−５′−アミノヌクレオシドを有するＰＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッドが、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ（クレ
ノウ・フラグメント）を酵素的ポリメリゼーションに用
いる場合、プライマーとして使用できることはEP-A 067
2 677から明らかである。
【０００８】これらの結果は、ＤＮＡポリメラーゼ／プ
ライマー・鋳型複合体に関する結晶構造の研究により、
プライマーのホスホジエステル官能基と酵素の間の相互
作用が数個の位置で存在することから全く予期しえない
ものである〔C.M. Joyce, T.A. Steitz, Annu.Rev.Bioc
hem. (1994) 63, 777-822; S. H. Eom,Nature (1996) 3
82, 278-281〕。
ライマー・鋳型複合体に関する結晶構造の研究により、
プライマーのホスホジエステル官能基と酵素の間の相互
作用が数個の位置で存在することから全く予期しえない
ものである〔C.M. Joyce, T.A. Steitz, Annu.Rev.Bioc
hem. (1994) 63, 777-822; S. H. Eom,Nature (1996) 3
82, 278-281〕。
【０００９】プライマー中の陰性電荷の除去がポリメラ
ーゼによるプライマーの受け入れに不利に働く事実は、
天然のホスホジエステル官能基を中性のヌクレオシド間
ブリッジ、たとえば３′−Ｏ−スルホネートまたは３′
−Ｎ−スルホンアミドで一部置換したプライマーによる
検討でさらに確認されている〔K. A. Perrinら, J. Am.
Chem. Soc. (1994) 116, 7427-7428〕。
ーゼによるプライマーの受け入れに不利に働く事実は、
天然のホスホジエステル官能基を中性のヌクレオシド間
ブリッジ、たとえば３′−Ｏ−スルホネートまたは３′
−Ｎ−スルホンアミドで一部置換したプライマーによる
検討でさらに確認されている〔K. A. Perrinら, J. Am.
Chem. Soc. (1994) 116, 7427-7428〕。
【００１０】これらの結果に基づき、非荷電プライマー
の一部のその受け入れに関しては、EP-A 0672 677に記
載されたＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子によって構成
され、カルボキシル末端に５′−デオキシ−５′−アミ
ノヌクレオシドを有するクレノウ酵素が、多くのＤＮＡ
ポリメラーゼ中の例外であると考えざるを得なかった。
の一部のその受け入れに関しては、EP-A 0672 677に記
載されたＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子によって構成
され、カルボキシル末端に５′−デオキシ−５′−アミ
ノヌクレオシドを有するクレノウ酵素が、多くのＤＮＡ
ポリメラーゼ中の例外であると考えざるを得なかった。
【００１１】ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを用いる核酸増
幅におけるクレノウポリメラーゼの使用の欠点は、たと
えば、コピーされた鋳型鎖の増幅をＰＣＲやＬＣＲのよ
うな既知の増幅方法と同様に達成できるのに十分な熱安
定性を、この酵素がもたないことである。
幅におけるクレノウポリメラーゼの使用の欠点は、たと
えば、コピーされた鋳型鎖の増幅をＰＣＲやＬＣＲのよ
うな既知の増幅方法と同様に達成できるのに十分な熱安
定性を、この酵素がもたないことである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、上述の欠点がなく、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー
を伸長させる他のＤＮＡポリメラーゼを見出すことにあ
った。
目的は、上述の欠点がなく、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー
を伸長させる他のＤＮＡポリメラーゼを見出すことにあ
った。
【００１３】驚くべきことに、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、３′−ヒドロキシル基を有し任意に修飾された
ヌクレオシド単位少なくとも１個を一端にもつＰＮＡ／
ＤＮＡプライマーを伸長できることが見出されたのであ
る。
ーゼは、３′−ヒドロキシル基を有し任意に修飾された
ヌクレオシド単位少なくとも１個を一端にもつＰＮＡ／
ＤＮＡプライマーを伸長できることが見出されたのであ
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ポ
リメラーゼ酵素、３′−ヒドロキシル基を有するヌクレ
オシド単位少なくとも１個を一端にもつ１またはそれ以
上のＰＮＡ／ＤＮＡプライマーおよび核酸の増幅に通常
必要な成分たとえば非標識または放射標識デオキシリボ
ヌクレオチドトリホスフェートを用いて核酸を増幅させ
る方法において、ポリメラーゼ酵素は熱安定性である方
法に関する。熱安定性ポリメラーゼとしては、たとえば
Thermus属の種からのＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Pyrococcus woeseiからのＰｗｏ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Thermococcus属種の株９°Ｎからの９°Ｎ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（登録商標）、またはThermococcus l
itoralisからのＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼが適当である。
リメラーゼ酵素、３′−ヒドロキシル基を有するヌクレ
オシド単位少なくとも１個を一端にもつ１またはそれ以
上のＰＮＡ／ＤＮＡプライマーおよび核酸の増幅に通常
必要な成分たとえば非標識または放射標識デオキシリボ
ヌクレオチドトリホスフェートを用いて核酸を増幅させ
る方法において、ポリメラーゼ酵素は熱安定性である方
法に関する。熱安定性ポリメラーゼとしては、たとえば
Thermus属の種からのＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Pyrococcus woeseiからのＰｗｏ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Thermococcus属種の株９°Ｎからの９°Ｎ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（登録商標）、またはThermococcus l
itoralisからのＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼが適当である。
【００１５】本発明の他の態様は、上記方法において１
つよりも多いポリメラーゼが使用される方法である。こ
の目的では、たとえば２またはそれよりも多い異なるポ
リメラーゼの組合せが使用できる。本発明の特定の一実
施態様においては、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメ
ラーゼとＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの組合
せが使用される。
つよりも多いポリメラーゼが使用される方法である。こ
の目的では、たとえば２またはそれよりも多い異なるポ
リメラーゼの組合せが使用できる。本発明の特定の一実
施態様においては、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメ
ラーゼとＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの組合
せが使用される。
【００１６】
【発明の実施の形態】適当なＰＮＡ／ＤＮＡプライマー
の例はＥＰ 0672 677 Ａ2に記載されている。とくに、E
P 0672 677 A2 に記載されているＰＮＡ／ＤＮＡプライ
マーは一端に１〜３個、好ましくは１個のヌクレオシド
単位を有する場合に適当である。ヌクレオシド単位がＰ
ＮＡ／ＤＮＡプライマーの３′−末端に存在するＰＮＡ
／ＤＮＡプライマーも好ましい。
の例はＥＰ 0672 677 Ａ2に記載されている。とくに、E
P 0672 677 A2 に記載されているＰＮＡ／ＤＮＡプライ
マーは一端に１〜３個、好ましくは１個のヌクレオシド
単位を有する場合に適当である。ヌクレオシド単位がＰ
ＮＡ／ＤＮＡプライマーの３′−末端に存在するＰＮＡ
／ＤＮＡプライマーも好ましい。
【００１７】適当なＰＮＡ／ＤＮＡプライマーはたとえ
ば、式I
ば、式I
【化１】 〔式中、ｎは０〜２であり、ｘは２〜５０であり、Ｒは
水素または２〜１８個の炭素原子を有する有機基であ
り、Ｂは互いに独立に、ヌクレオチド化学において慣用
される塩基、たとえば、天然塩基たとえばアデニン、シ
トシン、チミン、グアニン、ウラシル、ヒポキサンチ
ン、もしくは非天然塩基たとえばプリン、２,６−ジア
ミノプリン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニ
ン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６
−ジアミノプリン、プソイドイソシトシン、５−メチル
シトシン、５−フルオロウラシル、５−(Ｃ3〜Ｃ6）−
アルキニルウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシ
トシン、またはそれらのプロドラッグ型である〕のプラ
イマーである。
水素または２〜１８個の炭素原子を有する有機基であ
り、Ｂは互いに独立に、ヌクレオチド化学において慣用
される塩基、たとえば、天然塩基たとえばアデニン、シ
トシン、チミン、グアニン、ウラシル、ヒポキサンチ
ン、もしくは非天然塩基たとえばプリン、２,６−ジア
ミノプリン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニ
ン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６
−ジアミノプリン、プソイドイソシトシン、５−メチル
シトシン、５−フルオロウラシル、５−(Ｃ3〜Ｃ6）−
アルキニルウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシ
トシン、またはそれらのプロドラッグ型である〕のプラ
イマーである。
【００１８】適当なＤＮＡ／ＰＮＡプライマーはさら
に、式IIまたはIII
に、式IIまたはIII
【化２】 （式中、ｎは０〜２であり、ｘは２〜５０であり、Ｒは
水素または２〜１８個の炭素原子を有する有機基であ
り、Ｂは上述の意味を有する）のプライマーである。
水素または２〜１８個の炭素原子を有する有機基であ
り、Ｂは上述の意味を有する）のプライマーである。
【００１９】好ましいＤＮＡ／ＰＮＡプライマーは式
I、IIまたはIIIにおいてｎ＝０のプライマーである。好
ましいＤＮＡ／ＰＮＡプライマーはまた、式I、IIまた
はIIIにおいてｘ＝５〜２５、とくに好ましくは１０〜
１８のプライマーである。
I、IIまたはIIIにおいてｎ＝０のプライマーである。好
ましいＤＮＡ／ＰＮＡプライマーはまた、式I、IIまた
はIIIにおいてｘ＝５〜２５、とくに好ましくは１０〜
１８のプライマーである。
【００２０】２〜１８個の炭素原子を有する有機基の例
にはＣ2〜Ｃ18−アルカノイル、好ましくはＣ2〜Ｃ10−
アルカノイル、とくに好ましくはアセチル、Ｃ2〜Ｃ18
−アルキル、好ましくはＣ2〜Ｃ10−アルキル、Ｃ3〜Ｃ
8−シクロアルカノイルまたはＣ3〜Ｃ13−ヘテロアリー
ルがある。
にはＣ2〜Ｃ18−アルカノイル、好ましくはＣ2〜Ｃ10−
アルカノイル、とくに好ましくはアセチル、Ｃ2〜Ｃ18
−アルキル、好ましくはＣ2〜Ｃ10−アルキル、Ｃ3〜Ｃ
8−シクロアルカノイルまたはＣ3〜Ｃ13−ヘテロアリー
ルがある。
【００２１】ヌクレオシド単位の語は、糖基と塩基を有
するヌクレオシドを意味するものとして理解すべきであ
り、この場合、塩基および糖基は修飾されていてもよ
く、また個々のヌクレオシド単位は互いにホスフェート
基を介して連結されていても、またさらにヌクレオシド
単位はホスフェート基もしくはアミド結合を介してプラ
イマーのＰＮＡ残基に連結されていてもよい。糖基は通
常リボース基であるが、これも修飾されていてもよい。
糖基に修飾を有するヌクレオシドの例は、５′−アミノ
−５′−デオキシチミジン、エチルアミノ−Ｎ−（チミ
ニルアセチル）エタノール、〔（２−アミノエチル）−
Ｎ９−アデニルアセチルアミノ〕メチルホスホン酸があ
る。
するヌクレオシドを意味するものとして理解すべきであ
り、この場合、塩基および糖基は修飾されていてもよ
く、また個々のヌクレオシド単位は互いにホスフェート
基を介して連結されていても、またさらにヌクレオシド
単位はホスフェート基もしくはアミド結合を介してプラ
イマーのＰＮＡ残基に連結されていてもよい。糖基は通
常リボース基であるが、これも修飾されていてもよい。
糖基に修飾を有するヌクレオシドの例は、５′−アミノ
−５′−デオキシチミジン、エチルアミノ−Ｎ−（チミ
ニルアセチル）エタノール、〔（２−アミノエチル）−
Ｎ９−アデニルアセチルアミノ〕メチルホスホン酸があ
る。
【００２２】塩基は慣用の塩基を意味するものと理解さ
れ、たとえば天然塩基のアデニン、シトシン、チミン、
グアニン、ウラシル、ヒポキサンチン、もしくは他の非
天然塩基たとえばプリン、２,６−ジアミノプリン、７
−デアザグアニン、７−デアザアデニン、Ｎ4Ｎ4−エタ
ノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリ
ン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−
フルオロウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラ
シル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、または
それらのプロドラッグ型である。
れ、たとえば天然塩基のアデニン、シトシン、チミン、
グアニン、ウラシル、ヒポキサンチン、もしくは他の非
天然塩基たとえばプリン、２,６−ジアミノプリン、７
−デアザグアニン、７−デアザアデニン、Ｎ4Ｎ4−エタ
ノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリ
ン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−
フルオロウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラ
シル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、または
それらのプロドラッグ型である。
【００２３】熱安定性ポリメラーゼ酵素とは、必要な熱
による鎖の分離後の更なるコピー過程に再び酵素を用い
ることを要しないで、核酸たとえばＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、好ましくはＤＮＡの増幅を可能にする酵素を意味す
るものと理解される。
による鎖の分離後の更なるコピー過程に再び酵素を用い
ることを要しないで、核酸たとえばＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、好ましくはＤＮＡの増幅を可能にする酵素を意味す
るものと理解される。
【００２４】以後の熱による鎖の分離時に不活性化され
るため、鋳型鎖の１回のコピー過程しか可能でないクレ
ノウ酵素とは異なり、熱安定性ポリメラーゼたとえばＶ
ｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと過剰のＰＮＡ／ＤＮ
Ａプライマーを使用すれば、コピーされた鋳型鎖の増幅
を、既知の増幅方法たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ・チ
ェーン反応）およびＬＣＲ（リガーゼ・チェーン反応）
と同様に達成することが可能である〔ＰＣＲについて
は、たとえばMethods in Molecular Biology: 15(1993)
PCR Protocols, B. A. White編, Humana Press 参
照〕。
るため、鋳型鎖の１回のコピー過程しか可能でないクレ
ノウ酵素とは異なり、熱安定性ポリメラーゼたとえばＶ
ｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと過剰のＰＮＡ／ＤＮ
Ａプライマーを使用すれば、コピーされた鋳型鎖の増幅
を、既知の増幅方法たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ・チ
ェーン反応）およびＬＣＲ（リガーゼ・チェーン反応）
と同様に達成することが可能である〔ＰＣＲについて
は、たとえばMethods in Molecular Biology: 15(1993)
PCR Protocols, B. A. White編, Humana Press 参
照〕。
【００２５】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＮ
Ａ／ＤＮＡプライマーの伸長は、鋳型の多重コピーの調
製にとくに適当であり、増幅産物には放射性または非放
射性標識グループを含有させることが好ましい。
Ａ／ＤＮＡプライマーの伸長は、鋳型の多重コピーの調
製にとくに適当であり、増幅産物には放射性または非放
射性標識グループを含有させることが好ましい。
【００２６】たとえば、放射標識増幅生成物の調製に
は、ポリメラーゼ反応に〔α−32Ｐ〕−または〔α−35
Ｓ〕−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート
を使用することができる。同様に、非放射標識グループ
を含有するヌクレオシドトリホスフェートを導入すれ
ば、それ自体既知の方法〔U. Englisch & D. Gauss (19
91) Angew.Chem., 103, 629-46〕により相当する非放射
標識ＤＮＡフラグメントが組み立てられる。
は、ポリメラーゼ反応に〔α−32Ｐ〕−または〔α−35
Ｓ〕−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート
を使用することができる。同様に、非放射標識グループ
を含有するヌクレオシドトリホスフェートを導入すれ
ば、それ自体既知の方法〔U. Englisch & D. Gauss (19
91) Angew.Chem., 103, 629-46〕により相当する非放射
標識ＤＮＡフラグメントが組み立てられる。
【００２７】本発明の増幅反応はたとえば図１に従って
実施される。本技術分野の熟練者には周知のＰＣＲ法に
従い、上述のＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用すれば、
適当な鋳型核酸、とくに鋳型ＤＮＡの指数関数的増幅を
行うことが可能である。
実施される。本技術分野の熟練者には周知のＰＣＲ法に
従い、上述のＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用すれば、
適当な鋳型核酸、とくに鋳型ＤＮＡの指数関数的増幅を
行うことが可能である。
【００２８】プライマー機能を発揮できない純粋なＰＮ
Ａとは異なり、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを熱安定性酵
素たとえばＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと組み合
わせて使用すると、毛細管電気泳動による本来労力を要
し感度の低い検出〔C. Carlsonら, Nature (1996) 380,
207〕を、より迅速で感度の高い検出方法たとえばオー
トラジオグラフィー、Phosphorus Imager（登録商標）
または抗体法に変更することができるという利点があ
る。
Ａとは異なり、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを熱安定性酵
素たとえばＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼと組み合
わせて使用すると、毛細管電気泳動による本来労力を要
し感度の低い検出〔C. Carlsonら, Nature (1996) 380,
207〕を、より迅速で感度の高い検出方法たとえばオー
トラジオグラフィー、Phosphorus Imager（登録商標）
または抗体法に変更することができるという利点があ
る。
【００２９】発明の利用の概観：本発明は、極めて一般
的に、診断とくに病的状態に関連する１または２種以上
の遺伝子の発現を伴う疾患の診断における使用に及ぶも
のである。この方法は、それらが結合する標的核酸配列
の存否またはその量の検出に使用できる。
的に、診断とくに病的状態に関連する１または２種以上
の遺伝子の発現を伴う疾患の診断における使用に及ぶも
のである。この方法は、それらが結合する標的核酸配列
の存否またはその量の検出に使用できる。
【００３０】本発明はまた、診断試験における上記方法
の使用に及ぶものである。本発明の方法は、たとえばＨ
ＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳ
Ｖ、Ｂ型肝炎ウイルスまたはパピローマウイルスによっ
て生じる感染または疾患の診断に使用することができ
る。
の使用に及ぶものである。本発明の方法は、たとえばＨ
ＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳ
Ｖ、Ｂ型肝炎ウイルスまたはパピローマウイルスによっ
て生じる感染または疾患の診断に使用することができ
る。
【００３１】本発明の方法は、たとえば癌の診断にも使
用することができる。この関連ではたとえば、癌の発生
または癌の増殖に関与する標的が用いられる。このよう
な標的の例は次の通りである。 １) 核癌タンパク質たとえばｃ−ｍｙｃ，Ｎ−ｍｙｃ，
ｃ−ｍｙｂ, ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ, ＰＣＮ
Ａ，ｐ１２０； ２) 細胞質／膜結合癌タンパク質たとえばＥＪ−ｒａ
ｓ，ｃ−Ｈａ−ｒａｓ，Ｎ−ｒａｓ，ｒｒｇ，ｂｃｌ−
２，ｃｄｃ−２，ｃ−ｒａｆ−１，ｃ-ｍｏｓ,ｃ−ｓｒ
ｃ，ｃ−ａｂｌ； ３) 細胞受容体、たとえばＥＧＦ受容体、ｃ−ｅｒｂ
Ａ、レチノイド受容体、プロテインキナーゼ調節サブユ
ニット、ｃ−ｆｍｓ； ４）サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスたと
えばＣＳＦ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ，
ＩＬ−２，ＩＬ−４，ｂＦＧＦ，ミエロブラスチン、フ
ィブロネクチン。
用することができる。この関連ではたとえば、癌の発生
または癌の増殖に関与する標的が用いられる。このよう
な標的の例は次の通りである。 １) 核癌タンパク質たとえばｃ−ｍｙｃ，Ｎ−ｍｙｃ，
ｃ−ｍｙｂ, ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ, ＰＣＮ
Ａ，ｐ１２０； ２) 細胞質／膜結合癌タンパク質たとえばＥＪ−ｒａ
ｓ，ｃ−Ｈａ−ｒａｓ，Ｎ−ｒａｓ，ｒｒｇ，ｂｃｌ−
２，ｃｄｃ−２，ｃ−ｒａｆ−１，ｃ-ｍｏｓ,ｃ−ｓｒ
ｃ，ｃ−ａｂｌ； ３) 細胞受容体、たとえばＥＧＦ受容体、ｃ−ｅｒｂ
Ａ、レチノイド受容体、プロテインキナーゼ調節サブユ
ニット、ｃ−ｆｍｓ； ４）サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスたと
えばＣＳＦ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ，
ＩＬ−２，ＩＬ−４，ｂＦＧＦ，ミエロブラスチン、フ
ィブロネクチン。
【００３２】本発明の方法はさらに、たとえば、インテ
グリンまたは細胞−細胞接着受容体たとえばＶＬＡ−
４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭに
よって影響される疾患の診断に適している。
グリンまたは細胞−細胞接着受容体たとえばＶＬＡ−
４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭに
よって影響される疾患の診断に適している。
【００３３】本発明の方法はまた、たとえば、細胞の増
殖および／または遊走によって影響される疾患の診断に
も適している。この場合にはたとえば、増殖および／ま
たは遊走過程に関与する標的を使用できる。このような
標的の例は次の通りである。 １) 核トランス作用因子タンパク質およびサイクリン、
たとえばｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｍｙｂ, ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｆ
ｏｓ／ｊｕｎ, サイクリン，ｃｄｃ２キナーゼ； ２) マイトジェンまたは増殖因子、たとえば、ＰＤＧ
Ｆ，ｂＦＧＦ，ＥＧＦ，ＨＢ-ＥＧＦ，ＶＥＧＦおよび
ＴＧＦ−β； ３) 細胞受容体、たとえばｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容
体、ＶＥＧＦ受容体、およびＰＤＧＦ受容体。
殖および／または遊走によって影響される疾患の診断に
も適している。この場合にはたとえば、増殖および／ま
たは遊走過程に関与する標的を使用できる。このような
標的の例は次の通りである。 １) 核トランス作用因子タンパク質およびサイクリン、
たとえばｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｍｙｂ, ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｆ
ｏｓ／ｊｕｎ, サイクリン，ｃｄｃ２キナーゼ； ２) マイトジェンまたは増殖因子、たとえば、ＰＤＧ
Ｆ，ｂＦＧＦ，ＥＧＦ，ＨＢ-ＥＧＦ，ＶＥＧＦおよび
ＴＧＦ−β； ３) 細胞受容体、たとえばｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容
体、ＶＥＧＦ受容体、およびＰＤＧＦ受容体。
【００３４】Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼは３′
→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、正常ＤＮＡプラ
イマーを分解する〔Kongら, J.Biol.Chem. (1993) 1965
-1975〕。本発明のプライマーはこの核酸分解に対する
安定性が上昇している。
→５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、正常ＤＮＡプラ
イマーを分解する〔Kongら, J.Biol.Chem. (1993) 1965
-1975〕。本発明のプライマーはこの核酸分解に対する
安定性が上昇している。
【００３５】多数の既知の市販されているＤＮＡポリメ
ラーゼについての実験により、たとえば熱安定性の、Th
ermus属の種からのＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus woeseiからのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Thermococcus属の種の株９°Ｎからの９°Ｎ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（登録商標）または Thermococcus li
toralis からのＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼは、
３′−ヒドロキシル基を有するヌクレオシド単位少なく
とも１個を一端にもつＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを伸長
できることが明らかにされた。
ラーゼについての実験により、たとえば熱安定性の、Th
ermus属の種からのＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus woeseiからのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Thermococcus属の種の株９°Ｎからの９°Ｎ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（登録商標）または Thermococcus li
toralis からのＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼは、
３′−ヒドロキシル基を有するヌクレオシド単位少なく
とも１個を一端にもつＰＮＡ／ＤＮＡプライマーを伸長
できることが明らかにされた。
【００３６】Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼの使用
は、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼとの反応では完
全長の核酸フラグメントのコピーが生成するので有利で
ある。Ｔｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの使用は
さらに、高い増幅率が達成されるので有利である。
は、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼとの反応では完
全長の核酸フラグメントのコピーが生成するので有利で
ある。Ｔｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの使用は
さらに、高い増幅率が達成されるので有利である。
【００３７】本発明の方法は、ＤＮＡ／ＰＮＡプライマ
ーが鋳型に対して過剰に存在すると有利である。ＤＮＡ
／ＰＮＡプライマーの２〜２０倍過剰が有利であり、５
〜１０倍過剰がとくに有利である（いずれの場合も分子
量に基づいて）。
ーが鋳型に対して過剰に存在すると有利である。ＤＮＡ
／ＰＮＡプライマーの２〜２０倍過剰が有利であり、５
〜１０倍過剰がとくに有利である（いずれの場合も分子
量に基づいて）。
【００３８】ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー、ＤＮＡプライ
マーおよびＤＮＡ鋳型の配列： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１： Ｈ−ｔａａ ｔａｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（５′ＮＨ
−Ｔ）−３′ （５′ＮＨ−Ｔは５′−アミノ−５′−デオキシチミジ
ン、構造は式I，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２： アセチル−ｔａａ ｔａｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（ｅ
ａｅ(ｔ)）Ａ−３′ （ｅａｅ(ｔ)はエチルアミノ−Ｎ−（チミニルアセチ
ル）エタノール単位、構造は式III，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３： アセチル−ｔｇｃ ａａｇ ｃｔｔ ａａ（５′ＮＨ−
Ｔ）−３′ （５′ＮＨ−Ｔは５′−アミノ−５′−デオキシチミジ
ン、構造は式I，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４： アセチル−ｔｇｃ ａａｇ ｃｔｔ ａ（ＰＨＯＮＡ-ａ）
(Ｔ)−３′ （ＰＨＯＮＡ−ａは〔（２−アミノエチル）−Ｎ９−ア
デニルアセチルアミノ〕メチルホスホン酸単位、構造は
式II，ｎ＝０参照） ＤＮＡプライマー１： ５′−ｄ（ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ Ｔ−
３′) ＤＮＡプライマー２： ５′−ｄ（ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡ
Ａ−３′) ＤＮＡプライマー３： ５′−ｄ（ＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＣ−３′) ＤＮＡ鋳型３（81マー）： 5′−d（GCC CCA GGG AGA AGG CAA CTG GAC CGA AGG CG
C TTG TGG AGA AGG AGT TCA TAG CTG GGC TCC CTA TAG
TGA GTC GTA TTA-3′） ＤＮＡ鋳型４（46マー）： 5′−d（CGA GCT TAA GTC AGC GCC TAC TAT AGT GAG TC
G TAT TAA GCT TGC A-3′） 大文字：ＤＮＡ、小文字：ＰＮＡ
マーおよびＤＮＡ鋳型の配列： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１： Ｈ−ｔａａ ｔａｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（５′ＮＨ
−Ｔ）−３′ （５′ＮＨ−Ｔは５′−アミノ−５′−デオキシチミジ
ン、構造は式I，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２： アセチル−ｔａａ ｔａｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（ｅ
ａｅ(ｔ)）Ａ−３′ （ｅａｅ(ｔ)はエチルアミノ−Ｎ−（チミニルアセチ
ル）エタノール単位、構造は式III，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３： アセチル−ｔｇｃ ａａｇ ｃｔｔ ａａ（５′ＮＨ−
Ｔ）−３′ （５′ＮＨ−Ｔは５′−アミノ−５′−デオキシチミジ
ン、構造は式I，ｎ＝０参照） ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４： アセチル−ｔｇｃ ａａｇ ｃｔｔ ａ（ＰＨＯＮＡ-ａ）
(Ｔ)−３′ （ＰＨＯＮＡ−ａは〔（２−アミノエチル）−Ｎ９−ア
デニルアセチルアミノ〕メチルホスホン酸単位、構造は
式II，ｎ＝０参照） ＤＮＡプライマー１： ５′−ｄ（ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ Ｔ−
３′) ＤＮＡプライマー２： ５′−ｄ（ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＡ
Ａ−３′) ＤＮＡプライマー３： ５′−ｄ（ＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧＴＣＡＧＣ−３′) ＤＮＡ鋳型３（81マー）： 5′−d（GCC CCA GGG AGA AGG CAA CTG GAC CGA AGG CG
C TTG TGG AGA AGG AGT TCA TAG CTG GGC TCC CTA TAG
TGA GTC GTA TTA-3′） ＤＮＡ鋳型４（46マー）： 5′−d（CGA GCT TAA GTC AGC GCC TAC TAT AGT GAG TC
G TAT TAA GCT TGC A-3′） 大文字：ＤＮＡ、小文字：ＰＮＡ
【００３９】
実施例１： 核酸基板ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１，ＤＮＡプライマ
ー１〜３およびＤＮＡ鋳型３と４の調製 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１（１６マー，Ｈ−ｔａａｔ
ａｃｇａｃｔｃａｃｔａ(５′ＮＨ−Ｔ)−３′）はEP 0
672 677 A2 に記載されているようにして合成した。Ｄ
ＮＡプライマー１,２および３ならびにＤＮＡ鋳型３お
よび４はＡＢＩシンセサイザー上で合成し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により精製した。ＤＮＡプライマ
ー１（15pmol）を、総容量６０μl中１０単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Gibco BRL）、および１０mCi
のRedivue〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（Amersham，3000 Ci／mm
ol）を用いて５′末端で標識した。リン酸化は３７℃で
９０分間インキュベートして行った。ついで８５℃に１
５分間加熱して反応を停止させた。
ー１〜３およびＤＮＡ鋳型３と４の調製 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１（１６マー，Ｈ−ｔａａｔ
ａｃｇａｃｔｃａｃｔａ(５′ＮＨ−Ｔ)−３′）はEP 0
672 677 A2 に記載されているようにして合成した。Ｄ
ＮＡプライマー１,２および３ならびにＤＮＡ鋳型３お
よび４はＡＢＩシンセサイザー上で合成し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により精製した。ＤＮＡプライマ
ー１（15pmol）を、総容量６０μl中１０単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Gibco BRL）、および１０mCi
のRedivue〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（Amersham，3000 Ci／mm
ol）を用いて５′末端で標識した。リン酸化は３７℃で
９０分間インキュベートして行った。ついで８５℃に１
５分間加熱して反応を停止させた。
【００４０】実施例２： 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポ
リメラーゼならびにＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いたＰＮＡ／ＤＮＡプライマーの伸長（充填反
応） 充填反応でプライマーの鋳型への完全な結合を保証する
ため、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーション
は、１.８ｍＭトリス塩酸塩（pH 7.0）、０.５ｍＭＭｇ
Ｃｌ2および２３ｍＭ ＮａＣｌを含む総容量５００μl
中、１５pmolのプライマー（標識ＤＮＡプライマー１ま
たは非標識ＤＮＡ／ＰＮＡプライマー１）および５０pm
olのＤＮＡ鋳型３を用いて実施した。この混合物を９５
℃で１５分間加熱し、ついで１時間で室温に冷却した。
Ｔｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔ
（登録商標）ポリメラーゼはBoehringer Mannheimおよ
びNewEnglandBiolabsから入手した。酵素反応は適当な
緩衝液中総容量２５μlにおいて０.１５pmolのプライマ
ー／鋳型複合体ならびに必要なすべてのｄＮＴＰをａ)
５ｍＭおよびｂ)５０ｍＭの最終濃度で用いて実施し
た。ＤＮＡ／ＰＮＡプライマー１の場合は、非標識ｄＣ
ＴＰに代えて〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（400Ci／mmol）を
用いた。酵素反応にＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4が必要な
場合には、この化合物を最終濃度２ｍＭで反応混合物に
添加した。反応は酵素を加えて開始させ、混合物を３７
℃または７５℃において１５分間インキュベートした。
次に５μlの停止／負荷染料（NewEngland Biolabs）を
加えて反応を中断した。各反応液のアリコート（５μ
l）をネイティブなゲル（ゲル濃度12％、10ワット、４
時間）および変性ゲル（ゲル濃度15％、35ワット、２時
間）上ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し
た。ついでゲルを１２％（v／v）メタノールおよび１０
％（v／v）酢酸水溶液中で固定し、乾燥し、Phosphorus
Imager（登録商標）プレート（Molecular Dynamics）
に一夜暴露してオートラジオグラフィーにより検討し
た。
リメラーゼならびにＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いたＰＮＡ／ＤＮＡプライマーの伸長（充填反
応） 充填反応でプライマーの鋳型への完全な結合を保証する
ため、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーション
は、１.８ｍＭトリス塩酸塩（pH 7.0）、０.５ｍＭＭｇ
Ｃｌ2および２３ｍＭ ＮａＣｌを含む総容量５００μl
中、１５pmolのプライマー（標識ＤＮＡプライマー１ま
たは非標識ＤＮＡ／ＰＮＡプライマー１）および５０pm
olのＤＮＡ鋳型３を用いて実施した。この混合物を９５
℃で１５分間加熱し、ついで１時間で室温に冷却した。
Ｔｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔ
（登録商標）ポリメラーゼはBoehringer Mannheimおよ
びNewEnglandBiolabsから入手した。酵素反応は適当な
緩衝液中総容量２５μlにおいて０.１５pmolのプライマ
ー／鋳型複合体ならびに必要なすべてのｄＮＴＰをａ)
５ｍＭおよびｂ)５０ｍＭの最終濃度で用いて実施し
た。ＤＮＡ／ＰＮＡプライマー１の場合は、非標識ｄＣ
ＴＰに代えて〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（400Ci／mmol）を
用いた。酵素反応にＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4が必要な
場合には、この化合物を最終濃度２ｍＭで反応混合物に
添加した。反応は酵素を加えて開始させ、混合物を３７
℃または７５℃において１５分間インキュベートした。
次に５μlの停止／負荷染料（NewEngland Biolabs）を
加えて反応を中断した。各反応液のアリコート（５μ
l）をネイティブなゲル（ゲル濃度12％、10ワット、４
時間）および変性ゲル（ゲル濃度15％、35ワット、２時
間）上ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し
た。ついでゲルを１２％（v／v）メタノールおよび１０
％（v／v）酢酸水溶液中で固定し、乾燥し、Phosphorus
Imager（登録商標）プレート（Molecular Dynamics）
に一夜暴露してオートラジオグラフィーにより検討し
た。
【００４１】実施例３： 線状ＰＣＲ反応（増幅） Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＮＡ
／ＤＮＡプライマー１を用いた鋳型鎖の増幅には過剰の
プライマー、２０pmolのＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１を
２pmolのＤＮＡ鋳型３（81マー）および２００ｍＭのｄ
ＮＴＰを適当な反応緩衝液中に混合し最終容量を５０μ
lとした。混合物を鉱油の層で覆い、２単位のＶｅｎｔ
（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始
させた。ポリメラーゼ反応は以下の要領で実施した。す
なわち、１分間９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃
を３０サイクル、最後に８分間７２℃で反応を完結させ
た。混合物をフェノールで１回、ついでフェノール／ク
ロロホルム、最後にクロロホルムで抽出した。７.８Ｍ
の酢酸アンモニウムおよび１００％（v／v）エタノール
を用いてＤＮＡを沈殿させた。沈殿を１０μlのＴＥ緩
衝液に溶かし、アリコートをゲル電気泳動によって分析
した。
／ＤＮＡプライマー１を用いた鋳型鎖の増幅には過剰の
プライマー、２０pmolのＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１を
２pmolのＤＮＡ鋳型３（81マー）および２００ｍＭのｄ
ＮＴＰを適当な反応緩衝液中に混合し最終容量を５０μ
lとした。混合物を鉱油の層で覆い、２単位のＶｅｎｔ
（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始
させた。ポリメラーゼ反応は以下の要領で実施した。す
なわち、１分間９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃
を３０サイクル、最後に８分間７２℃で反応を完結させ
た。混合物をフェノールで１回、ついでフェノール／ク
ロロホルム、最後にクロロホルムで抽出した。７.８Ｍ
の酢酸アンモニウムおよび１００％（v／v）エタノール
を用いてＤＮＡを沈殿させた。沈殿を１０μlのＴＥ緩
衝液に溶かし、アリコートをゲル電気泳動によって分析
した。
【００４２】実施例４： Ｎ−（２−モノメトキシトリチルアミノ）エチルアミノ
エタノール ６０mlのジクロロメタン中９.２４ｇのモノメトキシト
リチルクロリドの溶液を１００mlの無水ジメチルホルム
アミド中９.３ｇのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ジア
ミノエタンの溶液に、攪拌しながら２時間を要して０℃
で添加する。混合物を４℃で一夜攪拌する。ついで溶媒
を真空中で除去し、残留物を１００mlの酢酸エチルと５
０mlの水に分配する。水相を４０mlの酢酸エチルととも
に４回蒸発させる。残った粗生成物をシリカゲル上、１
％トリエチルアミンを含む酢酸エチル中メタノールの勾
配（１〜10％）を用いクロマトグラフィーによって精製
する。純粋な生成物を含む分画を合わせて蒸発乾固す
る。 収量：泡状物７.９１ｇ Ｒf：０.１４（酢酸エチル／メタノール／トリエチルア
ミン：100／10／1） ＭＳ（ＦＡＢ，ＭｅＯＨ／ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）：３８
３.３（Ｍ＋Ｌｉ）+
エタノール ６０mlのジクロロメタン中９.２４ｇのモノメトキシト
リチルクロリドの溶液を１００mlの無水ジメチルホルム
アミド中９.３ｇのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ジア
ミノエタンの溶液に、攪拌しながら２時間を要して０℃
で添加する。混合物を４℃で一夜攪拌する。ついで溶媒
を真空中で除去し、残留物を１００mlの酢酸エチルと５
０mlの水に分配する。水相を４０mlの酢酸エチルととも
に４回蒸発させる。残った粗生成物をシリカゲル上、１
％トリエチルアミンを含む酢酸エチル中メタノールの勾
配（１〜10％）を用いクロマトグラフィーによって精製
する。純粋な生成物を含む分画を合わせて蒸発乾固す
る。 収量：泡状物７.９１ｇ Ｒf：０.１４（酢酸エチル／メタノール／トリエチルア
ミン：100／10／1） ＭＳ（ＦＡＢ，ＭｅＯＨ／ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）：３８
３.３（Ｍ＋Ｌｉ）+
【００４３】実施例５： Ｎ−（２−モノメトキシトリチルアミノ）エチルアミノ
−Ｎ−（チミニルアセチル）エタノール １.８４ｇのカルボキシメチルチミンを５０mlの無水ジ
メチルホルムアミドに溶解し、ついで３.２４ｇのＴＯ
ＴＵおよび３.４mlのジイソプロピルエチルアミンを加
える。混合物を２０分間攪拌し、ついで実施例４からの
Ｎ−（２−モノメトキシトリチルアミノ）エチルアミノ
エタノール３.７６ｇを加える。この溶液を室温で１６
時間攪拌し、ついで真空中で蒸発させる。残留物を８０
mlの酢酸エチルに溶解し、０.５％のトリエチルアミン
を含む水２０mlで４回抽出する。有機相を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、約１５mlに濃縮する。生成物を２００ml
のジエチルエーテルに攪拌しながら滴下して沈殿させ
る。粗生成物をろ過して乾燥させる。生成物はさらに、
シリカゲル上、１％トリエチルアミンを含む酢酸エチル
／ヘプタン（10／1）中メタノールの勾配（２〜５％）
を用いクロマトグラフィーによって精製する。純粋な生
成物を含む分画を合わせて蒸発乾固し、残留物をジエチ
ルエーテルと磨砕する。 収量：無定形の固体１.９５ｇ Ｒf：０.１６（酢酸エチル／メタノール／トリエチルア
ミン：100／20／1） ＭＳ（ＥＳ+）：５４３.３（Ｍ＋Ｈ）+
−Ｎ−（チミニルアセチル）エタノール １.８４ｇのカルボキシメチルチミンを５０mlの無水ジ
メチルホルムアミドに溶解し、ついで３.２４ｇのＴＯ
ＴＵおよび３.４mlのジイソプロピルエチルアミンを加
える。混合物を２０分間攪拌し、ついで実施例４からの
Ｎ−（２−モノメトキシトリチルアミノ）エチルアミノ
エタノール３.７６ｇを加える。この溶液を室温で１６
時間攪拌し、ついで真空中で蒸発させる。残留物を８０
mlの酢酸エチルに溶解し、０.５％のトリエチルアミン
を含む水２０mlで４回抽出する。有機相を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、約１５mlに濃縮する。生成物を２００ml
のジエチルエーテルに攪拌しながら滴下して沈殿させ
る。粗生成物をろ過して乾燥させる。生成物はさらに、
シリカゲル上、１％トリエチルアミンを含む酢酸エチル
／ヘプタン（10／1）中メタノールの勾配（２〜５％）
を用いクロマトグラフィーによって精製する。純粋な生
成物を含む分画を合わせて蒸発乾固し、残留物をジエチ
ルエーテルと磨砕する。 収量：無定形の固体１.９５ｇ Ｒf：０.１６（酢酸エチル／メタノール／トリエチルア
ミン：100／20／1） ＭＳ（ＥＳ+）：５４３.３（Ｍ＋Ｈ）+
【００４４】実施例６： ２−シアノエチル ２−(２−〔（４−メトキシフェニ
ル）ジフェニルメチル〕アミノエチル）−〔（５−メチ
ル−２,４−ジオキソ−３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミ
ジン−１−イル）アセチル〕アミノエチル ジイソプロ
ピルホスホロアミデート 実施例５からのＮ−(２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−(２
−〔（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル〕アミ
ノエチル）−２−(５−メチル−２,４−ジオキソ−３,
４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）アセトア
ミド（0.5ｇ, 0.922mmol）を、無水ジクロロメタン（15
ml）に溶解する。この溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル
エチルアミン（3.69mmol；0.63ml）および２−シアノエ
チル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイ
ト（1.10mmol；0.24ml）を加える。１時間後に、反応混
合物に酢酸エチルを加え、溶媒を真空中で蒸発させる。
残留物を酢酸エチルに溶解し、この溶液を飽和ＮａＣｌ
水溶液で４回洗浄する。有機相を乾燥し（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）、ろ過し、真空中で蒸発させる。残留物をシリカ
ゲル上溶出液としてジクロロメタン：酢酸エチル：ＮＥ
ｔ3（49.5：49.5：1）を用いカラムクロマトグラフィー
によって精製する。生成物を含む分画を合わせて濃縮す
る。標記化合物は白色の固体として、収量０.４７４ｇ
（69％）で得られる。 Ｒf：０.４５（ジクロロメタン：酢酸エチル／１：
１）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ １３３.７５
（ｓ），１３４.５（ｓ） ＭＳ（ＥＡＢ）：７３４.４（Ｍ+）
ル）ジフェニルメチル〕アミノエチル）−〔（５−メチ
ル−２,４−ジオキソ−３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミ
ジン−１−イル）アセチル〕アミノエチル ジイソプロ
ピルホスホロアミデート 実施例５からのＮ−(２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−(２
−〔（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル〕アミ
ノエチル）−２−(５−メチル−２,４−ジオキソ−３,
４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）アセトア
ミド（0.5ｇ, 0.922mmol）を、無水ジクロロメタン（15
ml）に溶解する。この溶液に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル
エチルアミン（3.69mmol；0.63ml）および２−シアノエ
チル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイ
ト（1.10mmol；0.24ml）を加える。１時間後に、反応混
合物に酢酸エチルを加え、溶媒を真空中で蒸発させる。
残留物を酢酸エチルに溶解し、この溶液を飽和ＮａＣｌ
水溶液で４回洗浄する。有機相を乾燥し（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）、ろ過し、真空中で蒸発させる。残留物をシリカ
ゲル上溶出液としてジクロロメタン：酢酸エチル：ＮＥ
ｔ3（49.5：49.5：1）を用いカラムクロマトグラフィー
によって精製する。生成物を含む分画を合わせて濃縮す
る。標記化合物は白色の固体として、収量０.４７４ｇ
（69％）で得られる。 Ｒf：０.４５（ジクロロメタン：酢酸エチル／１：
１）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ １３３.７５
（ｓ），１３４.５（ｓ） ＭＳ（ＥＡＢ）：７３４.４（Ｍ+）
【００４５】実施例７： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２，アセチル−ｔａａ ｔａ
ｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（ｅａｅ(ｔ)）Ａ−３′ 市販の孔径が制御されたアデノシン誘導体化ガラス（５
mmol）を充填した合成カラムを Eppendorf Biotronik E
cosyn D 300型ＤＮＡシンセサイザーに装着して、ジク
ロロメタン中３％濃度のトリクロロ酢酸により処理し
５′−末端ジメトキシトリチル基を除去する。アセトニ
トリルで完全に洗浄したのち、ＤＮＡアクティベーター
溶液（アセトニトリル中テトラゾール，Applied Biosys
tems）と混合したエチルアミノ−Ｎ−（チミニルアセチ
ル）エタノールホスホロアミダイトの０.１Ｍ溶液をカ
ラムに添加する。カップリング反応は１５分間行わせ、
ついでこれを反復する。カラムをアセトニトリルで洗浄
し、ついでＤＮＡ酸化溶液（ヨウ素、ピリジン、水；Ap
plied Biosystems）を１分間カラムに加える。洗浄後、
未反応ヒドロキシル官能基をＴＨＦ中無水酢酸、Ｎ−メ
チルイミダゾールおよびルチジン（Applied Biosystem
s）でキャッピングして保護する。アセトニトリルで完
全に洗浄したのち、ジクロロメタン中３％濃度のトリク
ロロ酢酸で処理してＮ−モノメトキシトリチル保護基を
除去する。以後、ＰＮＡ合成をＥＰ 0672677 Ａ2に記載
のようにして継続する。合成完了後、Ｎ−末端モノメト
キシトリチル保護基をジクロロメタン中３％濃度のトリ
クロロ酢酸で処理して除去し、アミノ末端をＴＨＦ中無
水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ルチジン（Applied
Biosystems）でキャッピングして保護する。プライマー
を固体の基板から濃アンモニア水溶液を用いて切断し、
この溶液を５５℃に５時間加熱して塩基性の保護基を除
去する。サンプルの一部を、半製造Ｃ18逆相ＨＰＬＣに
より溶出液として０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム
中１０〜８０％ＭｅＣＮを用いて精製する。Sephadex N
AP−10 カラム（Pharmacia）により脱塩し凍結乾燥する
と、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２が２ＯＤ260（＝10.38
mmol）の収量で得られる。 ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）ｍ／ｚ ４６３６.１（計算値
4635.41）
ｃ ｇａｃ ｔｃａ ｃｔａ−（ｅａｅ(ｔ)）Ａ−３′ 市販の孔径が制御されたアデノシン誘導体化ガラス（５
mmol）を充填した合成カラムを Eppendorf Biotronik E
cosyn D 300型ＤＮＡシンセサイザーに装着して、ジク
ロロメタン中３％濃度のトリクロロ酢酸により処理し
５′−末端ジメトキシトリチル基を除去する。アセトニ
トリルで完全に洗浄したのち、ＤＮＡアクティベーター
溶液（アセトニトリル中テトラゾール，Applied Biosys
tems）と混合したエチルアミノ−Ｎ−（チミニルアセチ
ル）エタノールホスホロアミダイトの０.１Ｍ溶液をカ
ラムに添加する。カップリング反応は１５分間行わせ、
ついでこれを反復する。カラムをアセトニトリルで洗浄
し、ついでＤＮＡ酸化溶液（ヨウ素、ピリジン、水；Ap
plied Biosystems）を１分間カラムに加える。洗浄後、
未反応ヒドロキシル官能基をＴＨＦ中無水酢酸、Ｎ−メ
チルイミダゾールおよびルチジン（Applied Biosystem
s）でキャッピングして保護する。アセトニトリルで完
全に洗浄したのち、ジクロロメタン中３％濃度のトリク
ロロ酢酸で処理してＮ−モノメトキシトリチル保護基を
除去する。以後、ＰＮＡ合成をＥＰ 0672677 Ａ2に記載
のようにして継続する。合成完了後、Ｎ−末端モノメト
キシトリチル保護基をジクロロメタン中３％濃度のトリ
クロロ酢酸で処理して除去し、アミノ末端をＴＨＦ中無
水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ルチジン（Applied
Biosystems）でキャッピングして保護する。プライマー
を固体の基板から濃アンモニア水溶液を用いて切断し、
この溶液を５５℃に５時間加熱して塩基性の保護基を除
去する。サンプルの一部を、半製造Ｃ18逆相ＨＰＬＣに
より溶出液として０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム
中１０〜８０％ＭｅＣＮを用いて精製する。Sephadex N
AP−10 カラム（Pharmacia）により脱塩し凍結乾燥する
と、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２が２ＯＤ260（＝10.38
mmol）の収量で得られる。 ＭＳ（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）ｍ／ｚ ４６３６.１（計算値
4635.41）
【００４６】実施例８： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３，アセチル−ｔｇｃ ａａ
ｇ ｃｔｔ ａａ（５′ＮＨ−Ｔ）−ＯＨ３′ ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３〔１２マー、アセチル−ｔ
ｇｃ ａａｇ ｃｔｔａａ−（５′ＮＨ−Ｔ）−ＯＨ
３′〕は EP 0672 677 A2 の記載のようにしてＰＮＡ／
ＤＮＡプライマー１と同様に合成する。ただし、最後の
ＰＮＡ単位のモノメトキシトリチル基の除去後、キャッ
ピングは実施例７に記載のように実施する。
ｇ ｃｔｔ ａａ（５′ＮＨ−Ｔ）−ＯＨ３′ ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３〔１２マー、アセチル−ｔ
ｇｃ ａａｇ ｃｔｔａａ−（５′ＮＨ−Ｔ）−ＯＨ
３′〕は EP 0672 677 A2 の記載のようにしてＰＮＡ／
ＤＮＡプライマー１と同様に合成する。ただし、最後の
ＰＮＡ単位のモノメトキシトリチル基の除去後、キャッ
ピングは実施例７に記載のように実施する。
【００４７】実施例９： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４，アセチル−ｔｇｃ ａａ
ｇ ｃｔｔ ａ（ＰＨＯＮＡ−ａ）(Ｔ)−ＯＨ３′ ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４はチミジンを負荷したＣＰ
Ｇ基板に出発して合成する。ジメトキシトリチル基はジ
クロロメタン中３％濃度のトリクロロ酢酸溶液で処理し
て除去する。ＰＨＯＮＡ−ａモノマー単位は EP 073989
8 に記載のようにして調製し、ヒドロキシル基にカップ
リングさせる。ついで、ＰＮＡの合成をEP 0672 677 A2
に記載のように継続する。
ｇ ｃｔｔ ａ（ＰＨＯＮＡ−ａ）(Ｔ)−ＯＨ３′ ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４はチミジンを負荷したＣＰ
Ｇ基板に出発して合成する。ジメトキシトリチル基はジ
クロロメタン中３％濃度のトリクロロ酢酸溶液で処理し
て除去する。ＰＨＯＮＡ−ａモノマー単位は EP 073989
8 に記載のようにして調製し、ヒドロキシル基にカップ
リングさせる。ついで、ＰＮＡの合成をEP 0672 677 A2
に記載のように継続する。
【００４８】実施例１０： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１，８１−マーＤＮＡ鋳型３
およびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woese
i）を用いる充填反応 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー1（15pmol）を１.８ｍＭトリ
ス塩酸塩（ｐＨ7.0）、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ2および２３
ｍＭ ＮａＣｌを含有する総容量５００μl中でＤＮＡ鋳
型３（50pmol）とハイブリダイズさせた。充填反応は、
０.１５pmolのプライマー／鋳型複合体および必要なす
べてのｄＮＴＰを最終濃度５０μmolで含有するＰｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼのために調製した緩衝液（25μl）
中で実施した。非標識ｄＣＴＰは〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ
（400Ci／mmol）で置換した。反応は２単位のＰｗｏ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woesei,入手先：Boehri
nger Mannheim）の添加により開始させ、７５℃で１５
分間インキュベートした。各反応液のアリコート（５μ
l）をネイティブ（12％アクリルアミド、10ワット、４
時間）および９５℃に２０分間加熱後の変性（15％アク
リルアミド、35ワット、２時間）ＰＡＧＥ（ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）の両者によって分析した。この
ゲルを固定し、乾燥し、オートラジオグラフィー（Phos
phorus Imager, Molecular Dynamics）に付した。
およびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woese
i）を用いる充填反応 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー1（15pmol）を１.８ｍＭトリ
ス塩酸塩（ｐＨ7.0）、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ2および２３
ｍＭ ＮａＣｌを含有する総容量５００μl中でＤＮＡ鋳
型３（50pmol）とハイブリダイズさせた。充填反応は、
０.１５pmolのプライマー／鋳型複合体および必要なす
べてのｄＮＴＰを最終濃度５０μmolで含有するＰｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼのために調製した緩衝液（25μl）
中で実施した。非標識ｄＣＴＰは〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ
（400Ci／mmol）で置換した。反応は２単位のＰｗｏ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woesei,入手先：Boehri
nger Mannheim）の添加により開始させ、７５℃で１５
分間インキュベートした。各反応液のアリコート（５μ
l）をネイティブ（12％アクリルアミド、10ワット、４
時間）および９５℃に２０分間加熱後の変性（15％アク
リルアミド、35ワット、２時間）ＰＡＧＥ（ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）の両者によって分析した。この
ゲルを固定し、乾燥し、オートラジオグラフィー（Phos
phorus Imager, Molecular Dynamics）に付した。
【００４９】実施例１１： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１，８１−マーＤＮＡ鋳型３
および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を用い
る充填反応 充填反応は、適当な緩衝液中で９°Ｎ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（登録商標）（NewEngland Biolabs）を用いるほか
は実施例１０に記載のように実施する。
および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を用い
る充填反応 充填反応は、適当な緩衝液中で９°Ｎ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（登録商標）（NewEngland Biolabs）を用いるほか
は実施例１０に記載のように実施する。
【００５０】実施例１２： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２，８１−マーＤＮＡ鋳型３
およびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woese
i）を用いる充填反応 充填反応は、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２を用いるほか
は実施例１０の記載と同様に実施する。
およびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus woese
i）を用いる充填反応 充填反応は、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２を用いるほか
は実施例１０の記載と同様に実施する。
【００５１】実施例１３： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２，８１−マーＤＮＡ鋳型３
および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を用い
る充填反応 充填反応は、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２を用いるほか
は実施例１１の記載と同様に実施する。
および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を用い
る充填反応 充填反応は、ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー２を用いるほか
は実施例１１の記載と同様に実施する。
【００５２】実施例１４： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー３，ＤＮＡプライマー３，４
６−マーＤＮＡ鋳型４およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラー
ゼを用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例８からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー３、５pmolのＤＮＡ鋳型４、０.５pmolの５′
−標識ＤＮＡプライマー３および２００μＭのｄＮＴＰ
を混合する。他の条件は実施例１０に記載の通りとす
る。増幅は次のように実施する。３０サイクル、１分間
９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃。
６−マーＤＮＡ鋳型４およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラー
ゼを用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例８からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー３、５pmolのＤＮＡ鋳型４、０.５pmolの５′
−標識ＤＮＡプライマー３および２００μＭのｄＮＴＰ
を混合する。他の条件は実施例１０に記載の通りとす
る。増幅は次のように実施する。３０サイクル、１分間
９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃。
【００５３】実施例１５： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー４，ＤＮＡプライマー３，４
６−マーＤＮＡ鋳型４およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラー
ゼを用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例９からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー４、５pmolのＤＮＡ鋳型４、０.５pmolの５′
−標識ＤＮＡプライマー３および２００μＭのｄＮＴＰ
を混合する。他の条件は実施例１０に記載の通りとす
る。増幅は次のように実施する。３０サイクル、１分間
９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃。
６−マーＤＮＡ鋳型４およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラー
ゼを用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例９からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー４、５pmolのＤＮＡ鋳型４、０.５pmolの５′
−標識ＤＮＡプライマー３および２００μＭのｄＮＴＰ
を混合する。他の条件は実施例１０に記載の通りとす
る。増幅は次のように実施する。３０サイクル、１分間
９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２℃。
【００５４】実施例１６： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１，８１−マーＤＮＡ鋳型３
およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラー
ゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例１からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー１、５pmolのＤＮＡ鋳型３（実施例１参照）、
０.５pmolの５′−標識ＤＮＡプライマー２および２０
０μＭのｄＮＴＰを混合する。他の条件は実施例１０に
記載の通りとする。増幅は次のように実施する。３０サ
イクル、１分間９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２
℃。
およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラー
ゼ・チェーン反応（ＰＣＲ） ＰＣＲには、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラー反応緩衝液およ
び２単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーを含む最終容量５
０μl中に５０pmolの実施例１からのＰＮＡ／ＤＮＡプ
ライマー１、５pmolのＤＮＡ鋳型３（実施例１参照）、
０.５pmolの５′−標識ＤＮＡプライマー２および２０
０μＭのｄＮＴＰを混合する。他の条件は実施例１０に
記載の通りとする。増幅は次のように実施する。３０サ
イクル、１分間９４℃、２分間５８℃、５０秒間７２
℃。
【００５５】実施例１７： ＰＮＡ／ＤＮＡプライマー１，８１−マーＤＮＡマトリ
ックス３、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を
用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ) ＰＣＲは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを用いるほかは
実施例１６に記載の通り実施する。
ックス３、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）を
用いるポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ) ＰＣＲは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを用いるほかは
実施例１６に記載の通り実施する。
【図１】本発明によるプライマー増幅反応の進行図
ＮＵ＝ヌクレオシド単位 ｄＮＴＰ＝デオキシヌクレオチドトリホスフェート
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ステイーブン・エイ・ベナー アメリカ合衆国フロリダ州32605．ゲイン ズビル．ノースウエストシクステイエイト ステラス1501 (72)発明者 ミヒアエル・ルツ ドイツ連邦共和国77654オフエンブルク. エールツベルガーシユトラーセ26
Claims (10)
- 【請求項１】 ３′−ヒドロキシル基を有するヌクレオ
シド単位少なくとも１個を一端にもつ１またはそれ以上
のＰＮＡ／ＤＮＡプライマー、ポリメラーゼ酵素および
通常必要な成分を用いて核酸を増幅させる方法におい
て、ポリメラーゼ酵素は熱安定性である方法。 - 【請求項２】 ポリメラーゼ酵素はＶｅｎｔ（登録商
標）ポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔ
ｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼまたは９°Ｎ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（登録商標）シリーズの酵素である請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーは一端に１〜
３個のヌクレオシド単位を有する請求項１または２記載
の方法。 - 【請求項４】 ＰＮＡ／ＤＮＡプライマーは一端に１個
のヌクレオシド単位を有する請求項１〜３のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項５】 ＤＮＡが増幅される請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項６】 ヌクレオシド単位はＰＮＡ／ＤＮＡプラ
イマーの３′−末端に存在する請求項１〜５のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の
増幅方法における熱安定性ポリメラーゼ酵素の使用。 - 【請求項８】 用いられる熱安定性酵素は、Ｖｅｎｔ
（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、または９
°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）シリーズの酵素
である請求項７記載の使用。 - 【請求項９】 ポリメラーゼ酵素のＶｅｎｔ（登録商
標）およびＴｔｈ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの組
合せを使用する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれかに記載の方法
の診断における使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19637339A DE19637339A1 (de) | 1996-09-13 | 1996-09-13 | Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren |
| DE19637339:5 | 1996-09-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1099088A true JPH1099088A (ja) | 1998-04-21 |
Family
ID=7805541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9250443A Pending JPH1099088A (ja) | 1996-09-13 | 1997-09-16 | 核酸の増幅方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6063571A (ja) |
| EP (1) | EP0829542A1 (ja) |
| JP (1) | JPH1099088A (ja) |
| CA (1) | CA2215489A1 (ja) |
| DE (1) | DE19637339A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2002539800A (ja) * | 1999-03-24 | 2002-11-26 | ジーン セラピー システムズ インコーポレーテッド | 転写活性のあるｄｎａ断片を製造する方法 |
| US6316230B1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-11-13 | Applera Corporation | Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera |
| US6297016B1 (en) | 1999-10-08 | 2001-10-02 | Applera Corporation | Template-dependent ligation with PNA-DNA chimeric probes |
| WO2001068673A1 (en) | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| US20040014644A1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-01-22 | Vladimir Efimov | Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression |
| US6962906B2 (en) * | 2000-03-14 | 2005-11-08 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| AU2001267191A1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-17 | Tm Bioscience Corporation | Capture moieties for nucleic acids and uses thereof |
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| AU2002259316A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Protein arrays and methods and systems for producing the same |
| US20050032060A1 (en) * | 2001-08-31 | 2005-02-10 | Shishir Shah | Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays |
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| US20080131880A1 (en) * | 2006-11-22 | 2008-06-05 | Bortolin Laura T | PNA-DNA oligomers and methods of use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
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| US5313242A (en) * | 1993-04-27 | 1994-05-17 | Eastman Kodak Company | Thru-wall web processing apparatus |
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