JPH1075787A

JPH1075787A - 変異型アラニンアミノトランスフェラーゼおよびその製造法

Info

Publication number: JPH1075787A
Application number: JP8231540A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Houriyou; 一生芳陵; Junichi Sumiya; 順一炭谷
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1996-09-02
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 1998-03-24

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子組換え型ヒトアラニンアミノトランス
フェラーゼ（ｈＡＬＴ）の微生物宿主内での生産性効率
よい性質を有する変異型ｈＡＬＴ、その製造法を提供す
るものである。【解決手段】天然型ｈＡＬＴのＮ末端部の少なくとも
５アミノ酸を欠削した構造を有する変異型ｈＡＬＴ、そ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、変異型ｈＡＬＴの
生産能を有する遺伝子組換え微生物、当該微生物を用い
る変異型ｈＡＬＴの製造法、変異型ｈＡＬＴ分析用組成
物である。【効果】従来低い生産性しか有しなかった天然型ｈＡ
ＬＴに比べ、微生物宿主内で大量に生産することが可能
になり、標準血清への使用など臨床診断の分野で利用さ
れ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え体が
微生物宿主で高効率に生産される変異型ヒトアラニンア
ミノトランスフェラーゼおよびその製造法であって、臨
床診断用酵素として有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａ
ｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、
Ｅ．Ｃ．２．６．１．２、以下ＡＬＴと略称する）は一
般にＧＰＴ（Ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒ
ａｎｓａｍｉｎａｓｅ）と称され、その血中濃度が肝機
能の障害の指標となり、臨床診断の分野で広く使用され
ている酵素である。臨床診断でのＡＬＴの使用には、標
準品となる酵素が不可欠であり、ヒト由来のＡＬＴ（以
下ｈＡＬＴと略称する）が生体成分からの精製や細胞培
養法などにより生産されてきた。しかし生体成分からの
精製や細胞培養法によるｈＡＬＴの生産は煩雑かつ非常
に高価であり、これを解決する目的で、ｈＡＬＴの全長
遺伝子による大腸菌宿主での遺伝子組換え体の生産法が
開発されている（特開平５−６８５４８号公報、特開平
８−１０３２７８号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしこれらのｈＡＬ
Ｔの大腸菌宿主での遺伝子組換え体生産法も、十分に生
産効率を高めているとはいえず、ｈＡＬＴの安価で安定
的な供給のために、さらなる生産性の向上法が求められ
ていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に関し鋭意研究の結果、天然型ｈＡＬＴのＮ末端部の
少なくとも５アミノ酸、好ましくは９アミノ酸（開始コ
ドンによりコードされるアミノ酸は含まない）を欠削し
た配列表１のアミノ酸配列の１０から４９５で表される
変異型ｈＡＬＴの微生物宿主遺伝子組換え体において、
酵素活性、ミカエリス定数、熱安定性やｐＨ安定性の酵
素学的性質が天然型ｈＡＬＴとほとんど変わらず、か
つ、天然型ｈＡＬＴの微生物宿主遺伝子組換え体と比較
して、少なくとも５アミノ酸を欠削した変異型ｈＡＬＴ
の遺伝子的性質、そのポリペプチド的性質が関与して変
異型ｈＡＬＴが意外にも高効率に発現することを発見
し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明は、天然型ｈＡＬＴにおい
てそのＮ末端の少なくとも５アミノ酸を欠削したＡＬＴ
活性を有する変異型ｈＡＬＴ、配列表１のアミノ酸配列
の１０から４９５で表されるアミノ酸配列からなり、Ａ
ＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴ、配列表１のアミノ酸
配列の１０から４９５で表されるアミノ酸配列からな
り、ＡＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、宿主にとって外来性であり、天然
型ｈＡＬＴにおいてそのＮ末端の少なくとも５アミノ酸
を欠削したＡＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴの生産能
を有することを特徴とする実質的に純粋な遺伝子組換え
微生物、配列表１のアミノ酸配列の１０から４９５で表
されるアミノ酸配列からなり、ＡＬＴ活性を有する変異
型ｈＡＬＴの生産能を有することを特徴とする実質的に
純粋な遺伝子組換え微生物、配列表１のアミノ酸配列の
１０から４９５で表されるアミノ酸配列からなり、ＡＬ
Ｔ活性を有する変異型ｈＡＬＴのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを保有する実質的に純粋な遺伝子組換え微生
物である。

【０００６】さらに本発明は、宿主にとって外来性であ
り、天然型ｈＡＬＴにおいてそのＮ末端の少なくとも５
アミノ酸を欠削したＡＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴ
の生産能を有する実質的に純粋な遺伝子組換え微生物を
培養することを特徴とする変異型ｈＡＬＴの製造法、配
列表１のアミノ酸配列の１０から４９５で表されるアミ
ノ酸配列からなり、ＡＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴ
の生産能を有する実質的に純粋な遺伝子組換え微生物を
培養することを特徴とする変異型ｈＡＬＴの製造法、配
列表１のアミノ酸配列の１０から４９５で表されるアミ
ノ酸配列からなり、ＡＬＴ活性活性を有する変異型ｈＡ
ＬＴのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保有する実質
的に純粋な遺伝子組換え微生物を培養することを特徴と
する変異型ｈＡＬＴの製造法、天然型ｈＡＬＴにおいて
そのＮ末端の少なくとも５アミノ酸を欠削したＡＬＴ活
性を有する変異型ｈＡＬＴ分析用組成物、配列表１のア
ミノ酸配列の１０から４９５で表されるアミノ酸配列か
らなり、ＡＬＴ活性を有する変異型ｈＡＬＴ分析用組成
物である。

【０００７】天然型ｈＡＬＴのＮ末端の少なくとも５ア
ミノ酸を欠削した変異型ｈＡＬＴを作製するためには、
以下のようにすればよい。すなわちｃＤＮＡライブラリ
ーからの分離と変異、またはＤＮＡの全合成などにより
取得した変異型ｈＡＬＴ遺伝子を、適当なベクターに組
み込み、微生物に導入して形質転換体とし、形質転換微
生物を培養し、培養微生物より変異型ｈＡＬＴを抽出、
精製すればよい。

【０００８】ｈＡＬＴの遺伝子を取得する方法には特に
制限はなく、ヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリーよ
り、既知である天然型ｈＡＬＴのアミノ酸配列（Ｉｓｈ
ｉｇｕｒｏＭ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１９９１，３０，１０４５１−１０４５７）や
活性発現に基づき、従来の遺伝子クローニング技術によ
り分離してもよいし、全遺伝子ＤＮＡを合成してもよ
い。ヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリーは、従来の遺
伝子操作技術によりヒトの生体成分より調製してもよい
し、市販のヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを使用す
ることもできる。

【０００９】最初に天然型ｈＡＬＴ遺伝子を分離するの
であれば、ｃＤＮＡライブラリーから、既知である天然
型ｈＡＬＴのアミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレオチ
ドプローブ法によるスクリーニングを行ってもよいし、
ＰＣＲ法により分離してもよい。またｃＤＮＡライブラ
リーからＡＬＴ活性発現を指標としてスクリーニングを
行ってもよい。また全遺伝子ＤＮＡを合成することもで
きる。

【００１０】このようにして分離した天然型ｈＡＬＴ遺
伝子から変異型ｈＡＬＴの遺伝子を作製する方法につい
ては特に制限はなく、従来遺伝子組換え技術において慣
用されている方法を用いることができる。例えば、ｈＡ
ＬＴ構造遺伝子の５’末端側と同様なＤＮＡ配列を有
し、かつ欠削するアミノ酸をコードするＤＮＡを除いた
構造になるように設計・合成したオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用した部位特異変異法やＰＣＲ法、合成Ｄ
ＮＡの組み込みなどの方法により、天然型ｈＡＬＴのＮ
末端から少なくとも５アミノ酸を除去した変異型ｈＡＬ
Ｔの遺伝子の作製を行えばよく、またＮ末端からのアミ
ノ酸の除去の上限としては変異型ｈＡＬＴの生産性が良
好であってＡＬＴ活性を有するものであればよく、例え
ばＮ末端から２０アミノ酸の除去、好ましくは１５アミ
ノ酸の除去である。

【００１１】また直接に変異型ｈＡＬＴ遺伝子を取得す
るのであれば、２種１組であるＰＣＲ用のオリゴヌクレ
オチドプライマーの一方を、ｈＡＬＴ構造遺伝子の５’
末端側と同様なＤＮＡ配列を有し、かつ欠削するアミノ
酸をコードするＤＮＡを除いた構造になるように設計・
合成し、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法を用いて合
成すればよい。また全遺伝子ＤＮＡを合成することもで
きる。

【００１２】またＰＣＲ法による遺伝子合成の際に、そ
の後の操作を簡易にするために、合成されるＤＮＡフラ
グメントの末端に適当な制限酵素認識部位を付加するこ
とは、一般的に行われている手法である。変異型ｈＡＬ
Ｔ遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内
で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝
子組み換え用として構築されたものが適しており、ファ
ージベクターとしては、例えば、エシェリヒア属に属す
る微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λ
ｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プラスミドベクタ
ーとしては、例えば、エシェリヒア属に属する微生物を
宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、
ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ
１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、ｐＴｒｃ９９Ａ、枯草菌を宿主
とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放
線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０
２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とす
る場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用
できる。また特に、変異型ｈＡＬＴ遺伝子を組み込んだ
際に、効率よく働くプロモーターが上流に存在するよう
な構造のベクターが適しており、大腸菌を宿主微生物と
する場合には、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、
ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどがこれに
合致する。

【００１３】また、これらのベクターに、変異型ｈＡＬ
Ｔ遺伝子を組み込む方法についても特に制限されず、従
来慣用されている方法を用いることができる。たとえば
適当な制限酵素を用いて、変異型ｈＡＬＴ遺伝子を含む
ＤＮＡ及び該発現用ベクターを処理し、それぞれから変
異型ｈＡＬＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片およびベクターを
得た後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、適当な微生
物宿主に導入し、形質転換微生物からプラスミドを抽出
・精製することにより、発現プラスミドが得られる。

【００１４】変異型ｈＡＬＴ遺伝子を組み込んだ発現プ
ラスミドを導入する微生物にも特に制限はなく、組み換
えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例
えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場
合、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシ
ェリヒア・コリＭＶ１１８４などが利用できる。ま
た、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチラ
ス・サチリスＩＳＷ１２１４など、放線菌に属する微
生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２
４など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物
の場合、サッカロマイセス・セルビシエＩＮＶＳＣ１
などが使用できる。

【００１５】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物が大腸菌やサッカロマ
イセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンス
に属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテント
セル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよ
く、菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。宿主
微生物への目的プラスミド移入の有無についての選択
は、ベクターの薬剤耐性マーカーや栄養要求性マーカー
に基づき、選択培地による選択培養法により選択すれば
よい。

【００１６】また変異型ｈＡＬＴ遺伝子を導入した遺伝
子組換え微生物を培養して変異型ｈＡＬＴを生産させる
方法にも特に制限はないが、形質転換体である微生物の
栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、
通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。

【００１７】炭素源としては、宿主微生物が資化可能な
炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロ
ース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜な
どが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン加水分解物などが使用される。その他、リ
ン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、
カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミ
ノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

【００１８】培養温度は宿主微生物が発育し、変異型ｈ
ＡＬＴを生産する範囲で適宜変更し得るが、例えば宿主
微生物が大腸菌に属する場合、好ましくは２０〜４２℃
程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、
変異型ｈＡＬＴが最高終了に達する時期を見計らって適
当な時期に培養を終了すればよく、例えば宿主微生物が
大腸菌に属する場合、通常は１２〜４８時間程度であ
る。培地ｐＨは宿主微生物が発育し、変異型ｈＡＬＴを
生産する範囲で適宜変更し得るが、例えば宿主微生物が
大腸菌に属する場合、好ましくはｐＨ６．０〜８．０程
度である。

【００１９】また生産された変異型ｈＡＬＴを抽出する
方法にも特に制限はなく、従来より用いられている方法
を用いることができる。抽出法の具体例としては、得ら
れた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、微生
物菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾ
チームなどの酵素的方法で破壊して変異型ｈＡＬＴの微
生物宿主遺伝子組み換え体を含有する菌体抽出液を取得
すればよい。

【００２０】また天然型ｈＡＬＴの微生物宿主遺伝子組
み換え体も、変異型ｈＡＬＴと同様の方法で取得するこ
とができる。以上の方法により得られる変異型ｈＡＬＴ
微生物宿主遺伝子組み換え体と、ヒト細胞由来の天然型
ｈＡＬＴの諸性質を比較すると下記のようになる。（１）酵素作用天然型ｈＡＬＴ、変異型ｈＡＬＴ共に、下記に示すよう
に、Ｌ−アラニンと２−オキソグルタル酸からピルビン
酸とＬ−グルタミン酸を生成する反応を触媒するかまた
はその可逆的反応を触媒する。

【００２１】

【化１】

【００２２】（２）分子量（アミノ酸配列より算出）天然型ｈＡＬＴ：５４５００（４９５アミノ酸）変異型ｈＡＬＴ：５３６００（４８６アミノ酸時）（３）ミカエリス定数天然型ｈＡＬＴ：１５．６ｍＭ（基質：Ｄ，Ｌ−アラニン）０．１５ｍＭ（基質：α−ケトグルタル酸）変異型ｈＡＬＴ：１５．４ｍＭ（基質：Ｄ，Ｌ−アラニン）０．１７ｍＭ（基質：α−ケトグルタル酸）（４）熱安定性天然型ｈＡＬＴ：４５℃１５分の処理で１００％、５０℃１５分の処理で９２％の活性が残存する。変異型ｈＡＬＴ：４５℃１５分の処理で１００％、５０℃１５分の処理で８７％の活性が残存する。（５）ｐＨ安定性天然型ｈＡＬＴ：ｐＨ６．０〜８．０の間で安定である。変異型ｈＡＬＴ：ｐＨ６．０〜８．０の間で安定である。（６）微生物宿主での遺伝子組換え体の生産性天然型ｈＡＬＴ：変異型ｈＡＬＴ＝１：２我々は、このようにして得られた変異型ｈＡＬＴ微生物
宿主遺伝子組換え体が、天然型ｈＡＬＴに比べ、酵素的
性状にはほとんど変化がなく、かつ微生物宿主遺伝子組
換え体の生産性が高いことを確認した。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と
記述した操作は、例えばマニアティスらの方法（Ｔ．ｍ
ａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に
添付された手順に従えば実施できるものである。また、
実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素な
ど）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り
宝酒造株式会社より購入したものである。

【００２４】

【実施例１】＜天然型および変異型ｈＡＬＴ遺伝子の取得＞天然型お
よび変異型ｈＡＬＴ遺伝子をＰＣＲ法により分離し、か
つ微生物宿主内でｈＡＬＴを生産させるために、既知の
天然型ｈＡＬＴのアミノ酸配列を基に、次の３種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計した。１）天然型ｈＡＬＴ構造遺伝子の開始コドン直上に制限
酵素ＮｃｏＩ切断部位ＣＣＡＴＧＧを付加する天然型ｈ
ＡＬＴ遺伝子合成用オリゴヌクレオチドプライマーＡＬ
Ｔ１。２）天然型ｈＡＬＴ構造遺伝子の開始コドンＡＴＧ以後
の２７塩基（開始コドンＡＴＧを含まない）を欠失さ
せ、かつ開始コドンＡＴＧ直上に制限酵素ＮｃｏＩＣＣ
ＡＴＧＧ切断部位を付加する変異型ｈＡＬＴ遺伝子合成
用オリゴヌクレオチドプライマーＡＬＴ２。３）ｈＡＬＴ遺伝子の終始コドン下流に制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ切断部位ＡＡＧＣＴＴを付加するオリゴヌクレ
オチドプライマーＡＬＴ３。

【００２５】ＡＬＴ１の塩基配列構造を配列表２に、Ａ
ＬＴ２の塩基配列を配列表３に、ＡＬＴ３の塩基配列構
造を配列表４に示した。これらのオリゴヌクレオチドを
合成依頼し（ＢＥＸ社）、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社：ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅｃ
ＤＮＡＬｉｖｅｒ）を鋳型とし、ＤＮＡＴｈｅｒｍ
ａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅ
ｔｕｓ社）とＰＣＲ反応用キット（宝酒造社：ＴａＫａ
ＲａＴａｑ）を使用し、天然型ｈＡＬＴ遺伝子合成の
ためにＡＬＴ１とＡＬＴ３を、変異型ｈＡＬＴ遺伝子合
成のためにＡＬＴ２とＡＬＴ３を組み合わせてプライマ
ーとして、マニュアルに従いＰＣＲを行い、開始コドン
直上にＮｃｏＩ切断部位を、終始コドン下流にＨｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位を付加した、天然型および変異型ｈＡＬ
Ｔ遺伝子を含む約１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントをそ
れぞれ合成した。天然型ｈＡＬＴの構造遺伝子塩基配列
（開始、終止コドンを含まない）とアミノ酸配列は配列
表１に示した。

【００２６】

【実施例２】＜天然型および変異型ｈＡＬＴ発現プラスミドの作製＞
実施例１で合成した天然型ｈＡＬＴ遺伝子含有ＤＮＡフ
ラグメント１００ｎｇをそれぞれ１ｕのＮｃｏＩと１ｕ
のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、各ｈＡＬＴ遺伝子を含む約
１．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ断片
を、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ各１ｕで切断し
１ｕのアルカリフォスファターゼで切断末端を脱リン酸
化した１００ｎｇのプラスミドｐＴＶ１１９Ｎと、Ｔ４
リガーゼで連結させ、プラスミドｐｃＡＬＴ１を作製し
た。このｐｃＡＬＴ１をエシェリヒア・コリＤＨ１株
（ＡＴＣＣ３３８４９）にコンピテントセル法により導
入し、形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＡＬ
Ｔ１を取得し、常法に従ってｐｃＡＬＴ１を抽出・精製
した。

【００２７】同様にして、変異型ｈＡＬＴ遺伝子含有Ｄ
ＮＡフラグメントとｐＴＶ１１９Ｎから発現プラスミド
ｐｃＡＬＴ２と形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ１・
ｐｃＡＬＴ２（ＦＥＲＭＢＰ−５６１５）を作製し
た。また、ｐＴＶ１１９Ｎの代わりにプラスミドｐＴｒ
ｃ９９Ａ（Ｆａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、同様にし
て、天然型ｈＡＬＴ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントから
ｐＴｒｃＡＬＴ１と形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ
１・ｐＴｒｃＡＬＴ１を、変異型ｈＡＬＴ遺伝子含有Ｄ
ＮＡフラグメントからｐＴｒｃＡＬＴ２と形質転換体エ
シェリヒア・コリＤＨ１・ｐＴｒｃＡＬＴ２を作製し
た。図１にｐｃＡＬＴ１、ｐｃＡＬＴ２、ｐＴｒｃＡＬ
Ｔ１およびｐＴｒｃＡＬＴ２の構造を示した。

【００２８】

【実施例３】＜変異型ｈＡＬＴの発現＞実施例２で得られた形質転換
体エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＡＬＴ１、ＤＨ１・
ｐｃＡＬＴ２、ＤＨ１・ｐＴｒｃＡＬＴ１、ＤＨ１・ｐ
ＴｒｃＡＬＴ２を、それぞれ５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンと１００μＭのＩＰＴＧ含有３．７％ＢＨＩ（ＤＩＦ
ＣＯ社製）培地にて３７℃で一夜培養し、培養液を１
１，０００Ｇで１分遠心分離し、菌体を集菌した。この
各菌体を１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）
中で超音波破砕し、菌体破砕液を天然型または変異型ｈ
ＡＬＴ遺伝子組換え体溶液とした。

【００２９】

【実施例４】＜天然型ＡＬＴと変異型ＡＬＴとの遺伝子組換え体の生
産性比較＞実施例３で調製した天然型ｈＡＬＴ遺伝子組
換え体溶液と変異型ｈＡＬＴ遺伝子組み換え体溶液のＡ
ＬＴ活性を以下の活性測定法により測定し、各生産性を
比較した。第１試薬０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．１６ｍｌ１０ｍＭＮＡＤ０．１０ｍｌ０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー０．１０ｍｌ１００ｕ／ｍｌジアフォラーゼ０．０５ｍｌ１５０ｍＭ α−ケトグルタル酸０．０２ｍｌ２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００．１０ｍｌ３０ｍＭＡＤＰ０．１０ｍｌ０．１ＭＥＤＴＡ０．０２ｍｌ１２００ｕ／ｍｌグルタミン酸デヒドロゲナーゼ０．１０ｍｌ第２試薬１．５ＭＤ，Ｌ−アラニン０．２５ｍｌ第１試薬０．７５ｍｌと第２試薬０．２５ｍｌを混合
し、３７℃、３分間予備加温後、ＡＬＴ溶液０．０２ｍ
ｌを添加し、３７℃、１０分間酵素反応をさせ、０．５
％ＳＤＳを２ｍｌ加えて反応を停止させた後、５５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。

【００３０】以上の方法により測定した天然型ｈＡＬＴ
と変異型ｈＡＬＴ遺伝子組換え体の天然型ｈＡＬＴ遺伝
子組換え体と変異型ｈＡＬＴ遺伝子組換え体の発現効率
を表１に示す。

【００３１】

【実施例５】＜変異型ＡＬＴの性状検定＞天然型ｈＡＬＴと変異型ｈ
ＡＬＴ遺伝子組み換え体の酵素学的性質を以下のように
して測定し、比較した。なお、変異型ｈＡＬＴ遺伝子組
み換え体としては、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＡ
ＬＴ２により生産したものを使用した。・ミカエリス定数：Ｋｍ値基質Ｄ，Ｌ−アラニンの０ｍＭ，１２０ｍＭ，２４０ｍ
Ｍ，３６０ｍＭ，６００ｍＭ濃度の各溶液を調製し、上
記方法でＡＬＴ活性を測定後、Ｋｍ値を算出した。ま
た、基質α−ケトグルタル酸の０ｍＭ，７．５ｍＭ，１
５ｍＭ，７５ｍＭ，１５０ｍＭ濃度の各溶液を調製し、
同様にしてＫｍ値を算出した。・熱安定性氷中（０℃）、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃で、
０．１％ＢＳＡを添加したＡＬＴ溶液を１５分保温後、
残存活性値を上記方法で測定した。・ｐＨ安定性０．５Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ３．０と４．０、０．５
Ｍの３，３ジメチルグルタミン酸緩衝液ｐＨ４．０，
５．０および６．０、０．５Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．
０，７．０および８．０、０．５ＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝
液ｐＨ６．０，７．０，８．０および９．０、０．５Ｍ
のグリシン緩衝液ｐＨ９．０と１０．０に溶解したＡＬ
Ｔ溶液（各１％ＢＳＡ添加）を６０℃で５分保温後、残
存活性値を上記方法で測定した。

【００３２】以上の方法により測定した天然型ｈＡＬＴ
と変異型ｈＡＬＴ遺伝子組換え体のミカエリス定数、熱
安定性、ｐＨ安定性を表２に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】

【発明の効果】本発明の変異型ｈＡＬＴは、天然型ｈＡ
ＬＴと同等の酵素学的性質を有し、かつ遺伝子組換え体
が微生物宿主中で効率よく生産される性質を有し、ｈＡ
ＬＴの生産が容易になった。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１４８５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：c DNA 起源生物名：ヒト配列の特徴ＰＣＤＳ配列 GCC TCG AGC ACA GGT GAC CGG AGC CAG GCG GTG AGG CAT GGA CTG AGG 48 Ala Ser Ser Thr Gly Asp Arg Ser Gln Ala Val Arg His Gly Leu Arg 1 5 10 15 GCG AAG GTG CTG ACG CTG GAC GGC ATG AAC CCG CGT GTG CGG AGA GTG 96 Ala Lys Val Leu Thr Leu Asp Gly Met Asn Pro Arg Val Arg Arg Val 20 25 30 GAG TAC GCA GTG CGT GGC CCC ATA GTG CAG CGA GCC TTG GAG CTG GAG 144 Glu Tyr Ala Val Arg Gly Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu Glu 35 40 45 CAG GAG CTG CGC CAG GGT GTG AAG AAG CCT TTC ACC GAG GTC ATC CGT 192 Gln Glu Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg 50 55 60 GCC AAC ATC GGG GAC GCA CAG GCT ATG GGG CAG AGG CCC ATC ACC TTC 240 Ala Asn Ile Gly Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Arg Pro Ile Thr Phe 65 70 75 80 CTG CGC CAG GTC TTG GCC CTC TGT GTT AAC CCT GAT CTT CTG AGC AGC 288 Leu Arg Gln Val Leu Ala Leu Cys Val Asn Pro Asp Leu Leu Ser Ser 85 90 95 CCC AAC TTC CCT GAC GAT GCC AAG AAA AGG GCG GAG CGC ATC TTG CAG 336 Pro Asn Phe Pro Asp Asp Ala Lys Lys Arg Ala Glu Arg Ile Leu Gln 100 105 110 GCG TGT GGG GGC CAC AGT CTG GGG GCC TAC AGC GTC AGC TCC GGC ATC 384 Ala Cys Gly Gly His Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Val Ser Ser Gly Ile 115 120 125 CAG CTG ATC CGG GAG GAC GTG GCG CGG TAC ATT GAG AGG CGT GAC GGA 432 Gln Leu Ile Arg Glu Asp Val Ala Arg Tyr Ile Glu Arg Arg Asp Gly 130 135 140 GGC ATC CCT GCG GAC CCC AAC AAC GTC TTC CTG TCC ACA GGG GCC AGC 480 Gly Ile Pro Ala Asp Pro Asn Asn Val Phe Leu Ser Thr Gly Ala Ser 145 150 155 160 GAT GCC ATC GTG ACG GTG CTG AAG CTG CTG GTG GCC GGC GAG GGC CAC 528 Asp Ala Ile Val Thr Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Gly Glu Gly His 165 170 175 ACA CGC ACG GGT GTG CTC ATC CCC ATC CCC CAG TAC CCA CTC TAC TCG 576 Thr Arg Thr Gly Val Leu Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser 180 185 190 GCC ACG CTG GCA GAG CTG GGC GCA GTG CAG GTG GAT TAC TAC CTG GAC 624 Ala Thr Leu Ala Glu Leu Gly Ala Val Gln Val Asp Tyr Tyr Leu Asp 195 200 205 GAG GAG CGT GCC TGG GCG CTG GAC GTG GCC GAG CTT CAC CGT GCA CTG 672 Glu Glu Arg Ala Trp Ala Leu Asp Val Ala Glu Leu His Arg Ala Leu 210 215 220 GGC CAG GCG CGT GAC CAC TGC CGC CCT CGT GCG CTC TGT GTC ATC AAC 720 Gly Gln Ala Arg Asp His Cys Arg Pro Arg Ala Leu Cys Val Ile Asn 225 230 235 240 CCT GGC AAC CCC ACC GGG CAG GTG CAG ACC CGC GAG TGC ATC GAG GCC 768 Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Gln Thr Arg Glu Cys Ile Glu Ala 245 250 255 GTG ATC CGC TTC GCC TTC GAA GAG CGG CTC TTT CTG CTG GCG GAC GAG 816 Val Ile Arg Phe Ala Phe Glu Glu Arg Leu Phe Leu Leu Ala Asp Glu 260 265 270 GTG TAC CAG GAC AAC GTG TAC GCC GCG GGT TCG CAG TTC CAC TCA TTC 864 Val Tyr Gln Asp Asn Val Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe His Ser Phe 275 280 285 AAG AAG GTG CTC ATG GAG ATG GGG CCG CCC TAC GCC GGG CAG CAG GAG 912 Lys Lys Val Leu Met Glu Met Gly Pro Pro Tyr Ala Gly Gln Gln Glu 290 295 300 CTT GCC TCC TTC CAC TCC ACC TCC AAG GGC TAC ATG GGC GAG TGC GGG 960 Leu Ala Ser Phe His Ser Thr Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys Gly 305 310 315 320 TTC CGC GGC GGC TAT GTG GAG GTG GTG AAC ATG GAC GCT GCA GTG CAG 1008 Phe Arg Gly Gly Tyr Val Glu Val Val Asn Met Asp Ala Ala Val Gln 325 330 335 CAG CAG ATG CTG AAG CTG ATG AGT GTG CGG CTG TGC CCG CCG GTG CCA 1056 Gln Gln Met Leu Lys Leu Met Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val Pro 340 345 350 GGA CAG GCC CTG CTG GAC CTG GTG GTC AGC CCG CCC GCG CCC ACC GAC 1104 Gly Gln Ala Leu Leu Asp Leu Val Val Ser Pro Pro Ala Pro Thr Asp 355 360 365 CCC TCC TTT GCG CAG TTC CAG GCT GAG AAG CAG GCA GTG CTG GCA GAG 1152 Pro Ser Phe Ala Gln Phe Gln Ala Glu Lys Gln Ala Val Leu Ala Glu 370 375 380 CTG GCG GCC AAG GCC AAG CTC ACC GAG CAG GTC TTC AAT GAG GCT CCT 1200 Leu Ala Ala Lys Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Phe Asn Glu Ala Pro 385 390 395 400 GGC ATC AGC TGC AAC CCA GTG CAG GGC GCC ATG TAC TCC TTC CCG CGC 1248 Gly Ile Ser Cys Asn Pro Val Gln Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Arg 405 410 415 GTG CAG CTG CCC CCG CGG GCG GTG GAG CGC GCT CAG GAG CTG GGC CTG 1296 Val Gln Leu Pro Pro Arg Ala Val Glu Arg Ala Gln Glu Leu Gly Leu 420 425 430 GCC CCC GAT ATG TTC TTC TGC CTG CGC CTC CTG GAG GAG ACC GGC ATC 1344 Ala Pro Asp Met Phe Phe Cys Leu Arg Leu Leu Glu Glu Thr Gly Ile 435 440 445 TGC GTG GTG CCA GGG AGC GGC TTT GGG CAG CGG GAA GGC ACC TAC CAC 1392 Cys Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr His 450 455 460 TTC CGG ATG ACC ATT CTG CCC CCC TTG GAG AAA CTG CGG CTG CTG CTG 1440 Phe Arg Met Thr Ile Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Arg Leu Leu Leu 465 470 475 480 GAG AAG CTG AGC AGG TTC CAT GCC AAG TTC ACC CTC GAG TAC TCC 1485 Glu Lys Leu Ser Arg Phe His Ala Lys Phe Thr Leu Glu Tyr Ser 485 490 495

【００３７】

【配列表】

配列番号：２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列 CCGGCCATGG CCTCGAGCAC AGGTG 25

【００３８】

【配列表】

配列番号：３配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列 CCGGCCATGG CGGTGAGGCA TGGACTGAG 29

【００３９】

【配列表】

配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列 GGCCAAGCTT CAGGAGTACT CGAGGGT 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐｃＡＬＴ１，ｐｃＡＬＴ
２，ｐＴｒｃＡＬＴ１，ｐＴｒｃＡＬＴ２の制限酵素地
図を示す。図中の”ベクター”は、ｐｃＡＬＴ１、ｐｃ
ＡＬＴ２ではｐＴＶ１１９Ｎを、ｐＴｒｃＡＬＴ１、ｐ
ＴｒｃＡＬＴ２ではｐＴｒｃ９９Ａを表す。また図中
の”ｈＡＬＴ遺伝子”は、ｐｃＡＬＴ１、ｐＴｒｃＡＬ
Ｔ１では天然型ｈＡＬＴ構造遺伝子を、ｐｃＡＬＴ２、
ｐＴｒｃＡＬＴ２では変異型ｈＡＬＴ構造遺伝子を表
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ
においてそのＮ末端の少なくとも５アミノ酸を欠削した
アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する変異型
ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ。
【請求項２】配列表１のアミノ酸配列の１０から４９
５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミ
ノトランスフェラーゼ。
【請求項３】配列表１のアミノ酸配列の１０から４９
５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミ
ノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ。
【請求項４】ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の２８か
ら１４８５で表される塩基配列である請求項第３記載の
ＤＮＡ。
【請求項５】宿主にとって外来性であり、ヒトアラニ
ンアミノトランスフェラーゼにおいてそのＮ末端の少な
くとも５アミノ酸を欠削したアラニンアミノトランスフ
ェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミノトラン
スフェラーゼの生産能を有することを特徴とする実質的
に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項６】配列表１のアミノ酸配列の１０から４９
５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミ
ノトランスフェラーゼの生産能を有することを特徴とす
る実質的に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項７】配列表１のアミノ酸配列の１０から４９
５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミ
ノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを保有する実質的に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項８】ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の２８か
ら１４８５で表される塩基配列である請求項第７記載の
実質的に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項９】実質的に純粋な遺伝子組換え微生物が、
エシェリヒア属に属する微生物である請求項第５記載の
実質的に純粋な遺伝子組換え微生物。
【請求項１０】エシェリヒア属に属する微生物が、エ
シェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＡＬＴ２（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−５６１５）である請求項９記載の実質的に純粋な遺
伝子組換え微生物。
【請求項１１】宿主にとって外来性であり、ヒトアラ
ニンアミノトランスフェラーゼにおいてそのＮ末端の少
なくとも５アミノ酸を欠削したアラニンアミノトランス
フェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンアミノトラ
ンスフェラーゼの生産能を有する実質的に純粋な遺伝子
組換え微生物を培養することを特徴とする変異型ヒトア
ラニンアミノトランスフェラーゼの製造法。
【請求項１２】配列表１のアミノ酸配列の１０から４
９５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノ
トランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンア
ミノトランスフェラーゼの生産能を有する実質的に純粋
な遺伝子組換え微生物を培養することを特徴とする変異
型ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼの製造法。
【請求項１３】配列表１のアミノ酸配列の１０から４
９５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノ
トランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンア
ミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを保有する実質的に純粋な遺伝子組換え微生物を培
養することを特徴とする変異型ヒトアラニンアミノトラ
ンスフェラーゼの製造法。
【請求項１４】ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の２８
から１４８５で表される塩基配列である請求項第１３記
載の変異型ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼの製
造法。
【請求項１５】実質的に純粋な遺伝子組換え微生物
が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項第１１
記載の変異型ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼの
製造法。
【請求項１６】エシェリヒア属に属する微生物が、エ
シェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＡＬＴ２（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−５６１５）である請求項１５記載の変異型ヒトアラ
ニンアミノトランスフェラーゼの製造法。
【請求項１７】ヒトアラニンアミノトランスフェラー
ゼにおいてそのＮ末端の少なくとも５アミノ酸を欠削し
たアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する変異
型ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ分析用組成
物。
【請求項１８】配列表１のアミノ酸配列の１０から４
９５で表されるアミノ酸配列からなり、アラニンアミノ
トランスフェラーゼ活性を有する変異型ヒトアラニンア
ミノトランスフェラーゼ分析用組成物。