JPH10510712A - Ｆａｓ／ａｐｏ１受容体機能のモジュレーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＦＡＳ／ＡＰＯ１の機能をモジュレートすることのできるタンパク質を提供する。前記タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターによって形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記タンパク質を単離することにより、前記タンパク質を製造してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 ＦＡＳ／ＡＰＯ１受容体機能のモジュレーター 技術分野 本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属するレセプターおよ びそれらの生物学的機能を制御する分野に一般的に関する。ＴＮＦ／ＮＧＦ受容 体スーパーファミリーは、ｐ５５腫瘍壊死因子受容体およびｐ７５腫瘍壊死因子 受容体（ＴＮＦ−Ｒｓ）、ＦＡＳリガンド受容体（ＦＡＳ／ＡＰＯ１またはＦＡ Ｓ−Ｒともいわれ、以下ＦＡＳ−Ｒという）ならびにそのほかのものなどの受容 体を含む。さらに詳しくは、本発明は新規なタンパク質、ここではＭＯＲＴ−１ と表わし（ＨＦ−１ともいう）、Ｆａｓ−Ｒの細胞内ドメイン（ＩＣ）（この細 胞内ドメインをＦａｓ−ＩＣと表わす）に結合し、Ｆａｓ−Ｒの機能をモジュレ ートすることのできるタンパク質に関する。さらに、ＭＯＲＴ−１は自己会合も でき、それ自身の細胞傷害性を引き起こすことが可能である。本発明はＭＯＲＴ −１の製造および使用にも関する。 ＨＦ−１（オリジナルの表記）およびＭＯＲＴ−１（本発明で用いる表記）は 両方とも本願明細書に用いられるが、同一のタンパク質を示す。 背景技術 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）およびリンホトキシン（ＴＮＦ−β）（以下、Ｔ ＮＦはＴＮＦ−αおよびＴＮ Ｆ−βの両者を意味する）は、単核食細胞によっておもに形成される多機能な前 炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン類であり、細胞に多 大な影響を及ぼす（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．（１９８６）ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒ ｏｎ７（Ｉｏｎ Ｇｒｅｓｓｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．８３−１２２，Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；ａｎｄ Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒ ａｍｉ（１９８７））。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は、特定の細胞表面受容 体に結合することによってそれらの効果を開始する。その効果のうちのいくつか は生物にとって利益になるようである。たとえば、それらは腫瘍細胞またはウイ ルス感染した細胞を破壊するかもしれず、顆粒球の抗菌活性を増大させるかもし れない。このように、腫瘍や感染源に対する生物の防御にＴＮＦは寄与し、かつ 損傷からの回復に寄与する。ＴＮＦは抗腫瘍剤として用いることができ、その適 用の際にはＴＮＦが腫瘍細胞の表面のその受容体に結合し、それによって腫瘍細 胞を死へと導く出来事が始まる。ＴＮＦは抗感染薬としても用いることができる 。 しかしながら、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者は有害な効果も有する。過剰に 産生されたＴＮＦ−αは数種の疾患において主たる病原の役割をすることがあり うる、という証拠がある。さらに、ＴＮＦ−αの効果、主として血管系に対する 効果は敗血症性ショック症状の主たる原因である、と現在のところ知られている （Ｔｒａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。いくつかの疾患では、ＴＮＦは脂 肪細胞の活性を抑制することおよび食欲不振を引き起こすことにより体重の過剰 損欠（悪液質）を引 き起こすかもしれず、そのためにＴＮＦ−αはカケクチンと呼ばれていた。ＴＮ Ｆはリウマチ様疾患においては組織に対する損傷のメディエーターとして（Ｂｅ ｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，１９８７）、移殖片対宿主反応においては 観察される損傷の主たるメディエーターとして（Ｐｉｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７）も記載されていた。さらに、ＴＮＦは炎症の過程およびほかの多くの 疾患と関係することが知られている。 ２種の明らかに独立して発現される受容体、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ−Ｒｓ は、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両者に特異的に結合し、前述のＴＮＦの生物学的 効果を開始および／または媒介する。これらの２種の受容体は構造的に似ていな い細胞内ドメインを有するが、それはそれらが異なるシグナリングをすることを 示唆している（Ｈｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｌ ｅｏｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１ ９９０；Ｎｏｐｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９０；ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０参照）。しかしなが ら、細胞のメカニズム、たとえばｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内シグ ナリングに関係する様々なタンパク質やおそらくはほかの因子類は、まだ今のと ころ解明されていない（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４に、以下にも記載される ように、ｐ７５ＩＣおよびｐ５５ＩＣに結合しうる新規なタンパク質が初めて記 載されている）。リガンド、すなわちＴＮＦ（αまたはβ）が受容 体に結合したのちに通常生じることがこの細胞内シグナリングである。それは反 応のカスケードの開始に関与し、その結果ＴＮＦに対して観察される細胞の応答 が生ずる。 前述のＴＮＦの細胞致死性効果に関しては、これまでに研究されたたいていの 細胞ではこの効果はｐ５５ＴＮＦ−Ｒによっておもに引き起こされる。ｐ５５Ｔ ＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン）に対する抗体は、それら自 身が細胞致死性効果を引き起こすことができ（ＥＰ ４１２４８６参照）、その 効果はこれらの抗体による受容体の架橋の有効性と関係するが、細胞内シグナリ ングプロセスの発生の第１段階であると信じられている。さらに、突然変異の研 究（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅ ｔ ａｌ．，１９９３）によれば、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの生物学的機能はその細胞 内ドメインの完全さに依存することが示されており、したがって、ＴＮＦの細胞 致死性効果を導く細胞内シグナリングの開始は、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの２またはそ れより多くの細胞内ドメインの会合の結果として生ずる、ということが示唆され ている。さらには、ＴＮＦ（αおよびβ）はホモトリマーとして存在し、受容体 分子に対するその結合能および架橋能、すなわち受容体の凝集を生じさせる能力 によって、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒを介する細胞内シグナリングを誘導すると示唆され る。ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４には（以下にも記載する）、ｐ５５ＩＣとｐ ５５ＤＤがいかにして自己会合し、リガンドに依存した様式でＴＮＦに関連した 効果を細胞内に誘導することができるかについて記載 されている。 ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのほかのメンバーは、Ｆａｓ抗原と も言われ、様々な組織に発現される細胞表面タンパク質であり、そしてＴＮＦ− ＲおよびＮＧＦ−Ｒを含む多数の細胞表面受容体と相同性を共有するＦＡＳ受容 体（ＦＡＳ−Ｒ）である。ＦＡＳ−Ｒはアポトーシスの形態で細胞死を媒介し（ Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、自己反応性Ｔ細胞のネガティブセレクタ ーとして働く、すなわちＴ細胞の成熟の間にＦＡＳ−Ｒは自己抗原を認識するＴ 細胞のアポトーシスによる死（ａｐｏｐｔｏｐｉｃ ｄｅａｔｈ）を媒介するよ うである。また、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子（ｌｐｒ）の突然変異により、ヒト自己免疫 疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似ているマウスのリンパ球分裂疾患が 生ずるということも見出されている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅ ｔ ａｌ．，１９９２）。ＦＡＳ−Ｒのリガンドは数ある中でもキラーＴ細胞（ または細胞傷害性Ｔリンパ球−ＣＴＬｓ）によって担持される細胞表面関連分子 であると考えられており、したがって、前記ＣＴＬｓがＦＡＳ−Ｒを担持する細 胞に接触すると、それらはＦＡＳ−Ｒを担持する細胞のアポトーシスによる細胞 死を誘導することができる。さらに、ＦＡＳ−Ｒに特異的なモノクローナル抗体 が作製されたが、このモノクローナル抗体は、ヒトＦＡＳ−ＲをコードするｃＤ ＮＡによって形質転換されたマウス細胞を含む、ＦＡＳ−Ｒ担持細胞のアポトー シスによる細胞死を誘導することが可能である（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９ ９１）。 Ｔリンパ球のほかに様々のほかの正常細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを発現 しており、この受容体をトリガーすることにより殺されることが可能であること も見出されている。このような傷害プロセスが制御されずに誘導されることは、 ある疾患における組織損傷、たとえば急性肝炎における肝細胞の破壊、の原因と なるのではないかと疑われている。したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞傷害性活性を 抑制する方法を見出すことによって治療が可能になるかもしれない。 反対に、ある悪性細胞およびＨＩＶ感染細胞がそれらの表面にＦＡＳ−Ｒを担 持することも見出されているので、ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性効果をこれら に引き起こすためにＦＡＳ−Ｒに対する抗体またはＦＡＳ−Ｒリガンドが用いら れてもよく、それによってそのような悪性細胞やＨＩＶ感染細胞と戦う手段が提 供されてもよい（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１参照）。したがって、ＦＡ Ｓ−Ｒの細胞傷害性活性を増大するためのほかの方法を見出すことにより、さら に治療が可能になるかもしれない。 ＴＮＦ（αまたはβ）およびＦＡＳ−Ｒリガンドに対する細胞の応答、たとえ ば前述の病理学的な状態における細胞の応答をモジュレートする方法を提供する ことは長い間必要であると考えられている。ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドが 過剰に発現されているばあいは、ＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドによって誘導 される細胞致死性効果を抑制することが望まれ、一方ほかの状態、たとえば創傷 を治癒させたいばあいは、ＴＮＦ効果を増大することが望ましく、腫瘍細胞また はＨＩＶ感染細胞に おけるＦＡＳ−Ｒのばあいは、ＦＡＳ−Ｒが媒介する効果を増大することが望ま しい。 細胞表面に結合しているＴＮＦ−ＲｓへのＴＮＦの結合を競合させるために、 抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体（本質的には受容体の可溶性細胞外ドメ インである）を用いてＴＮＦのその受容体に対する結合を抑制し、ＴＮＦの有害 な効果を調節するよう、多くのアプローチが本発明者らによって行なわれている （たとえば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＥＰ １８ ６８３３、ＥＰ ３０８３７８、ＥＰ ３９８３２７およびＥＰ ４１２４８６ 参照）。さらに、ＴＮＦによって誘導される細胞の効果のためにはＴＮＦがその 受容体に結合することが必要であるということにもとづいて、本発明者らによる アプローチ（たとえばＩＬ １０１７６９およびその対応ＥＰ ５６８９２５参 照）は、ＴＮＦ−Ｒｓの活性をモジュレートすることによりＴＮＦ効果をモジュ レートするよう行なわれている。要するに、ＥＰ ５６８９２５（ＩＬ １０１ ７６９）はＴＮＦ−Ｒｓにおけるシグナル伝達および／または切断（ｃｌｅａｖ ａｇｅ）をモジュレートする方法に関し、その方法によればペプチドまたはほか の分子が受容体それ自身またはその受容体と相互に作用するエフェクタータンパ ク質のいずれかと相互に作用してＴＮＦ−Ｒｓの正常な機能をモジュレートする 。ＥＰ ５６８９２５にはｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン および細胞内ドメインに変異を有する様々なｐ５５ＴＮＦ−Ｒｓの変異体の構築 および特徴付けが記載されている。ここではｐ５５ＴＮＦ−Ｒの前記ドメンイン 内の領域が受容体を機能させること、すなわちリガンド（ＴＮＦ）の結合および それに引き続くシグナル伝達ならびに細胞内シグナリング（これにより最終的に 細胞にＴＮＦ効果が観察されることになる）、に不可欠であるとして同定された 。さらに、ＴＮＦ−Ｒの前記ドメインの様々な領域に結合することのできるタン パク質、ペプチドまたはほかの因子（そのタンパク質、ペプチドおよびほかの因 子はＴＮＦ−Ｒの活性を制御またはモジュレートに関係してもよい）を単離し、 同定するための多くのアプローチも記載されている。そのようなタンパク質およ びペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離し、クローニングするための多くのア プローチ、これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構 築するための多くのアプローチそしてＴＮＦ−ＲとまたはＴＮＦ−Ｒの様々の領 域に結合する前記タンパク質およびペプチドと相互に作用する抗体またはそれら のフラグメントを作製するための多くのアプローチがＥＰ ５６８９２５にも記 載されている。しかしながら、ＥＰ ５６８９２５はＴＮＦ−Ｒｓ（たとえばｐ ５５ＴＮＦ−Ｒ）の細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチド を特定しておらず、ＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメインに結合するそのようなタンパ ク質またはペプチドを単離し、同定するための酵母ツーハイブリッドアプローチ も記載されていない。同様に、ＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインに結合することができ るタンパク質またはペプチドについてはこれまでのところ開示されていない。 このように、ＴＮＦの効果またはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果を阻害することが 望まれているばあいは、細胞表 面でのＴＮＦ−ＲｓかＦＡＳ−Ｒの量または活性を低下させることが望ましく、 増大されたＴＮＦまたはＦＡＳ−Ｒリガンドの効果が求められるばあいは、ＴＮ Ｆ−ＲｓまたはＦＡＳ−Ｒの量または活性を増大することが望ましい。これまで のところ、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５ＴＮＦ−Ｒの両者のプロモーターが配 列決定され、分析されて、様々な転写調節因子に特定のキー配列（ｋｅｙ ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ）モチーフが多数わかっている。そして、これらのＴＮＦ−Ｒｓの 発現自体はそれらのプロモーターレベルで調節されることができる。すなわち受 容体の数を減少させるためにはプロモーターからの転写を抑制し、受容体の数を 増加させるためにはプロモーターからの転写を増大する（ＩＬ １０４３５５お よびＩＬ １０９６３３参照）。これに対応する、ＦＡＳ−Ｒ遺伝子のプロモー ターレベルでのＦＡＳ−Ｒの調節に関する研究は、これまでのところ報告されて いない。 さらに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体およびその構造的に関連する受容体Ｆ ＡＳ−Ｒは、リンパ球が産生するリガンド類によって刺激されると、それら自身 の活動停止を導く分解活性を細胞に引き起こすということは既知であるが、この トリガーのメカニズムは依然理解されていない、ということも記載しておくべき であろう。突然変異の研究によれば、ＦＡＳ−Ｒおよびｐ５５ＴＮＦ受容体（ｐ ５５−Ｒ）において細胞傷害性のためのシグナリングは、それらの細胞内ドメイ ン内の別々の領域に関係するということが示されている（Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｉｔｏｈ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，１９９３）。これ らの領域（「デス・ドメイン」）には配列に類似性がある。ＦＡＳ−Ｒおよびｐ ５５−Ｒの両者の「デス・ドメイン」は自己会合をする傾向がある。それらの自 己会合は、シグナリングの開始に必要な受容体の凝集を明らかに促進し（Ｓｏｎ ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｏ ｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５とともにＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４参照 ）、受容体の発現レベルが高いとリガンド−非依存性シグナリングを引き起こす ことにもなりうる（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４およびＢｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。 このように、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４および本発明以前には、ＴＮＦま たはＦＡＳ−Ｒリガンドの細胞に対する効果のようなＴＮＦ／ＮＧＦスーパーフ ァミリーに属するリガンドの効果を、細胞内シグナリングプロセス（そのシグナ リングはＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーに属する受容体類の細胞内ド メイン類（ＩＣｓ）、たとえばＦＡＳ−ＩＣやＴＮＦ−Ｒｓの細胞内ドメイン類 、すなわちｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメインおよびｐ７５ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメ イン（それぞれｐ５５ＩＣおよびｐ７５ＩＣ）などによっておそらくは大きく支 配されている）を介して調節するであろうタンパク質は提供されていなかった。 したがって、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合することができるタンパク質 、ＭＯＲＴ−１、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのタンパク質は、 ＦＡＳリガンドがその受容体に結合することにより開始される 細胞内シグナリングプロセスに関与すると現在のところ信じられている、を提供 することは本発明の目的の１つである。本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その 類似体、フラグメントおよび誘導体は以前述べた出願に記載されているＦＡＳ− ＩＣ結合タンパク質とは明らかに異なるものである。 本発明のほかの目的は、これらのＦＡＳ−ＩＣ結合分子であるＭＯＲＴ−１タ ンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体に対するアンタゴニスト（たとえ ば抗体）、前記ＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質が正のシグナルエフェクターである （すなわち、シグナリングを誘導する）ばあいは、所望によりそのアンタゴニス トはシグナリングプロセスを阻害するために用いられてもよく、前記ＦＡＳ−Ｉ Ｃ結合タンパク質が負のシグナルエフェクターである（すなわち、シグナリング を阻害する）ばあいは、所望によりそのアンタゴニストはシグナリングプロセス を増大させるために用いられてもよい、を提供することである。 本発明のさらなるほかの目的は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラ グメントおよび誘導体を用いてさらなるタンパク質または因子、たとえばシグナ リングプロセスのさらに下流に関与するかもしれないタンパク質または因子を単 離し、特徴付けすることおよび／またはシグナリングプロセスのさらに上流にあ り、これらＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体が結合 するほかの受容体（たとえば、ほかのＦＡＳ−Ｒｓまたは関連する受容体）、つ まりそれらの機能にも関与する受容体類を単離し、同定することである。 さらに、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体を それらに対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体の作製の ために抗原として用いることを目的とする。その抗体は異なるソース、たとえば 細胞抽出物または形質転換された細胞系から新規なＭＯＲＴ−１タンパク質を精 製するために、さらに使用されてもよい。 そのうえ、これらの抗体は診断の目的で、たとえばＦＡＳ−Ｒ受容体を介する 細胞の効果が異常に機能することに関係する疾患を同定するために使用されても よい。 本発明のさらなる目的は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメン トまたは誘導体からなる薬学的組成物ならびに前記抗体またはほかのアンタゴニ ストからなる薬学的組成物を提供することである。 発明の開示 本発明にしたがって、我々はＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合しうる新規な タンパク質を見出した。このＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質は、ＦＡＳ−Ｒリガン ドが細胞表面で結合したのちに通常起こる細胞内シグナリングプロセスを介する かまたはモジュレートすることにより、細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果の メディエーターまたはモジュレーターとして作用するであろう。 この新規なタンパク質はＨＦ１またはＭＯＲＴ−１（「Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏ ｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ（受容体毒性のメディエーター）」で あるため）と表わされており、加えてそのＦＡＳ−ＩＣ結合特異性はほかの特性 （実施例１参照）、たとえばそれは ｐ５５−ＴＮＦ−ＲおよびＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍ ａｉｎ（ＤＤ），」（ｐ５５−ＤＤおよびＦＡＳ−ＤＤ）領域と相同な領域を有 し、よって自己会合も可能である、という特性を有する。ＭＯＲＴ−１は単独で 細胞傷害性、その自己会合能力におそらく関係する活性を活性化することも可能 である。現在のところ、「デス・ドメイン」相同配列（ＭＯＲＴ−ＤＤ、ＭＯＲ Ｔ−１のＣ末端部に存在する）を含むＭＯＲＴ−１の領域の同時発現（ｃｏ−ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、ＦＡＳ−ＩＣの「デス・ドメイン」に結合するその能 力から期待されるように、ＦＡＳで誘導される細胞死を強く妨害することもわか っている。さらに、同一の実験条件において、ＭＯＲＴ−ＤＤ領域を含まないＭ ＯＲＴ−１の一部分（ＭＯＲＴ−１のＮ末端部、アミノ酸１〜１７７、「ＭＯＲ Ｔ−１ヘッド」）の同時発現は、ＦＡＳで誘導される細胞死の妨害をせず、する としてもＦＡＳで誘導される細胞傷害性がいく分か増大されるということがわか った。 したがって、本発明は、ここでＭＯＲＴ−１と表わすタンパク質、その類似体 またはフラグメント、これらすべてはＦＡＳ−リガンド受容体の細胞内ドメイン （ＦＡＳ−ＩＣ）と結合するかまたは相互作用することが可能である、をコード するＤＮＡ配列を提供する。 とくに、本発明は、 （ａ）未変性のＭＯＲＴ−１タンパク質のコード領域に由来するｃＤＮＡ配列、 （ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）のｃＤＮＡとハイブリダイゼ ーションすることができ、生 物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質をコードするＤＮＡ配 列および （ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果と して同義性であり、生物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質 をコードするＤＮＡ配列 からなる群れより選ばれたＤＮＡ配列を提供する。 本発明の前記ＤＮＡ配列の特定の具体例は、図４に示された配列からなるタン パク質ＭＯＲＴ−１をコードするＤＮＡ配列である。 本発明は、本発明の前記配列のいずれかにコードされるＭＯＲＴ−１タンパク 質、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのタンパク質、類似体、フラグ メントおよび誘導体はＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインと結合するかまたは相互作用 することが可能である、も提供する。 本発明の前記タンパク質の特定の具体例は、図４に示される推測されたアミノ 酸配列を有するＭＯＲＴ−１タンパク質である。 また、本発明は、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントま たは誘導体をコードし、本発明の前記ＤＮＡ配列を含み、適切な真核宿主細胞ま たは原核宿主細胞で発現することができるベクター；前記ベクターを含む形質転 換された真核宿主細胞または原核宿主細胞；およびＭＯＲＴ−１タンパク質、類 似体、フラグメントまたは誘導体の発現に適した条件下でＭＯＲＴ−１タンパク 質、類似体を産生し、前記タンパク質をえるために必要なこのタンパク質の翻訳 後修飾を引き起こし、そして前述の形質転換した細胞の培地からまたは前 述の形質転換した細胞の細胞抽出物から前述の発現したタンパク質、類似体、フ ラグメントまたは誘導体を抽出する方法も提供する。 ほかの観点において、本発明は、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似 体、フラグメントおよび誘導体に特異的な抗体またはその活性な誘導体もしくは フラグメントも提供する。 さらに本発明のほかの観点に関していえば、前述の本発明のＤＮＡ配列または それらがコードするタンパク質の様々な使用が提供される。中でもその使用はつ ぎのものを含む。 (ｉ)ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果のモジュレーシ ョン法であって、１またはそれより多くの本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類 似体、フラグメントまたは誘導体、そのすべては前記ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメイ ンに結合可能であり、ＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートすることができる、で前 記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が１またはそれより多くの前記 ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を、細胞内投与に 適した形態で、前記細胞に導入することまたは１またはそれより多くの前記タン パク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列を、前記配 列を担持する適切な発現ベクターの形態で（そのベクターは前記配列が前記細胞 で発現されるように前記細胞への前記配列の挿入を行なうことができる）、前記 細胞に導入することからなるモジュレーション法； (ii)細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、Ｍ ＯＲＴ−１、その類似体、フラグメントまたは誘導体、そのすべてはＦＡＳ−Ｒ の細胞内ドメインに結合でき、かつＦＡＳ−Ｒの活性を修飾することができる、 で前記細胞を処理することからなり、前記細胞の処理が前記ＭＯＲＴ−１、類似 体、フラグメントまたは誘導体を、その細胞内導入に適した形態で、前記細胞に 導入することまたは前記ＭＯＲＴ−１、類似体、フラグメントまたは誘導体をコ ードするＤＮＡ配列を、その配列を担持する適切なベクターの形態で（そのベク ターは前記配列が前記細胞に発現されるように前記配列の前記細胞への挿入を行 なうことが可能である）、を前記細胞に導入することからなるモジュレート法； (iii)前記(ii)の方法において、前記細胞の処理が、 (ａ)ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合するこ とができるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする第１の配列、お よび前記細胞に発現するとＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートすることができる本 発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選ばれ たタンパク質、をコードする第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクター を構築するステップ；および (ｂ)前記(ａ)のベクターを前記細胞に感染させることのステップ からなる、組換え動物ウイルスベクターを用いて前記細胞をトランスフェク ションすることである方 法； (iv)ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレート する方法であって、本発明の抗体またはその活性誘導体もしくは活性フラグメン トで前記細胞を処理することからなり、その処理とは前記抗体、活性フラグメン トまたは活性誘導体を含有する適切な組成物を前記細胞に適用することであり、 その適用において、前記細胞のＭＯＲＴ−１タンパク質またはその部分が細胞外 表面に露出するばあいは、前記組成物は細胞外適用のために形成され、前記ＭＯ ＲＴ−１タンパク質が細胞内に存在するばあいは、前記組成物は細胞内適用のた めに形成されるモジュレート法； (ｖ)ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレート する方法であって、本発明のＭＯＲＴ−１配列の少なくとも一部分のアンチセン ス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で前記細胞を処理することからなり 、前記オリゴヌクレオチド配列がＭＯＲＴ−１タンパク質の発現をブロックする ことができるモジュレート法； (vi)前記(ｖ)の方法であって、前記細胞の処理が、 (ａ)ＦＡＳ−Ｒ担持細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合することがで きるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする第１の配列と本発明の ＭＯＲＴ−１配列の少なくとも一部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌ クレオチド配列であり、前記ウイルスにより前記細胞に導入されるとＭＯＲＴ− １タンパク質の発現をブロックすることが できるオリゴヌクレオチド配列である第２の配列を担持する組換え動物ウイルス ベクターを構築するステップ；および (ｂ)前記(ａ)のベクターを前記細胞に感染させるステップ からなる、組換え動物ウイルスベクターを用いて前記細胞をトランスフェク ションする方法； (vii)腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞を処理する方法 であって、 (ａ)腫瘍細胞表面受容体もしくはＨＩＶ感染細胞表面受容体またはほかの疾 患の細胞に担持されている受容体と結合することができるウイルスの表面タンパ ク質をコードする配列および本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグ メントおよび誘導体から選ばれたタンパク質であり、前記腫瘍細胞、ＨＩＶ感染 細胞またはほかの疾患の細胞で発現するとその細胞を殺すことができるタンパク 質をコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築すること；お よび (ｂ)前記(ａ)のベクターを腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾 患の細胞に感染させることからなる方法； (viii)細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートする方法であって、 本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡ配列と相互作用す ることのできるリボザイム配列をコードするベクターを、そのリボザイム配列が 前記細胞で発現できる形態で前記細胞に導入するリボザイム操作を適用 することからなり、前記リボザイム配列が細胞で発現するとリボザイムは細胞の ｍＲＮＡ配列と相互作用し、そのｍＲＮＡ配列を切断し、細胞でのＭＯＲＴ−１ タンパク質の発現を阻害する方法； (ix)前記方法のいずれかから選ばれた方法であって、前記ＭＯＲＴ−１タンパク 質または配列をコードするＭＯＲＴ−１が、ＦＡＳ−ＩＣに特異的に結合するＭ ＯＲＴ−１タンパク質の少なくとも一部分またはＦＡＳ−ＩＣに特異的に結合す るＭＯＲＴ−１タンパク質の一部分をコードする配列をコードするＭＯＲＴ−１ の少なくとも一部分からなる方法； (ｘ)ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合できるタンパク質を単離して固定する方 法であって、ストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションののちＰ ＣＲクローニングの操作を適用することからなり、本発明の配列またはその一部 分をプローブとして用いて、少なくとも部分的にそれらと相同性を有するｃＤＮ ＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからの配列と結合させ、そののちに結合した 配列をＰＣＲ操作により増幅し、クローン化して本発明の前記配列と少なくとも 部分的に相同性を有するタンパク質をコードするクローンをえる方法。 本発明はまた、細胞に対するＦＡＳリガンド効果をモジュレートするための薬 学的組成物であって、活性成分としてつぎのうちのいずれかからなる薬学的組成 物を提供する： (ｉ)本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その生物学的に活性なフラグメント、類 似体、誘導体またはその混合 物；(ii)細胞表面受容体と結合できるタンパク質をコードし、かつ本発明のＭＯ ＲＴ−１タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントまたは類似体をコ ードする組換え動物ウイルスベクター；および(iii)本発明のＭＯＲＴ−１配列 のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列であって、前記(ii)の 組換え動物ウイルスベクターの第２の配列であってもよいオリゴヌクレオチド配 列。 ＭＯＲＴ−１はＦＡＳ−ＩＣと結合する明確な領域とＭＯＲＴ−１の自己会合 に関係する別の明確な領域を有し、したがってこれらの明確な領域またはその部 分を、ＭＯＲＴ−１またはＦＡＳ−Ｒに結合でき、ＭＯＲＴ−１に関連する細胞 内シグナリングプロセスもしくはＦＡＳ−Ｒに関連する細胞内シグナリングプロ セスに関係するかもしれないほかのタンパク質、受容体などを同定するために独 立して用いてもよい、ということを記載しておくべきである。さらに、ＭＯＲＴ −１は前述のＭＯＲＴ−１の明確な領域もしくはほかの領域またはその組み合わ せたもののいずれかに関連するほかの活性、たとえばＭＯＲＴ−１単独の細胞傷 害性効果に関係するかもしれない酵素活性を有してもよい。このように、ＭＯＲ Ｔ−１に関連する前記のようなさらなる活性に関係するかもしれないほかのタン パク質、ペプチドなどを特異的に同定するためにＭＯＲＴ−１を使用してもよい 。 本発明のほかの観点および具体例も、つぎの本発明の詳細な説明に記載されて いるように提供される。 至る所で用いられているつぎの用語「細胞に対するＦＡＳ−リガンド効果のモ ジュレーション」および「細胞 に対するＭＯＲＴ−１効果のモジュレーション」はｉｎ ｖｉｔｒｏ処理のみな らずｉｎ ｖｉｖｏ 処理も含む、ということを記載しておくべきである。 図面の簡単な説明 図１ＡおよびＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＦ１（ＭＯＲＴ１）およびＦＡＳ− ＩＣ間の相互作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオー トラジオグラムの複写物である。図１Ａは、ＦＬＡＧ−ＨＦ１（ＦＬＡＧ−ＭＯ ＲＴ１）融合タンパク質またはルシフェラーゼｃＤＮＡ（コントロール）でトラ ンスフェクトされたＨｅＬａ細胞の抽出物由来のタンパク質の免疫沈降物のコン トロールオートラジオグラムを示す。免疫沈降は抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行なっ た。； 図１Ｂは、融合タンパク質としてＦＬＡＧオリゴペプチド（ＦＬＡＧ−ＭＯ ＲＴ１）を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞で産生された［³⁵Ｓ］− メチオニンを代謝的に標識したＨＦ１のＧＳＴ、ヒトおよびマウスＧＳＴ−ＦＡ Ｓ−ＩＣ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｈｕＦＡＳ−ＩＣ、ＧＳＴ−ｍＦＡＳ−ＩＣ ）ならびにＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質、ここでＦＡＳ−ＩＣはＩｌｅ からＡｌａへの置換変異を２２５位に含んでいた（ＧＳＴ−ｍＦＡＳ−ＩＣ、Ｉ ２２５Ａ）、に対する結合をオートラジオグラフィーにより評価する方法で、Ｈ Ｆ１とＦＡＳ−ＩＣとの間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの相互作用を評価するために行 なった代表的なゲルのオート ラジオグラムを示す。初めに抽出されていた標識ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１を含むＨ ｅＬａ細胞の［³⁵Ｓ］標識タンパク質は、様々なＧＳＴとＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ タンパク質（グルタチオンビーズに結合している）との相互作用に付され、その のちＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。相互作用のすべての実験におけるコントロール として、ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＨｅＬａの細胞の抽出物を、 ＧＳＴとＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質との相互作用に付し、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥに付した。図１ＡおよびＢについては実施例１にも記載する。 図２Ａ、ＢおよびＣは、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の様々な免疫 沈降物が分離され、ＨＦ１（ＭＯＲＴＩ）とＦＡＳ−ＩＣとのｉｎ ｖｉｖｏで の相互作用を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオートラジ オグラムの複写物である。前記ＨｅＬａ細胞は、ＨＦ１−ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ− ＭＯＲＴ１）融合タンパク質のみ、ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質とヒトＦＡ Ｓ−Ｒ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１＋Ｆａｓ／ＡＰＯ１）またはヒトＦＡＳ−Ｒのみ （Ｆａｓ／ＡＰＯ１）のみをコードするＤＮＡ構築物（図２Ａ）；ＨＦ１−ＦＬ ＡＧ融合タンパク質とヒトｐ５５Ｒ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１＋ｐ５５Ｒ）をコー ドするＤＮＡ構築物（図２Ｂ）；またはＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質および ヒトＦＡＳ−Ｒとｐ５５−Ｒとの間のキメラ融合タンパク質（ＦＡＳ−Ｒの細胞 外ドメインがｐ５５−Ｒの対応する領域と置換されたもの）（ＦＬＡＧ −ＭＯＲＴ１＋ｐ５５−ＦＡＳキメラ）、もしくはＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５−Ｒキメ ラ融合タンパク質のみ（ｐ５５−Ｆａｓキメラ）をコードするＤＮＡ構築物（図 ２Ｃ）でトランスフェクトされた。すべてのばあいにおいて、トランスフェクト された細胞は［³⁵Ｓ］システイン（２０μＣｉ／ｍｌ）および［³⁵Ｓ］メチオニ ン（４０μＣｉ／ｍｌ）で代謝的に標識され、タンパク質抽出に付された。その のち、異なるトランスフェクト細胞由来のタンパク質抽出物を、抗ＦＬＡＧ抗体 、抗ＦＡＳ抗体、抗ｐ７５−Ｒ抗体および抗ｐ５５−Ｒ抗体（図２Ａ〜Ｃにおけ るαＦＬＡＧ、αＦＡＳ、αｐ７５−Ｒおよびαｐ５５−Ｒ）である様々な抗体 で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。図２Ａの左側にはＦＡＳ−Ｒ（Ｆ ａｓ／ＡＰＯ１）およびＨＦ１−ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧ−ＭＯＲＴ１）に対応する タンパク質バンドが示されており、図２ＡとＢの間にはスタンダード分子量マー カー（ｋＤａで）の相対位置が示され、図２Ｃの右側にはｐ５５Ｒとｐ５５−Ｆ ＡＳキメラに対応するタンパク質バンドが示されている。図２Ａ〜Ｃについては 実施例１にも記載されている。 図３は、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡが、実施例 １で記載されているように、ＨＦ１ ｃＤＮＡでプローブされたノーザンブロッ トの複写物を示す。 図４は、実施例１で記載されているように、ＨＦ１の予備的なヌクレオチドと推 測されたアミノ酸配列を図 表的に示したものであり、そこでは翻訳開始候補位置、すなわち４９位の下線を 引いたメチオニン残基（ボールドで下線が引かれているＭ）、が存在するが、「 デス・ドメイン」に下線が付されている。星印は翻訳終止コドン（ヌクレオチド ７６９〜７７１）を示す。各ラインの最初と中間にはヌクレオチド配列およびア ミノ酸配列の配列の始まり（５′末端）に対する相対位置を示す２種の数字が与 えられている。１番目の数字はヌクレオチドを示し、２番目の数字はアミノ酸を 示す。 図５は、ＭＯＲＴ−１のＣ末端を決定する実験の結果を示す。図５は、実施例１ に記載されているように、ＨｅＬａ細胞で発現した様々なＭＯＲＴ−１−ＦＬＡ Ｇ融合産物を分離し、³⁵Ｓ−システインと³⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した のちに、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）（レーン２、４および６）また はコントロールとしての抗ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体（＃９）（レーン１、３および ５）を用いて免疫沈降したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）のオ ートラジオグラムの複写物である。 図６（ＡおよびＢ）は、ＭＯＲＴ−１でトランスフェクトされた細胞において細 胞致死性効果がリガンドに依存せずに引き起こされることをグラフ的に示したも のである。細胞の生存率は、中性レッドの取り込みアッセイをする（図６Ａ）か またはトランスフェクトされたＤＮＡを発現する細胞の生存率を特別に決定する ために培地中に分泌された胎盤アルカリホスファターゼの量を測定する（図６Ｂ ）かにより決 定された。ＨＦ１（ＭＯＲＴ１）、ヒトＦＡＳ−ＩＣ、ヒトｐ５５−ＩＣまたは ルシフェラーゼ（コントロール）をコードする、テトラサイクリンで制御された 発現ベクターとすべてのばあいにおいて分泌型アルカリホスファターゼをコード するｃＤＮＡとを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。これにより細胞 の生存率に対するこれらのタンパク質の一時的な発現の効果を評価することがで きる。図６Ａおよび６Ｂの両方において、白ぬきグラフはテトラサイクリン（１ μｇ／ｍｌ、発現をブロックするため）の存在下でトランスフェクトされた細胞 の増殖を表わし、黒ぬりグラフはテトラサイクリンが存在しないばあいのトラン スフェクトされた細胞の増殖を示す。図６ＡおよびＢについては、実施例１にも 記載されている。 図７は、実施例１に記載されているように、ＦＡＳ−Ｒを介する細胞傷害性効果 に対するＭＯＲＴ−１タンパク質の異なる部分の効果をグラフ的に示すものであ る。 発明の詳細な説明 １つの観点において本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体スーパーファミリーのメ ンバーであるＦＡＳ−Ｒ受容体の細胞内ドメインに結合することができ、ＦＡＳ −Ｒのメディエーターまたはモジュレーターとして、たとえばＦＡＳリガンドが ＦＡＳ−Ｒに結合することによって開始するシグナリングプロセスにおいてある 役割を有するものとして考えられる新規なタンパク質ＭＯＲＴ−１ （ＨＦ１）に関する。本発明のＭＯＲＴ−１のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列も 新規な配列を表わす（それらはＤＮＡ配列またはアミノ酸配列のデータバンクで ある「ＧＥＮＥＢＡＮＫ」または「ＰＲＯＴＥＩＮ ＢＡＮＫ」にない）。 このように、本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列および ＤＮＡ配列によりコードされるＭＯＲＴ−１タンパク質に関する。 さらに、本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質の生物学的に活性な類似体、フラグ メントおよび誘導体をコードするＤＮＡ配列類ならびにそれらによってコードさ れる類似体類、フラグメント類および誘導体類にも関する。前記類似体、フラグ メントおよび誘導体の製造は通常の方法によって行なわれる（たとえばＳａｍｂ ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。その方法ではＭＯＲＴ−１タンパク 質をコードするＤＮＡ配列において１またはそれより多くのコドンが欠失、付加 またはほかのものによって置換されていてもよく、未変性のタンパク質に対して 少なくとも１つのアミノ酸残基の変化を有する類似体がえられる。受け入れられ る類似体類は、少なくともＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインへの結合の可能性を保持 しているものかまたはほかのいずれかの結合や酵素活性を介することのできるも の、たとえばＦＡＳ−ＩＣに結合するがシグナルを出さない、すなわちさらに下 流の受容体、タンパク質またはほかの因子には結合しないかシグナルに依存する 反応を触媒しない類似体である。いわゆるドミナントネガティブ効果を有する類 似体、すなわちＦＡＳ−ＩＣに対する結合かまたはその結合ののちにひ き続くシグナリングのいずれかが欠失している類似体は、前記のようにして産生 することができる。前記類似体は、たとえば天然のＦＡＳ−ＩＣ結合タンパク質 と競合させてＦＡＳ−リガンド効果を阻害するために使用することができる。同 様に、ＦＡＳリガンド効果を増大させる働きをするであろういわゆるドミナント ポジティブ類似体が産生されてもよい。これらは天然のＦＡＳ−ＩＣ結合タンパ ク質と同じかもしくはそれよりも良好なＦＡＳ−ＩＣ結合特性ならびにシグナリ ング特性を有するであろう。類似体のように、ＭＯＲＴ−１の生物学的に活性な フラグメント類は、ＭＯＲＴ−１の類似体について前述したように製造されれば よい。ＭＯＲＴ−１の適切なフラグメント類は、ＦＡＳ−ＩＣ結合の可能性を保 持するフラグメントかまたは前述のようにほかのいかなる結合または酵素活性を 介することのできるフラグメントである。したがって、類似体について前述した ように、ドミナントネガティブ効果またはドミナントポジティブ効果を有するＭ ＯＲＴ−１フラグメントを製造することも可能である。これらのフラグメントは 本発明の類似体の特定のクラスを示す、すなわちそれらは全ＭＯＲＴ−１配列由 来のＭＯＲＴ−１の一部分であり、その一部分またはフラグメントの各々は前述 の望ましい活性のいずれかを有すると定義される、ということを記載しておくべ きである。同様に、誘導体はＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体またはフラグ メントの１またはそれより多くのアミノ酸残基の側鎖を標準的に修飾することに より、またはＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体またはフラグメントをほかの 分子、たとえば当業者によく知 られているような抗体、酵素、受容体などに複合させることにより製造してよい 。 新規なＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントおよび誘導体は多 くのことに使用できる可能性を有する。たとえば、 (ｉ)ＦＡＳ−Ｒリガンドにより誘導される細胞傷害性が望まれる、抗腫瘍、抗炎 症または抗ＨＩＶ感染などＦＡＳ−Ｒリガンド効果の増大が望まれる状況におい て、それらはＦＡＳ−Ｒリガンドの機能を模擬するかまたは増大させるために使 用してよい。このばあいには、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果、すなわち細胞傷害効果 を増大させるＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体 は、それ自体が既知の標準的な操作によって細胞に導入されてよい。たとえば、 ＭＯＲＴ−１タンパク質が細胞内に存在し、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果が望まれる 細胞にそれを導入すべきなので、細胞にこのタンパク質を特別に導入するための システムが必要である。これを行なう方法の１つはつぎのようである。組換え動 物ウイルス、たとえばワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）由来の１つを作製し、そ のＤＮＡに対してつぎの２種の遺伝子を導入する：細胞に特異的に発現される細 胞表面タンパク質に結合するリガンド、たとえばいくつかの細胞（ＣＤ４リンパ 球、および関連する白血球）に特異的に結合するエイズ（ＨＩＶ）ウイルスｇｐ １２０タンパク質など、または組換えウイルスベクターがＦＡＳ−Ｒを担持する 細胞に結合できるように、ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に 特異的に結合するそのほかのリガンドをコードする遺伝子；およびＭＯＲＴ−１ タンパク質をコードする遺伝子。こうしてウイルスの表面に細胞表面結合タンパ ク質が発現すると、ウイルスは腫瘍細胞またはほかのＦＡＳ−Ｒを担持する細胞 を標的とし、続いて配列をコードするＭＯＲＴ−１タンパク質がウイルスを介し て細胞内に導入されるであろう。細胞で一度発現するとＦＡＳ−Ｒリガンド効果 が増大され、殺されることが望まれる腫瘍細胞またはほかのＦＡＳ−Ｒを担持す る細胞の死が導かれるであろう。前記組換え動物ウイルスの構築は標準的な操作 により行なわれる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照） 。ほかの可能性は、ＭＯＲＴ−１タンパク質の配列を、細胞に吸収され、そこで 発現されることのできるオリゴヌクレオチドの形態で導入することである。さら なる可能性は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，ｖｏｌ．２７０，Ｎｏ．２４，ｐｐ．１４２５５−１４２５８，１９９５ にＬｉｎらによって記載されている方法を修飾することによる。 (ii)それらはＦＡＳ−Ｒリガンド効果を阻害するために使用してもよい。たとえ ば、敗血症性ショック、移植片対宿主拒絶または急性肝炎における組織の傷害の ようなばあいでは、ＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導されるＦＡＳ−Ｒ細胞内シグナリ ングをブロックすることが望まれている。このような状況では、たとえば、標準 的な方法によってＭＯＲＴ−１タンパク質 のための配列をコードするアンチセンスを有するオリゴヌクレオチドを細胞へ導 入することが可能であり、それによりＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするｍＲ ＮＡの翻訳が効果的にブロックされ、ＭＯＲＴ−１タンパク質の発現がブロック されてＦＡＳ−Ｒリガンド効果の阻害が導かれるであろう。前記オリゴヌクレオ チドは、ウイルスによって担持される第２の配列をオリゴヌクレオ配列にした前 記組換えウイルスアプローチを用いて細胞内に導入されてもよい。 ほかの可能性はＭＯＲＴ−１タンパク質に特異的な抗体を使用してその細胞内 シグナリング活性を阻害することである。 さらに、ＦＡＳ−Ｒリガンド効果を阻害するほかの方法は、最近開発されたリ ボザイムアプローチによるものである。リボザイムはＲＮＡを特異的に切断する 触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは一般的に好まれる標的ＲＮＡ、たとえば本 発明のＭＯＲＴ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡを切断するために創作され てもよい。そのようなリボザイムはＭＯＲＴ−１ｍＲＮＡに特異的な配列を有し 、それと相互作用する（相補的に結合する）ことができ、続いてｍＲＮＡを切断 してＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を減少させ（または完全に消失させ）るであ ろう。その減少した発現のレベルは標的細胞でのリボザイム発現のレベルに依存 する。リボザイムを一般的に好まれる細胞（たとえば、ＦＡＳ−Ｒを担持する細 胞）に導入するために、任意の適切なベクタ ー、たとえば通常この目的のために用いられるプラスミド、動物のウイルス（レ トロウイルス）ベクターを使用してもよい（ウイルスが第２の配列として一般的 に好まれるリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを有する、前記（ｉ）も参照） 。（リボザイムに関する総説、方法などについては、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｐｉｃｋ，１９９３；Ｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ． ，１９９３；Ｊｏｓｅｐｈ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９３；Ｓｈｉｍａｙａｍ ａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂａｒ ｉｎａｇａ，１９９３；Ｃｒｉｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ａｎｄ Ｋ ｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３参照）。 (iii)それらは、それらに結合できるほかのタンパク質、たとえば細胞内シグナ リングプロセスに関係し、ＴＮＦ−ＲまたはＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインの下流に 存在するほかのタンパク質を単離、同定およびクローン化するために使用されて もよい。たとえば、ＭＯＲＴ−１タンパク質、すなわちそれをコードするＤＮＡ 配列は酵母ツーハイブリッドシステム（実施例１、下記参照）に使用されてもよ い。前記システムではＭＯＲＴ−１タンパク質の配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤ ＮＡライブラリーからＭＯＲＴ−１タンパク質に結合できるタンパク質をコード するほかの配列（「プレイ（ｐｒｅｙ）」）を単離し、クローン化し、同定する ために「ベイト（ｂａｉｔ）」として用いられるであろう。同様に、本発 明のＭＯＲＴ−１タンパク質がほかの細胞のタンパク質、たとえばＴＮＦ／ＮＧ Ｆ受容体スーパーファミリーのほかの受容体に結合できるかどうかを決定されて もよい。 (iv)ＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導体は同じク ラスのほかのタンパク質、すなわちＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインまたは機能的に関 連する受容体に結合し、かつ細胞内シグナリングプロセスに関係するものを単離 し、同定し、クローン化するために使用されてもよい。この適用では前述の酵母 ツーハイブリッドシステムを用いてもよく、またストリンジェントではないサザ ンハイブリダイゼーションに続いてＰＣＲクローニングを行なう、最近開発され たシステム（Ｗｉｌｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を用いてもよい。Ｗｉｌｋ ｓらの刊行物には、キナーゼモチーフの既知の配列、創作されたキナーゼ配列に もとづいてストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションを適用し、 そののちにＰＣＲによってクローニングをすることによる、２種の推定のタンパ ク質−チロシンキナーゼの同定およびクローニングが記載されている。このアプ ローチは、本発明にしたがってＭＯＲＴ−１タンパク質の配列を用い、ＦＡＳ− Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク質に関係するものを同定してクローン化するため に用いてもよい。 (ｖ)さらに、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまた は誘導体を利用するほかのアプローチは、アフィニティクロマトグラフィーの 方法にそれらを用いてそれらが結合することのできるほかのタンパク質または因 子たとえば、ＦＡＳ−Ｒに関連するほかの受容体や細胞内シグナリングプロセス に関係するほかのタンパク質または因子を単離し、同定することである。この適 用では本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導 体を個別にアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに付着させ、細胞抽出 物と接触させるかまたは細胞内シグナリングプロセスに関係があると疑われるタ ンパク質または因子を単離してもよい。アフィニティクロマトグラフィー操作に 続き、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントまたは誘導 体と結合するほかのタンパク質または因子を溶出し、単離して特徴付けることが 可能である。 (vi)前述のように、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメン トまたは誘導体は、免疫原（抗原）として使用してそれに特異的な抗体を産生し てもよい。これらの抗体は細胞抽出物からかまたはＭＯＲＴ−１タンパク質、そ の類似体またはフラグメントを産生する形質転換された細胞系からのいずれかか らＭＯＲＴ−１タンパク質を精製する目的で使用されてもよい。さらに、これら の抗体は、ＦＡＳ−Ｒリガンドシステムが異常に機能すること、たとえば過剰に 活性化されるかまたは不充分な活性しかないＦＡＳ−Ｒリガンドで誘導される細 胞の効果に関する疾患を同定する目的の診断に使用されてもよい。このように、 そのような疾患がＭＯＲＴ− １タンパク質に関係する多機能な細胞内シグナリングシステムに関連するのなら 、前記抗体は重要な診断具として役立つであろう。 (vii)ＭＯＲＴ−１は、ほかの細胞内タンパク質（いわゆるＭＯＲＴ−１結合タ ンパク質、以下参照）に結合するその能力を有する理由で多くのほかのタンパク 質の間接的なモジュレーターとして使用されてもよい。ほかの細胞内タンパク質 はさらなる細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインに直接結 合する。前記タンパク質または前記細胞内ドメインの具体例としては、よく知ら れているｐ５５ＴＮＦ受容体があげられ、その細胞内シグナリングはその細胞内 ドメインに直接結合する多くのタンパク質によってモジュレートされている（と もに出願中のＩＬ １０９６３２参照）。事実、我々はｐ５５ＴＮＦ受容体の細 胞内ドメインに結合するＭＯＲＴ−１結合タンパク質を単離した（以下および実 施例２参照）。 これらのほかの細胞内タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを モジュレートする目的で、前記(ii)で述べたような多くの方法でＭＯＲＴ−１を 細胞内に導入してもよい。 本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質の単離、同定および特徴付けは、よく知られ ている標準的なスクリーニング操作のいずれかを用いて行なわれてもよい、とい うことも述べておくべきである。たとえば、これらのスクリーニング操作のうち の１つとして、ここで（実施例１）述べられているように酵母ツーハイブリッド 操作が本発明 のＭＯＲＴ−１タンパク質を同定するために用いられた。同様に、前述および以 下にも述べるように、当該分野でよく知られているアフィニティクロマトグラフ ィー、ＤＮＡハイブリダイゼーション操作などのほかの操作を用いて本発明のＭ ＯＲＴ−１タンパク質を単離、同定および特徴付けするかまたは本発明のＭＯＲ Ｔ−１タンパク質に結合することのできるさらなるタンパク質、因子、受容体な どを単離、同定および特徴付けしてもよい。 さらには、ＭＯＲＴ−１の特徴のなかにはＦＡＳ−ＩＣに結合するその能力が あり、自己会合のその能力もある、ということを述べておくべきである。ＭＯＲ Ｔ−１は単独で細胞傷害性を活性化し、自己会合のその能力に関連する活性を活 性化することも可能である、ということも記載しておくべきである。ＦＡＳ−Ｉ Ｃに結合するＭＯＲＴ−１の一部分は、その自己会合に関係するＭＯＲＴ−１の 部分と異なると思われる（実施例１参照）。ＭＯＲＴ−１は、前述のＭＯＲＴ− １分子の明確な部分またはその分子のほかの部分またはこれらの部分のいずれか の組み合わさったものの機能であるかもしれないほかの活性を有してもよい。こ れらのほかの活性は酵素的であってもよく、またほかのタンパク質との結合に関 連していてもよい（たとえば、ＭＯＲＴ−１結合タンパク質またはほかの受容体 、因子など）。このように、ＭＯＲＴ−１はＦＡＳ−Ｒリガンド効果またはそれ 自身のＭＯＲＴ−１を介する細胞の効果のモジュレーションのために、前記方法 で使用されてもよく、ほかの受容体、因子などに関連するほかの細胞シグナリン グプロセスのモ ジュレーションに使用されてもよい。 さらに詳しくは、本発明のこの観点によりＤＮＡ分子それ自体をコードするＭ ＯＲＴ−１およびその変異体（すなわち、ＭＯＲＴ−１の類似体または活性画分 をコードする）がＦＡＳ−Ｒの活性をモジュレートする（または細胞に対するＦ ＡＳリガンド効果をモジュレートするかまたは媒介する）ための遺伝子治療（す なわち、前記(ｉ)および(ii)の使用で述べた方法により）に使用することができ る。さらに、ＭＯＲＴ−１は細胞に対する細胞傷害性効果を有するので、これら のＭＯＲＴ−１またはＤＮＡ分子をコードするＭＯＲＴ−１変異体も、細胞にお けるＭＯＲＴ−１効果をモジュレートするための遺伝子治療に用いられてもよい （これも前記(ｉ)および(ii)の使用の方法による）。これらの遺伝子治療の適用 において、ＭＯＲＴ−１、類似体または誘導体は３通りの方法で用いられてもよ い： (ａ)ＦＡＳ−ＩＣおよびＭＯＲＴ−１結合能力を有する（すなわち、２つのＭＯ ＲＴ−１領域を含み、そのうちの１つはＦＡＳ−ＩＣへの結合に関し、もう１つ はＭＯＲＴ−１の自己会合に関する）全ＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、 誘導体または活性フラグメントはＦＡＳ−ＲおよびＭＯＲＴ−１に関連する効果 をモジュレートするために用いられてよい； (ｂ)ＦＡＳ−ＩＣに結合するＭＯＲＴ−１の一部分ならびにその部分の類似体、 誘導体および活性フラグメントがＦＡＳ−ＩＣに「ドミナントネガティブ」効果 を誘導する、すなわちＦＡＳ−Ｒを介する細胞の 効果を阻害するために使用されてもよく、ＦＡＳ−ＩＣに対する「機能の獲得（ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」効果、すなわちＦＡＳ−Ｒを介する細胞 の効果の増大を誘導するために使用されてもよい；および (ｃ)ＭＯＲＴ−１に特異的に結合するＭＯＲＴ−１の一部分ならびにこの部分の 類似体、誘導体および活性画分は、ＭＯＲＴ−１に対する「ドミナントネガティ ブ」効果または「機能の獲得」効果、すなわちＭＯＲＴ−１に関連する細胞の効 果の阻害または増大を誘導するために使用されてもよい。 前記(iv)の使用で述べたように、ＭＯＲＴ−１タンパク質はＭＯＲＴ−１に対 して特異的な抗体を作製するために使用されてもよい。これらの抗体またはその フラグメントは以下に詳述するように使用されてもよく、これらの適用では抗体 またはそのフラグメントはＭＯＲＴ−１に特異的なものであると理解される。 ここで記載される抗体に関しては、用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノ クローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（ａ ｎｔｉ−Ｉｄ）抗体を意味し、酵素的切断に限らず、ペプチド合成法または組換 え法のような既知の技法のうちのいずれかにより提供されるそのフラグメントと 同様に、可溶性の形態または結合した形態で標識されうる。 ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清由来の不均一な抗体分子 の群である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均一な群を含 み、その群は実質的に同様のエピトープ結合部位を含む。モノ クローナル抗体は当業者に知られている方法でえられればよい。たとえば、Ｋｏ ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７ （１９７５）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３７６，１１０；Ａｕｓｕｂ ｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢ ＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；およびＣｏｌｌｉｇａ ｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎ ｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３ ）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、「参考文献」によりここに完全に 取り入れられている。前記抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを 含むイムノグロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのうちのいずれかであっ てもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉ ｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ またはｉｎ ｖｉｖｏ で培養されてもよい。ｉｎ ｖ ｉｖｏ またはｉｎ ｓｉｔｕ における高力価のモノクローナル抗体の産生は近 年好まれている産生方法である。 キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分の分子であり、たとえばマウス モノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリンの定常領域とを有す る。キメラ抗体は適用の際の免疫原性を減少させるためにおもに用いられ、作製 の際の収率を高めるために用いられ る。たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマからの高収率を有す るが、ヒトにおいては高い免疫原性を有するばあいに、ヒト／マウスキメラモノ クローナル抗体が用いられる。キメラ抗体およびそれらの製造法は当該分野で既 知である（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅ ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１ −６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ ｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １２５０２３（ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １４，１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕ ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ １７１４９６（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９，１９８５ ）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３４９４（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ ５，１ ９８６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ ＷＯ ８６０１５３３，（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ １３，１９８ ６）；Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ １８４１８７（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ １１，１９８６ ）；Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂ ｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ８７０２６７１（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｙ ７，１９８７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：２１４−２１８（１ ９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１− １０４３（１９８８）；ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢ ＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｓｕｐｒａ．）。これ らの参考文献は「参考文献」の欄によりここに完全に取り入れられている。 抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に 関連する特有の決定基を認識する抗体である。イディオタイプ抗体は、モノクロ ーナル抗体、それに対して抗イディオタイプが作製される、を用いて、モノクロ ーナル抗体のソースと同一の種および遺伝型を有する動物（たとえば、マウスの 株）を免疫することにより作製することができる。免疫された動物は免疫する抗 体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗 体（抗−イディオタイプ抗体）を産生することにより免疫する抗体のイディオタ イプ決定基に対する応答をするであろう。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ ．４，６９９，８８０を参照のこと。これは「参考文献」の欄によりここに完全 に 取り入れられている。 抗イディオタイプ抗体は、さらなるほかの動物に免疫応答を誘導するための「 免疫原」（いわゆる抗抗イディオタイプ抗体を産生する）として用いられてもよ い。抗抗イディオタイプは抗イディオタイプを誘導するオリジナルのモノクロー ナル抗体とエピトープ的に同一であってもよい。このようにモノクローナル抗体 のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有す る抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。 したがって、本発明のＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体、フラグメントま たは誘導体に対して産生されるモノクローナル抗体は、適切な動物、たとえばＢ ＡＬＢ／ｃマウス、において抗イディオタイプ抗体を誘導するために用いてもよ い。前記免疫されたマウスからの脾細胞は、抗イディオタイプモノクローナル抗 体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマを産生するために用いられる。さ らに、抗イディオタイプモノクローナル抗体はキーホールリンペット・ヘモシア ニン（ＫＬＨ）のようなキャリアーと結合することができ、さらなるＢＡＬＢ／ ｃマウスに免疫するために用いられることができる。これらのマウスからの血清 は、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体のエピト ープに特異的なオリジナルのモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗イディ オタイプ抗体を含むであろう。 こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それら自身のイディオタ イプエピトープ、または評価されるエピトープに構造的に類似する「イディオト ー プ」、たとえばＧＲＢプロテイン−α、を有する。 用語「抗体」は、完全な分子とそれらのフラグメントたとえば、抗原に結合で きるＦａｂとＦ（ａｂ′）₂の両者を含むものも意味する。ＦａｂおよびＦ（ａ ｂ′）₂フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントがなく、循環からより急 速に取り除かれ、完全な抗体よりも組織結合特異性が少なくてもよい（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）） 。 本発明に有用な抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）₂およびほかのフラグメントが、 完全な抗体分子のためにここに記載されている方法にしたがって、ＭＯＲＴ−１ タンパク質の検出および定量のために使用されてもよい。前記フラグメントは、 パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメントを産生するため）などの酵素を用いるタンパク質分解によって典 型的に産生される。 抗体がある分子と特異的に反応してその分子と抗体とが結合できるばあいは、 抗体は分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体に結合さ れるいずれかの分子の一部分であって、その抗体に認識されうる部分を含むこと を意味する。エピトープまたは「抗原決定基」は、アミノ酸や糖の側鎖などの化 学的に活性な表面分子基から通常なり、特定の三次元構造特性のみならず特定の 電荷特性も有する。 「抗原」は、抗体に結合されることのできる分子またはその分子の一部分であ り、抗原のエピトープに結合できる抗体を動物にさらに産生させることができる 。抗原 は１またはそれより多くのあるエピトープを有していてもよい。前述の特異的な 反応は、抗原が高度な選択性様式で対応する抗体と反応するが、ほかの抗原によ って引きおこされてもよいほかの多数の抗体とは反応しないことを示すよう意図 されている。 本発明で有用な抗体のフラグメントを含む抗体は、サンプル中のＭＯＲＴ−１ の定量的または定性的検出または本発明のＭＯＲＴ−１を発現する細胞の存在を 検出するために用いてよい。これは、光学顕微鏡的、フローサイトメトリック的 または蛍光定量的検出と組み合わされた、蛍光的に標識された抗体を用いる免疫 蛍光法（以下参照）によって確立されうる。 本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は、本発明のＭＯＲＴ−１の ｉｎ ｓｉｔｕ での検出のために、免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法のよう に、組織学的に使用されてもよい。Ｉｎ ｓｉｔｕ 検出は患者から組織学的な 試料を採取し、その試料に標識された本発明の抗体を提供することによって完成 する。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメン ト）を生物学的サンプルに適用するかまたは上にかぶせることにより提供される 。このような操作を用いると、ＭＯＲＴ−１の存在のみならず、検査される組織 でのその分布も測定されうる。本発明を用いると、広く様々な組織学的な方法（ 染色操作など）のいずれもが、そのｉｎ ｓｉｔｕ 検出を達成するために修飾 されうる、ということを当業者であれば容易に認めるであろう。 本発明のＭＯＲＴ−１のためのアッセイは典型的に は、生物学的サンプル、たとえば生物学的液体、組織抽出物、リンパ球や白血球 などの新鮮にえられた細胞または組織培地でインキュベートされた細胞など、を ＭＯＲＴ−１タンパク質を同定することのできる検出可能な標識抗体の存在下で インキュベートし、当該分野でよく知られている多くの技法のうちのいずれかに よりその抗体を検出することからなる。 生物学的サンプルはニトロセルロースのような固相支持体もしくは固相キャリ ヤー、または細胞、細胞の粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することので きるほかの固体支持体もしくは固体キャリヤーで処理されてもよい。支持体また はキャリヤーは適切な緩衝液で洗浄され、前記のように本発明の検出可能な標識 抗体で処理してもよい。そののち、固相支持体またはキャリヤーを緩衝液で２度 洗浄して結合していない抗体を除去してもよい。この固相支持体またはキャリヤ ーに結合した標識の量は従来の手段により検出すればよい。 「固相支持体」、「固相キャリヤー」「固体支持体」、「固体キャリヤー」、 「支持体」または「キャリヤー」は、抗原や抗体を結合することのできるいかな る支持体またはキャリヤーをも意味するものである。よく知られている支持体ま たはキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレ ン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性セルロースおよび修飾されたセ ルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイガン（ｇａｂｂｒｏｓ）およびマグネ タイトがあげられる。キャリヤーの特性は、本発明の目的のためにはある程度ま で可溶性であるかまたは不溶性であることが できる。支持体の材料は事実上、結合される分子が抗原か抗体に結合できる限り 、いかなる構造のコンフィグレーションであってもよい。このように、支持体ま たはキャリヤーのコンフィグレーションは、ビーズのような球状、試験管の内側 表面またはロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。また、表面はシー ト、テストストリップなどのように平らであってもよい。好ましい支持体または キャリヤーはポリスチレンビーズを含む。抗体または抗原を結合するためのほか の適するキャリヤーについては、当業者であればわかり、ルーチンの実験を用い ることにより同一のものを確認できるであろう。 前述のようにして本発明でえられた多数の抗体の結合活性は、よく知られてい る方法により測定すればよい。当業者であればルーチンの実験を用いることによ り各測定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろ う。 洗浄、撹拌、振とう、ろ過などのほかのステップは、通常のようにまたは特定 の条件に対しては必要に応じてアッセイ追加してもよい。 本発明の抗体を検出可能となるように標識することのできる方法のうちの１つ は、抗体に酵素を結合させ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いることである。こ の酵素は、のちに適切な基質にさらされると検出可能な、たとえば分光光度的、 蛍光定量的または可視的手段により、化学的分子を産生するように基質と反応す るであろう。抗体を検出可能にするために標識する際に用いることのできる酵素 は、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレ アーゼ、デルタ−５ −ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリ セロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオ−スリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビパー オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシ ダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラー ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチ ルコリンエステラーゼがあげられる。検出は酵素用の色素基質を用いる色素法に より行なうことができる。検出は、同様にして調製されたスタンダードと比較し た基質に対する酵素反応の程度を視覚的に比較することにより行なってもよい。 検出は様々なほかの免疫測定法を用いて行なってもよい。たとえば、放射能で 標識された抗体または抗体のフラグメントにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）を用いてＲ−ＰＴＰアーゼを検出することができる。ＲＩＡについての好ま しい記載は、Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．らによるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐ ａｎｙ，ＮＹ（１９７８）に見られ、とくにＣｈａｒｄ，Ｔ．による“Ａｎ Ｉ ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”というタイトルの章に言及されてい る。これは「参考文献」の欄によりここに取り入れられている。放射性アイソト ープも、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオート ラジオ グラフィーを用いて検出することができる。 本発明の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光的に標識された 抗体が適切な波長の光にさらされると、その存在は蛍光により検出することがで きる。通常最もよく用いられている蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオ シアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシア ニン、ｏ −フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。 抗体は、¹⁵²Ｅまたはランタニド系のほかのものなどの蛍光発光金属を用いて 検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペン タ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができ る。 抗体は、化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することもで きる。化学発光が付された抗体の存在は、化学反応の過程のあいだに生ずる発光 体の存在を検出することにより測定される。とくに有用な化学発行標識化合物の 具体例は、ルミノール、イソルミノール、サーマティック アクリジニウムエス テル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾ ール、アクリジニウム塩およびオキシレートエステルである。 同様に、バイオ発光化合物が本発明の抗体の標識に用いられてもよい。バイオ 発光体は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的なシス テムに見出されるタイプの化学発光体である。バイオ発光タンパク質の存在は、 発光体の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要なバイ オ発光化合物 は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。 本発明の抗体分子は「ツーサイト」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイ としても知られている、免疫的定量アッセイに利用するために適応させてもよい 。典型的な免疫的定量アッセイでは、一定量の未標識抗体（または抗体のフラグ メント）を固体支持体またはキャリヤーに結合させ、検出可能に標識した一定量 の可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成された３成分の 複合体を検出および／または定量する。 典型的で好まれる免疫定量アッセイは「フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）」ア ッセイであり、そこでは固相に結合した抗体がまず試験されるサンプルに接触し 、２成分の固相抗体−抗原複合体の形成によりサンプルから抗原を抽出する。適 切なインキュベーション期間ののち、固相支持体またはキャリヤーを洗浄して未 反応の抗原を含む残った液体サンプルを除去し、未知の量の標識抗体（「レポー ター分子」として働く）を含む溶液を接触させる。未標識抗体を介して固体支持 体またはキャリヤーに結合した抗原と標識抗体とを複合体とするために２回目の インキュベーションをしたのち、固体の支持体またはキャリヤーを２回洗浄し、 未反応の標識抗体を除去する。 本発明の抗原を用いると有用なアッセイでもあるほかのタイプの「サンドイッ チ」アッセイ、いわゆる「同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」および「リバ ース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」のアッセイ、が用いられる。同時のアッセイは、固体 支持体またはキャリヤーに結合した 抗体および標識抗体が試験されるサンプルに同時に加えられるので、１つのイン キュベーションステップからなる。インキュベーションが完了すると、固体支持 体またはキャリヤーを洗浄して残った液体サンプルおよび複合化されなかった標 識抗体を除去する。固体支持体またはキャリヤーに結合した標識抗体の存在は、 通常の「フォーワード」サンドイッチアッセイのようにして測定される。 「リバース」アッセイでは、標識抗体の溶液をまず液体サンプルに段階的に加 え、つづいて固体支持体またはキャリヤーに結合する未標識の抗体を、適切なイ ンキュベーションを行なったのちに加える。２回目のインキュベーションののち に、固相を通常の様式で洗浄し、試験されるサンプルおよび未反応の標識抗体の 溶液の残りからそれを解放する。固体支持体またはキャリヤーに連結した標識抗 体は、「同時に」および「フォーワード」アッセイで行なうようにして測定され る。 本発明のＭＯＲＴ−１は標準的な組換えＤＮＡ操作（たとえば、Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）により産生されてもよい。その操作では、 タンパク質をコードする配列を含む適切な真核生物または原核生物のベクターに より、適切な真核生物または原核生物の宿主細胞が形質転換される。したがって 、本発明は本発明のタンパク質を産生するためのそのような発現ベクターおよび 形質転換された宿主にも関する。前述のように、これらのタンパク質はそれらの 生物学的活性を有する類似体、フラグメントおよび誘導体を含み、したがってそ れらをコードするベクターもこれらのタンパク質 の類似体およびフラグメントをコードするベクターを含み、形質転換された宿主 は前記類似体およびフラグメントを産生する宿主を含む。これらのタンパク質の 誘導体は形質転換された宿主により産生されるタンパク質またはそれらの類似体 またはフラグメントを標準的に修飾することにより産生される誘導体である。 本発明はＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする組換え動物ウイルスベクター、 このベクターは、細胞内にＭＯＲＴ−１配列を直接挿入するために、特定の標的 細胞（たとえば癌細胞）の表面タンパク質と結合できるウイルス表面タンパク質 をコードするベクターでもある、からなる薬学的組成物にも関する。本発明のほ かの観点はつぎの実施例から明らかであろう。 以下に本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および図面に 限定されるものではない。実施例１：ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合するＭＯＲＴ−１タンパク質のク ローニングおよび単離 ( ｉ)ツーハイブリッド スクリーンおよびツーハイブリッド β−ガラクトシダ ーゼ発現試験 ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインと相互作用するタンパク質を単離するために、酵 母ツーハイブリッドシステムを用いた（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ（１９ ８９）、共に係属中のＩＬ １０９６３２、１１２００２および１１２６９２も 参照）。要約すると、このツーハイブリッドシステムは、２つの別のドメイン、 ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有するＧＡＬ４のよ うな真核転写アクチベーターの回復を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏ での特異的な タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母を用いる遺伝子アッセイ である。それらドメインが発現し、結合して回復したＧＡＬ４タンパク質を形成 すると、ドメインは上流の活性化配列に結合することができ、ｌａｃＺまたはＨ ＩＳ３などのレポーター遺伝子の発現を制御するプロモーターを順に活性化する 。レポーター遺伝子の発現は培養された細胞中に容易に観察される。このシステ ムでは、タンパク質と相互作用する候補の遺伝子は別々の発現ベクターへクロー ン化される。一方の発現ベクターでは、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとハイブ リッドタンパク質を生成するように、ある候補タンパク質の配列がＧＡＬ４ＤＮ Ａ−結合ドメインの配列と同位相で（ｉｎ ｐｈａｓｅ ｗｉｔｈ）クローン化 され、他方のベクターでは、ＧＡＬ４−活性化ドメインとハイブリッドタンパク 質を生成するように、第２候補タンパク質の配列がＧＡＬ４−活性化ドメインの 配列と同位相でクローン化される。 つぎに２つのハイブリッドベクターは、上流のＧＡＬ４結合部位が制御されて いるｌａｃＺまたはＨＩＳ３レポーター遺伝子を有する酵母宿主株中へ同時に形 質転換される。２つのハイブリッドタンパク質が発現しかつそれらのタンパク質 が互いに相互作用しうる、形質転換されたそれらの宿主細胞（同時形質転換体） のみが、レポーター遺伝子を発現することができるであろう。ｌａｃＺレポータ ー遺伝子のばあい、Ｘ−ｇａｌが培地に加えられると、この遺伝子を発現してい る宿主細胞は色が青くなるであろう。したがって、青いコロニーは２つのク ローン化された候補タンパク質が互いに相互作用することができるという事実を 示す。 このツーハイブリッドシステムを用いて、細胞内ドメイン、ＦＡＳ−ＩＣ、を 単独でベクターｐＧＢＴ９（ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合配列を担持する、ＣＬＯＮＴ ＥＣＨ、米国より入手、以下参照）へ、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインとの融合 タンパク質を作製するために、クローン化した。ｐＧＢＴ９へのＦＡＳ−Ｒのク ローニングには、ＦＡＳ−Ｒの全長ｃＤＮＡ配列（係続中のＩＬ１１１１２５参 照）をコードするクローンが用いられ、そこから種々の制限酵素を用いる標準的 な操作により細胞内ドメイン（ＩＣ）を切断し、つぎに標準的操作により単離し 、その多くのクローニング部位領域（ＭＣＳ）に、対応する適切な制限酵素を用 いて、開裂したｐＧＢＴ９ベクターへ挿入した。ＦＡＳ−ＩＣは完全なＦＡＳ− Ｒの残基１７５〜３１９から延長（ｅｘｔｅｎｄ）しているが、残基１７５〜３ １９を含むこの部分はｐＧＢＴ９ベクターへ挿入されたＦＡＳ−ＩＣである（Ｉ Ｌ１１１１２５も参照）ということを記載すべきである。 つぎに前記ハイブリッド（キメラの）ベクターを、ＧＡＬ４活性化ドメインを 有する、ｐＧＡＤＧＨベクターへクローン化されたヒトＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮ Ａライブラリーとともに、ＨＦ７ｃ酵母宿主株へ、同時トランスフェクトした（ 全ての前記ベクター、ｐＧＢＴ９およびＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーを担 持するｐＧＡＤ ＧＨ、ならびに酵母株は、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリ ッドシステム ＃ＰＴ１２６５−１の一部として、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅ ｓ，Ｉｎｃ．，米国より購入した）。同時トランスフェクトされた酵母をヒスチ ジン欠損培地（Ｈｉｓ^-培地）中でのそれらの増殖能により選択した。増殖して いるコロニーは陽性の形質転換体であることを示す。選択した酵母クローンは、 つぎにそのｌａｃＺ遺伝子発現能、すなわちそのＬＡＣＺ活性について試験した 。これは、ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる酵素、β−ガラクトシダーゼによ り異化され、青く着色した生産物を形成するＸ−ｇａｌを培地に加えることによ り行なった。このように、青いコロニーは活性ｌａｃＺ遺伝子を示す。ｌａｃＺ 遺伝子の活性には、ＧＡＬ４転写アクチベーターが形質転換されたクローンにお いて活性型で存在すること、すなわち前記ハイブリッドベクターによりコードさ れるＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインが他方のハイブリッドベクターによりコード されるＧＡＬ４活性化ドメインと正確に結合することが必要である。このような 組み合わせは、ＧＡＬ４ドメインのそれぞれに融合した２つのタンパク質が互い に安定に相互作用（結合）するばあいに限り可能である。このように、単離され たＨｉｓ⁺および青い（ＬＡＣＺ⁺）コロニーは、ＦＡＳ−ＩＣをコードするベク ターおよびＦＡＳ−ＩＣに安定に結合しうるヒトＨｅＬａ細胞起源のタンパク質 産物をコードするベクターとともに同時トランスフェクトされたコロニーである 。 前記ＨｉＳ⁺、ＬＡＣＺ⁺酵母コロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離し、標準 的操作で大腸菌株ＨＢ１０１へ電気穿孔し、つづいてＬｅｕ⁺およびアンピシリ ン耐性形質転換体を選択をした。これらの形質転換体はＡｍ ｐ^RおよびＬｅｕ²の両コード配列を有するハイブリッドｐＧＡＤ ＧＨベクター を担持するものである。したがって、このような形質転換体は、ＦＡＳ−ＩＣに 結合しうる新たに同定されたタンパク質をコードする配列を担持するクローン類 である。つぎにプラスミドＤＮＡをこれらの形質転換した大腸菌から単離し、 (ａ)前述のように、それらをオリジナルのＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメインハイブリッ ドプラスミド（ＦＡＳ−ＩＣを担持するハイブリッドｐＧＴＢ９）とともに酵母 株ＨＦ７へ再形質転換すること。コントロール群として、たとえばｐＡＣＴ−ラ ミンまたはｐＧＢＴ９単独の配列をコードする無関係なタンパク質を担持するベ クターを、ＦＡＳ−ＩＣ−結合タンパク質（すなわちＭＯＲＴ−１）をコードす るプラスミドとともに同時形質転換のために用いた。つぎに同時形質転換した酵 母はＨｉｓ^-培地単独、または３−アミノトリアゾールの異なる濃度を含む培地 で増殖について試験した、および (ｂ)プラスミドＤＮＡおよびオリジナルのＦＡＳ−ＩＣハイブリッドプラスミド および(ａ)に記載のコントロールプラスミドを酵母宿主細胞株ＳＦＹ５２６に再 形質転換することおよびＬＡＣＺ⁺活性（β^-ｇａｌ形成の有効性、すなわち青色 形成）を決定すること により再試験した。 前記試験の結果は、コロニーの色で評価すると、Ｈｉｓ^-培地におけるコロニ ーの増殖のパターンはＬＡＣ Ｚ活性のパターンに一致した、すなわちＨｉｓ⁺ コロニーはＬＡＣＺ⁺でもあったことを示した。さらに、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合 ハイブリッドおよび活性化−ドメインハ イブリッドを、ＨＦ−７酵母宿主細胞よりＧＡＬ４転写アクチベーターによる良 好なＬＡＣＺ誘導能を有するＳＦＹ５２６酵母宿主へトランスフェクションした のちに、液体培地（好ましい培地条件）におけるＬＡＣ Ｚ活性を評価した。 前記操作を用いて、ＨＦ１と称する、「受容体により誘導される毒性のメディ エーター（Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｏ ｘｉｃｉｔｙ）」のため今やＭＯＲＴ−１とも称するタンパク質が同定され、単 離されおよび特徴づけられた。 さらに、多数の前記ツーハイブリッド β−ガラクトシダーゼ発現試験におい て、β−ガラクトシダーゼの発現は好ましいフィルターアッセイによっても評価 されたことも記載すべきである。スクリーニングでは、約３×１０⁶ｃＤＮＡの うちの５つがＭＯＲＴ−１挿入物を含むことがわかった。つぎにいわゆるクロー ン化したＭＯＲＴ−１ｃＤＮＡ挿入物を標準的なＤＮＡ配列決定操作を用いて配 列決定した。ＭＯＲＴ−１のアミノ酸配列をＤＮＡ配列から推定した。ｃＤＮＡ 挿入物によりコードされるタンパク質における残基の番号付けはＳｗｉｓｓ−Ｐ ｒｏｔ ｄａｔａ ｂａｎｋにならう。欠失突然変異株をＰＣＲにより、および 点突然変異株をオリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，（１９９４））により生 産した。(ii) タンパク質の誘導された発現、代謝的標識および免 疫沈降法 ＦＬＡＧオクトペプチドにＮ末端結合したＭＯＲＴ−１（ＦＬＡＧ−ＨＦ１、 Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｔ．，米国）、Ｆａｓ− ＩＣ、ＦＡＳ−Ｒ、ｐ５５−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメ イン（アミノ酸１５３〜３１９）に融合したｐ５５−Ｒの細胞外ドメイン（アミ ノ酸１〜１６８）からなるキメラ、およびコントロールとして働くルシフェラー ゼｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞で発現させた。発現はテトラサイクリン−制御発現ベ クターを用い、テトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを発現するＨｅ Ｌａ細胞のクローン（ＨｔＴＡ−１）（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９ ９２）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４に記載、Ｂｏｌｄｉｎら（１９９５）も 参照）において行なった。［³⁵Ｓ］メチオニンおよび［³⁵Ｓ］システイン（ＤＵ ＰＯＮＴ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅ．，米国およびＡｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕ ｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）での代謝的標識はトランスフェクションの １８時間のち、さらにメチオニンおよびシステイン欠損であるが２％透析ウシ胎 児血清を添加したダルベッコの改良イーグル培地で４時間インキュベーションを 行なった。つぎに細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７ ．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコーレート、０． １％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、溶解質を無関係なウサギ抗血清 （３μｌ／ｍｌ）およびプロテインＧセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国、６０μｌ／ｍｌ）と のインキュベーションにより前清浄した。免疫沈降法は、ＦＬＡＧオクトペプチ ド（Ｍ２、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）、ｐ５５−Ｒ（＃１８および＃２０、 （Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０））、またはＦＡＳ−Ｒ（ＺＢ ４、Ｋａｍｉｙａ Ｓｏｕｔｈａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａ．，米国）に対するマウ スモノクローナル抗体（５μｌ／アリコート）と、もしくはコントロールとして アイソタイプ適合マウス抗体とともに溶解質の０．３ｍｌアリコートを４℃で１ 時間インキュベーションし、さらにプロテインＧセファロースビーズ（３０μｌ ／アリコート）と１時間インキュベートすることにより行なった。(iii) Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 結合 野生型ＦＡＳ−ＩＣまたは突然変異したＦＡＳ−ＩＣとのグルタチオンＳ−ト ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体を生産し、グルタチオン−アガロースビーズ に吸着させた（ＩＬ １０９６３２、１１１１２５、１１２００２、１１２６９ ２に記載、Ｂｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）、Ｆ ｒａｎｇｉｏｎｉ ａｎｄ Ｎｅｅｌ（１９９３）も参照）。代謝的に標識した ＦＬＡＧ−ＨＦ１融合タンパク質のＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣへの結合は、代謝的に ［³⁵Ｓ］メチオニン（６０μＣｉ／ｍｌ）で標識した、ＦＬＡＧ−ＨＦ１を発現 するＨｅＬａ細胞の抽出物と４℃で２時間ビーズをインキュベーションすること により評価した。抽出物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ −４０、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ フェニルメチ ルスルホニルフルオリド、２０μｇ／ｍｌアプロトニン、２０μｇ／ｍｌロイペ プチン、１０ｍＭフッ化ナトリウムおよび０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム（１ ｍｌ／５×１０⁵細胞）を含む緩衝液において調製した。(iv) 誘導されたＨＦ１の発現により誘発する細胞傷害性の評価 ＨＦ１、Ｆａｓ−ＩＣ、ｐ５５−ＩＣおよびルシフェラーゼｃＤＮＡをテトラ サイクリン−制御発現ベクターへ挿入し、分泌型胎盤アルカリホスファターゼｃ ＤＮＡとともにＨｔＴＡ−１細胞（ＨｅＬａ細胞系）にトランスフェクトし（Ｇ ｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ（１９９２））、ＳＶ４０プロモーター（ｐ ＳＢＣ−２−ベクター（Ｄｉｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３））の制御下に おいた。細胞死を中性レッドの取り込みアッセイ（Ｗａｌｌａｃｈ（１９８４） ）または、トランスフェクトされたｃＤＮＡを発現するそれらの細胞における死 を特異的に評価するために、インキュベーションの最後の５時間に増殖培地に分 泌される胎盤アルカリホスファターゼの量を決定すること（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８））により、トランスフェクションの４０時間のちに評価 した。 ＦＡＳ−ＩＣへの結合と関係するＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）タンパク質の領域を 分析するための実験のもう一方のセットでは、テトラサイクリン−制御発現ベク ター（ｐＵＨＤ１０−３）を用いて、以下のタンパク質、ヒトＦＡＳ−Ｒ単独、 ヒトＦＡＳ−ＲだけでなくＭＯＲＴ −１のＮ末端部分（アミノ酸１〜１１７、「ＭＯＲＴ−１ヘッド」）、ヒトＦＡ Ｓ−ＲだけでなくＭＯＲＴ−１のＣ末端部分、これはその「デス・ドメイン」相 同領域（アミノ酸１３０〜２４５、「ＭＯＲＴ−１ ＤＤ」、ＩＬ １１２７４ ２も参照）を含む、ＦＬＡＧ−５５．１１（Ｎ末端でＦＬＡＧオクタペプチドに 融合したタンパク質５５．１１のアミノ酸３０９〜９００、タンパク質５５．１ １はｐ５５−ＩＣ−特異的結合タンパク質である。ＩＬ １０９６３２も参照） がテトラサイクリン−制御トランスアクチベーターを含むＨｅＬａ細胞（ＨｔＴ Ａ−１）で一時的に発現された。トランスフェクションの１２時間後、細胞をト リプシン処理し、３０，０００細胞／ウェルの濃度で再びまいた。さらなるイン キュベーションの２４時間のち、細胞を、１０ｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在 下、種々の濃度（０．００１〜１０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体）でＦＡＳ− Ｒの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体ＣＨ−１ １、Ｏｎｃｏｒ）を用いて６時間処理した。つぎに細胞生存率を中性レッド取り 込みアッセイにより決定し、結果はシクロヘキシミド単独（抗−ＦＡＳ−Ｒモノ クローナル抗体ＣＨ−１１がない）とインキュベーションした細胞と比較して生 存可能な細胞の％で表わした。( ｖ)ノーザン分析および配列分析 ポリＡ⁺ＲＮＡをＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから単離した（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ− ｄＴ ｍＲＮＡ ｋｉｔ．ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｄｅｎ、独国）。プローブとして ＨＦ１ ｃＤＮＡを用いるノーザン分析を通常の方法（ＰＣＴ ／ＵＳ９５／０５８５４に記載、Ｂｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）も 参照）により行なった。ＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）のヌクレオチド配列をジデオキ シチェーンターミネーション法により両方向で決定した。 前記実験過程により結果（表１および図１〜７に示す）は以下のようである。 ツーハイブリッド操作によりクローン化されたＭＯＲＴ−１ ｃＤＮＡの配列分 析はそれが新規タンパク質をコードすることを示した（下記参照）。このタンパ ク質（ＭＯＲＴ−１、「受容体−誘導毒性のメディエーター」のため）のＦａｓ −ＩＣへの結合の特異性をさらに評価するために、およびそれが結合するＦａｓ −ＩＣの特定の領域を定義するために、ツーハイブリッド試験を適用し、以下の 発見に導いた（表１）。(ａ)タンパク質はヒトおよびマウスＦａｓ−ＩＣの両方 に結合するが、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリーの３種の受容体（ｐ５５および ｐ７５ＴＮＦ受容体ならびにＣＤ４０）を含む、数種のほかの試験したタンパク 質類には結合しない。 (ｂ)ｉｎ ｖｉｔｒｏ およびｉｎ ｖｉｖｏ の両方においてシグナリングを消 滅させることが示される（ｌｐｒ^Cg突然変異（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａ ｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）、Ｉｔｏｈ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ（１９９ ３））、ＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」における２２５位（Ｉｌｅ）の置換突 然変異もまたＦＡＳ−ＩＣへのＭＯＲＴ−１の結合を阻止する。 (ｃ)ＦＡＳ−ＲにおけるＭＯＲＴ−１結合部位はこの受容体の「デス・ドメイン 」内に存在する、および(ｄ)ＭＯＲＴ−１はそれ自体に結合する。この自己結合 、およ びＦＡＳ−ＲへのＨＦ１の結合はタンパク質の異なる領域に関係する。残基１〜 １１７に対応するＭＯＲＴ−１のフラグメントは全長ＭＯＲＴ−１に結合するが 、それ自体にもＦＡＳ−ＩＣにも結合しない。逆に、残基１３０〜２４５に対応 するフラグメントはＦＡＳ−Ｒに結合するが、ＭＯＲＴ−１には以前結合しない （表１）。さらに、表１の結果から、ＦＡＳ−Ｒの「デス・ドメイン」領域はＦ ＡＳ−ＩＣ自己会合に決定的であることが、ｐ５５−ＩＣの自己会合のためのｐ ５５−Ｒの「デス・ドメイン」領域のように、明らかである。これらの「デス・ ドメイン」の両端における欠失はその自己会合能に影響を及ぼさないが、一方で これらの「デス・ドメイン」内での欠失は自己会合に影響を及ぼす。ＭＯＲＴ− １のばあいでは、ＭＯＲＴ−１のＦＡＳ−ＩＣに対する結合もまたＦＡＳ−Ｒの 完全（全長）な「デス・ドメイン」に依存するが、一方でＦＡＳ−ＩＣ結合のた めのＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイン」領域の領域外は依存しない。 β−ガラクトシダーゼ発現フィルターアッセイにより評価したようにトランス フェクトされたＳＦＹ５２６酵母内でのＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインおよび活性 化−ドメイン構築物（ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ−ＧＨ）によりコードされるタ ンパク質の相互作用を前記表１に表わす。ＤＮＡ−結合ドメイン構築物は、ヒト Ｆａｓ−ＩＣの４種の構築物、２２５位にＩｌｅからＬｅｕまたはＩｌｅからＡ ｌａへの置換突然変異を有する２種の全長構築物（各々、Ｉ２２５ＮおよびＩ２ ２５Ａ）を含むマウスＦａｓ−ＩＣの４種の構築物、および３種のＨＦ１（ＭＯ ＲＴ−１）構築物を含み、その全ての構築物類を図式的に表の左手側に示す。活 性化−ドメイン構築物は、３種のＨＦ１構築物類、そのＨＦ１部分はＤＮＡ−結 合−ドメイン構築物におけるのと同様である、および全長ヒトＦａｓ−ＩＣ構築 物、Ｆａｓ−ＩＣ部分は前記ＤＮＡ−結合ドメイン構築物におけるのと同じであ る、を含んでいた。ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ５５−ＩＣ残 基２０６〜４２６）、ヒトＣＤ４０の細胞内ドメイン類（ＣＤ４０−ＩＣ、残基 ２１６〜２７７）およびヒトｐ７５ＴＮＦ受容体の細胞内ドメイン（ｐ７５−Ｉ Ｃ、残基２８７〜４６１）だけでなく、ラミン、サイクリンＤおよび「空の（ｅ ｍｐｔｙ）」Ｇａ１４（ｐＧＢＴ９）ベクター類をＤＮＡ−結合ドメイン構築物 の形態で陰性コントロール群として供した。ＳＮＦ−１およびＳＮＦ４をＤＮＡ −結合ドメイン（ＳＮＦ）構築物および活性化−ドメイン（ＳＮＦ４）構築物の 形態で陽性のコントロール群として供した。「空の」Ｇａｌ４ベクター（ｐＧＡ Ｄ−ＧＨ）もまた活性ドメイ ン構築物の形態で陰性コントロール群として供した（ｐ５５−ＩＣ、ｐ７５−Ｉ Ｃに関するさらなる詳細については、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５８５４も参照）。 記号「＋＋」および「＋」は、各々、アッセイの３０および９０分間内での強い 発色を意味し、ならびに「−」は２４時間内に発色がないことを意味する。スコ アがない組み合わせは試験しなかったことを与える。 ＦＬＡＧオクタペプチドとそのＮ末端で融合したＨＦ１（ＭＯＲＴ−１）分子 （ＦＬＡＧ−ＨＦ１）の発現は４種の異なるサイズ、約２７、２８、３２および ３４ｋＤのタンパク質類をＨｅＬａ細胞内で産生した。図１（ＡおよびＢ）にｉ ｎ ｖｉｔｒｏ でのＦａｓ−ＩＣとのＨＦ１の相互作用を実証する結果を示す 。図１ＡおよびＢの記載でわかるように、図１ＡはＦＬＡＧ−ＨＦ１（ＦＬＡＧ −ＭＯＲＴ１）融合タンパク質でまたはコントロールとしてのルシフェラーゼｃ ＤＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の抽出物由来のタンパク質の免疫 沈降物のコントロールオートラジオグラムの複写物であり、免疫沈降は抗−ＦＬ ＡＧ抗体（αＦＬＡＧ）を用いて行なわれた。図１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ に おけるＨＦ１とＦＡＳ−ＩＣの間の相互作用を示すオートラジオグラムの複写物 である。そこではＨＦ１は、トランスフェクトされたＨｅＬａの細胞の抽出より えられた、［³⁵Ｓ］メチオニン−代謝的標識ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質の 形態であり、またＦＡＳ−ＩＣは、ＦＡＳ−ＩＣの２２５位に置換突然変異を有 するものを含むヒトおよびマウスＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパク質の形態で あり、そのＧＳＴ−ＦＡＳ−ＩＣ融合タンパ ク質の全てが大腸菌において生産された。ＧＳＴ−融合タンパク質は、ＨＦ１− ＦＬＡＧ融合タンパク質を含む抽出物との相互作用させる前にグルタチオンビー ズに付着され、この相互作用に続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥが行なわれた。このよう にｉｎ ｖｉｔｒｏ での相互作用を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにつづくオートラジオ グラフィーにより、ＧＳＴ、ヒトまたはマウスＦａｓ−ＩＣとのＧＳＴ融合（Ｇ ＳＴ−ｈｕＦａｓ−ＩＣ、ＧＳＴ−ｍＦａｓ−ＩＣ）に対するまたは２２５位で のＩｌｅからＡｌａへの置換突然変異を含むＦａｓ−ＩＣとのＧＳＴ融合に対す る、ＦＬＡＧオクタペプチドとの融合（ＦＬＡＧ−ＨＦ１）としてトランスフェ クトされたＨｅＬａ細胞内で生産され、［³⁵Ｓ］で代謝的に標識されたＨＦ１の 結合を評価することにより見きわめた。図１Ｂから明らかなように、全４種のＦ ＬＡＧ−ＨＦ１タンパク質はＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣ融合タンパク質とのインキュ ベーションでＦａｓ−ＩＣへの結合能を示した。酵母ツーハイブリッド試験（表 １）におけるように、ＨＦ１はｌｐｒ^Cg突然変異部位での置換（Ｉ２２５Ａ）を 有するＧＳＴ−Ｆａｓ−ＩＣ融合タンパク質には結合しない。 ＦＬＡＧ−ＨＦ１ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質もまたＦＡＳ−Ｒ の細胞内ドメインに対してだけでなくその細胞外ドメインがｐ５５Ｒのそれと置 換されたＦＡＳ−Ｒキメラ（ｐ５５−ＦＡＳ）の細胞内ドメインに対して、Ｈｅ Ｌａ細胞においてこれらの受容体で同時発現させると、結合能を示した。図２（ Ａ、Ｂ、Ｃ）に、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞内での、すなわちｉｎ ｖｉｖｏ でのＦＡＳ−ＩＣとのＨＦ１の相 互作用を実証する結果を示す。図２Ａ、Ｂ、Ｃ、の記載において前記のように、 これらの図はｉｎ ｖｉｖｏ相互作用およびこれらのタンパク質をコードする構 築物で同時トランスフェクトされた細胞内でのＨＦ１とＦＡＳ−ＩＣのあいだの 相互作用の特異性を実証する種々のトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞類の免 疫沈降物のオートラジオグラムの複写物である。このように、ＦＬＡＧ−ＨＦ１ 融合タンパク質は単独で、またはヒトＦＡＳ−Ｒ、ＦＡＳ−Ｒの細胞外ドメイン がヒトｐ５５−Ｒにおける対応する領域と置換されたＦＡＳ−Ｒキメラ（ｐ５５ −ＦＡＳ）と一緒に、または陰性コントロールとして、ヒトｐ５５−Ｒと一緒に 、ＨｅＬａ細胞内で発現し、［³⁵Ｓ］システイン（２０μＣｉ／ｍｌ）および［³⁵ Ｓ］メチオニン（４０μＣｉ／ｍｌ）で代謝的に標識された。同時発現された 受容体とのＨＦ１の交差免疫沈降は示した抗体類（図２Ａ〜Ｃ）を用いて行なっ た。図２Ａ〜Ｃにおいて明らかなように、ＦＬＡＧ−ＨＦ１はＦＡＳ−Ｒの細胞 内ドメインに対してだけでなくｐ５５−Ｒの細胞外ドメインおよびＦＡＳ−Ｒの 細胞内ドメインを有するＦＡＳ−Ｒ−ｐ５５−Ｒキメラの細胞内ドメインに対し ても、ＨｅＬａの細胞内でこれらの受容体類が同時発現されると、結合しうる（ それぞれ、図２Ａの中央の３つのレーンおよび図２Ｃの左側の３つのレーンを参 照）。さらに、トランスフェクトされた細胞の抽出物からのＦＬＡＧ−ＨＦ１の 免疫沈降もまた同時発現されたＦＡＳ−Ｒ（図２Ａ）または同時発現されたｐ５ ５−ＦＡＳキメラ（図２Ｃ）の沈降という結果になった。逆に、これらの受容体 類の免疫沈降はＦＬＡＧ−Ｈ Ｆ１の共沈降という結果になった（図２Ａおよび２Ｃ）。 プローブとしてＨＦ１ ｃＤＮＡを用いるノーザン分析はＨｅＬａ細胞におい て単一のハイブリダイゼーションした転写産物を表わした。図３は、トランスフ ェクトされた細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡ（０．３μｇ）がＨＦ１ ｃＤＮＡとハ イブリダイズされたノーザンブロットの複写物を示す。この転写産物のサイズ（ 約１．８ｋＢ）はＨＦ１ ｃＤＮＡのそれ（約１７０２ヌクレオチド）に近い。 配列分析では、ｃＤＮＡは約２５０アミノ酸のオープンリーディングフレーム を含むことが判った。図４は「デス・ドメイン」モチーフに下線を引き、可能性 のある開始Ｍｅｔ残基（４９位、ボールド、下線を引いたＭ）および翻訳終結コ ドン（７６９〜７７１位のコドンの下の星印）も同様にし、ＨＦ１の予備の（ｐ ｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ）ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を表わす。この「 デス・ドメイン」モチーフは既知のｐ５５−ＲおよびＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイ ン」モチーフ類（ｐ５５ＤＤおよびＦＡＳ−ＤＤ）と相同性を共有する。ＨＦ１ の正確なＣ末端を決定するためおよびＨＦ１の正確なＮ末端（開始Ｍｅｔ残基） に関する証拠をうるために、追加の実験を以下のように行なった。 前記方法を用いて、ＦＬＡＧオクタペプチドとそのＮ末端で融合したＨＦ１分 子（ＦＬＡＧ−ＨＦ１）をコードする多数の構築物を構築し、³⁵Ｓ−システイン および³⁵Ｓ−メチオニンを用いて発現されたタンパク質の代謝的標識とともにＨ ｅＬａ細胞で発現させた（図５Ｂに関 しては前記参照）。ＨＦ１−ＦＬＡＧ分子はＨＦ１コード配列の異なる部分を含 む以下のｃＤＮＡによりコードされた。 ｉ）ヌクレオチド１〜１４５（図４参照）を欠失させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５ ′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡ、 ii）ＨＦ１全長ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮ Ａ（図１Ｂに関しては前記ＦＬＡＧ−ＨＦ１構築物参照）、 iii）ヌクレオチド１〜１４５に加えてヌクレオチド８３２〜１７０１を欠失 させ、１４２〜１４４位のコドンＧＣＣをこの部位での翻訳開始を阻止するため にＴＣＣに突然変異させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオク タペプチドｃＤＮＡ。 前記ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合生産物の発現につづき、抗−ＦＬＡＧモノクローナ ル抗体（Ｍ２）またはコントロールとして、抗−ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体（＃９） を用い、前記のように免疫沈降を行ない、つづいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ア クリルアミド）およびオートラジオグラフィーを行なった。結果を図５に示す。 図５は、前記ＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質が分離され、ゲルの各レーンにの せられたサンプルが以下のようであるオートラジオグラムの複写物である。 レーン１および２：ヌクレオチド１〜１４５を欠失させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５ ′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１− ＦＬＡＧ融合タンパク質。 レーン３および４：全長ＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結 合したＦＬＡＧオクタペプチドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１−ＦＬＡＧ融 合タンパク質。 レーン５および６：ヌクレオチド１〜１４５に加えて８３２〜１７０１を欠失さ せ、１４２〜１４４位でＧＣＣをこの部位での翻訳開始を阻止するためにＴＣＣ に突然変異させたＨＦ１ ｃＤＮＡの５′末端に結合したＦＬＡＧオクタペプチ ドｃＤＮＡによりコードされるＨＦ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質。 免疫沈降は、レーン２、４および６におけるサンプル用には抗−ＦＬＡＧモノ クローナル抗体を用いて、レーン１、３および５におけるサンプル用には抗−ｐ ７５ＴＮＦ−Ｒ抗体で行なった。 図５のオートラジオグラムから、レーン２および４における生産物のサイズが 同一であることにより、ヌクレオチド７６９〜７７１がＨＦ１の翻訳終止部であ ること、すなわちこのコドンは終止シグナルであり、図４に星印により示される ことが確かめられた、ということは明らかである。さらに、レーン６においてち ょうど２つの翻訳産物を表わす広いバンドが存在すること（ゲル上にみられるが オートラジオグラム上では強く標識されているので単一のバンドになっている） は、レーン２および４にさらに２つの産物（さらに大きい分子量の広いバンド） が存在するということがＦＬＡＧ−ＨＦ１融合分子のＮ末端およびＨＦ１配列内 のメチオニン 残基数４９（図４におけるアミノ酸配列の４９位にボールドの下 線をひいたＭを参照）の両方での翻訳の開始を反映している、ということを示す 。このように、前記結果はＨＦ１の（認められていた）Ｃ末端を確認し、またＨ Ｆ１の Ｎ末端は図４における配列の４９位であろうという証拠を提供した。 実に、その５′末端に融合したＦＬＡＧオクタペプチドがないＨＦ１の追加の 発現実験により、Ｍｅｔ⁴⁹は翻訳開始の有効部位として働くことが示された。 「Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ」および「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｎｋ」データベースで 処理された調査は図４に表わされるＨＦ１の配列に対応するものはないことを示 したことを記載すべきである。このように、ＨＦ１は新規ＦＡＳ−ＩＣ−特異的 結合タンパク質を表わす。 ｐ５５−ＩＣの高い発現は細胞傷害効果（ＩＬ １０９６３２、１１１１２５ およびＢｏｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）参照）を引き起こす。ＨｅＬ ａ細胞でのＦａｓ−ＩＣの発現もまた、低い程度ではあるが、感度のよいアッセ イを使用するばあいにのみ検出される、そのような効果を有する。図６Ａおよび Ｂは、ＨＦ１、加えてヒトｐ５５−ＩＣおよびＦＡＳ−ＩＣでトランスフェクト された細胞における細胞傷害効果がリガンド非依存的に引き起こされることを図 式的に表わす。ＨｅＬａ細胞の生存率に対する、ＨＦ１、ヒトＦａｓ−ＩＣ、ヒ トｐ５５−ＩＣ、またはコントロールとして働くルシフェラーゼの一過性発現の 効果をテトラサイクリン−制御発現ベクターを用いて評価した。細胞生存率は、 分泌型胎盤アルカリホスファターゼをコードするｃＤＮＡとともに、テトラサイ クリン（１μｇ／ｍｌ）発現を阻止するため）の存在下（白ぬきのバー、図６Ａ およびＢ）または不在下（黒ぬりのバー、図６ＡおよびＢ）でこれらのｃＤＮＡ 類をトランスフェクションした４０分 後に評価した。細胞の生存率は、トランスフェクトされたＤＮＡを発現するそれ らの特定の細胞の生存率を特異的に決定するために、中性レッドの取り込みアッ セイにより（図６Ａ）または、増殖培地に分泌される胎盤アルカリホスファター ゼの量を測定することにより（図６Ｂ）決定した。 このように、ＨｅＬａ細胞におけるＨＦ１の発現により、ＦＡＳ−ＩＣ発現に よってひきおこされるよりも重大な細胞死に至るということは図６およびＢから 明らかである。ｐ５５−ＩＣ、ＦＡＳ−ＩＣおよびＨＦ１の全てのこれらの細胞 傷害性効果は、「デス・ドメイン」領域に関し、これらのタンパク質類の全てに 存在し、その「デス・ドメイン」が自己会合する傾向を有し、およびそれゆえに 細胞傷害性効果を促進しうると思われる。 ＨＦＩ（ＭＯＲＴ−１）の前記特徴、すなわち、細胞死誘導に関係するＦＡＳ −Ｒの特定の領域とのＨＦ１の特異的会合、およびシグナリングを妨げるその領 域における構造のわずかな変化でさえ、ＨＦ１の結合を消滅させる（ｌｐｒ^Cg突 然変異）という事実、の観点ではこのタンパク質が細胞死のシグナリングまたは トリガーの役割をになうことを示す。この考えは、それ自身が細胞傷害性効果を 誘発するＨＦ１の能力が観察された、ということによりさらに支持される。この ように、ＨＦ１（ＭＯＲＴ−１）は(ｉ)ＦＡＳ−Ｒのみならずそれ自身に対して も結合するそれ自身の能力によるＦＡＳ−Ｒの自己会合のモジュレーターとして 機能し、または(ii)ＦＡＳ−Ｒシグナリングに関係する追加のタンパク質のため のドッキング部位として働く、すなわちＨＦ１は「ドッキ ング」タンパク質でありそれゆえＦＡＳ−Ｒに加えてほかの受容体に結合するで あろう、または(iii)ＦＡＳ−Ｒシグナリングとの相互作用を有する異なるシグ ナリングシステムの部分を構築するのであろう。 ＦＡＳ−ＩＣ結合およびＦＡＳ−Ｒを介する細胞の効果（細胞傷害性）のモジ ュレーションに関係するＭＯＲＴ−１（ＨＦ１）の領域をさらに分析するために 、ＭＯＲＴ−１の部分（「ＭＯＲＴ−１ヘッド」、アミノ酸１０１１７および「 ＭＯＲＴ−１ｄｄ」、アミノ酸１３０〜２４５）（別々に）をコードするベクタ ー類を用いて、ＨｅＬａ細胞の同時トランスフェクションのためのヒトＦＡＳ− Ｒをコードするベクターとともに、前記実験を行なった。これらの実験では種々 のタンパク質およびタンパク質の組み合わせを、タンパク質をコードする配列を テトラサイクリン−制御発現ベクターｐＵＨＤ１０−３に挿入することによりテ トラサイクリン−制御トランスアクチベーター（ＨｔＴＡ−１）を含むＨｅＬａ 細胞で一時的に発現させた。コントロールトランスフェクション群はＦＡＳ−Ｒ のみをコードするベクターおよびＦＬＡＧ−５５．１１融合タンパク質（５５． １１タンパク質は、アミノ酸３０９〜９００を含む部分がＦＬＡＧオクタペプチ ドに（そのＮ末端で）融合したｐ５５−ＩＣ−特異的結合タンパク質である）を コードするベクターを用いた。 トランスフェクションおよびインキュベーション期間（前記(iv)参照）につづ き、トランスフェクトされた細胞を、細胞により発現されたＦＡＳ−Ｒの細胞外 ドメインに特異的に結合する種々の濃度の抗−ＦＡＳ−Ｒモノ クローナル抗体（ＣＨ−１１）で処理した。抗ＦＡＳ−Ｒ抗体のこの結合は細胞 表面でＦＡＳ−Ｒの凝集を誘導し（ＦＡＳ−Ｒリガンドのようである）、ＦＡＳ −ＩＣを介する細胞内シグナリング経路を誘導し、最後には、細胞死（ＦＡＳ− Ｒを介する細胞傷害性）という結果になる。用いられる抗−ＦＡＳ−Ｒモノクロ ーナル抗体（ＣＨ−１１）の濃度は０．０１〜１０μｇ／ｍｌの範囲であり、通 常０．００５、０．０５、０．５および５μｇ／ｍｌのような濃度であった。細 胞は１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下抗−ＦＡＳ抗体で処理した。 前記分析の結果を、トランスフェクトされた細胞の４つの異なるグループのそ れぞれについて、処理された細胞に用いられる抗−ＦＡＳ−Ｒモノクローナル抗 体（ＣＨ１１）の濃度の関数として、トランスフェクトされた細胞の生存率％を 表わす図７に図式的に説明する。トランスフェクトされた細胞のこれらのグルー プを以下のように異なる記号により記する。(ｉ)白ぬきの四角はＦＬＡＧ−５５ ．１１融合タンパク質をコードする非関連（すなわち、非ＦＡＳ−ＩＣ結合）コ ントロールベクター（「５５．１１」、陰性コントロール）によりトランスフェ クトされた細胞を記し、(ii)黒ぬりの四角はＦＡＳ−Ｒをコードするベクターお よび、ＭＯＲＴ−１「デス・ドメイン（ｄｄ）」相同領域を含む、ＭＯＲＴ−１ のＣ末端部分、アミノ酸１３０〜２４５をコードするベクターで同時トランスフ ェクトされた細胞（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｄｄ」を記し、(iii)黒ぬりの三角はＦ ＡＳ−Ｒをコードするベクターのみでトランスフェクトされ た細胞（「ｆａｓ」、陽性コントロール）を記し、および(iv)白ぬきの丸はＦＡ Ｓ−ＲをコードするベクターおよびＭＯＲＴ−１のＮ末端部分、アミノ酸１〜１ １７、「ＭＰＲＴ−１ヘッド」をコードするベクターで同時トランスフェクトさ れた細胞（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｈｅ」）を記す。 図７に示した結果から、トランスフェクトされた細胞におけるＦＡＳ−Ｒの発 現は抗−ＦＡＳ−Ｒ抗体の細胞傷害性効果に対して感受性（「ｆａｓ」と「５５ ．１１」とを比較）が増大されることが明らかである。さらに、「デス・ドメイ ン」相同領域を含むＭＯＲＴ−１における領域およびＦＡＳ−Ｒの同時発現（「 ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｄｄ」）は、ＦＡＳ−Ｒ「デス・ドメイン」（ＦＡＳ−ＤＤ ）に結合するＭＯＲＴ−１「デス・ドメイン」（ＤＤ）領域の能力（前記表１参 照）から予期されるように、ＦＡＳで誘導される（すなわち、ＦＡＳ−Ｒを介す る）細胞死を強く妨害する。さらに、ＭＯＲＴ−１のＮ末端部分およびＦＡＳ− Ｒの同時発現（「ｆａｓ⁺ｍｏｒｔ１ｈｅ」）はＦＡＳ−Ｒを介する細胞死を妨 害せず、かりにするとしても、いくらか細胞傷害性を高める（すなわち、わずか に細胞死が増加する）程度である。 このように、前記結果は明らかに、ＭＯＲＴ−１タンパク質はＦＡＳ−ＩＣへ の結合にかぎり２つの異なる領域を有することおよびＦＡＳ−ＩＣの細胞−細胞 傷害性活性の介在が関与することを示す。 したがってこれらの結果は異なる薬学的適用のためにはＭＯＲＴ−１タンパク 質の異なる部分（すなわち、活 性フラグメント類またはアナログ類）を使用するということの根拠をも提供する 。たとえば、その「デス・ドメイン」領域を含むＭＯＲＴ−１のＣ末端部分のみ を本質的に含むＭＯＲＴ−１タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはそ の誘導体は、ＦＡＳ−Ｒを含む細胞または組織におけるＦＡＳ−Ｒの介する細胞 傷害性効果を阻害するために用いられてもよく、それゆえたとえば、急性肝炎の ようなばあいに、ＦＡＳ−Ｒリガンドの有害な効果からこれらの細胞または組織 を保護するであろう。また、腫瘍細胞および自己反応性ＴおよびＢ細胞のような ばあいに望まれれば、ＭＯＲＴ−１のＮ末端部分のみを本質的に含むＭＯＲＴ− １タンパク質のアナログまたはフラグメントまたはその誘導体を、ＦＡＳ−Ｒを 含む細胞および組織におけるＦＡＳ−Ｒの介する細胞傷害性効果を高めるために 用いてこれらの細胞または組織を破壊に導いてもよい。ここで詳述したように、 ＭＯＲＴ−１の異なる領域の前記使用は、処理が望まれる特定の細胞または組織 中へＭＯＲＴ−１領域コード配列を挿入するために種々の組み換えウイルス（た とえば、ワクシニア）を用いて行なわれてもよい。 さらに、これらのＭＯＲＴ−１領域を介する同様の所望の効果を達成するため に、前記ＭＯＲＴ−１領域に対応する配列または分子構造を有する抗体、ペプチ ドおよび有機分子のような種々のほかの分子を製造し、用いることも可能である 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ (31)優先権主張番号 １１４６１５ (32)優先日 1995年７月16日 (33)優先権主張国 イスラエル（ＩＬ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 バルフォロメーフ、ユージーン イスラエル国、76100 レホボト、ピーオ ー ボックス 26、デパートメント オブ メンブレイン リサーチ アンド バイ オフィジックス アット ザ ワイズマン インスティチュート オブ サイエンス （番地なし) (72)発明者 メット、アイゴア イスラエル国、76462 レホボト、レビン エプスタイン ストリート 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＦＡＳ−Ｓリガンド受容体の細胞内ドメイン（ＦＡＳ−ＩＣ）と結合するか または相互作用することが可能である、ここでＭＯＲＴ−１（またはＨＦ１）と 表わすタンパク質、その類似体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列。 ２．（ａ）未変性のＭＯＲＴ−１タンパク質のコード領域に由来するｃＤＮＡ配 列、 （ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）の配列とハイブリダイゼー ションすることができ、生物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパ ク質をコードするｃＤＮＡ配列および （ｃ）（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果 として同義性であり、生物学的に活性なＦＡＳ−Ｒ細胞内ドメイン結合タンパク 質をコードするＤＮＡ配列 からなる群れより選ばれたＤＮＡ配列。 ３．図４に示された配列からなるタンパク質ＭＯＲＴ−１をコードする請求の範 囲第１項または第２項記載のＤＮＡ配列。 ４．タンパク質、類似体、フラグメントおよび誘導体がＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメ インと結合するかまたは相互作用することができる請求の範囲第１〜３項のいず れかに記載の配列にコードされるＭＯＲＴ−１タンパク質、その類似体もしくは フラグメントおよび誘導体。 ５．図４に示される推測されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第４項記載のタ ンパク質ＭＯＲＴ−１。 ６．請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ配列からなるベクター。 ７．真核宿主細胞で発現することができる請求の範囲第６項記載のベクター。 ８．原核宿主細胞で発現することができる請求の範囲第６項記載のベクター。 ９．請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載のベクターを含む形質転換された真 核宿主細胞または原核宿主細胞。 10．タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体の発現に適した条件下で請 求の範囲第９項記載の形質転換された宿主細胞を増殖し、該タンパク質、類似体 、フラグメントまたは誘導体をえるために必要な該タンパク質の翻訳後修飾を引 き起こし、そして発現した該タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を 単離することからなる請求の範囲第４項記載のタンパク質、その類似体、フラグ メントまたは誘導体の製造法。 11．請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントま たは誘導体に特異的な抗体またはその活性なフラグメントもしくは誘導体。 12．ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合可能であり、ＦＡＳ−Ｒの活性をモジュ レートすることができる、１またはそれより多くの請求の範囲第４項記載のＭＯ ＲＴ−１タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体でＦＡＳ−Ｒを担持す る細胞を処理することからなり、該細胞の処理が１またはそれより多くの該タン パク質、類似体、フラグメントまたは誘導体を、その細 胞内導入に適した形態で、該細胞に導入すること、または１またはそれより多く の該タンパク質、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列を 、該配列を担持する適切な発現ベクター、該ベクターは該配列が該細胞で発現さ れるように該細胞への該配列の挿入を行なうことができる、の形態で該細胞に導 入することからなる、ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効 果のモジュレーション法。 13．ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合でき、かつＦＡＳ−Ｒの活性を修飾する ことができるＭＯＲＴ−１、その類似体、フラグメントまたは誘導体で細胞を処 理することからなり、該細胞の処理が該ＭＯＲＴ−１、類似体、フラグメントま たは誘導体を、その細胞内導入に適した形態で、該細胞に導入すること、または 該ＭＯＲＴ−１、類似体、フラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列を 、その配列を担持する適切なベクター、該ベクターは該配列が該細胞に発現され るように該配列の該細胞への挿入を行なうことが可能である、の形態で該細胞に 導入することからなる、細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートす る方法。 14．請求の範囲第１２項記載の方法であって、前記細胞の処理が、 （ａ）ＦＡＳ−Ｒを担持する細胞の表面の特定の細胞表面受容体に結合するこ とができるウイルスの表面タンパク質（リガンド）をコードする第１の配列、お よび前記細胞に発現するとＦＡＳ−Ｒの活 性をモジュレートすることができる請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパ ク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選ばれたタンパク質、コードする 第２の配列を担持する組換え動物ウイルスベクターを構築するステップ；および （ｂ）前記（ａ）のベクターを前記細胞に感染させるステップ からなる組換え動物ウイルスベクターを用いて前記細胞をトランスフェクショ ンすることである方法。 15．請求の範囲第１１項記載の抗体またはその活性フラグメントもしくは活性誘 導体でＦＡＳ−Ｒを担持する細胞を処理する、その処理とは該抗体、活性フラグ メントまたは活性誘導体を含有する適切な組成物を該細胞に適用することである 、ことからなり、該細胞のＭＯＲＴ−１タンパク質またはその部分が細胞外表面 に露出するばあいは、該組成物は細胞外適用のために形成され、該ＭＯＲＴ−１ タンパク質が細胞内に存在するばあいは、該組成物は細胞内適用のために形成さ れるＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレート する方法。 16．請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＭＯＲＴ−１配列の少なくとも一 部分のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列で該細胞を処理す ることからなり、該オリゴヌクレオチド配列がＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を ブロックすることができるＦＡＳ−Ｒを担持する細胞に対するＦＡＳ−Ｒリガン ド効果をモジュレートする方法。 17．請求の範囲第１６項記載の方法であって、前記オリ ゴヌクレオチド配列が請求の範囲第１４項記載のウイルスを介して前記細胞に導 入され、該ウイルスの第２の配列が該オリゴヌクレオチド配列をコードする方法 。 18．腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞を処理する方法で あって、 （ａ）特定の腫瘍細胞表面受容体もしくはＨＩＶ感染細胞表面受容体またはほ かの疾患の細胞に担持されている受容体と結合することができるウイルスの表面 タンパク質をコードする配列および請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパ ク質、類似体、フラグメントおよび誘導体から選ばれたタンパク質であり、該腫 瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞またはほかの疾患の細胞で発現するとその細胞を殺すこ とができるタンパク質をコードする配列を担持する組換え動物ウイルスベクター を構築すること；および （ｂ）前記（ａ）のベクターを該腫瘍細胞もしくはＨＩＶ感染細胞またはほか の疾患の細胞に感染させることからなる腫瘍細胞またはＨＩＶ感染細胞またはほ かの疾患の細胞を処理する方法。 19．請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする細胞のｍＲＮ Ａ配列と相互作用することのできるリボザイム配列をコードするベクターを、そ のリボザイム配列が該細胞で発現できる形態で該細胞に導入するリボザイム操作 を適用することからなり、該リボザイム配列が細胞で発現するとリボザイムは細 胞のｍＲＮＡ配列と相互作用し、そのｍＲＮＡ配列を切 断し、細胞でのＭＯＲＴ−１タンパク質の発現を阻害する、細胞に対するＦＡＳ −Ｒリガンド効果をモジュレートする方法。 20．請求の範囲第１２〜１９項のいずれかに記載の方法から選ばれた方法であっ て、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質または配列をコードするＭＯＲＴ−１が、ＦＡ Ｓ−ＩＣに特異的に結合するＭＯＲＴ−１タンパク質の少なくとも一部分または ＦＡＳ−ＩＣに特異的に結合するＭＯＲＴ−１タンパク質の一部分をコードする 配列をコードするＭＯＲＴ−１の少なくとも一部分からなる方法。 21．ＭＯＲＴ−１タンパク質がアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに 付着され、該付着されたタンパク質を細胞抽出物と接触させ、そののちに該付着 されたタンパク質に結合した細胞抽出物由来のタンパク質、因子または受容体を 溶出し、単離し、分析するアフィニティクロマトグラフィーの操作を適用するこ とからなる請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質に結合することので きるタンパク質、因子または受容体の単離および同定法。 22．ＭＯＲＴ−１タンパク質をコードする配列が１つのハイブリッドベクターに 担持され、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第２のハイブ リッドベクターに担持され、それらのベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換 し、陽性の形質転換体を単離し、つづいて第２のハイブリッドベクターを抽出し て、該ＭＯＲＴ−１タンパク質と結合するタンパク質をコードする配列をえる、 酵母ツーハイブリッド操作 を適用することからなる請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質と結合 することのできるタンパク質を単離し、同定する方法。 23．活性成分として、請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質、その生 物学的に活性なフラグメント、類似体、誘導体またはそれらの混合物からなる細 胞へのＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物。 24．活性成分として、細胞表面受容体と結合することができるタンパク質をコー ドし、請求の範囲第４項記載のＭＯＲＴ−１タンパク質、その生物学的に活性な フラグメント、類似体、誘導体をコードする組換えウイルスベクターからなる細 胞へのＦＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物。 25．活性成分として、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＭＯＲＴ−１配 列のアンチセンス配列をコードするオリゴヌクレオチド配列からなる細胞へのＦ ＡＳ−Ｒリガンド効果をモジュレートするための薬学的組成物。 26．ストリンジェントではないサザンハイブリダイゼーションののちＰＣＲクロ ーニングの操作を適用することからなり、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記 載の配列またはその一部分をプローブとして用いて、少なくとも部分的にそれら と相同性を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーからの配列と結合さ せ、そののちに結合した配列をＰＣＲ操作により増殖し、クローン化して請求の 範囲第１〜３項のいずれかに記載の前記配列と少なくとも部分的に相同性を有す るタンパク質をコードするクローンをえる、ＦＡＳ−Ｒの細胞内ドメインに結合 できるタンパク質を単離して固定する方法。 27．請求の範囲第１２〜１９項のいずれかに記載の方法で、ＭＯＲＴ−１、その 類似体、フラグメントまたは誘導体とともにまたはＭＯＲＴ−１、その類似体ま たはフラグメントをコードする配列とともに該細胞を処理することからなり、該 処理の結果ＭＯＲＴ−１を介する効果が増大されるかまたは阻害される、細胞に 対するＭＯＲＴ−１で誘導される効果のモジュレーション法。 28．請求の範囲第２７項記載の方法であって、前記ＭＯＲＴ−１タンパク質、そ の類似体、フラグメントまたは誘導体が、ＭＯＲＴ−１自体への結合に特異的に 関係するＭＯＲＴ−１の一部分であるかまたはＭＯＲＴ−１自体への結合に特異 的に関係するＭＯＲＴ−１の一部分をコードするＭＯＲＴ−１配列である方法。