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CN1612750B - Taci-免疫球蛋白融合蛋白质 - Google Patents

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Abstract

干预肿瘤坏死因子受体与其配体结合的分子，例如，可溶性的受体，已经被证实在基础研究中和作为治疗方法均有用。本发明提供了经过改进的可溶性的跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)受体。

Description

TACI-免疫球蛋白融合蛋白质
技术领域
本发明总的来说涉及包含肿瘤坏死因子受体部分和免疫球蛋白部分的改良的融合蛋白质。具体地说，本发明涉及改良TACI-免疫球蛋白融合蛋白质。
发明背景
细胞因子是介导包括调节很多细胞类型的生长和各种生物效应的可溶的小蛋白质，(参见：例如Arai等人，Annu.Rev.Biochem.59：783(1990)；Mosmann，Curr.Opin.Immunol.3：311(1991)；Paul和Seder，Cell76：241(1994))。构成细胞因子组的蛋白质包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、以及其他调节分子。例如：人的白细胞介素-17是刺激白细胞介素-6、胞内粘附分子1、白细胞介素-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的表达和前列腺素E2表达的细胞因子，并且在CD34+造血前体细胞转变成嗜中性粒细胞的优先成熟中起作用(Yao等人，J.Immunol.155：5483(1995)；Fossiez等人，J.Exp.Med.183：2593(1996))。
结合细胞因子的受体一般由一种或多种整合膜蛋白质组成，该整合膜蛋白质以高亲和性与细胞因子结合并且将该结合事件通过特定的受体亚基的胞质部分转导到细胞。根据其细胞外的配体结合区的相似性，细胞因子的受体被分为若干类。例如：根据其特征性的200个残基的胞外区，负责结合和/或转导干扰素效应的受体链是Ⅱ型细胞因子受体家族的成员。
在免疫应答的时候发生的细胞相互作用由若干细胞表面受体家族的成员(包括肿瘤坏死因子受体(FNFR)家族)调节。TNFR家族由一些整合膜糖蛋白受体构成，在与它们各自配体的连接中，许多受体调节不同造血细胞谱系之间的相互作用(参见：例如Cosman，StemCells12：440(1994)；Wajant等人，Cytokine Growth Factor Rev.10：15(1999)；Yeh等人.，Immunol.Rev.169：283(1999)；Idriss和Naismith，Microsc.Res.Tech.50：184(2000))。
一种这样的受体是TACI，跨膜激活剂和CAML-相互作用剂(vonBülow和Bram，Science228：138(1997)；Bram和von Bülow，美国专利5,969,102(1999))。TACI是一种膜结合受体，它具有包含二个富含半胱氨酸的假性重复片断(cysteine-rich pseudo-repeats)的胞外区、一个跨膜区和与CAML(钙调节剂和亲环蛋白配体)相互作用的胞质区、CAML是位于胞内囊泡的整合膜蛋白质，当其在Jurkat细胞内过度表达时，是一种NF-AT激活的协同诱导物。TACI与B细胞和T细胞的一种亚型相关。在此提供编码TACI的核苷酸序列和其相应的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：1和2。
TACI受体与肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的两个成员相结合。一个配体被不同地称为ZTNF4、“BAFF”、“neutrokine-α”、“BLyS”、“TALL-1”、以及“THANK”(Yu等人，国际公开文本WO98/18921(1998)，Moore等人，Science285：269(1999)；Mukhopadhyay等人J.Biol.Chem.274：15978(1999)；Schneider等人J.Exp.Med189：1747(1999)；Shu等人，J.Leukoc.Biol.65：680(1999))。提供ZTNF4氨基酸序列为SEQ ID NO：3。另一个配体被不同地称为“ZTNF2”、“APRIL”和“TNRF死亡配体-1”(Hahne等人，J.Exp.Med.188：1185(1998)；Kelly等人，Cancer Res.60：1021(2000))。提供ZTNF2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。两个配体都亦与B细胞成熟受体(BCMA)结合(Gross等人，Nature404：995(2000))。提供BCMA的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：27。
经证实的肿瘤坏死因子受体的体内活性表明了该受体的可溶形式的临床潜力。TACI受体的可溶形式已经被以免疫球蛋白融合蛋白质的形式被制造出来。最初的版本导致低水平表达的异质蛋白质。在TACI氨基末端、在Fc羧基末端以及TACI柄部可观察到异质性。因此对药用的TACI受体组合物存在着需要。
发明概述
本发明提供了改良的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质，它适合作为治疗用的化合物。
附图简述
图1显示了人TACI的氨基酸序列。富含半胱氨酸的假性重复段的位置用阴影指出，跨膜结构域被框住，同时柄的区域用虚线指出。
图2是免疫球蛋白的IgG1亚群的示意图。CL：轻链恒定区；CH1、CH2、CH3：重链恒定区；VL：轻链可变区；VH：重链可变区；CHO：碳水化合物；N：氨基末端；C：羧基末端。
图3A、3B、3C和3D为野生型人γ1恒定区Fc的氨基酸序列与变体Fc-488、Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8的比较。人的γ1恒定区的CH1结构域不是Fc的一部分，因此没有显示。指出了铰链区、CH2和CH3结构域的位置。指出了一般与轻链恒定区(LC)和重链恒定区(HC)结合的二硫键有关的Cys残基。符号“.”表示在该位置与野生型相同，而“***”表示羧基末端的位置，并且说明了Fc6与其它Fc版本相比在羧基末端的差异。用EU索引位置指出氨基酸的位置。
图4显示125I-ZTNF4与多种TACI-Fc构建体的特异性结合。TACI-Fc融合蛋白质具有缺少SEQ ID NO：2氨基酸序列的前29个氨基酸残基的TACI部分。融合蛋白质之一具有带完整柄结构区的TACI部分，而TACI-Fc融合蛋白质之中的三个具有在柄结构区有多种缺失(TACI(d1-29，d107-154)-Fc5；TACI(d1-29，d111-154)-Fc5；TACI(d1-29，d120-154)-Fc5)的TACI部分。实施例4叙述了实验的详细情况。
发明详述
1.总述
如下所述，本发明提供了跨膜激活剂、钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质，以及应用TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的方法。例如，本发明提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包含给予肿瘤细胞含有TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的组合物。上述组合物可以给予体外培养的细胞。或者，该组合物可以是一种药物组合物，它包含药学可接受的载体和TACI一免疫球蛋白融合蛋白质，该药物组合物可以给予患肿瘤受治疗者。受治疗者可以是哺乳动物的受治疗者。该药物组合物的施用可以抑制，例如，哺乳动物受治疗者的B淋巴细胞的增殖。
本发明还提供了在哺乳动物中抑制ZTNF4活性的方法，它包含给哺乳动物施用含有TACI-免疫球蛋白的组合物。ZTNF4活性可与多种不同的疾病和病症相关联。例如，含有TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的药物组合物可用于治疗自身免疫病，如系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病、克罗恩氏病、类风湿关节炎、多关节型(polyarticular-course)青少年类风湿关节炎以及银屑病性关节炎。或者，含有TACI-免疫球蛋白的药物组合物可用于治疗病症，例如哮喘、支气管炎、肺气肿以及终末阶段的肾衰。含有TACI-免疫球蛋白的药物组合物亦可用于治疗肾脏疾病，例如肾小球肾炎、脉管炎、肾炎、淀粉样变以及肾盂肾炎，或者用于病症，例如肿瘤、慢性白细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴组织增生病以及轻链丙球蛋白病。在某种情况下，ZTNF4活性可以与T细胞相关联。含有TACI-免疫球蛋白的药物组合物亦可用于治疗与免疫抑制、移植排斥、移植物对抗宿主的疾病以及炎症相关的疾病或病症。例如：含有TACI-免疫球蛋白的药物组合物可用于减轻炎症和治疗病症，例如关节痛、肿胀、贫血及败血症性休克。
本发明还提供了在哺乳动物受治疗者中降低循环血液的ZTNF4水平的方法，它包括将含有药学可接受的载体和TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的药物组合物给予哺乳动物受治疗者，其中药物组合物的给药降低哺乳动物受治疗者循环血液中ZTNF4的水平。作为说明，与药物组合物用药前血液的ZTNF4水平相比，上述药物组合物的给药能够降低循环血液的ZTNF4水平至少10％、至少20％、至少10到60％、至少20到50％、或至少30到40％。本领域中的技术人员可以测定循环中的ZTNF4水平。在实施例4和实施例5中叙述了说明性的方法。
如下所述，说明性的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质包含：
(a)TACI受体部分，它由具有SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到154的氨基酸序列的多肽片段组成，其中TACI受体部分包含至少(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基34到66和(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基71到104的序列之一，同时其中TACI受体部分至少与ZTNF2或ZTNF4之一结合，以及
(b)包含免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白部分。
适合的TACI受体部分包括：含有SEQ ID NO：2氨基酸残基34到66和SEQ ID NO：2氨基酸残基71到104的多肽；含有SEQ ID NO：2氨基酸残基34到104的多肽；含有SEQ ID NO：2氨基酸残基30到110的氨基酸序列的多肽；以及具有由SEQ ID NO：2氨基酸残基30到110组成的氨基酸序列的多肽。
TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的免疫球蛋白部分可以包含重链恒定区，如人的重链恒定区。I gG1重链恒定区是适合的重链恒定区的例子之一。说明性的IgG1重链恒定区是含有CH2和CH3区的IgG1 Fc片段。IgG1 Fc片段可以是野生型IgG1 Fc片段或经突变的IgG1 Fc片段，例如含有SEQ ID NO：33氨基酸序列的Fc片段。一种典型的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：54的氨基酸序列的蛋白质。
本文所述的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质可以是聚合物，如二聚体。
本发明还提供了编码TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的核酸分子。用SEQ ID NO：53提供了说明性的编码TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的核苷酸序列。
本发明还包括由具有SEQ ID NO：2氨基酸残基30到154的氨基酸序列的多肽片段组成的TACI可溶性受体，其中TACI可溶性受体包含至少(i)SEQ ID NO：2氨基酸残基34到66和(ii)SEQ ID NO：2氨基酸残基71到104的序列之一，同时其中TACI可溶性受体至少与ZTNF2或ZTNF4之一结合。本文所述的附加TACI可溶受体是对于TACI-免疫球蛋白融合蛋白质适合的TACI受体部分。此外，TACI可溶性受体可用于所述的对于TACI-免疫球蛋白融合蛋白质方法中。
参阅下面的详细叙述和附图将会对本发明的这些方面和其它方面了解更清楚。此外还有，下面确定了各种参考资料。
2.定义
在接着进行的叙述中，大量使用了许多术语。提供下面定义以便于理解本发明。
本文所用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、用聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、以及用任何连接反应、剪切反应、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)、或者天然存在核苷酸的类似物(如天然存在核苷酸的α-对映体形式)、或者前二者的结合物的单体组成。修饰的核苷酸在糖的部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分可以有变更。糖的修饰包括，例如：用卤素、烷基、氨基和叠氮基替换一个或更多羟基，或者糖类可作为醚类或酯类被官能化。此外，整个糖的部分可以用立体的和电子的相似结构(如重氮糖和碳环糖的类似物)替换。在碱基部分中修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶、或者其它熟知的杂环取代物。核酸的单体可以由磷酸二酯键或该键的类似键连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、磷酸苯胺硫代酯、磷酸苯胺酯、磷酸酰胺酯等等。术语“核酸分子”亦包括所谓的“肽核酸”，它含有附着在聚酰胺主链上的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链也可以是双链。
术语“核酸分子的互补体”是指与所提到的核苷酸序列相比，有互补的核苷酸序列和相反方向的核酸分子。例如：序列5’ATGCACGGG3’(SEQ ID NO：57)与5’CCCGTGCAT3’(SEQ ID NO：58)是互补的。
术语“重叠群”表示核酸分子具有与另一核酸分子相同的或互补的一段邻接的序列。邻接序列被认为是核酸分子以其全部或以部分“重叠”某给定的核酸分子的某一段。
术语“简并核苷酸序列”表示与编码多肽的参照核酸分子相比，包含一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如：GAU和GAC三联体各自编码Asp)。
术语“结构基因”是指一种核酸分子，它被转录到信使RNA(mRNA)中，然后mRNA被翻译为氨基酸的序列，后者是特异的多肽的特征。
“分离的核酸分子”是没有整合到生物的基因组DNA中的核酸分子。例如：已经从细胞基因组DNA中分离出的编码生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个例子是不整合到生物基因组中的化学合成的核酸分子。已经从特定物种分离出的核酸分子比该物种染色体的完整DNA分子小。
“核酸分子构建体”是一种单链或者双链的核酸分子，它已经通过人的干预修饰过，它含有以自然界不存在的排列方式结合和排列的核酸片段。
“线状DNA”表示含有游离的5’和3’端的非环状DNA分子。线状DNA可以用酶切或物理断裂的方法，从如质粒之类的闭环DNA分子来制备。
“互补DNA(cDNA)”是用逆录酶从mRNA模板产生的单链DNA分子。一般，使用与部分mRNA互补的引物以开始逆转录。本领域技术人员也使用术语“cDNA”来指由上述单链DNA分子和其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”也指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
“启动子”是控制结构基因转录的核苷酸序列。一般，启动子位于结构基因转录起始位点附近的5’非编码区。在转录起动中起作用的启动子内的序列元件经常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合部位、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSEs；McGehee等人，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环状AMP效应元件(CREs)、血清效应元件(SREs；Treisman，Seminars inCancer Biol.1：47(1990))、糖皮质激素效应元件(GREs)、以及其它转录因子的结合部位，如CRE/ATF(O’Reilly等人，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye等人，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP效应元件结合蛋白质(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))和八聚体因子(通常参阅：Watson等人编著，Molecular Biology of the Gene，第四版(The Ben jamin/CummingsPublishing Company，Inc.1987)，和Lemaigre与Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子是可诱导的启动子，那么转录速率响应于诱导剂而提高。如果启动子是组成型启动子，用诱导剂不能调节转录速率。阻抑型启动子亦被熟知。
“核心启动子”含有启动子功能的基本核苷酸序列，包括TATA框和转录的起点。根据本定义，在没有可提高活性或赋予组织特异性活性的特异性序列的情况下，核心启动子可以具有或不具有可检测出的活性。
“调节元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如：调节元件可以含有与细胞因子结合的核苷酸序列，该细胞因子使转录能够排他或择优地在特殊的细胞、组织或细胞器中进行。该调节元件的类型一般与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”的方式表达的基因相关联。
“增强子”是调节元件的一种类型，它可以提高转录效率，而与增强子相对转录起始位点的距离或方向无关。
“异源DNA”是指一种DNA分子或DNA分子的种群，它在给定的宿主细胞内不天然存在。对于特定的宿主细胞异源的DNA分子，只要是宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)联合，就可以含有由的宿主细胞物种(即内源DNA)衍生的DNA。例如：含有编码多肽的非宿主DNA片段、与包含转录启动子的宿主DNA片段可操作地连接的DNA分子被认为是异源DNA分子。相反，异源DNA分子可以包含与外源启动子可操作连接的内源基因。作为另一个实例，如果将该DNA分子引入到缺少野生型基因的突变细胞中，包含从野生型细胞中得到的基因的DNA分子被认为是异源DNA。
““多肽”是由天然产生或合成的肽键连接的氨基酸残基的聚合物。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。
“蛋白质”是包括一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可以包含非肽的成分，如碳水化合物基团。可以在生产蛋白质的细胞中将碳水化合物和其它非肽取代基团加入到蛋白质中，并且该基团将因细胞的类型不同而不同。本文给蛋白质下定义是依据它们的氨基酸主链结构；对象碳水化合物基团之类的取代基一般不作规定，但其仍然可以存在。
用非宿主DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。
“整合的遗传因子”是通过人工的操作将该因子引入到细胞之后已经掺入到宿主细胞的染色体中的DNA片段。在本发明中，整合遗传因子通常大多数是从用电穿孔或其它技术而引入到细胞中的线性质粒得到的。整合遗传因子被从原始宿主细胞传递到其后代。
“克隆载体”是一种在宿主细胞中具有自我复制能力的核酸分子，例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体一般含有一个或少量允许在不丧失载体基本生物功能的情况下可以以特定方式插入核酸分子的限制性核酸内切酶识别位点，以及编码适合供克隆载体转化细胞的鉴定和选择之用的标记基因的核苷酸序列。标记基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是一种编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。一般，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常在启动子的控制下发生，而该基因被称为“可操作地连接到”启动子上。相似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，调节元件和核心启动子是可操作地连接的。
“重组宿主”是一种含有异源核酸分子，如克隆载体或表达载体，的细胞。在本文中，重组宿主的例子是从表达载体生产TACI-Fc融合蛋白质的细胞。
“整合的转化体”是重组宿主细胞，在其中异源DNA被整合进入到细胞的基因组DNA中。
“融合蛋白质”是由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白质。例如：TACI-免疫球蛋白融合蛋白质包含TACI受体部分和免疫球蛋白部分。如本文所使用的，“TACI受体部分”是结合至少ZTNF2或ZTNF4中的一个的TACI受体的胞外结构域的一部分。短语“免疫球蛋白部分”是指包含免疫球蛋白恒定区的多肽。例如：免疫球蛋白部分可以包含重链恒定区。术语“TACI-Fc”融合蛋白质是指免疫球蛋白部分包含重链恒定区CH2和CH3的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质。
术语“受体”表示一种与被称为“配体”的生物活性分子结合的与细胞相关的蛋白质。这种相互作用介导配体对细胞的效应。在TACI受体结合的背景下，词组“特异性结合”是指配体与受体竞争性结合的能力。例如：ZTNF4与TACI受体特异性结合，这可以通过观测可检测的标记过的ZTNF4和未标记的ZTNF4之间对TACI受体的竞争来证明。
受体可以是膜结合的、胞质的、细胞核的；单体的(例如：甲状腺素激活的受体、β-肾上腺素受体)或聚合物的(例如：PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于它包含胞外的配体结合域和一般与信号转导有关的胞内效应器域的多个结构域的结构。在某些膜结合受体中，胞外的配体结合域和胞内效应器域位于分离的肽链上，它们构成了具有完整功能的受体。
通常，配体与受体结合导致受体中的构象变化，该变化导致细胞中效应器域和其它分子之间的相互作用，它依次地引起细胞新陈代谢中的变化。与受体-配体相互作用经常相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷酸化作用、环化AMP产生的增加、细胞钙质的转移、细胞膜脂质的动员、细胞粘着、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。
术语“分泌信号序列”表示编码在合成较大的多肽的细胞中作为较大多肽的组分引导该多肽通过其分泌途径的肽(分泌肽)的DNA序列。在通过分泌途径转运时，较大的多肽通常被切割以除去分泌肽。
“分离的多肽”是基本上不含有污染的细胞组分，如在自然界中与多肽相连的碳水化合物、脂质或其它蛋白质杂质的多肽。一般，分离的多肽制剂含有高纯度的多肽，即纯度至少约80％、纯度至少约90％、纯度至少约95％、纯度高于95％、或纯度高于99％。显示特定的蛋白质制剂含有分离的多肽的一种方法是在蛋白质制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色之后显出单个条带。但是，术语“分离的”不排斥相同的多肽以其他的物理形式存在，例如二聚体或者糖基化的或衍生的形式。
本文所使用的术语“氨基端”和“羧基端”是用来表示在多肽内的位置。在上下文允许的地方，使用这些术语来提及多肽的特定的序列或一部分以表示其邻近或相对的位置。例如：某一序列在多肽内的参照序列的羧基端是指位于参照序列的羧基末端的近端，但是不一定在整个多肽的羧基末端。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，就结构基因而论，表达包括将结构基因转录到mRNA中和将mRNA翻译为一个或多个多肽。
本文所使用的术语“拼接变体”表示从基因转录而来的RNA的可变形式。拼接变体通过在转录的RNA分子内，或在比较少见的情况下，在分别转录的RNA分子之间，使用可变拼接位点而自然产生，并且可以导致从相同基因转录产生若干mRNA的结果。拼接变体可以编码具有不同的氨基酸序列的多肽。本文中亦使用术语拼接变体来表示由从基因转录的mRNA的拼接变体编码的多肽。
本文所使用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子以及这些分子的合成的类似物。
术语“补体/抗补体对”表示在适当的条件下形成非共价连接的稳定配对的不同部分。例如：生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)是补体/抗补体对的典型。其它典型的补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、正义/反义多核苷酸对等等。由于希望补体/抗补体对接着还能解离，补体/抗补体对最好结合亲和力小于109M-1。
“抗体片段”是抗体的一部分，如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等等。与结构无关，抗体片段与被完整抗体识别的相同抗原结合。
术语“抗体片段”还包括与特异性抗原结合的合成或基因工程改造的多肽，例如：由轻链可变区组成的多肽、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、其中用肽连接体(“scFv蛋白质”)连接轻链和重链可变区的重组单链多肽分子以及由与高变区极为相似的氨基酸残基组成的最小识别单位。
“嵌合抗体”是含有从啮齿类动物抗体得到的可变区和互补决定区的重组蛋白质，而该抗体分子的其他部分是从人的抗体中得到的。
“人源化的抗体”是已经将单克隆抗体的鼠互补决定区从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区转移到人的可变区的重组蛋白质。
如本文所使用的，“治疗剂”是一种分子或原子，它与抗体部分缀合以生产可用于治疗的缀合物。治疗剂的例子包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合物(chelators)、硼化合物、光活性剂或染料以及放射性同位素。
“可检测标记”是一种分子或原子，其与抗体部分缀合以生产可用于诊断的分子，可检测标记的例子包括螯合物、光活性剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁离子或其它标记部分。
本文所使用的术语“亲和标记物”表示可以附在另一多肽上的多肽片段，用以纯化或检测第二多肽，或者为第二多肽提供底物的附着位点。原则上，任何可以得到其抗体或其他有特异性结合的试剂的肽或蛋白都可以作为亲和标记物来使用。亲和标记物包括多组氨酸序列段、蛋白A(Nilsson等人，EMBOJ.4：1075(1985)；Nilsson等人，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S-转移酶(Smith和Johnson，Gene67：31(1988))、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp等人，Biotechnology6：1204(1988))、链酶抗生物素蛋白结合肽、或其它抗原表位或结合结构域。通常参阅：Ford等人，ProteinExpressionand Purification2：95(1991)。编码亲和标记物的DNA分子可以从商业供应商(例如：Pharmacia Biotech、Piscataway，NJ)处获得。
“裸抗体”是一种完整的抗体，与抗体片段不同，它不与治疗剂缀合。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体两种，以及某些重组抗体，如嵌合和人源化的抗体。
如本文所用到的，术语“抗体组分”包括完整的抗体和抗体片段两种。
免疫缀合物”是指抗体组分与治疗剂或可检测标记的缀合物。
“靶多肽”或“靶肽”是包含至少一个表位的氨基酸序列，它在靶细胞，例如肿瘤细胞或载有传染性因子的抗原的细胞上表达。T细胞识别由主要组织相容性复合分子递呈的针对靶多肽或靶肽的肽表位，并且一般溶解靶细胞或在靶细胞的位置招募其它免疫细胞，从而杀伤靶细胞。
“抗原肽”是被T细胞识别的一种肽，它与主要组织相容性复合分子结合以形成MHC-肽复合体，从而，在对T细胞递呈时诱导细胞毒性淋巴细胞的应答。因此，抗原肽可以与适当的主要组织相容性复合分子结合，并且诱导结合或表达该抗原的靶细胞的毒性T细胞的应答，例如针对靶细胞的细胞溶解作用或特异性细胞因子的释放。抗原肽可以在递呈抗原的细胞或靶细胞上，与I类或II类主要组织相容性复合分子结合。
在真核生物中，RNA聚合酶Ⅱ催化结构基因的转录以生产mRNA。核酸分子可以被设计成含有RNA聚合酶Ⅱ的模板，其中RNA的转录物具有与特异mRNA互补的序列。该RNA转录物被称为“反义RNA”，同时编码反义RNA的核酸分子被称为“反义基因”。反义RNA分子可以与mRNA分子结合，导致mRNA翻译的抑制。
由于标准分析方法的不精确，聚合物的分子量和长度被理解为近似值。以“大约”X或“大概”X来表达该值时，所述的数值X应被理解为精确到±10％。
3.编码TACI-免疫球蛋白蛋白质的核酸分子的生产
图1提供了预测的人的TACI氨基酸序列(yon Bülow和Bram，Science278：138(1997))。TACI多肽含有下述预期元件：(a)作为肿瘤坏死因子配体结合结构域特征的二个富含半胱氨酸的假重复结构，(b)存在于配体结合结构域和跨膜结构域之间的62个氨基酸的“柄区”，(c)20个氨基酸的跨膜结构域，和(d)127个氨基酸的胞内结构域。氨基酸序列不含有预期的疏水的氨基端信号序列。
为了制造用作为天然配体：天然受体相互作用的抑制剂的人的TACI可溶形式，产生了TACI胞外结构域-人的免疫球蛋白Fc融合蛋白质。可以得到的人的TACI序列被用作设计融合蛋白质分子的起点(von Bülow和Bram，Science278：138(1997))。该初始构建体，设计为“TACI-Fc4”，包括下面所述的TACI多肽的氨基酸残基1到154以及修饰过的人的Fc段。当不包括任何预期的跨膜结构域的潜在部分时，为了包括尽可能多的TACI柄区而选择残基154作为融合点。
鉴于天然TACI多肽不含有氨基端信号序列，为了产生TACI-Fc4融合蛋白质的分泌形式，将氨基端信号序列加到TACI上。信号序列是来自人的组织纤溶酶原激活蛋白的修饰过的前原(pre-pro)序列。修饰被包括进来是为了促进信号肽酶的切割和弗林蛋白酶的特异性加工，并且由于这一原因，该序列已经被称为“优化的tPA(otPA)前导序列”。在下文的阐明了otPA序列(SEQ ID NO：25)；已修饰过的氨基酸残基被用阴影标出。将重组TACI-Fc4融合蛋白质的编码序列插入到表达载体中，而它被转染到中国仓鼠的卵巢细胞中。
-35                    -30
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys
转染过的中国仓鼠的卵巢细胞以大约以0.3pg/细胞/天的低水平生产TACI-Fc4蛋白质。TACI-Fc4蛋白质用羊抗人IgG Fc抗血清的免疫印记分析显现出两个条带，一个带比大概48kDa的期望尺寸小。纯化蛋白质的氨基酸序列分析显现，较小的带由在TACI柄区中多个位点上对TACI融合蛋白质的切割造成。参考SEQ ID NO：2发现，虽然，蛋白质也在氨基酸110、139和141位置上被切割，但是主要的末端在氨基酸残基118和123。
除了由在柄区切割引起异源性之外，在氨基和羧基末端也观察到了异源性。参考SEQ ID NO：2，发现主要的氨基末端在氨基酸残基1、10和13上。在羧基末端中的差异反映了重组免疫球蛋白和免疫球蛋白融合蛋白质的天然异源性，它包括在羧基末端编码的赖氨酸残基的不完全去除。其它异源性的来源是在附着于编码Fc的免疫球蛋白CH2结构域的碳水化合物结构的可变的自然属性中发现的。
制成了新版本的TACI-Fc以解决所观察到的异源性。所设计的构建体至少包括在TACI部分中的以下变异之一：(1)缺失TACI柄区的部分，(2)用BCMA柄区的一部分替换TACI柄区的一部分，(3)使在位置119的精氨酸残基突变，以消除潜在的弗林蛋白酶切割位点，(4)使在位置121的精氨酸残基突变，以消除潜在的弗林蛋白酶切割位点，(5)使在位置122的精氨酸残基突变，以消除潜在的弗林蛋白酶切割位点，(6)将在位置123和142的氨基酸残基突变为在鼠TACI的相应位置的氨基酸残基，(7)用人的重链可变区信号序列替换人的otPA信号序列，(8)将在位置29的缬氨酸残基突变为甲硫氨酸残基，并且将otPA信号序列连接到该残基的氨基末端位置，以及(9)将otPA信号序列连接到在位置30的丙氨酸残基的氨基末端的位置。
修饰亦被引入到了免疫球蛋白部分。五类免疫球蛋白，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，已经在高等脊椎动物中被鉴别出来。IgG、IgD和IgE蛋白质的特征是由二硫键连接的由两个相同重链和两个相同轻链组成的异型四聚体。一般，IgM是以四聚体的五聚体的形式被发现的，而IgA是作为四聚体的二聚体出现。
IgG构成主要类型，它是以血浆中发现的第二丰富的蛋白质的状态存在的。在人类中，IgG由被称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的四种亚型组成。如图2所示，每种免疫球蛋白的重链都具有由恒定区蛋白质结构域(CH1、铰链区部、CH2和CH3)组成的恒定区，它对于给定的亚型是不变的。IgG类型的重链恒定区用希腊符号γ来标记。例如，IgG1亚型免疫球蛋白含有γ1重链恒定区。
Fc片段，或Fc结构域，由用二硫键连接的重链铰链区、CH2和CH3结构域组成。在免疫球蛋白融合蛋白质中，IgG1亚型的Fc结构域经常被用作免疫球蛋白部分，因为IgG1具有任何血清蛋白质中最长的血清半衰期。较长的血清半衰期可以成为对于动物研究和潜在的人类治疗应用的所希望的蛋白质特性。此外，IgG1亚型具有最强的实现抗体介导的效应子功能的能力。在免疫球蛋白融合蛋白质中或许最有用的基本的效应子的功能是IgG1抗体介导抗体依赖的细胞毒作用的能力。在另一方面，对于主要作为拮抗物的融合蛋白质这可能是不希望的功能。在IgG1亚型中，若干对于抗体恒定区介导的活性重要的特异性氨基酸残基已经被确定。因此包含或排除这些特异性的氨基酸就允许包含或排除特异性的免疫球蛋白恒定区介导的活性。
由于制造Fc融合蛋白质，六个版本的修饰的人的IgG1 Fc被产生出来。为了便于克隆含有人的γ1Fc区的融合蛋白质而设计了Fc-488，并且它是用野生型人的免疫球蛋白γ1恒定区作为模板来构建的。考虑到由于不成对的半胱氨酸残基所导致的潜在的有害作用，决定用丝氨酸残基替换正常情况下用二硫键与免疫球蛋白轻链恒定区结合半胱氨酸(SEQ ID NO：6的氨基酸残基24)。为了将来DNA操作的简便，额外的变化被引入到编码EU索引位置218(SEQ ID NO：6的氨基酸残基22)的密码子中，以引入BglII限制酶的识别位点。将这些变化引入到在PCR引物上编码的PCR产物中。根据BglII位点的位置和为了使Fc铰链区完整，将EU索引位置216和217(SEQ ID NO：6的氨基酸残基20和21)的密码子掺入到融合蛋白质的相应序列中。
Fc4、Fc5和Fc6包含了通过降低Fc γ RI的结合和补体Clq的结合而降低由Fc介导的效应子功能的突变。Fc4包含与被引入到Fc-488中的相同氨基酸替代。将额外的氨基酸替代引入，以降低潜在的Fc介导的效应子的功能。具体而言，三个氨基酸替代被引入以降低Fc γ RI结合。它们是在EU索引位置234、235和237(SEQ ID NO：6的氨基酸残基38、39和41)的替代物。在这些位置的替代已经显示降低对Fc γ RI的结合(Duncan等人，Nature332：563(1988))。这些氨基酸替代也可以降低Fc γ RIIa的结合，以及Fc γ RIII的结合(Sondermann等人，Nature406：267(2000)；Wines等人，J.Immunol.164：5313(2000))。
若干研究小组已经描述了在补体C1q结合和接着发生的补体的固定中EU索引位置330和331(SEQ ID NO：6的氨基酸残基134和135)的相关性(Canfield和Morrison，J.Exp.Med173：1483(1991)；Tao等人，J.Exp.Med.178：661(1993))。将在该位置的氨基酸替代引入到Fc4中以减少补体的固定。除终止密码子之外，Fc4的CH3结构域和在相应的野生型多肽中的完全一样，将克隆的DNA在大肠杆菌的dam+菌株中培育时，TGA被变为TAA以消除潜在的dam甲基化位点。
在Fc5中，将在EU索引位置218的精氨酸残基突变回赖氨酸，因为含有该特殊Fc的融合蛋白质不使用BglII克隆方案。Fc5序列的其他部分与上述的Fc4相符。
除羧基端赖氨酸密码子已经被除去之外，Fc6和Fc5完全一样。成熟免疫球蛋白的C末端赖氨酸经常在从B细胞分泌之前在翻译后从成熟免疫球蛋白被除去，或在血清循环时被除去。因此，C末端的赖氨酸残基一般在循环的抗体上不会被找到。如在上面所述的Fc4和Fc5一样，在Fc6序列中的终止密码子被改为TAA。
除位于CH2结构域的在EU索引位置297上的氨基酸替代之外，Fc7和野生型γ1Fc完全一样。EU索引位置Asn-297(SEQ ID NO：6的氨基酸残基101)是N-连接的碳水化合物的附着的位点。由于在碳水化合物结构中潜在的批与批之间的变化，N-连接的碳水化合物在重组表达的蛋白质中引入了潜在的变异性的来源。在消除这种潜在的变异性的努力中，将Asn-297突变为谷氨酰胺残基以防止N-连接的碳水化合物在该残基位置上的附着。在残基297上的碳水化合物也参与Fc与FcγRIII的结合(Sondermann等人，Nature406：267(2000))。因此，通常碳水化合物的去除会减少重组的含Fc7融合蛋白质与FcγRs的结合。如上所述，Fc7序列的终止密码子突变为TAA。
除将在EU索引位置220(SEQ ID NO：6的氨基酸残基24)半胱氨酸残基用丝氨酸残基替代之外，Fc8和在SEQ ID NO：6中所示的野生型免疫球蛋白γ1区完全一样。该突变去除了通常与免疫球蛋白轻链恒定区以二硫键结合的半胱氨酸残基。
表1叙述了实例TACI-Fc构建体。
表1
实例TACI-Fc融合蛋白质构建体
 
TACI序列a Fc版本
TACIb Fc4
TACIb Fc5
TACIb Fcγ1
TACI(d107-154) Fc5
TACI(R119Q) Fc4
TACI(1-104)-BCMA(42-54)c Fc5
TACI(d143-150) Fc5
TACI(R142G，d143-150) Fc5
TACI(R119G，Q121P，R122Q，S123A) Fc5
TACI(R119G，R122Q) Fc5
TACI(d1-28，V29M) Fc6
TACI(d1-29) Fc6
TACI(d1-29) Fc5
TACI(d1-29，d107-154) Fc5
TACI(d1-29，d111-154) Fc5
TACI(d1-29，d120-154) Fc5
a在括号内提供了参考SEQ ID NO：2氨基酸序列的、关于氨基酸序列的位置、突变和缺失信息。
b包括SEQ ID NO：2氨基酸残基1到154。
c该构建体包括SEQ ID NO：2(TACI)氨基酸残基l到104和SEQ ID NO：27(BCMA)氨基酸42到54。
用重组的中国仓鼠卵巢细胞生产TACI-Fc蛋白质，采用免疫印记分析和氨基酸序列分析分离并分析。意想不到的是，从N末端缺失前29个氨基酸的TACI多肽导致在中国仓鼠卵巢细胞的TACI-Fc融合蛋白质生产中增长10倍。该缺失也减少了全长柄区的切割。此外，在TACI柄区内的切割，通过截短柄区或者通过在另一个氨基酸序列(例如：BCMA柄区的氨基酸序列)内替换TACI的柄区而得到抑制。
如实施例4所述，TACI-Fc构建体的功能分析表明，融合蛋白质TACI(d1-29)-Fc5、TACI(d1-29、d107-154)-Fc5、TACI(d1-29、d111-154)-Fc5和TACI(d1-29、d120-154)-Fc5对于ZTNF4具有相似结合亲和力。但是，构建体TACI(d1-29)-Fc5、TACI(d1-29、d111-154)-Fc5和TACI(d1-29、d120-154)-Fc5与构建体TACI(d1-29、d107-154)-Fc5相比，每摩尔TACI-Fc对ZTNF4表现出更高的结合性。根据目的应用(即：治疗、诊断或研究)，可以使用高能或者低能的TACI-Fc融合蛋白质。此外，高能和低能TACI-Fc融合蛋白质的组合使ZTNF2或ZTNF4的滴定成为可能。
本发明预期包含由SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到106、SEQ IDNO：2的30到110、SEQ ID NO：2的30到119或者SEQ ID NO：2的30到154组成的TACI受体部分的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质。本发明也包括包含由SEQ ID NO：2的氨基酸残基31到106、SEQ ID NO：2的31到110、SEQ ID NO：2的31到119或者SEQ ID NO：2的31到154组成的TACI受体部分的TACI-免疫球蛋白融合蛋白质。
更一般地说，本发明包括TACI-免疫球蛋白融合蛋白质，其中TACI受体部分由SEQ ID NO：2氨基酸残基30到154的片段组成，并且其中TACI受体部分至少与ZTNF2或ZTNF4之一结合。上述片段包含富含半胱氨酸的假性重复区，以及任选地至少能够包括以下之一：存在于富含半胱氨酸的假性重复区的氨基端的位置上的N末端片段，和存在于富含半胱氨酸的假性重复区的羧基端位置上的柄片段。适合的富含半胱氨酸的假性重复区包括多肽：(a)至少包含SEQ ID NO：2氨基酸残基34到66和SEQ ID NO：2氨基酸残基71到104之一，(b)包含SEQID NO：2氨基酸残基34到66和SEQ ID NO：2氨基酸残基71到104二者，或者(c)包含SEQ ID NO：2氨基酸残基34到104。
适合的N末端片段包括SEQ ID NO：2的下述部分：氨基酸残基33、氨基酸残基32到33、氨基酸残基31到33以及氨基酸残基30到33。适合的柄片段包括SEQ ID NO：2氨基酸残基105到154的一个或多个氨基酸。例如，柄片段可以由SEQ ID NO：2的下述部分组成：氨基酸残基105、氨基酸残基105到106、氨基酸残基105到107、氨基酸残基105到108、氨基酸残基105到109、氨基酸残基105到110、氨基酸残基105到111、氨基酸残基105到112、氨基酸残基105到113、氨基酸残基105到114、氨基酸残基105到115、氨基酸残基105到116、氨基酸残基105到117、氨基酸残基105到118、氨基酸残基105到119、氨基酸残基105到120、氨基酸残基105到121、氨基酸残基105到122、氨基酸残基105到123、氨基酸残基105到124、氨基酸残基105到125、氨基酸残基105到126、氨基酸残基105到127、氨基酸残基105到128、氨基酸残基105到129、氨基酸残基105到130、氨基酸残基105到131、氨基酸残基105到132、氨基酸残基105到133、氨基酸残基105到134、氨基酸残基105到135、氨基酸残基105到136、氨基酸残基105到137、氨基酸残基105到138、氨基酸残基105到139、氨基酸残基105到140、氨基酸残基105到141、氨基酸残基105到142、氨基酸残基105到143、氨基酸残基105到144、氨基酸残基105到145、氨基酸残基105到146、氨基酸残基105到147、氨基酸残基105到148、氨基酸残基105到149、氨基酸残基105到150、氨基酸残基105到151、氨基酸残基105到152、氨基酸残基105到153和氨基酸残基105到154。
额外的适合的柄片段包括BCMA柄区的一个或多个氨基酸(即：SEQID NO：27的氨基酸残基42到54)。例如：柄片段可以由以SEQ ID NO：27的下述部分组成：氨基酸残基42、氨基酸残基42到43、氨基酸残基42到44、氨基酸残基42到45、氨基酸残基42到46、氨基酸残基42到47、氨基酸残基42到48、氨基酸残基42到49、氨基酸残基42到50、氨基酸残基42到51、氨基酸残基42到52、氨基酸残基42到53和氨基酸残基42到54。
更一般地说，柄片段可以由二到50个氨基酸残基组成。
本文中所述的融合蛋白质的免疫球蛋白部分包含至少一个免疫球蛋白恒定区。优选地是，免疫球蛋白部分代表人免疫球蛋白的片段。人免疫球蛋白序列可以是野生型的氨基酸序列，或者是具有至少上面讨论过的氨基酸突变之一的经修饰野生型氨基酸序列。
人免疫球蛋白氨基酸序列也可以具有一个或多个已知同种异型决定簇的特征性的突变而与野生型不同。表2显示人的I gGγ1恒定区的同种异型决定簇(Putman，The Plasma Proteins，Vol.V，第49到140页(Academic Press，Inc.1987))。EU索引位置214、356、358和431定义了已知的I gGγ1同种异型体。位置214在I gGγ1恒定区的CH1结构域中，因此，不存在于Fc序列内。SEQ ID NO：6的野生型Fc序列包括Glm(1)和Glm(2-)同种异型体。但是，可以将TACI-Fc蛋白质的Fc部分修饰以反映这些同种异型体的任何组合。
表2
人免疫球蛋白γ1恒定区同种异型决定簇
本文公开的TACI-Fc蛋白质的实例包含人IgG1恒定区。但是，适合的免疫球蛋白部分也包括包含至少一个恒定区的多肽，如来自下述任何免疫球蛋白的重链恒定区：IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。较更有利地，与野生型IgG1或野生型IgG3相比，从野生型IgG2或野生型IgG4衍生的免疫球蛋白部分提供降低了的效应子功能。如上所述本发明还预期包含TACI受体部分以及为白蛋白或-β2巨球蛋白的融合蛋白质。
另一类与ZTNF2或ZTNF4结合的受体融合蛋白质是BCMA-免疫球蛋白融合蛋白质。已经用BCMA-Fc4融合蛋白质进行了研究，其中BCMA部分由SEQ ID NO：27的氨基酸残基1到48组成。意想不到的是，用鼠进行的药物动力学研究揭示，BCMA-Fc4融合蛋白质具有大约101小时的半衰期，然而，TACI-Fc蛋白质有25小时的半衰期。因此，BCMA-免疫球蛋白融合蛋白质的药物应用在一定的临床背景下可能更优选。此外，TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白质的组合对于一定的治疗情况可能有利。该组合治疗可以通过TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白质的给药，或通过TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白质的异源二聚体的给药来实现。
另一类的结合ZTNF4的受体融合蛋白质是包含被称为“Ztnfr12”的受体胞外结构域的免疫球蛋白融合蛋白质。Ztnfr12氨基酸和核苷酸序列分别以SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60被提供。适合的Ztnfr12受体部分包括包含SEQ ID NO：60氨基酸残基1到69或者SEQ ID NO：60氨基酸残基19到35的多肽。
本发明的融合蛋白质可以有单链多肽、二聚体、三聚体、或二聚体或三聚体的复合物的形式。二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体，同时三聚体可以是同源三聚体或异源三聚体。异源二聚体的实例包括TACI-免疫球蛋白多肽和BCMA-免疫球蛋白多肽、TACI-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽、以及BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽。异源三聚体的实例包括TACI-免疫球蛋白多肽和两个BCMA-免疫球蛋白多肽、TACI-免疫球蛋白多肽和两个Ztnfr12-免疫球蛋白多肽、BCMA-免疫球蛋白多肽和两个Ztnfr12-免疫球蛋白多肽、两个TACI-免疫球蛋白多肽和BCMA-免疫球蛋白多肽、两个TACI-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽、两个BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽、以及TACI-免疫球蛋白多肽、BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽的三聚体。
在上述融合蛋白质中，TACI受体部分可以至少包含SEQ ID NO：2的下述氨基酸序列之一：氨基酸残基30到154、氨基酸残基34到66、氨基酸残基71到104、氨基酸残基47到62以及氨基酸残基86到100。BCMA受体部分可以至少包含SEQ ID NO：27的下述氨基酸序列之一：氨基酸残基1到48、氨基酸残基8到41、以及氨基酸残基21到37。Ztnfr12受体部分可以至少包含SEQ ID NO：60的下述氨基酸序列之一：氨基酸残基1到69、以及氨基酸残基19到35。
融合蛋白质可以使用在实施例中所述的用来构建实例TACI-Fc分子的PCR方法来生产。但是，本领域的技术人员可以应用其他标准的方法。例如，编码TACI、BCMA、Ztnfr12或免疫球蛋白多肽的核酸分子可以通过使用根据本文中公开的序列而得到的多核苷酸探针筛选人cDNA或基因组文库来获得。这些技术是标准的和非常完备地建立的(参阅：例如，Ausubel等人(eds.)，Short Protocols in MolecularBiology，第3版，第4-1到4-6页(John Wiley和Sons1995)(“Ausubel(1995)”)；Wu等人，Methods in Gene Biotechnology，第33-41页(CRC Press，Inc.1997)(“Wu(1997)”)；Ausubel(1995)见第5-1到5-6页；Wu(1997)见第307-327页))。
另外，用于构建免疫球蛋白融合蛋白质的分子可以通过用突变引发的长寡核苷酸和本文所述的核苷酸序列合成核酸分子来获得。(参阅：例如，Ausubel(1995)见第8-8到8-9页)。应用聚合酶链反应的成熟工艺提供了可合成长度至少二千碱基DNA分子的能力(Adang等人，PlanttMolec.Biol.21：1131(1993)，Bambot等人，PCRMethodsand Applications2：266(1993)，Dillon等人，“Use of thePolymerase Chain Reaction for the Rapid Construction ofSynthetic Genes，”in Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，第263-268页，(Humana Press，Inc.1993)，和Holowachuk等人，PCR Methods Appl.4：299(1995))。
本发明的核酸分子也可以用“基因机”以诸如亚磷酰胺方法之类的方案合成。如果需要化学合成双链DNA，例如对于基因或基因片段合成之类的应用，那么分别合成各互补链。短基因(60到80个碱基对)的生产在技术上是简单的，它可以用在合成互补链之后对其退火来完成。但是，对于较长的基因(大于300碱基对)的生产，可能需要特殊的策略，因为，在化学DNA合成时每个周期的偶联效率很少为100％。为了克服该问题，用长度20到100个核苷酸的单链片段以模块的形式装配成合成的基因(双链的)。关于多核苷酸合成的综述，参阅，例如，Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press1994)，Itakura等人，Annu.Rev.Biochem.53：323(1984)，和Climie等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA87：633(1990)。
4.TACI-免疫球蛋白多肽的生产
本发明的多肽可以通过按照传统的技术在重组的宿主细胞中生产。对于表达编码TACI-免疫球蛋白的序列，编码多肽的核酸分子必须与在表达载体中控制转录表达的调节序列切实可操作地连接，之后引入到宿主细胞中。除转录的调节序列(如启动子和增强子)之外，表达载体可以包括翻译调节序列和适于筛选带有表达载体的细胞的标记基因。
适合在真核细胞中生产外源蛋白的表达载体一般含有(1)编码细菌复制起始点的和在细菌宿主中为表达载体的生长和选择提供的抗生素抗性标记的原核DNA元件；(2)控制转录起始的真核DNA元件，如启动子；和(3)控制转录物加工的DNA元件，如转录终止/聚腺苷酸化序列。
表达载体也可以包括编码指导异源多肽进入到宿主细胞的分泌途径的分泌序列的核苷酸序列。例如，表达载体可以包含编码TACI免疫球蛋白的核苷酸序列和由从任何分泌型基因中得到的分泌序列。如上面讨论的，一种适合的信号序列是tPA信号序列。典型的信号序列由SEQ ID NO：25提供。另一个适合的信号序列是鼠26-10VH信号序列。例如Near等人，Mol.Immunol.27：901(1990)叙述了鼠26-10抗体。说明性的鼠26-10VH信号序列的氨基酸和核苷酸序列分别由SEQ IDNO：61和SEQ ID NO：65提供。SEQ ID NO：62公开了包含鼠26-10VH信号序列的TACI-Fc5融合蛋白质的氨基酸序列。
本发明的TACI-免疫球蛋白蛋白质可以在哺乳动物细胞中表达。适合的哺乳动物宿主细胞的实施例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCCCRL1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL8544，ATCC CRL10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chas in等人，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、海拉S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL1650)和鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL1658)。
对于哺乳动物宿主，转录和翻译调节信号可以从病毒来源得到，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒，等等，其中调节信号与高水平表达的特定基因相关。适合的转录和翻译调节序列也可以从哺乳动物的基因获得，如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。
转录调节序列包括一个足够指导RNA合成启始的启动子区。适合的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等人，j.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))、疱疹病毒TK启动子(McKnight，Cell31：355(1982))、SV40早期启动子(Benoist等人，Nature290：304(1981))、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子(Gorman等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA79：6777(1982))、巨细胞病毒启动子(Foecking等人，Gene45：101(1980))、以及小鼠乳癌病毒启动子(一般参阅：Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins in MammalianCell Culture，”载于Protein Engineering：Principles andPractice，Cleland等人(eds.)，第163-181页(John Wiley和Sons，Inc.1996))。一种实用的启动子和增强子的组合由骨髓增殖肉瘤病毒启动子和人巨细胞病毒增强子提供。
另一方面，如果，用真核启动子调节原核启动子，则原核启动子，如噬菌体T3RNA聚合酶启动子，可以用于控制哺乳动物细胞内TACI-免疫球蛋白蛋白质的生产(Zhou等人，Mol.Cell.Biol.10：4529(1990)，以及Kaufman等人，Nucl.AcidsRes.19：4485(1991))。
可以用包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的传递、电穿孔等等在内的多种标准技术，将表达载体引入到宿主细胞内。可以将转染过的细胞进行选择并且繁殖，以提供含有在宿主细胞基因组中稳定整合的表达载体的重组宿主细胞。用于将载体引入到真核细胞的技术和采用显性选择标记以选择上述稳定转化体的技术已有叙述，例如，Ausubel(1995)和Murray(ed.)，Gene Transfer andExpression Protocols(Humana Press1991)。
例如，一种适合的选择标记是提供抗生素新霉素抗药性的基因。这种情况下，在新霉素类药物，如G-418或其同类存在的情况下进行选择。选择系统也可以用于提高目的基因的表达水平，即被称为“扩增”的过程。扩增是在低水平的选择剂存在的情况下以培养转染子(transfectant)来进行的，接下来，增加选择剂的量以选择高水平生产的所引入的基因的产品的细胞。适合的可扩增可选择标记是提供氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶。也可以使用其他药物的抗性基因(例如：潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。或者，将像绿荧光蛋白质之类的改变表型的标记或者像CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶之类的细胞表面蛋白质，可以通过用例如FACS分类术或磁性小珠分离技术之类的方法，从未转染的细胞中分离转染的细胞。
TACI-免疫球蛋白多肽也可以用病毒传递系统通过培养哺乳动物细胞来生产。用于此目的的代表性的病毒包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺伴随病毒(AVV)。腺病毒，一种双链DNA病毒，是目前研究最多的用于异源核酸传递的基因转导载体(关于综述，参阅Becker等人，Meth.Cell Biol.43：161(1994)，以及Douglas和Curiel，Science & Medicine4：44(1997))。腺病毒系统的优点包括，能够容纳相对较大的DNA的插入、以高滴度生长的能力、转染较大范围的哺乳动物细胞类型的能力、以及允许使用大量可以得到的含有不同启动子的载体的灵活性。
通过删除部分腺病毒基因组，可以接纳较大的异源DNA的插入(大于7kb)。可以用直接连接反应或通过与共转染的质粒一起同源重组将该插入物整合到病毒DNA中。一种选择是从病毒载体中删除必须的E1基因，这将导致除非由宿主细胞提供E1基因，否则不能复制。例如，腺病毒载体传染的人293细胞(ATCC Nos.CRL-1573，45504，45505)可以作为贴壁细胞或以相对高的细胞密度在悬浮培养基中生长，以生产显著量的蛋白质(参阅Garnier等人，Cytotechnol.15：145(1994))。
本领域的技术人员可以设计适合的表达载体来用哺乳动物细胞生产本文所述的融合蛋白质。实施例4叙述了一种表达载体的特性。作为另一个实例，表达载体可以包含双顺反子表达盒，其包括人巨细胞病毒增强子的一部分、骨髓增殖肉瘤病毒的启动子、编码融合蛋白质的核苷酸序列、脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入位点、编码鼠二氢叶酸还原酶的核苷酸序列、再加上SV40聚腺苷酸添加序列。SEQ ID NO：69的核苷酸序列显示了一种巨细胞病毒增强子/骨髓增殖肉瘤病毒LTR启动子构建体，其中巨细胞病毒增强子从核苷酸1延伸到407。缺少负控制区的骨髓增殖肉瘤病毒LTR启动子从SEQ ID NO：69的核苷酸408延伸到核苷酸884。没有负控制区的骨髓增殖肉瘤病毒LTR启动子的核苷酸序列在SEQ ID NO：70中提供。
实施例1叙述了一种表达载体，它包含指导重组蛋白质的转基因表达的巨细胞病毒启动子、免疫球蛋白内含子和组织纤溶酶原激活蛋白的信号序列。一种合适的免疫球蛋白内含子是鼠26-10VH内含子。SEQ ID NO：66提供了鼠26-10VH内含子的示例核苷酸序列。表达载体也可以包括位于编码TACI-免疫球蛋白蛋白质的核苷酸序列上游的5’未翻译区(UTR)。适合的5’-UTR可以从鼠26-10VH基因中得到。SEQ ID NO：63公开了有用的天然鼠26-10VH的5’-UTR核苷酸序列，而SEQ ID NO：64显示鼠26-10VH5’-UTR核苷酸序列时，它已经在3’末端被得到最优化。
作为实例，SEQ ID NO：67提供了包括下述元件的核苷酸序列：天然鼠26-10VH5’-UTR(核苷酸1到51)、鼠26-10VH信号序列(核苷酸52到97和182到192)、鼠26-10VH内含子(核苷酸98到181)、编码TACI部分的核苷酸序列(核苷酸193到435)、以及编码Fc5部分的核苷酸序列(核苷酸436到1131)。由于用最优化的鼠26-10VH5’-UTR(核苷酸1到51)对天然序列的替换，核苷酸序列SEQ ID NO：68与SEQ ID NO：67不同。
TACI-免疫球蛋白蛋白质也可以在其它较高等的真核细胞，例如鸟类的、真菌的、昆虫、酵母或植物细胞中表达。杆状病毒系统提供了一种向昆虫细胞中引入克隆的基因的有效方法。适合的表达载体以苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)为基础，并且含有熟知的启动子，例如，果蝇热休克蛋白(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒立即早期基因启动子(ie-1)和晚早期39K启动子、杆状病毒p10启动子、和果蝇金属硫蛋白启动子。制备重组杆状病毒的第二种方法使用Luckow所述的基于转座子的系统(Luckow等人，J.Virol.67：4566(1993))。使用转移载体的该系统，以BAC-to-BAC试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)销售。该系统使用一种转移载体PFASTBAC(Life Technologies)，它含有Tn7转座子，以将编码TACI-免疫球蛋白多肽的DNA转移到大肠杆菌(E.Coli)中作为被称为“杆粒(bacmid)”的较大质粒而维持的杆状病毒的基因组中。参阅，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning等人，Gen.Virol.75：1551(1994)，以及Chazenbalk和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。此外，转移载体可以在表达的TACI-免疫球蛋白多肽的C-或N-末端包括与编码表位标签的DNA以符合读框的方式融合，该表位例如Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer等人，Proc.Nat’lAcadSci.82：7952(1985))。采用本领域已知的技术，将含有编码TACI-免疫球蛋白蛋白质核苷酸序列的转移载体转化到大肠杆菌中，并且筛选含有标志重组杆状病毒的间断的lacZ基因的杆粒。然后将含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA用普通技术分离。
实例PFASTBAC载体可以在相当大的程度上修饰。例如，可以将多角体蛋白启动子去除，用杆状病毒的碱性蛋白质启动子(也被称为Pcor，p6.9或MP启动子)替换，它在杆状病毒感染的早期表达，并且已经显示出比表达分泌型蛋白质有利(参阅，例如，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning等人，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，以及Chazenbalk和Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995))。在上述转移载体的构建体中，可以使用短的或长的碱性蛋白质启动子。此外，转移载体可以用从昆虫蛋白质中得到的分泌信号序列来构建。例如，来自蜕皮甾类葡糖基转移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen：San Diego，CA)的分泌信号序列可以在上述构建体中使用。
将重组病毒或杆粒用于转染宿主细胞。适合的昆虫宿主细胞包括从IPLB-Sf-21得到的细胞系，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)蛹卵巢细胞系，如Sf9(ATCC CRL1711)、Sf21AE和Sf21(InvitrogenCorporation；San Diego，CA)、以及果蝇(Drosophila)施奈德-2(Schneider-2)细胞、和从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中得到的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)(美国专利No.5,300,435)。可以将市场上能够得到的无血清培养基用于细胞的生长和维持。对于Sf9细胞，适合的培养基是Sf900IITM(Life Technologies)或ESF921TM(Expression Systems)；而对于粉纹夜蛾细胞，是Ex-cell0405TM(JRHBiosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(Life Technologies)。在使用重组病毒时，细胞一般从大概2-5×105细胞的接种密度生长到1-2×106细胞的密度，这时，以0.1到10的感染复数加入重组病毒的母株，更一般地，感染复数接近3。
在杆状病毒系统中生产重组蛋白质的成熟工艺由Bailey等人提供，可参阅：Bailey等人，“Manipulation of BaculovirusVectors，”载于Methods in Molecular Biology，卷7：Gene Transferand ExpressionProtocols，Murray(编辑)第147-168页(The HumanaPress，Inc.1991)，Patel等人，“The baculovirus expressionsystem，”载于DNA Cloning2：Expressionsystm，第2版，Glover等人(编辑)，第205-244页(Oxford University Press1995)，Ausubel(1995)第16-37到16-57页，Richardson(编辑)，Baculovirus Expression Protocols，(The Humana Press，Inc.1995)，以及Lucknow，“Insect Cell Expression Technology，”载于Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(编辑)，第183-218页(John Wiley & Sons，Inc.1996)。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以用于表达本文所述的基因。在这方面有特殊意义的酵母种类包括啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和Pichiamethanolica。对于酵母的表达适合的启动子包括从GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(醇脱氢酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)中得到的启动子。许多酵母克隆载体已经被设计出来并且很容易得到。载体可以被设计成生成使用在酵母中进行同源重组所需要的元件的构建体(参阅，例如，Raymond等人，BioTechniques26：134(1999))。例如，这样的表达载体可以包括对于在啤酒糖酵母中进行选择和复制所需要的URA3和CEN-ARS(自主复制序列)序列。其它适合的载体包括基于YIp-载体，如YIp5，YRp载体，如YRp17，YEp载体，如YEp13以及YCp载体，如YCp19。用外源DNA转化啤酒糖酵母细胞和用这些细胞生产重组多肽的方法已经被公开，例如，Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kawasaki等人，美国专利No.4,931,373；Brake，美国专利No.4,870,008；Welch等人，美国专利No.5,037,743；以及Murray等人，美国专利No.4,845,075。通过由可选择的标记决定的表型、普通的药物抗性或在缺少特定营养(例如：亮氨酸)的情况下生长的能力来筛选转化的细胞。适合在啤酒糖酵母中使用的载体系统是由Kawasaki等人(美国专利No.4,931,373)公开的POT1载体系统，它允许通过转化的细胞能够在含葡萄糖的培养基中生长来筛选转化的细胞。其他的适合用于酵母中的启动子和终止子，包括从糖酵解酶基因(参阅，如Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kingsman等人，美国专利No.4,615,974和Bitter，美国专利No.4,977,092)和醇脱氢酶基因(亦参阅美国专利No.4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454)中得到的那些。
本领域已知用于其它酵母的转化系统，酵母包括多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤氏酵母、Pichia methanolica、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichiaguillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)。参阅，例如，Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)和Cregg，美国专利No.4,882,279。根据McKnight等人在美国专利No.4,935,349所述的方法，可以使用曲霉属(Aspergillus)细胞。Sumino等人在美国专利No.5,162,228公开了转化Acremoniumchrysogenum的方法。Lambowitz在美国专利No.4,486,533公开了转化链孢霉属(Neurospora)的方法。
例如，在重组蛋白质的生产中作为宿主而使用Pichiamethanolica已经被Raymond公开，对此可参阅美国专利No.5,716,808，Raymond，美国专利No.5,736,383，Raymond等人，Yeast14：11-13(1998)，以及国际专利申请Nos.WO97/17450、WO97/17451、WO98/02536和WO98/02565。转化P.methanolica所用的DNA分子通常将以双链、环状质粒制备，在转化前最好将其线性化。对于用P.methanolica生产多肽，质粒中的启动子和终止子可以是P.methanolica基因的，如P.methanolica醇利用基因(AUG1或AUG2)。其它有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的那些。为方便DNA整合入宿主染色体，最好使质粒的整个表达片段在两端都被宿主DNA序列所包围。在Pichia methanolica中使用的可选择的适合标记是P.methanolicaADE2基因，它编码5-氨基咪唑核甘酸羧化酶(AIRC；EC4.1.1.21)，并且允许ade2宿主细胞在缺少腺嘌呤的情况下生长。对于希望最少量地使用甲醇的大量工业生产，宿主细胞可以在缺失两个甲醇利用基因(AUG1或AUG2)的情况下被应用。对于分泌型蛋白质的生产，宿主细胞可以在液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)上有缺陷。应用电穿孔，以便于将含有编码目的多肽的DNA的质粒引入到P.methanolica细胞。可以用指数式衰减的脉冲电场通过电穿孔转化P.methanolica细胞，其场强为2.5到4.5kV/cm，优选为大约3.75kV/cm，同时时间常数(t)为1到40毫秒，最优选为大约20毫秒。
也可以将表达载体引入到植物原生质体、完整的植物组织或分离的植物细胞中。将表达载体引入到植物组织中的方法包括直接转染或植物组织与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共同培养、微粒介导的传递、DNA注射、电穿孔等等。参阅，例如，Horsch等人，Science227：1229(1985)，Klein等人，Biotechnology10：268(1992)，以及Miki等人，“Procedures for Introducing ForeignDNA into Plants”载于Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick等人(编辑)，第67-88页(CRC Press，1993)。
另一方面，TACI-免疫球蛋白蛋白质可以在原核宿主细胞中生产。可以用于在原核宿主中生产TACI-免疫球蛋白多肽的合适的启动子为本领域中的技术人员所熟知，包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、噬菌体λ的PR和PL启动子、大肠杆菌的trp、recA、热休克、lacUV5tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的启动子、芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体的启动子、链霉菌属(streptomyces)启动子、噬菌体λ的int启动子、pBR322的bla启动子和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。对于原生启动子已有综述，可参阅Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson等人，Molecular Biology of the Gene，第4版(Benjamin Cummins1987)，以及Ausubel等人(1995)。
适合的原核宿主包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。适合的大肠杆菌菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF’、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(参阅，例如，Brown(编辑)，MolecularBiologyLabfax(Academic Press1991))。适合的枯草芽孢杆菌菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(参阅，例如，Hardy，“Bacillus CloningMethods，”载于DNACloning：APractical Approach，Glover(编辑)(IRL Press1985))。
在细菌，如大肠杆菌中表达TACI-免疫球蛋白蛋白质时，多肽可以被保留在胞质中，一般作为不可溶的颗粒，或者可以被细菌分泌序列引导进入壁膜间隙。在前一种情况下，细胞被裂解，并且颗粒回收并用例如异硫氢酸胍或脲变性。然后，变性的多肽可以通过稀释的变性剂被重新折叠和二聚化，例如用脲溶液和还原的及被氧化的谷胱甘肽组合溶液透析，接着用缓冲的盐溶液透析。在后一种情况下，通过破裂细胞(例如：超声处理或渗透震扰)的方法，可以将多肽以溶解的并且具有功能的形式从壁膜间隙回收，以释放壁膜间隙的内容物并回收蛋白质，从而排除了变性和重新折叠的必要。
用原核宿主表达蛋白质的方法为本领域的技术人员熟知(参阅，例如，Williams等人，“Expression of foreign proteins in E.coliusing plasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies，”载于DNA Cloning2：Expression Systems，第2版，Glover等人(编辑)第15页(Oxford University Press1995)，Ward等人，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，”载于Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，第137页(Wiley-Liss，Inc.1995)以及Georgiou，Expression of ProteinsinBacteria，”载于Protein Engineering：Principles andPractice，Cleland等人(编辑)，第101页(John Wiley&Sons，Inc.1996))。
人们已经提供了将表达载体引入到细菌、酵母、昆虫和植物细胞的标准方法，例如，Ausubel(1995)。
人们已经提供了用哺乳动物细胞系统生产表达和回收外源蛋白质的一般方法，例如：Etcheverry，Expression of Engineered Proteinsin Mammalian Cell Culture，”载于Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(编辑)，第163页(Wiley-Li ss，Inc.1996)。人们已经提供了回收用细菌系统生产的蛋白质的标准工艺，例如：Grisshammer等人，“Purification ofover-produced proteins fromE.coli cells，”载于DNA Cloning2：Expression Systems，第2版，Glover等人(编辑)第59-92页(Oxford University Press1995)。对于分离从杆状病毒系统分离重组蛋白质的成熟方法的叙述可参阅Richardson(编辑)，BaculovirusExpression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)。
或者，本发明的多肽可以通过下述方法合成，例如：完全固相合成、部分固相的方法、片段缩合或传统溶液合成。这些合成方法为本领域的技术人员熟知(参阅，例如：Merrifi eld，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart等人，“Solid Phase Peptide Synthesis”(第2版)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton等人，Solid Phase PeptideSynthesis：APractical Approach(IRL Press1989)，Fields和Colowick，“Solid-Phase Peptide Synthesis，”Methods inEnzymology Volume289(Academic Press1997)，以及Lloyd-Williams等人，Chemical Approachs to the Synthesis ofPeptide and Proteins(CRC Press，Inc.1997))。在全部化学合成策略中的变异，如“天然化学连接反应”和“表达蛋白质连接反应”也是标准的(参阅，例如：Dawson等人，Science266：776(1994)，Hackeng等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95：6705(1998)，以及Severinov和Muir，J.Biol.Chem.273：16205(1998))。
5.TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的鉴定
可以用多种方法评定融合蛋白质结合ZTNF4或ZTNF2的能力，从而检测TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的功能。作为实例，实施例4提供了测定ZTNF4结合亲和力和结合能力的方法。
或者，如Gross等人在国际专利申请No.WO00/40716中所述的，TACI-免疫球蛋白融合蛋白质可以用抑制由可溶ZTNF4对人B细胞的激活的能力而表征。简单地说，根据制造商的说明书，使用CD19磁珠和VarioMacs磁性分离系统(Miltenyi Biotec Auburn，CA)，将人B细胞从外周血单核细胞中分离。将B细胞与可溶的ZTNF4(25ng/ml)和重组的人IL-4(10ng/ml Pharmingen)混合，将该细胞以每个孔1×105细胞数铺到圆底96孔板上。
可以将可溶的TACI-免疫球蛋白蛋白质从大约5μg/ml稀释到大约6ng/ml，然后与B细胞一起孵育五天，在第四天对每孔用1μCi3H-胸苷脉冲过夜。作为对照，在没有ZTNF4的情况下，也将TACI-免疫球蛋白蛋白质与B细胞和IL-4一起孵育。用Packard平板收获器将平板收获，并用Packard读数器计数。
这种通用方法被用于测定三种TACI-Fc融合蛋白质。虽然，所有融合蛋白质都抑制B细胞增殖，但是构建体TACI(d1-29，d111-154)-Fc5和TACI(d1-29，d120-154)-Fc5比TACI(d1-29，d107-154)-Fc5更有效。
已有成熟的动物模型可以用来体内测试在一定疾病状态下TACI-免疫球蛋白蛋白质的效率。例如，可以用TACI-免疫球蛋白蛋白质在一些自身免疫疾病的动物模型中进行测试，例如，作为SLE(系统性红斑狼疮)的模型的MRL-lpr/lpr或NZB × NZW F1鼠同类品系。上述动物模型为本领域已知(参阅，例如，Cohen和Miller(编辑)，Autoimmune Disease Models：AGuidebook(Academic Press，Inc.1994))。
新西兰黑鼠(NZB)和新西兰白鼠(NZW)之间杂交的后代发育成为十分类似人类的SLE的自发形式的SLE。后代鼠，称为NZBW，在一个月龄时开始产生针对T细胞的IgM自身抗体，至五到七个月龄抗DNA自身抗体是占优势的免疫球蛋白。多克隆B细胞的过度活化导致自身抗体的超量产生。该自身抗体，尤其是那些针对单链DNA的抗体的积累，与肾小球肾炎的发生相关，它在临床上的表现为蛋白尿、氮质血症以及因肾衰竭而死亡。
肾衰竭是导致受自发SLE影响的小鼠死亡的最主要原因，在NZBW品系中，该过程是慢性的和消除性的。该病在雌鼠中比在雄鼠中更急且重，平均存活时间与雄鼠的406天相比仅为245天。虽然在7到9个月龄时许多雌鼠将出现症状(蛋白尿)，但是一些雌鼠发生症状时可以更年轻或更老。在NZBW鼠中观察到的致命的免疫性肾炎与在人的SLE中观察到的肾小球肾炎相类似，使得该自发型鼠模型对于潜在的SLE治疗测试非常具有吸引力(Putterman和Naparstek，MurineModels of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus，”载于Autoimmune Disease Models：A Guidebook，第217-234页(AcademicPress，Inc.，1994)；Mohan等人，J.Immunol.154：1470(1995)；以及Daikh等人，J.Immunol.159：3104(1997))。
如Gross等人在国际专利申请No.WO00/40716中所述，当NZBW鼠中B细胞自身抗体的产生被认为是平均处于高水平时，可以将TACI-免疫球蛋白蛋白质向NZBW鼠给药，以监测其在5周时间内对B细胞的抑制效果。简单地说，可以将100只8周大的雌性(NZB × NZW)F1鼠分成六组，每组15只。治疗前，一个月一次监测鼠的尿蛋白，抽血作全血细胞计数和血清库。血清可以用来对自身抗体的存在进行筛查。因为蛋白尿是肾小球肾炎的标志征象，所以在研究过程中一直以一定的间隔用试纸监测尿蛋白水平。在鼠大约为5个月龄时可以开始治疗。在5周内一周三次，对鼠进行腹膜内注射仅有载体(磷酸缓冲盐水)或人TACI-免疫球蛋白(对照蛋白质)或TACI-免疫球蛋白蛋白质(例如：每次给药20到100μg测试蛋白质)。
在治疗期间采血两次，并且在治疗以后将至少采集两次。在治疗开始后每两周测定蛋白尿的尿试纸检测值和体重。在安乐死的时候，采集血、尿的试纸检测值和体重。将脾和胸腺分割以用于荧光活化的细胞的分类分析和组织学研究。也将颌下唾液腺、肠系膜淋巴结链、带胆囊的肝叶、盲肠和大肠、胃、小肠、胰腺、右肾、肾上腺、舌与气管和食管一起、心脏以及肺采集用于组织学研究。
实验变态反应性脑脊髓炎的鼠模型，已经用来作为研究免疫介导的疾病的机理和潜在治疗干预方法二者的工具。该模型类似人的多发性硬化，并且作为神经蛋白，如髓鞘碱性蛋白或蛋白脂质蛋白，对T细胞激活的结果而产生脱髓鞘作用。用抗原接种诱导CD4+、II型MHC-限制的T细胞(Th1)。在对于实验变态反应性脑脊髓炎的方案中的改变可以产生该模型的急性、慢性复发性或者被动转移的变体(Weinberg等人，J.Immunol.162：1818(1999)；Mijaba等人，Cell.Immunol.186：94(1999)；以及Glabinski，Meth.Enzym.288：182(1997))。
Gross等人在国际专利申请No.WO00/40716中叙述了一种方法，用以评价在与实验变态反应性脑脊髓炎相关的症状的改善中TACI-免疫球蛋白蛋白质的效果。简单地说，给25只雌性PL×SJLF1小鼠(12周龄)皮下注射配有完全弗氏佐剂的抗原(髓鞘蛋白脂质蛋白，PLP，残基139-151)125μg/鼠。将该鼠分为五组，每组五只鼠。在0和2天给与百日咳毒素的腹膜内注射。给这些组1x、10x或100x剂量的TACI-免疫球蛋白蛋白质，一组将仅接受载体，而另一组将不进行治疗。预防性治疗在0天开始，干预性治疗在7天或临床征象出现时开始进行。在大约10到14天疾病征象，体重下降和麻痹出现，并持续大约一周。每天通过称体重和给予与它们症状程度相应的临床评分来评价动物。实验变态反应性脑脊髓炎的临床征象在接种的10到14天内出现，并且持续大约一周。在研究的最后，用过量的气体对全部动物进行安乐死，之后尸检。采集脑和脊柱用于组织学研究或冷冻脑和脊柱用于mRNA分析。对体重和临床评分的数据以个体和分组绘出曲线。
在胶原蛋白诱导的关节炎模型中，小鼠患有慢性炎症性关节炎，它非常类似人的类风湿关节炎。因为胶原蛋白诱导的关节炎与类风湿关节炎共有相似的免疫学和病理学特性，这使得它对于筛选潜在的人抗炎症化合物是理想的模型。在应用胶原蛋白诱导的关节炎模型中的另一个优点是，其病理机理已知。在I I型胶原上的T和B细胞表位已经确定，同时，多种与免疫介导的关节炎的免疫学(迟发型过敏反应和抗胶原蛋白抗体)和炎症(细胞因子、趋化因子和基质降解酶)相关的参数已经确定，并且可以应用于评定模型中测试化合物的效果(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407(1999)；Williams等人，Immunol.89：9784(1992)；Myers等人，Life Sci.61：1861(1997)；以及Wang等人，Immunol.92：8955(1995))。
Gross等人在国际专利申请No.wO00/40716中叙述了一种方法，用以评价在与胶原蛋白诱导的关节炎相关症状的改善中TACI-免疫球蛋白蛋白质的效果。简单地说，将8周大雄性DBA/1J鼠(Jackson Labs)分组为5只/组，每隔三周地进行两次50到100μ1的1mg/ml的胶原蛋白(小鸡或牛来源)皮下注射。一组对照组不进行胶原蛋白注射。第一次注射配有完全弗氏佐剂，而第二次注射配有不完全弗氏佐剂。在第二次注射时或在第二次注射之前、或者在动物出现了二或更高的临床评分并持续至少24小时之后，将TACI-免疫球蛋白蛋白质预防性地给药。在第二次胶原蛋白注射之后，通常在2到3周内，动物开始出现关节炎的症状。例如，TACI-Fc、对照蛋白质、人IgFc、或磷酸缓冲盐水(载体)可以在第二次注射前7天(第7天)开始用于预防性的给药。蛋白质可以100μg给药，以200μl一周三次给药，并且连续4周。
在胶原蛋白诱导的关节炎模型中，用游标卡尺对每一个爪测量爪的厚度，并且对每一个爪给予临床评分，以评价疾病的程度。例如，临床评分为“0”表示正常鼠，评分为“1”表示1或多个趾有红肿，评分为“2”表示轻度爪部炎症，评分为“3”表示中度爪部炎症，评分为“4”表示严重爪部炎症。在患病一段的时间后，通常为7天之后，对动物施行安乐死。采集爪，进行组织学研究或mRNA分析。采集血清，进行免疫球蛋白和细胞因子测定。
重症肌无力是另一种自身免疫疾病，其鼠模型也可以得到。重症肌无力是涉及产生针对烟碱乙酰胆碱受体的自身抗体的神经肌肉传导疾病失调。该疾病是获得性的或遗传性的，有着包括活动后异常乏力和疲劳的临床特征。
重症肌无力的鼠模型已经被建立。(Christadoss等人，“Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis WhichMimics Human Myasthenia gravid Pathogenesis for ImmuneIntervention，”载于Immunobiology of Proteins and Peptides VIII，Atassi和Bixler(编辑)，第195-199页(1995))。实验性自身免疫性重症肌无力是抗体介导的疾病，其特征在于针对乙酰胆碱受体的抗体的存在。该抗体破坏受体导致有缺陷的神经肌肉电脉冲，引起肌肉乏力。在实验性自身免疫性重症肌无力模型中，用烟碱乙酰胆碱受体免疫鼠。在第二次免疫后数周重症肌无力的临床征象变得明显。评价实验性自身免疫性重症肌无力有若干方法，包括用放射免疫试验测定乙酰胆碱受体抗体的血清水平(Christadoss和Dauphinee，J.Immunol.136：2437(1986)；Lindstrom等人，Methods Enzymol.74：432(1981))、测定肌肉乙酰胆碱受体或肌电描记术(Coligan等人(编辑)，ProtocolsinImmunology.Vol.3，第15.8.1页(JohnWiley&Sons，1997))。
TACI-免疫球蛋白在实验性自身免疫性重症肌无力方面的效果可以通过对临床上正在进展重症肌无力期间的B6鼠中应用融合蛋白质来测定。例如，给100只B6鼠在0天和30天用配以完全弗氏佐剂的乙酰胆碱受体20μg进行免疫。用乙酰胆碱受体强化之后，大约40到60％的小鼠发生从中度(2级)到重度(3级)临床重症肌无力。将患有2级和3级临床疾病的鼠分为三组(有着相等的乏力级别)，之后称重(乏力的鼠体重也减轻，因为它们在采食食物和水时有困难)和采血以获得血清(为得到治疗前抗乙酰胆碱受体抗体和同种型水平)。给A组1.P注射磷酸缓冲盐水，对B组腹膜内注射人IgG-Fc作为对照蛋白(100μg)，给C组用100μg TACI-Fc注射，一周三次持续四周。对鼠进行一周两次的在临床肌肉乏力方面的筛选，并且在治疗开始后15天和30天称重并采血以获得血清。在第15天采集全血，采用标记B220和CD5通过荧光活化细胞分选仪分析以测定T/B细胞之比。在治疗开始后30到45天将存活的鼠杀死，将其尸体冷冻，用于以后的肌肉乙酰胆碱受体提取，以测定肌肉乙酰胆碱受体的损失情况，这是重症肌无力的基本病理(参阅，例如，Coligan等人。(编辑)，Protocols in Immunology.Vol.3，第15.8.1页(John Wiley&Sons，1997))。
针对鼠肌肉乙酰胆碱受体的血清抗体可以通过确立的放射免疫试验法测定，同时抗乙酰胆碱受体的抗体同种型(IgM、IgG1、IgG2b和IgG2c)用ELISA检测。上述方法是已知的。测定TACI-免疫球蛋白对正在进展的临床重症肌无力、抗乙酰胆碱受体抗体和同种型水平、以及肌肉乙酰胆碱受体损失方面的效果。
可以将大约100只鼠在0天和30天用配以完全弗氏佐剂的乙酰胆碱受体20μg进行免疫。将患有临床重症肌无力的鼠分为四组。A组用100μg对照Fc进行腹膜内注射，B组用20μg对照Fc进行注射，C组用100μgTACI-Fc注射，以及D组用20μgTACI-Fc注射，一周三次持续四周。在治疗开始之前和治疗开始之后15天和30天，给鼠称重和采血以获得血清。如上面叙述的，测试血清中的抗乙酰胆碱受体抗体和同种型。也可以检测肌肉乙酰胆碱受体损失。
TACI-免疫球蛋白融合蛋白质的其它适合的测定，可以由本领域的技术人员确定。
6.TACI-免疫球蛋白缀合物的生产
本发明包括化学修饰的TACI-免疫球蛋白组合物，其中的TACI-免疫球蛋白多肽与聚合物相连接。一般该聚合物是水溶性的，因此在水性环境中，如生理环境中，TACI-免疫球蛋白缀合物不沉淀。适合的聚合物的实例是已经修饰过的具有单个反应基团的聚合物，例如用于酰化作用的活性酯、或用于烷化的醛。这样，聚合反应的程度可以被控制。活性醛的实例是聚乙二醇丙醛、或单-(C1-C10)烷氧基、或其芳氧基衍生物(参阅，例如，Harri s等人，美国专利No.5,252,714)。聚合物可以是支链或非支链。此外，聚合物的混合物可以用于生产TACI-免疫球蛋白的缀合物。
用于治疗的TACI-免疫球蛋白的缀合物可以含有制药上可接受的水溶性聚合物部分。适合的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、多-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、tresyl单甲氧基PEG、PEG丙醛、二琥珀酰碳酸酯PEG、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、右旋糖、纤维素、或其它以碳水化合物为基础的聚合物。适合的PEG具有的分子量可以从大约600到60,000，包括，例如：5,000、12,000、20,000和25,000。TACI-免疫球蛋白的缀合物也可以含有上述水溶性聚合物的混合物。
一个TACI-免疫球蛋白的缀合物的实例含有TACI-免疫球蛋白部分和附在TACI-免疫球蛋白N-末端的聚烷基氧化物部分。PEG是一种适合的聚烷基氧化物。作为实例，可以用PEG，即被称为“PEG化(PEGylation)”的过程来修饰TACI-免疫球蛋白。TACI-免疫球蛋白的PEG化可以采用本领域已知的任何一种PEG化反应进行(参阅，例如，欧洲专利EP 0 154 316，Delgado等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug CarrierSys tems9：249(1992)，Duncan和Spreafico，Clin.Pharmacokinet，27：290(1994)，以及Francis等人，IntJHematol 68：1(1998))。例如，PEG化可以用活性聚乙二醇分子通过酰化反应或烷基化反应进行。在另一种供选择的方法中，TACI-免疫球蛋白的缀合物用缩合活性的PEG来形成，其中PEG的末端羟基或氨基基团已经被活化的连接体所替换(参阅，例如，Karasiewicz等人，美国专利No.5,382,657)。
通过酰化来PEG化，一般需要将PEG的活化酯的衍生物与TACI-免疫球蛋白多肽反应。一个活化PEG酯的实例是以N-羟基琥珀酰亚胺酯化的PEG。如本文所使用的，术语“酰化反应”包括下列在TACI-免疫球蛋白和水溶性聚合物之间的连接类型：酰胺、氨基甲酸酯、聚氨酯等等。通过酰化来制备PEG化的TACI-免疫球蛋白的方法一般包含步骤(a)在一个或多个PEG基团附着在TACI-免疫球蛋白上的条件下将TACI-免疫球蛋白多肽与PEG(如：PEG醛衍生物的活性酯)反应，以及(b)获得反应产物。通常，对于酰化反应的最佳反应条件将根据已知的参数和期望的结果来确定。例如，PEG：TACI-免疫球蛋白的比越大，多PEG化的TACI-免疫球蛋白产物的百分比越大。
通过酰化得到的PEG化的产物一般是多PEG化的TACI-免疫球蛋白产物，其中赖氨酸ε-氨基基团借助于酰基连接基团被PEG化。连接键的实例是酰氨。一般，所得到的TACI-免疫球蛋白将至少95％被单、二或三PEG化，虽然根据反应条件可以生成具有PEG化程度较高的某些种类。采用标准提纯方法，例如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等等，可以将PEG化的种类从未缀合的TACI-免疫球蛋白多肽中分离。
通过烷基化进行PEG化一般包括，在还原剂的存在下，将PEG末端醛衍生物与TACI-免疫球蛋白反应。借助于-CH2-NH基团，PEG基团可以附着在多肽上。
借助于还原性烷基化作用来生产单PEG化的产物的衍化可以利用不同类型的伯氨基的不同活性来衍化。一般，在允许利用赖氨酸残基ε-氨基基团和蛋白质N末端残基α-氨基基团之间pKa差异的pH值下进行反应。通过上述选择性的衍化，含有像醛这样的活性基团的水溶性聚合物与蛋白质的附着是可控制的。与聚合物的缀合主要发生在蛋白质的N-末端，而没有对其他活性基团如赖氨酸侧链氨基基团的显著修饰。本发明提供了TACI-免疫球蛋白单聚合物缀合物的基本均一的制备物。
以还原性烷基化作用生产单聚合物TACI-免疫球蛋白缀合分子的基本均一的集合可以包含步骤(a)在还原性烷基化作用的条件下以选择性修饰TACI-免疫球蛋白氨基末端的α-氨基基团的适合的pH值，使TACI-免疫球蛋白多肽与活性PEG反应，和(b)获得反应产物。用于还原性烷基化作用的还原剂在水溶液中应该是稳定的，并且具有仅还原在还原性烷基化作用的起始过程中形成的希夫碱的能力。例证的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼烷二甲胺、硼烷三甲胺和硼烷砒啶。
对于TACI-免疫球蛋白单聚合物缀合物的基本均一的集合，还原性烷基化反应条件是使得水溶性聚合物部分与TACI-免疫球蛋白N-末端选择性地附着的条件。该反应条件通常根据赖氨酸氨基基团和在N-末端的α-氨基基团之间pKa差异而提供。pH值也影响所用得聚合物与蛋白质的比。一般说来，如果pH值较低，将希望聚合物对于蛋白质是更大量地过量，因为N-末端α-基团的活性越低，越需要较多的聚合物来实现最佳条件。如果pH值较高，聚合物：TACI-免疫球蛋白比则不需要这么大，因为有较多的活性基团可用而。一般，将pH值落在3到9或者3到6之间。
另一个要考虑的因素是水溶性聚合物的分子量。通常，聚合物的分子量越高，可以附着在蛋白质上的聚合物分子的数量越少。对于PEG化反应，一般的分子量是大约2kDa到大约100kDa、大约5kDa到大约50kDa或者大约12kDa到大约25kDa。通常水溶性聚合物对TACI-免疫球蛋白的摩尔比将在1∶1到100∶1。一般，水溶性聚合物对TACI-免疫球蛋白的摩尔比，对于多PEG化反应在1∶1到20∶1，而对于单PEG化反应则在1∶1到5∶1。
生产包含多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的通用方法在本领域是已知的。(可参阅，例如，Karasi ewicz等人，美国专利No.5,382,657，Greenwald等人，美国专利No.5,738,846，Nieforth等人，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)，Monkarsh等人，Anal.Biochem.247：434(1997))。
本发明设想的组合物包含本文所述的肽或多肽。上述组合物可以进一步包含载体。该载体可以是传统的有机或无机载体。载体的实例包括水、缓冲溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等等。
7.TACI-免疫球蛋白多肽的分离
就大分子污染而论，尤其就其它蛋白质和核酸以及不含传染性的和致热性的物质而论，本发明的多肽可以被提纯到至少大约80％纯度、至少大约90％纯度、至少大约95％纯度、或者大于95％纯度。本发明的多肽亦可以被提纯到药品纯的状态，即纯度大于99.9％。在某些制剂中，纯化的多肽基本上不含有其它多肽，尤其其它动物来源的多肽。
分级法和/或传统的纯化方法可以用于获得合成的TACI-免疫球蛋白多肽和从重组宿主细胞纯化的重组TACI-免疫球蛋白多肽的制剂。一般说来，硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取可以用于样品的分级。典型的纯化步骤可以包括羟磷灰石、大小排阻、FPLC和反相高效液相色谱。适合的层析介质包括衍生的右旋糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、专门的硅等等。PEI、DEAE、QAE和Q的衍生物是适合的。典型的层析介质包括用苯基、丁基或辛基基团衍生的，如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等等；或者聚丙烯酸树脂，如Amberchrom CG71(Toso Haas)等等。适合的固体支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联的琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联的聚丙烯酰胺树脂以及在其使用条件下不溶的类似物。该支持物可以用允许蛋白质以氨基基团、羧基基团、巯基基团、羟基基团和/或糖类部分附着的活性基团修饰。
偶联化学的实例包括溴化氰激活、N-羟基琥珀酰胺激活、环氧化物激活、巯基激活、酰肼激活、以及对于碳化二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。在本领域中，这些及其它固体介质是熟知并被广泛采用的，同时可以从商品供应商那里得到。多肽分离和纯化的特殊方法的选择是常规设计的问题，并且部分地由所选的支持物的特性来决定。可参阅，例如，Affinity Chromatography：Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology1988)，和Doonan，ProteinPurification Protocols(The Humana Press1996)。
在TACI-免疫球蛋白的分离和纯化中附加的变化可以被本领域的技术人员设计出来。例如，抗-TACI或抗-Fc抗体可以通过免疫亲和纯化用于分离大量的蛋白质。
本发明的多肽也可以通过特殊性质的利用来分离。例如，固定化的金属离子吸附层析可以用于纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些包含多组氨酸标记物的。简单地说，凝胶首先被用二价金属离子充满以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。富含组氨酸的蛋白质，将根据所用金属离子以不同亲和性，被吸附到该基质，之后，用竞争性洗脱、降低pH值、或者强螯合剂的使用，来将其洗脱。其他纯化方法包括，通过凝集素亲和层析、蛋白质A层析、以及离子交换层析进行糖基化蛋白质的纯化(M.Deutscher，(编辑)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。
如上所述，TACI-免疫球蛋白多肽或者其片段也可以通过化学合成来制备。TACI-免疫球蛋白多肽可以是单体或聚合物；糖基化的或非糖基化的；PEG化的或非PEG化的；并且可以包括或可以不包括起始的甲硫氨酸氨基酸残基。TACI-免疫球蛋白融合蛋白质可以是非糖基化的、糖基化的、或者仅在TACI部分或仅在免疫球蛋白部分糖基化的。免疫球蛋白部分可以从人抗体、嵌合抗体、或人源化的抗体获得。
8.TACI-免疫球蛋白多肽的治疗应用
通过结合ZTNF4或ZTNF2，TACI-免疫球蛋白蛋白质可以用于调节免疫系统，这样，阻止这些配体与内源TACI或BCMA受体的结合。因此，本发明包括，TACI-免疫球蛋白蛋白质在缺少足够数量的TACI或BCMA的受体或产生过量的ZTNF4或ZTNF2的受治疗者中的应用。这些分子可以对那些需要治疗的任何受治疗者给药，并且本发明设想了兽医的和人的治疗应用两个方面。实例的受治疗者包括哺乳动物的受治疗者，例如，农畜、家畜和人的患者。
TACI-免疫球蛋白多肽可以应用于治疗以下疾病：自身免疫疾病、B细胞癌、免疫调节、IBD和任何抗体介导的病状(例如：ITCP、重症肌无力等等)、肾脏疾病、间接T细胞免疫应答、移植排斥、以及移植物对抗宿主的病。本发明的多肽可以在免疫应答期间以特异性调节B细胞应答为目标。另外，本发明的多肽可以用于调节B细胞发育、其它细胞的发育、抗体产生和细胞因子产生。本发明的多肽也可以通过中和ZTNF4的增殖效应来调节T和B细胞的通讯。
本发明的TACI-免疫球蛋白多肽可以用于中和ZTNF4的效应，以治疗下述疾病，对于它们ZTNF4多肽增加是相关联的：前B细胞或B细胞白血病，例如：浆细胞白血病、慢性或急性淋巴细胞白血病；骨髓瘤，例如：多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、内皮性骨髓瘤和巨细胞骨髓瘤；以及淋巴瘤，例如：非霍奇金淋巴瘤。
ZTNF4是在CD8+细胞、单核细胞、树突细胞、活化的单核细胞中表达的，其表明，在某种自身免疫疾病中，细胞毒性T细胞可以通过ZTNF4的过度产生刺激B细胞产生。选择性阻断B淋巴细胞活动的免疫抑制蛋白质将被用于治疗疾病。自身抗体的产生为若干自身免疫疾病所共有，并且促进组织破坏和疾病加重。自身抗体也可以导致免疫复合物沉积并发症的发生，和导致许多系统性红斑狼疮的症状，包括：肾衰竭、神经痛症状和死亡。调节不依赖细胞应答的抗体的产生在许多疾病状态下也将是有益的。B细胞也已经显示出，在类风湿关节炎中的关节炎性的免疫球蛋白的分泌作用中起作用。因此，抑制ZTNF4抗体的产生，将有益于自身免疫疾病的治疗，例如重症肌无力、类风湿关节炎、多关节型青少年类风湿关节炎、银屑病性关节炎。像TACI-免疫球蛋白蛋白质这样的选择性地阻断或中和B淋巴细胞的活动的免疫抑制剂治疗将应用于上述目的。
本发明提供用TACI-免疫球蛋白蛋白质选择性阻断或中和与晚期肾病相关的B淋巴细胞活动的方法，其中所述肾病可以与或者不与自身免疫疾病相关。上述方法也将应用于治疗免疫性肾病。上述方法将应用于治疗肾小球肾炎，后者与例如膜性肾病、IgA肾病或贝惹病、IgM肾病、古德帕斯彻病、感染后肾小球肾炎、肾小球系增生性疾病、慢性淋巴细胞白血病、微小病变型肾病综合症的疾病相关。上述方法也用作为治疗与例如狼疮、多动脉炎、Henoch-Schonlein病、硬皮病、HIV相关疾病、淀粉样变或溶血性尿毒症的疾病相关的继发性肾小球肾炎或血管炎的治疗应用。本发明的方法也用于作为治疗与慢性肾盂肾炎、止痛药滥用、肾钙质沉着相关的间质性肾炎或肾盂肾炎、或由其它因素引起的肾病、肾结石、或者慢性或急性间质性肾炎的治疗应用的组成部分。
本发明的方法还包括TACI-免疫球蛋白蛋白质在治疗高血压或大血管病中的应用，包括肾动脉狭窄或阻塞和胆固醇栓塞或肾栓塞。
本发明还提供了治疗以下疾病的方法，如肾或泌尿系统肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变。
本发明还提供了用TACI-免疫球蛋白蛋白质阻断或抑制活化的B细胞以治疗哮喘和慢性呼吸道疾病，如支气管炎和肺气肿的方法。本文所述的TACI-免疫球蛋白蛋白质也可以用于治疗斯那格伦综合症。
还提供了用TACI-免疫球蛋白蛋白质抑制或中和效应子T细胞应答的方法，以用于免疫抑制，尤其是在对于移植物对抗宿主疾病和移植排斥的治疗中应用。此外，对于象胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和克罗恩氏病这样的自身免疫性疾病的治疗，TACI-免疫球蛋白蛋白质在治疗方案中有益。对于治疗慢性炎症疾病，尤其对于减轻关节痛、肿胀、贫血和其它相关症状以及治疗败血症性休克，本发明的方法将具有额外的治疗价值。
成熟的动物模型可用于体内测试在某种疾病状态下，本发明的TACI-免疫球蛋白蛋白质的效果。特别是，TACI-免疫球蛋白蛋白质可以用许多的自身免疫性疾病的动物模型进行体内测试，例如MRL-lpr/lpr或NZB × NZW F1鼠同类品系，其作为SLE(系统性红斑狼疮)的模型。这些动物模型在本领域是已知的。
新西兰黑鼠(NZB)和新西兰白鼠(NZW)之间杂交的后代发育为非常类似人类SLE的SLE的自发形式。后代鼠，称为NZBW，在一个月龄开始产生针对T细胞的IgM自身抗体，并且至5到7个月龄时，Ig抗DNA自身抗体是占优势的免疫球蛋白。多克隆的B细胞过度激活导致自身抗体的过度产生。该自身抗体、尤其针对单链DNA的抗体的沉积，与肾小球肾炎的发展相关，它临床上表现为蛋白尿、氮血症以及因肾衰竭而死亡。肾衰竭是导致受自发SLE影响的鼠死亡的最主要原因，在NZBW品系中，该过程是慢性的和消除性的。该病在雌鼠中比在雄鼠更急且严重，平均存活时间与雄鼠的406天相比仅为245天。虽然在7到9个月龄时许多雌鼠将出现症状(蛋白尿)时，但是一些雌鼠发生症状时可以更年轻或更老。在NZBW鼠中观察到的致命免疫性肾炎与在人的SLE中观察到的肾小球肾炎相类似，使得该自发型鼠模型对于潜在的SLE治疗测试有用。
实验变态反应性脑脊髓炎(EAE)的鼠模型，已经用来作为研究免疫介导的疾病的机理和潜在治疗干预方法二者的工具。该模型类似人的多发性硬化，并且作为神经蛋白，如髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)，对T细胞激活的结果而产生脱髓鞘作用。用抗原接种导致CD4+、II型MHC-限制的T细胞(Th1)的诱导。在对于EAE的方案中的改变可以产生该模型的急性、慢性复发性或者被动转移的变体。
在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中，鼠患有慢性炎症性关节炎，它非常类似人的类风湿关节炎(RA)。因为CIA与RA共有相似的免疫学和病理学特性，这使得它对于筛选潜在的人抗炎症化合物是理想的模型。应用CIA模型的另一个优点是，其病理机理已知。在II型胶原上的T和B细胞表位已经确定，同时，多种与免疫介导的关节炎相关的免疫学(迟发型过敏反应和抗胶原蛋白抗体)和炎症(细胞因子、趋化因子和基质降解酶)参数已经确定，并且可以应用于评定模型中测试化合物的效果。
重症肌无力(MG)是可以得到其鼠模型的另一种自身免疫疾病。MG是涉及产生针对烟碱乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体的神经肌肉传导疾病。MG是获得性的或遗传性的，有着包括活动后异常乏力和疲劳的临床特征。MG的鼠模型已经被确立。实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)是抗体介导的疾病，其特征在于针对AChR的抗体的存在。该抗体破坏受体，导致有缺陷的神经肌肉电脉冲，引起肌肉乏力。在EAMG模型中，用烟碱乙酰胆碱受体给鼠免疫。在第二次免疫后数周，MG的临床征象变得明显。评价EAMG有若干方法，包括用放射免疫试验测定AChR抗体的血清水平、测定肌肉AChR或肌电描记术。
通常，TACI-免疫球蛋白蛋白质的给药剂量将依据像受治疗者的年龄、体重、身高、性别、总体健康条件和既往的医疗历史这样的因素而不同。一般，理想的是提供在大约1pg/kg到10mg/kg(药量/受治疗者体重)范围内的一定剂量的TACI-免疫球蛋白蛋白质剂量给受治疗者，虽然依据情况也可以以较低或较高的剂量给药。
对受治疗者进行TACI-免疫球蛋白蛋白质给药可以是静脉内的、动脉内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的、胸膜内的、鞘内的、通过一个局部导管灌注、或病损内部直接注射。在以注射的方式给药治疗性的蛋白质时，可以以连续注入或者以单或多次的剂量给药。
给药的其他途径包括口服的、粘膜、肺的和透皮的。口服给药适合于聚脂微球体(microsphere)、玉米醇溶蛋白微球体、类蛋白质微球体、多氰基丙烯酸酯微球体以及基于脂质的系统(可参阅，例如，DiBase和Morrel，“Oral Delivery of MicroencapsulatedProteins，”载于Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，第255-288页(Plenum Press1997))。通过像胰岛素给药的模式，说明了鼻内给药的可行性(可参阅，例如，Hinchcliffe和Illum，Adv.DrugDeliv.Rev.35：199(1999))。包含TACI-免疫球蛋白的干燥的或液体的颗粒，可以借助于干粉分散剂、液体气雾发生器、或喷雾器来制备和吸入。(例如：Pettit和Gombotz，TIBTECH16：343(1998)；Patton等人，Adv.Drug.Deliv.Rev.35：235(1999))。该方法由AERX糖尿病管理系统举例说明，它是一种将气雾状胰岛素送入肺中的手持电动吸入器。研究表明，借助于低频超声波，48,000kDa大的蛋白质已经被以治疗浓度透皮递送，这证明了透皮给药的可行性(Mitragotri等人，Science269：850(1995))。通过电穿孔的透皮给药提供了另一种TACI-免疫球蛋白蛋白质给药的方法(Potts等人，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。
包含TACI-免疫球蛋白蛋白质的药物组合物可以根据已知的制备药用的组合物的方法来配制，由此，治疗用的蛋白质与制药上可接受的载体以混合物的形式来组合。一种组分，如果它的给药可以被受治疗的患者所耐受，即被称为是“制药上可接受的载体”。无菌的磷酸缓冲盐溶液是制药上可接受的载体的一个实例。其它适合的载体为本技术领域中众所周知。可参阅，例如，Gennaro(编辑)，Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)。
为了治疗的目的，将TACI-免疫球蛋白蛋白质以治疗有效量向患者给药。如果给药量在生理上有显著性，则TACI-免疫球蛋白蛋白质和制药上可接受的载体被认为是以“治疗有效量”给药。如果其存在引起了在受治疗的患者生理方面可检测的变化，则该药物在生理上显著。例如，如果其存在减轻了炎症反应，则用于治疗炎症的药物是生理上显著的。作为另一个实例，如果该药剂的给药引起肿瘤数量上的减少、减少的转移、实体瘤尺寸减小、或肿瘤坏死增加，则用于抑制肿瘤细胞生长的药物是生理上显著的。此外，如果该药物的给药引起循环中抗双链DNA抗体的减少、或至少下述症状之一的减轻：发热、关节痛、红斑性皮肤损害、或系统性红斑狼疮的其它特征，则用于治疗系统性红斑狼疮的药物是生理上显著的。将TACI-免疫球蛋白蛋白质以治疗有效量给药的通常的标志的一个实例是，在给受治疗的患者给药之后，ZTNF4(BLyS)的循环水平减少。
包含TACI-免疫球蛋白蛋白质的药物组合物可以以液体形式、气雾剂或固体形式提供。液体形式是以可注射的溶液和口服悬浮液为实例的。典型的固体形式包括胶囊、片剂以及可控制释放的形式。后一种形式是以微型渗透泵和植入物为实例的(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in DrugDelivery，”载于Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，第95-123页(CRC Press1995)；Bremer等人，“ProteinDelivery with Infusion Pumps，”载于Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(编辑)，第239-254页(Plenum Press1997)；Yewey等人，“Delivery of Protein from a ControlledRelease Injectable Implant，”载于Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(编辑)，第93-117页(Plenum Press1997))。
脂质体提供了一种以静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下、或借助于口服给药、吸入、鼻内给药等方式，向受治疗的患者递送治疗用的多肽的方法。脂质体是细微的膜泡，它由一个或多个包围含水区室的脂双层组成(通常可参阅，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs46：618(1993)，以及Ranade，“Site-Specific Drug DeliveryUsing Liposomes as Carriers，”载于Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，第3-24页(CRC Press1995))。脂质体在成分上类似于细胞膜，因此，脂质体可以被安全地给药，同时是可生物降解的。根据制备方法，脂质体可以是单层或多层的，脂质体的直径尺寸变化可以从0.02μm到大于10μm。多种药剂可以用脂质体封装：疏水药剂部分用双分子层，而亲水部分在内部含水的区域内(可参阅，例如，Machy等人，LiposomesInCellBiologyAndPharmacology(John Libbey1987)，和Ostro等人，AmericanJ.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，通过脂质体尺寸、分子层数、脂质组分、以及脂质体电荷和表面特征的变化，有可能控制封装的药物的治疗有效性。
脂质体实际上可以被任何类型的细胞吸收，然后缓慢地释放所封装的药物。或者，被吸收的脂质体可以被吞噬细胞胞吞。胞吞继之以脂质体脂质的被内溶酶体降解和封装药剂的释放(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。静脉内给药后，小的脂质体(0.1到1.0μm)一般被主要位于肝和脾的网状内皮系统的细胞吸收，而大于3.0μm的脂质体在肺部沉积。这种小的脂质体被网状内皮系统细胞的优先吸收已经被用于向巨噬细胞和肝部肿瘤递送化疗药剂。
网状内皮系统可以通过若干方法被避开，包括：以大剂量的脂质体颗粒使之饱和、或者用药理学的方法选择性失活巨噬细胞(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta802：428(1984))。另外，将糖脂或聚乙二醇衍生的磷脂加入脂质体膜已经显示出导致了显著地减少的网状内皮系统的吸收(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
脂质体也可以通过改变磷脂组成或者在脂质体中插入受体或配体来被制备出来，以靶向特定细胞或器官。例如：用高含量的非离子型表面活性剂制备的脂质体已经用于靶向肝(Hayakawa等人，日本专利04-244,018；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。该剂型是通过在甲醇中混合大豆磷脂酰胆碱、α-维生素E和乙氧基化氢化的蓖麻油(HCO-60)，在真空下浓缩混合物，之后用水重组而制备。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与大豆衍生的sterylglucoSide混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体剂型也已经表明靶向肝(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
或者，可以将多种靶向配体结合到脂质体表面，例如：抗体、抗体片段、碳水化合物、维生素和转运蛋白质。例如，可以将脂质体用分枝型半乳糖脂质衍生物来修饰，以靶向脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体专门在肝细胞表面表达(Kato和Sugiyama，Crit..Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。同样，Wu等人在Hepatology27：772(1998)上已经表明，用脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体导致缩短了的脂质体血浆半衰期和较大地增强了的肝细胞对脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体的吸收。另一方面，含分支型半乳糖脂衍生物的脂质体的肝部积累可被预注射的脱唾液酸胎球蛋白抑制(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多顺乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了另一种使脂质体靶向肝的方法(Kamps等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA94：11681(1997))。此外，Geho等人在美国专利No.4,603,044叙述了定向于肝细胞的脂质体小泡递送系统，它具有对与肝的特异性代谢细胞相关的肝胆受体的特异性。
在组织靶向的更普通的方法中，靶细胞被用对靶细胞表达的配体特异的生物素化的抗体预先标记(Harasym等人，Adv.DrugDeliv.Rev.32：99(1998))。在血浆消除游离抗体后，施用缀合链霉抗生素的脂质体。在另一种方法中，靶向抗体被直接附着在脂质体上(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
可以采用标准的蛋白质微量封装技术，将TACI-免疫球蛋白蛋白质封装在脂质体内(可参阅，例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，CancerRes.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta1063：95(1991)，Alving等人“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies，”载于Liposome Technology，第2版，Vol.III，Gregoriadis(编辑)，第317页(CRC Press1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))。如上所述，治疗用的脂质体可以含有多种组分。例如，脂质体可以包含聚(乙二醇)的脂质衍生物(All en等人，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
可降解的聚合物微球体已经被设计成可保持治疗性蛋白质的高的系统水平。微球体用降解的聚合物制备，例如，(丙交酯乙交酯)共聚物(PLG)、聚酐类、聚(原酯)、不可生物降解的乙基乙烯基乙酸酯聚合物，其中蛋白质被包在聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymer inDrug Delivery，”载于Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，第51-93页(CRC Press1995)；Roskos和Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful forProteinDel ivery，”载于ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，第45-92页(Plenum Press1997)；Bartus等人，Sciences281：1161(1998)；Putney和Burke，NatureBiotechnology16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。包有聚乙二醇(PEG)的毫微球体也可以为治疗用蛋白质静脉给药提供载体(可参阅，例如，Gref等人，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。
如上面所讨论的，本发明也设想了化学修饰的TACI-免疫球蛋白蛋白质，其中多肽与聚合物连接。
其它给药形式可以由本领域的技术人员设计，如，例如，Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，第5版(Lea&Febiger1990)、Gennaro(编辑)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack PublishingCompany1995)、以及Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)所示。
作为实例，药物组合物可以包括容器的试剂盒来供应，该容器包含TACI-免疫球蛋白蛋白质。治疗用多肽可以一次或多次剂量的可注射溶液形式，或者以在注射前重配制的无菌粉末的形式来提供。或者，上述试剂盒可以包括用于将治疗性多肽给药的干粉分散剂、液体气雾发生器或喷雾器。上述试剂盒可以进一步包含关于药物组合物的适应证和用法的书面的信息。此外，上述信息可以包括一个声明，即TACI-免疫球蛋白蛋白质组合物在已知对TACI部分或者对免疫球蛋白部分过敏的患者中禁忌。
9.TACI免疫球蛋白核苷酸序列的治疗应用
本发明包括编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的核酸分子的应用，以给需要上述治疗的受治疗者提供该融合蛋白质。如上面所讨论的，为了兽医治疗应用或人的治疗应用，可以将该核酸分子给有病症或疾病的受治疗者用药。正如在前面一个实例所讨论的，编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的核酸分子可以应用于系统性红斑狼疮的长期治疗。
有许多给受治疗者引入TACI免疫球蛋白基因的方法，包括：表达TACI免疫球蛋白的重组宿主细胞的应用、编码TACI免疫球蛋白的裸核酸的递送、阳离子脂质载体与编码TACI免疫球蛋白的核酸分子一起的应用、以及表达TACI免疫球蛋白的病毒的应用，例如重组逆转录病毒、重组腺伴随病毒、重组腺病毒、重组单纯疱疹病毒(可参阅，例如，Mulligan，Science260：926(1993)，Rosenberg等人，Science242：1575(1988)，LaSalle等人，Science259：988(1993)，Wolff等人，Science247：1465(1990)，Breakfield和Deluca，TheNewBiologist3：203(1991))。在离体的方法中，例如，从受治疗者分离细胞，用表达TACI免疫球蛋白基因的载体转染，之后植入到受者中。
为了实现TACI免疫球蛋白基因的表达，表达载体被构建出来，其中编码TACI免疫球蛋白基因的核苷酸序列被与核心启动子可操作地连接，并且可选择与调节元件连接，以控制基因转录。以上叙述了表达载体的一般要求。
或者，TACI免疫球蛋白基因可以用重组病毒载体来递送，包括例如：腺病毒载体(例如，Kass-Eisler等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90：11498(1993)，Kolls等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA91：215(1994)，Li等人，Hum.GeneTher.4：403(1993)，Vincent等人，Nat.Genet.5：130(1993)，以及Zabner等人，Cell75：207(1993))、腺伴随病毒载体(Flotte等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90：10613(1993))、α病毒，如Semliki Forest病毒和Sindbis病毒(Hertz和Huang，J.Vir.66：857(1992)，Raju和Huang，J.Vir.65：2501(1991)，以及Xiong等人，Science243：1188(1989))、疱疹病毒载体(例如：美国专利Nos.4,769,331、4,859,587、5,288,641和5,328,688)、细小病毒载体(Koering等人，Hum.Gene Therap.5：457(1994))、痘病毒载体(Ozaki等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.193：653(1993)，Panicali和Paoletti，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA79：4927(1982))、痘病毒，如金丝雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：317(1989)，和Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86(1989))、以及逆转录病毒(例如：Baba等人，J.Neurosurg79：729(1993)，Ram等人，Cancer Res.53：83(1993)，Takamiya等人，J.Neurosci.Res.33：493(1992)，Vile和Hart，Cancer Res.53：962(1993)，Vile和Hart，Cancer Res.53：3860(1993)，以及Anderson等人，美国专利No.5,399,346)。在不同的实施方案里，含有病毒载体的病毒载体本身，或者病毒颗粒，可以在如下面叙述的方法和组合物中应用。
作为一个系统的说明，腺病毒，即一种双链DNA病毒，用于异源核酸分子的递送是被详细表征的基因转移载体。(对于综述可参阅Becker等人，Meth.CellBiol.43：161(1994)；Douglas和Curiel，Science&Medicine4：44(1997))。腺病毒系统提供若干优点，包括：(i)接纳相对较大DNA的插入片段的能力，(ii)生长至高滴度的能力，(iii)感染较大范围的哺乳动物细胞类型的能力，以及(iv)与许多不同的启动子一起使用的能力，包括：普遍存在的、组织特异性的、和可调节的启动子。另外，可以将腺病毒通过静脉内注射给药，因为该病毒在血流中稳定。
使用部分腺病毒基因组已缺失的腺病毒载体，插入片断是通过直接连接反应或用共转染质粒同源重组的方法被合并到病毒DNA中的。在典型的系统中，必须的E1基因被从病毒载体中缺失，并且除非宿主细胞提供E1基因，否则病毒不能复制。当从静脉内向未治疗的动物给药时，腺病毒主要靶向肝。虽然已缺失E1基因的腺病毒递送系统在宿主细胞中不能复制，但是宿主的组织将表达和加工被编码的异源基因。如果相应的基因包括分泌信号序列，宿主细胞也将分泌异源蛋白质。分泌的蛋白质将从表达异源基因的组织(例如：高度血管化的肝)进入循环。
此外，含有各种病毒基因缺失的腺病毒载体可以用于减少或消除针对载体的免疫应答。上述腺病毒的E1已缺失，另外，包括E2A或E4的缺失(Lusky等人，J.Virol.72：2022(1998)；Raper等人，Human Gene Therapy9：671(1998))。E2b的缺失减少免疫应答也已经有报道(Amalfitano等人，J.Virol.72：926(1998))。通过删除整个腺病毒的基因组，可以接受很大的异源DNA的插入物。全部病毒基因已被缺失的被称为“gutless”腺病毒的后代，对于大的异源DNA插入物的插入尤其有利(对于综述，可参阅Yeh.和Perricaudet，FASEB J.11：615(1997))。
能够表达治疗基因的重组病毒的高滴度的母株可以采用标准方法从受感染哺乳动物细胞获得。例如：重组单纯疱疹病毒可以用Vero细胞制备，如以下文献所述：Brandt等人，J.Gen.Virol.72：2043(1991)，Herold等人，J.Gen.Virol.75：1211(1994)，Visalli和Brandt，Virology185：419(1991)，Grau等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30：2474(1989)，Brandt等人，J..Virol.Meth.36：209(1992)，以及Brown和MacLean(编辑)，HSV Virus Protocols(Humana Press1997)。
或者，可以将包含TACI免疫球蛋白基因的表达载体，用脂质体通过体内脂质转染法引入到受治疗者细胞中。合成阳离子脂质可以应用于制备脂质体用于在体内转染的编码标记的基因(Felgner等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA84：7413(1987)；Mackey等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85：8027(1988))。在体内将外源基因引入到特定器官的脂质转染法的应用具有某些实用的优点。脂质体可以用于导向对特定细胞类型的转染，它对于有细胞异质性的组织尤其有利，例如：胰、肝、肾和脑。脂质可以与为了定向目的的其他分子化学偶联。靶肽(例如：激素或神经递质)、蛋白质，如抗体，或非肽分子，可以与脂质体化学偶联。
电穿孔是另一种可选择的给药模式。例如：Aihara和Miyazaki，Nature Biotechnology16：867(1998)，已经说明了在体内为使基因转移到肌肉的电穿孔的应用。
通常，包含具有TACI免疫球蛋白核苷酸序列(如重组病毒)的治疗载体的组合物的剂量，将依据受治疗者的年龄、体重、身高、性别、总体的健康状况和既往的医疗历史这样的因素而不同。适合的治疗载体给药途径包括静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、肿瘤内注射以及注射到含肿瘤的腔隙内。作为实例，Horton等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA96：1553(1999)，说明了在鼠模型中，编码α-干扰素的质粒DNA的肌肉内注射对于原发性和转移性肿瘤产生有效的抗肿瘤效应。
包含本发明的病毒载体、非病毒载体、或者病毒载体和非病毒载体之组合的组合物，可以根据已知的制备药用的组合物的方法配制，由此，载体或病毒与制药上可接受的载体以混合物的形式组合。如上所述，一种组分，如磷酸缓冲盐水，如果它的给药可以被受治疗的患者所耐受，即被称为是“制药上可接受的载体”。其它适合的载体为本技术领域众所周知。(可参阅，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，和Gilman’sthe Pharmaceutical Basis of Therapeutics第7版(Mac MillanPublishing Company 1998))。
为了治疗的目的，将治疗用的基因表达载体或者包含上述载体和制药上可接受的载体的重组病毒，以治疗有效量向患者给药。如果给药量在生理上显著的，则表达载体(或病毒)和制药上可接受的载体的组合物被认为是以“治疗有效量”给药的。如果它的存在引起了在受治疗的患者生理方面可检测的变化，则药物在生理上显著。例如，如果它的存在减轻了炎症反应，则用于治疗炎症的药剂是生理上显著。作为另一个实例，如果该药剂的给药引起在肿瘤数量上减少、减少转移、实体瘤尺寸减小、或肿瘤坏死增加，则用于抑制肿瘤细胞生长的药物在生理上显著。
当用治疗用的基因表达载体或者重组病毒治疗的对象是人时，那么，该治疗优选为体细胞基因治疗。也就是说，用治疗性基因表达载体或者重组病毒治疗人时，优选不必需将核酸分子引入到可成为人生殖细胞系的一部分并被传递到相继的世代的细胞中(例如：人生殖细胞系的基因治疗)。
10.转基因小鼠的生产
转基因鼠可以被遗传改造为在所有组织或者在组织特异的或组织优选的调节元件控制下过度表达编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的核酸序列。该TACI免疫球蛋白融合蛋白质的过度产生者可以用来表征由过度表达引起的表型，并且转基因动物可以作为由过量的TACI受体蛋白质引起的人类疾病的模型之用。过度表达TACI免疫球蛋白融合蛋白质的转基因鼠也为在大动物的奶或血中生产TACI免疫球蛋白融合蛋白质提供了模型生物反应器。生产转基因鼠的方法对于本领域的技术人员是众所周知的(可参阅，例如，Jacob，“Expression andKnockout of Interferons in Transgenic Mice，”载于Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice，Jacob(编辑)，第111-124页(Academic Press，Ltd.1994)，Monastersky和Robl(编辑)，Strategies in Transgenic AnimalScience(ASM Press1995)，以及Abbud和Nilson，“RecombinantProtein Expression in Transgenic Mice，”载于Gene ExpressionSystems：Using Nature for the Art of Expression，Fernandez和Hoeffler(编辑)，第367-397页(Academic Press，Ltd.1999))。
例如，生产表达编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的核酸序列的转基因鼠的方法，可以从成熟的可育雄鼠(种鼠)(B6C3f1，2到8月龄(Taconic Farms，Germantown，NY))、切除输精管的雄鼠(不育鼠)(B6D2f1，2到8月(Taconic Farms))、性成熟前的可育雌鼠(供体)(B6C3f1，4到5周(Taconic Farms))和成熟的可育雌鼠(受体)(B6D2f1，2到4月(Taconic Farms))开始。将供体驯化一周，然后注射Pregnant Mare血清促性腺激素(SigmaChemical Company；St.Louis，MO)I.P.大约8IU/鼠，46-47小时后，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))I.P.8IU/鼠，以引起超量排卵。在激素注射之后让供体与种鼠交配。排卵通常在hCG注射13小时内发生。交配是通过交配以后的早晨阴道塞的存在来得到确认的。
受精卵在解剖镜下被采集。将输卵管采集起来，并且将卵放置在含有透明质酸酶(Sigma)的尿液分析的载玻片中。将卵在透明质酸酶中洗涤一次，再在已经用5％CO2、5％O2和90％N2在37℃孵化过的Whitten’sW640培养基中洗涤两次(详述见，例如：Menino和O’Claray，BiOl.Reprod.77：159(1986)，以及Dienhart和Downs，Zygote4：129(1996))。之后将卵储存在37℃/5％CO2的孵化器中直到显微注射。
将十到二十微克含有编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质序列的质粒DNA线性化、凝胶纯化、并且在10mM Tris-HCl(pH值7.4)、0.25mM EDTA(pH值8.0)中重悬浮，以每微升5到10毫微克的最终浓度进行显微注射。例如，编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的序列可以编码具有SEQ ID NO：2氨基酸残基1到29和111到154的缺失和Fc免疫球蛋白部分的TACI多肽。
将质粒DNA显微注射到装在一滴用温的CO2平衡的矿物油覆盖的W640培养基中的收获的卵中。将DNA吸入到注射针中(从0.75mmID、1mmOD硼硅酸盐毛细玻璃管拉成的)，注射到单个卵中。用注射针将每一个卵穿透，进入到一个或两个单倍体原核中。
皮升(picoliter)的DNA被注射到原核中，不与核仁接触便将注射针抽回。重复该程序直到全部卵被注射为止。将成功地显微注射的卵转移到有预先排气的W640培养基的器官组织培养盘中，以在37℃/5％CO2的孵化器中过夜储存。
第二天，将二细胞胚胎转移到假妊娠受体中。在与切除输精管的不能繁殖的鼠交配之后，通过阴道塞的存在对受体进行鉴定。将受体麻醉，在背部左侧剃毛，并且被转移到解剖显微镜下。在皮肤上切一个小切口，穿过位于膝和脾中间的以胸廓、鞍部、和后腿为界的腹部区域中央的肌肉壁。使生殖器官暴露在小手术单之上。将脂肪垫在手术单上伸出，并将小型弹簧镊(Roboz，Rockville)固定于脂肪垫上，悬挂于鼠的背部上，防止器官滑动回去。
用含矿物油及随后的交替的W640和气泡的细移液管，将12到17个健康的由前几天注射得到的二细胞胚胎转移到受体中。定位肿胀的壶腹，并且在壶腹和囊之间固定输卵管，用28g针在接近囊处在输卵管上做一个切口，确认没有弄破壶腹或囊。
将移液管转移到输卵管的切口中，将胚胎吹入，允许第一个气泡排出移液管。将脂肪垫缓慢推进腹膜，并让生殖器官滑入。用线缝合腹膜壁，并用伤口夹闭合皮肤。让鼠在37℃滑动加热器上恢复最少4小时。
让受体成对地返回笼中，并且允许其19-21天的妊娠。生育后，断奶前产后的19-21天是允许的。区分刚断奶小鼠的性别，然后放入分性别的笼中，用清洁剪刀剪去尾部0.5cm活体解剖(用于基因型分析)。
用例如QIAGEN DNEASY试剂盒按照制造商的说明书，从尾部剪下的小块来制备基因组DNA。通过PCR分析基因组DNA，该PCR是采用为扩增编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的核酸序列或扩增被引入相同质粒的可选择的标记基因而设计的引物。在确认动物是转基因的之后，通过将转基因雌鼠与野生型雄鼠，或者转基因雄鼠与一只或两只野生型雌鼠放在一起，让它们与近亲繁殖的品系杂交。当幼鼠出生并断奶时，其性别被分开，并且为了基因型分析将其尾部剪去。
为了在活的动物中进行转基因表达的检查，进行了部分肝切除。在紧接着剑突下的上腹部进行外科手术准备。采用无菌操作，在胸骨以下做一个1.5到2cm的小切口，使肝的左外叶露出。用4-0丝线，围绕下部的肝叶打一个结，将其固定在体腔外。当可吸收的Dexon(American Cyanamid；Wayne，N.J.)的第二个环被放在第一个结的近端时，用无创钳夹住该结。从Dexon结的远端切割，大约100mg切除的肝组织被置于无菌培养皿中。将切除的肝的切片转移到14ml聚丙烯圆底试管中并且立即在液氮中冷冻，然后，在干冰上储存。用缝线和伤口夹将手术部位闭合，手术后，将动物笼置于37℃加热垫上24小时。手术后每天对动物进行检查，手术后7到10天将伤口夹去除。为每只转基因鼠用RNA溶液杂交试验或者聚合酶链反应检测TACI免疫球蛋白融合蛋白质mRNA的表达水平。
采用上述的常规方法，在奶中表达显著水平的TACI免疫球蛋白融合蛋白质的转基因鼠已被生产出来。在这种独特的情况下，编码TACI免疫球蛋白融合蛋白质的序列编码了带有SEQ ID NO：2氨基酸残基1到29和111到154缺失和Fc免疫球蛋白部分的TACI多肽。
像通常叙述的一样，通过参考下述以实施例的方式提供的实施例将使本发明更容易被理解，但是这不能作为对本发明的限制。
实施例1
编码TACI-Fc蛋白质的核酸分子的构建
如Gross等人，Naturre404：995(2000)所述的，编码人的TACI的核酸分子在ZTNF4的受体克隆的表达时获得。采用标准技术，通过重叠PDR，产生出包含在TACI-Fc表达构建体中的编码序列(参阅，例如：Horton等人，Gene77：61(1989))。人的TACI cDNA和Fc cDNA被作为PCR扩增的起动模板来使用。PCR引物被设计出以生产想要的编码序列的5’和3’端，并且引入限制酶识别位点以便于该编码序列插入到表达载体中。将TACI-Fc编码序列插入到包括鼠功能性的二氢叶酸还原酶基因的表达载体中。一种表达载体也包含引导重组蛋白质转基因的表达的巨细胞病毒启动子、免疫球蛋白内含子、组织纤溶酶原激活蛋白的信号序列、内部核糖体进入序列、用于表面选择转染的细胞的被缺失了的CD8顺反子、以及用于在酵母细胞中生长质粒的酵母表达元件。
用于生产TACI-Fc融合蛋白质的一种方法是通过用于构建TACI-Fc4的方法来说明的。其它的TACI-Fc融合蛋白质是通过将编码TACI-Fc融合蛋白质的核苷酸序列插入到哺乳动物表达载体中，然后将该表达载体引入到哺乳动物细胞中来生产。
A.I g γ 1 Fc4片段的构建
为制备TACI-Fc4融合蛋白质，将人的IgG1的Fc区(铰链区和CH2和CH3结构域)修饰，以去除Igγ1受体(Fc γ RI)和补体(C1q)结合功能。人的IgG1 Fc的该修饰版本被指定为“Fc4”。
使用寡引物5’ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGCCCAC3’(SEQ ID NO：7)和5’GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAG ACAGGG AG3’(SEQ ID NO：8)采用PCR，将Fc区从人的胎儿肝的文库(Clontech)中分离。用PCR引起Fc区内的突变，以降低FcγRI的结合。将FcγRI结合位点(Leu-Leu-Gly-Gly；SEQ ID NO：6的氨基酸残基38到40，它相当于EU索引位置234到237)突变为Ala-Glu-Gly-Ala，以降低FcγR1的结合(参阅，例如：Duncan等人，Nature332：563(1988)；Baum等人，EMBO J.13：3992(1994))。寡核苷酸引物5’CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C3’(SEQ ID NO：9)和5’GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A3’(SEQ ID NO：10)被应用以引起该突变。向50μ1的最终体积中加入IgFc模板570ng、10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)5μ1、1.25mM dNTPs8μl、蒸馏水31μl、20mM寡核苷酸引物2μl。将相等体积的矿物油加入，将反应加热到94℃持续1分钟。将Pfu聚合酶(2.5单位，Stratagene)加入继而进行25个循环的在94℃持续30秒钟，55℃持续30秒钟，72℃持续1分钟，接着在72℃延伸反应7分钟。用电泳将反应产物分离，将与预测尺寸相对应的大约676个碱基对的条带检出。从凝胶上将该条带切断，并且使用QIAGENQIAquickTM Gel Extraction试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行回收。
PCR也被用于引起Ala到Ser(SEQ ID NO：6的氨基酸残基134，它相当于EU索引位置330)和Pro到Ser(SEQ ID NO：6的氨基酸残基135，它相当于EU索引位置331)的突变，以降低补体C1q的结合或补体的固定(Duncan和Winter，Nature332：788(1988))。作为模板使用FcγRI结合位点突变的IgFc序列进行两次第一轮的反应。向50μl的最终体积中加入FcγRI结合位点突变的IgFc模板1μl、10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)5μl、1.25mM dNTPs8μl、蒸馏水31μl、2μl的20mM5’GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGAG CCCA GATCT TCA GACAAAA CTCAC3’(SEQ ID NO：11)，即在SEQ IDNO：5的核苷酸36开始的5’引物、以及2μl的20mM5’TGGGAGGGCTTTGTTGGA3’(SEQ ID NO：12)，即在SEQ ID NO：5的核苷酸405互补体开始的3’引物。第二反应含有各2μl的20mM的贮液寡核苷酸引物5’TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCTCC3’(SEQ ID NO：13)，即在SEQ ID NO：5的核苷酸388开始的5’引物和5’GGATGG ATCC ATGAAGCACC TGT GGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTCCCAGATG3’(SEQ ID NO：14)，即3’引物的原料，以引起Ala到Ser的突变，XbaI限制性位点和终止密码子。将相等体积的矿物油加入，将反应加热到94℃持续1分钟。将Pfu聚合酶(2.5单位，Stratagene)加入继而进行25个循环的在94℃持续30秒钟，55℃持续30秒钟，72℃持续2分钟，接着在72℃延伸反应7分钟。用电泳将反应产物分离，并将分别与预测尺寸相对应的大约370个和大约395个碱基对的条带检测出来。从凝胶中将该条带切出，并且使用QIAGEN QIAquickTMGel Extraction试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行提取。
为连接上述片段，并且加入5’B amHI限制性位点和来自人免疫球蛋白JBL2’CL重链可变区的信号序列，进行第二轮反应，(Cogne等人，Eur.J.Immunol.18：1485(1988))。向50μl的最终体积中加入30μl蒸馏水、8μl 1.25mM dNTPs、5μl10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)以及两种第一次的两个PCR反应的产物各1μl。将相等体积的矿物油加入，将反应加热到94℃持续1分钟。将Pfu聚合酶(2.5单位，层聚基因)加入继而进行5个循环的在94℃持续30秒钟，55℃持续30秒钟，72℃持续2分钟。再次升温到94℃，并且将各2μl的20mM贮液的寡核苷酸引物5’GGATGGATCC ATGAAGCACCTGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGG CTC CCAGATG3’(SEQ ID NO：14)，即在SEQ ID NO：5的核苷酸1开始的5’引物和5’GGATTCTAGATTATTTACCC GGAGACAGGGA3’(SEQ ID NO：10)加入，继而进行25个循环的在94℃持续30秒钟，55℃持续30秒钟，72℃持续2分钟，最后在72℃延伸反应7分钟。采用凝胶电泳将反应部分显影。将与预测尺寸相对应的789个碱基对的条带检测出。
B.TACI-Fc4表达载体的构建
借助于在酵母中的同源重组，构建包含TACI-Fc4融合蛋白质编码区的表达质粒。采用PCR分离TACI的cDNA片段，它包括SEQ ID NO：1从核苷酸14到核苷酸475的多核苷酸序列。在TACI片段的生产中使用的两种引物是：(1)含有5’载体侧翼序列的40碱基对和与TACI片段氨基末端相对应的17个碱基对的引物(5’C TCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG3’；SEQID NO：15)；(2)与侧翼Fc4序列相对应的3’端的40个碱基对和与TACI片段羧基末端相对应的17个碱基对(5’GCATGTGTGA GTTTTGTCTGAAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG3’；SEQ ID NO：16)。向100μl的最终体积中加入TACI模板10ng、10x Taq聚合酶反应缓冲物(PerkinElmer)10μl、2.5nM dNTPs8μl、蒸馏水78μl、20mM寡核苷酸引物贮液各2μl和Taq聚合酶(2.5单位，Life Technology)。将相等体积的矿物油加入，将反应加热到94℃持续2分钟，继而进行25个循环的在94℃持续30秒钟，65℃持续30秒钟，65℃持续30秒钟，72℃持续1分钟，接着在72℃延伸反应5分钟。
用相似的方法将包含cDNA编码Fc4片段的片段构建。在Fc4片段生产中使用的两种引物是(上游和下游)，含有5’T ACI侧翼序列的40个碱基对和与Fc4片段氨基末端相对应的17个碱基对的寡核苷酸引物(5’GCA CAG AGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTGAAGGAGCCCA GATCTTCAGA3’；SEQ ID NO：17)；和含有与侧翼载体序列相对应的3’端的40个碱基对和与Fc4片段羧基末端相对应的17个碱基对的寡核苷酸引物(5’GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAATCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG3’；SE QID NO：18)。向100μl的最终体积中如上所述的Fc4模板10ng、10x Taq聚合酶反应缓冲液(Perkin E1mer)10μl、2.5nM dNTPs8μl、蒸馏水78μl、20mM寡核苷酸贮液各2μl和Taq聚合酶(2.5单位，LifeTechnology)。将相等体积的矿物油加入，将反应加热到94℃持续2分钟，继而进行25个循环的在94℃持续30秒钟，65℃持续30秒钟，72℃持续1分钟，接着在72℃延伸反应5分钟。
为了分析，10微升的如上所述的各100μl的PCR反应物与1xTBE缓冲液一起在0.8％LMP琼脂糖凝胶上(Seaplaque GTG)跑电泳。将剩余的90μl各种PCR反应物用添加的1M氯化钠5μl和无水乙醇沉淀。用SmaI切割质粒pZMP6，使之在多连接位点直线化。质粒pZMP6来自于质粒pCZR199(American Type Culture Collection，Manassas，VA，ATCC#98668)，是哺乳动物表达载体，它含有具有巨细胞病毒立即早期启动子的表达盒、来自鼠免疫球蛋白重链基因座的可变区的一致(consensus)内含子、用于编码序列插入的多个限制位点、终止密码子和人的生长激素的终止子。质粒还具有大肠杆菌的复制原点、带SV40启动子的哺乳动物可选择标记表达单位、增强子和复制的原点、二氢叶酸还原酶基因和SV40终止子。载体pZMP6通过用巨细胞病毒立即早期启动子替换金属硫蛋白启动子，和在开放的阅读框架的5’端的Kozac序列，从pCZR199构建。
将100微升感受态的酵母细胞(啤酒糖酵母)与10μl含有大约1μg TACI胞外结构域和Fc4PCR片段、以及100ng SmaI消化过的pZMP6载体混合，然后转移到0.2cm电穿孔杯。在0.75kV(5kV/cm)，∞ohms，25μF下给酵母/DNA混合物电脉冲。向每个杯加入600μl1.2M山梨糖醇，将酵母以两个300μl等分试样在URA-D平板铺板，之后在30℃温育。
大约48小时后，将来自单个平板的Ura+酵母转化物用1ml水重新悬浮，简单地离心使酵母细胞沉淀。用1ml溶胞缓冲液(2％TritonX-100、1％SDS、100mM氯化钠、10mM Tris、pH值8.0、1mM EDTA)将细胞沉淀重新悬浮。将500微升溶胞混合物加到含有300μl酸洗过的玻璃珠和200μl酚氯仿的Eppendorf试管，以1分钟的时间间隔旋转两到三次，接着在Eppendorf离心机中以最大速度旋转5分钟。将300微升的水相物转移到新的试管，并用600μl乙醇沉淀DNA，接着在4℃离心分离10分钟。用100μl水中将DNA沉淀重新悬浮。
电感受态的(electrocompetent)大肠杆菌细胞(DH10B、GibcoBRL)转化是用0.5到2ml准备的酵母DNA和40μlDH10B细胞进行的。以2.0kV、25mF和400ohms向细胞给予电脉冲。电穿孔后，将1mlSOC(2％细菌用胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)以250μl等分试样在四个LB AMP平板(LB培养液(Lennox)、1.8％细菌用琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上铺板。
通过限制性酶切消化鉴定包含TACI-Fc4的正确的表达构建体的个体的克隆，以确定插入物的存在，同时证实多种DNA序列已经正确地相互连接。阳性的克隆插入物要经过序列分析。采用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)根据生产商的说明书将大量的质粒DNA分离。
C.Fc5、Fc6和Fc7的构建
在Fc5中，将在EU索引位置218的Arg残基被变回Lys残基。野生型人的Igγ1在该位置含有赖氨酸。简单地说，使用寡核苷酸引物5’GAGCCC AAATCTT CAGAC AAAA CTCACACA TGCCCA3’(SEQ ID NO：19)和5’TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTA CCCGGAG ACA3’(SEQ ID NO：20)将编码Fc5的核酸分子生产出来。PCR扩增的条件如下所述。向50μl的最终体积中加入Fc4模板236ng、10Pfu反应缓冲液(Stratagene)5μl、2.5mM dNTPs 4μl、20μm的每种寡核苷酸1μl、Pfu聚合酶(2.5单位，Stratagene)1μl。扩增温度分布由以下组成：在94℃持续2分钟，5个循环的在94℃持续15秒钟，42℃持续20秒钟，72℃持续45秒钟，20个循环的在94℃持续15秒钟，72℃持续1分钟20秒钟，接着在72℃延伸反应7分钟。用琼脂糖凝胶电泳将反应产物分离，将与预测尺寸相对应的大约718个碱基对的条带检出。从凝胶中将该条带切下，并且使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行回收。
除羧基末端的赖氨酸密码子已经被除去之外，Fc6与Fc5相同。如在Fc4和Fc5中所述的，Fc6序列中的终止密码子变为TAA。Fc6用寡核苷酸引物5’GAG CCC AAAT CTTCA GACAA AACTCACACA TGCCCA3’(SEQ ID NO：19)和5’GGCGCG CCTC TAGATTAACCCGGAGACA GG GAGAGGC3’(SEQ ID NO：21)编码Fc5的模板DNA产生的。
除在位于CH2结构域的EU索引位置Asn297的氨基酸取代物之外，Fc7与野生型γ1Fc相同。将Asn297突变为Gln残基，以防止在该残基位置的N联接的碳水化合物的附着。如上所述，在Fc7序列中的终止密码子被变为TAA。Fc7是通过重叠PCR产生，用野生型人IgGγ1Fc cDNA作为模板和寡核苷酸引物5’GAGCCC AAATCTTGCGACAAAACTCACA3’(SEQ ID NO：22)和5’GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT3’(SEQ ID NO：23)以产生Fc7的5’半、以及寡核苷酸引物5’CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA3’(SEQ ID NO：24)和5’TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3’(SEQ ID NO：20)以产生Fc7的3’半。将两种PCR产物组合，并且用寡核苷酸引物5’GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA3’(SEQ ID NO：22)和5’TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3’(SEQ ID NO：20)扩增。
将全部所得PCR产物凝胶纯化，克隆，并且用DNA序列分析确认。
D.氨基端被截短的TACI-Fc融合蛋白质的构建
四种氨基端被截短TACI-Fc的版本被产生出来。四种全都具有与SEQ ID NO：2氨基酸残基30号融合的修饰过的人组织纤溶酶原激活蛋白的信号序列(SEQ ID NO：25)。但是，这四种蛋白质在Fc5与SEQ ID NO：2的TACI氨基酸序列融合的位点上不同。表3列出了四种融合蛋白质的结构。
表3
TACI融合蛋白质
 
TACI-Fc的名称 TACI氨基酸残基
TACI(d1-29)-Fc5 SEQ ID NO：2的30到154
TACI(d1-29，d107-154)-Fc5 SEQ ID NO：2的30到106
TACI(d1-29，d111-154)-Fc5 SEQ ID NO：2的30到110
TACI(d1-29，d120-154)-Fc5 SEQ ID NO：2的30到119
蛋白质编码表达盒采用标准技术通过重叠PCR产生(可参阅，例如：Horton等人，Gene77：61(1989))。将编码TACI的核酸分子和编码Fc5的核酸分子用作PCR的模板。寡核苷酸引物在表4和表5中被列出。
表4
用于生产TACI融合蛋白质的寡核苷酸引物
Figure S02812698X19950430D000691
表5
寡核苷酸序列
 
引物 核苷酸序列 SEQIDNo.  
ZC24，903 5′TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA3′ 40
ZC24，955 5′TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA3′ 41
ZC24，952 5′TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAA-TCTTCA3′ 42
ZC24，946 5′TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3′ 20
ZC24，951 5′TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA3′ 43
ZC24，949 5′ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA3′ 44
ZC28，978 5′TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA3′ 45
ZC28，979 5′CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA3′ 46
ZC28，981 5′TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA3′ 47
ZC28，980 5′GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA3′ 48
第一轮的PCR扩增由两种反应来组成得到四种氨基末端被截短的各版本。对于每一个版本，在一种反应中用5’和3’TACI寡核苷酸，而在另一种反应中用5’和3’F c5寡核苷酸，分别进行两种反应。第一轮的PCR扩增的条件如下所述。向25μl的最终体积中加入DNA模板大约200ng、10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)2.5μl、2.5mM dNTPs 2μl、20μM的5’寡核苷酸和3’寡核苷酸各0.5μl、Pfu聚合酶(2.5单位，Stratagene)0.5μl。扩增温度分布由以下组成：在94℃持续3分钟，35个循环的在94℃持续15秒钟，50℃持续15秒钟，72℃持续2分钟，接着在72℃延伸反应2分钟。用琼脂糖凝胶电泳将反应产物分离，将与预测尺寸相对应的条带从凝胶中切下，并且使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行回收。
第二轮的PCR扩增反应，或重叠PCR扩增反应，是采用从第一轮PCR凝胶纯化的片段作为模板而进行的。第二轮的PCR扩增反应的条件如下所述。向25μ1的最终体积中加入TACI片段和Fc片段的DNA模板每种大约10ng、10x Pfu反应缓冲液(Strategene)2.5μl、2.5mM dNTPs 2μl、20μM ZC24，903(SEQ ID NO：40)和ZC24，946(SEQID NO：20)各0.5μl以及Pfu聚合酶(2.5单位，Stratagene)0.5μl。扩增温度分布由以下组成：在94℃持续1分钟，35个循环的在94℃持续15秒钟，55℃持续15秒钟，72℃持续2分钟，接着在72℃延伸反应2分钟。用琼脂糖凝胶电泳将反应产物分离，将与预测尺寸相对应的条带从凝胶中切下，并且使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书进行回收。
对于四种版本的氨基末端被截短的TACI-Fc的PCR产物，将每种都分别使用Invitrogen’s ZEROBLUNT TOPO PCR C1oning试剂盒，按照制造商推荐的方法克隆。表6确定了这些TACI-Fc构建体的核苷酸和氨基酸序列。
表6
TACI-Fc变异体的序列
Figure S02812698X19950430D000711
在核苷酸序列得到验证后，将包含氨基末端被截短的TACI-Fc融合物的四种版本中的各种的质粒用FseI和AscI酶切消化，以释出编码氨基酸的片段。将FseI-AscI片段连接到含有CMV启动子和SV40多A片段的哺乳动物表达载体中。将表达载体引入到如下所述的中国仓鼠卵巢细胞中。
实施例2
用中国仓鼠卵巢细胞生产TACI-Fc蛋白质
借助于电转染，将TACI-Fc表达构建体用来转染在无动物蛋白的培养基中生长的适应悬浮的中国仓鼠卵巢(CHO)DG44细胞(Urlaub等人，Som.Cell.Molec.Genet12：555(1986))。由于在两个二氢叶酸还原酶染色体位置的缺失，CHODG44细胞缺少功能性二氢叶酸还原酶基因。在氨甲蝶呤浓度增加的情况下，细胞的生长导致表达构建体上二氢叶酸还原酶基因和连接的编码重组蛋白质的基因的扩增。
将CHODG44细胞在PFCHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)、4mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences)、和1x hypothanxine-胸苷补液(Life Technologies)中传代，然后在37℃和5％CO2的条件下将该细胞在置于旋转式摇动平台上以120RPM旋转的Corning摇动烧瓶中温育。将该细胞用线性化的表达质粒分别转染。为确保无菌，将Eppendorf试管中的质粒DNA 200μg与剪切的鲑鱼精子(salmonsperm)载体DNA(5’→3’Inc.Boulder，CO，10mg/ml)20μl、3M NaOAc(pH值5.2)22μl、以及100％乙醇(Gold Shield ChemicalCo.，Hayward，CA)484μl混合，在冰上进行25分钟的单次乙醇沉淀。温育后，将试管置于在4℃冷室中的无菌台(microfuge)中以14,000RPM离心，去上层清液，然后将沉淀用70％乙醇0.5ml洗涤两次，之后让其风干。
当通过在25ml锥形离心试管中以900RPM持续5分钟离心总共106细胞(16.5ml)，将DNA沉淀进行干燥时，CHODG44细胞被制备出。将CHO DG44细胞重新悬浮于总量300μl的PFCHO生长培养基中，之后放入带有0.4cm电极缺口的基因脉冲杯(Gene-PulserCuvette)(Bio-Rad)中。大约干燥50分钟后，将DNA在500μl PFCHO生长培养基中重新悬浮，加入杯中的细胞中以使总量不超过800μl，并且让其置于室温中持续5分钟以减少气泡形成。将杯置于0.296kV(千伏)和0.950HC(高电容)的BioRad Gene Pulser II设备中，并立即电穿孔。
在将细胞放置于在CoStar T-75烧瓶中的总量20ml的PFCH0培养基中之前，将细胞在室温温育5分钟。将烧瓶置于在37℃和5％CO2的条件下48小时，然后，在利用锥虫蓝不相容性通过血细胞记数器对细胞记数，并放入不含hypothanxine-胸苷补充液而含有200mM氨甲蝶呤(Cal Biochem)的PFCHO选择培养基中。
氨甲蝶呤选择过程的回收时，采用蛋白质印迹分析，检测含有分泌的TACI-Fc蛋白质的条件培养基。
实施例3
TACI-Fc蛋白质的结构分析
在某些情况下，TACI-Fc融合蛋白质在分析之前被部分纯化。将中国仓鼠卵巢细胞培养的条件培养基通过0.22μm的滤器进行无菌过滤，并且将其TACI-Fc蛋白捕获在蛋白质A柱上。结合蛋白质A的物质被洗脱，并通过S-200大小排阻柱而进行最终的纯化。
细胞的条件培养基和纯化的蛋白质两者上均进行蛋白质印迹分析，以评定TACI-Fc蛋白质的结构稳定性。简单的说，将蛋白质或上层清液的样品转移到硝化纤维素膜上，并用缀合过氧化物酶的羊抗鼠IgG2a(Boehringer Mannheim)，或缀合过氧化物酶的羊抗人IgG Fc特异性抗血清(Pierce)检测TACI-Fc蛋白质。
氨基末端的氨基酸序列分析在来自Perkin Elmer AppliedBiosystems Division(Foster City，CA)的Model 476A和494蛋白质测序系统上进行。数据分析用Applied Biosystems Model 610A蛋白质测序的数据分析系统，2.1a版进行。所用的绝大多数的设备和试剂来自Applied Biosystems，Inc。
实施例4
TACI-Fc蛋白质的功能分析
采用两种方法检测四种TACI-Fc蛋白质与ZTNF4的结合特性。一种方法测定TACI-Fc构建体与TACI覆盖的平板竞争125I-标记的ZTNF4的能力。在第二种方法中，增加浓度的125I-标记的ZTNF4与每种TACI-Fc构建体一起被温育，并测定与沉淀的ZTNF4-TACI-Fc复合物相关的放射活性。TACI-Fc融合蛋白质具有缺少SEQ ID NO：2氨基酸序列的前29个氨基酸残基的TACI部分。一种融合蛋白质具有带完整柄区的TACI部分(TACI(d1-29)-Fc5)，而其它三种融合蛋白质具有在柄区有多种缺失的TACI部分(TACI(d1-29，d107-154)-Fc5；TACI(d1-29，d111-154)-Fc5；TACI(d1-29，d120-154)-Fc5)。
A.竞争性结合测定
根据标准方法，用Iodobeads(Pierce)放射碘化ZTNF4。简单地说，采用用单个Iodobeads，将50μgZTNF4用4mCi的125I碘化。用0.25％的牛血清白蛋白溶液猝灭反应，使用PD-10柱(Pierce)通过凝胶过滤去除游离125I。在脱盐步骤之前和之后用三氯乙酸沉淀检测125I-ZTNF4制备物的特异性放射活性。
将被称为“TACI-N”的TACI受体的N-末端片段加到96孔平板(0.1μg/ml，共100μl)，在4℃下温育过夜。洗涤平板，用Superblock(Pierce)封闭，然后再洗涤。将TACI-Fc构建体，以0到11.5ng/ml范围内的不同浓度，与固定浓度的125I-ZTNF4(20ng/ml)混合，然后在用TACI-N覆盖的平板上在37℃温育2小时。对照物在溶液中含有TACI-N，或者不含有TACI-Fc。温育后，洗涤平板并且记数。每种测试三次进行。
结果显示，TACI-Fc构建体在浓度大约100ng/ml或更高的情况下完全抑制125I-ZTNF4的结合。TACI-Fc蛋白质、TACI(d1-29)-Fc5、TACI(d1-29，d111-154)-Fc5和TACI(d1-29，d120-154)-Fc5与TACI-Fc构建体，TACI(d1-29，d107-154)-Fc5相比，是更有效的抑制剂。单独的Fc片段不抑制结合。对三种实验的每种构建体计算IC50值。各种构建体的平均值是：TACI(d1-29)-Fc5：2.07nM；TACI(d1-29，d107-154)-Fc5：4.95nM；TACI(d1-29，d111-154)-Fc5：2.31nM；和TACI(d1-29，d120-154)-Fc5：2.21nM。
B.溶液结合测定
以0.05nM浓度，将每种TACI-Fc构建体以0.25ml/试管的总体积在室温下与0.4pM到1.5nM的125I-ZTNF4一起温育30分钟。向每个试管加入Pansorbin(Staph)悬浮液，15分钟后，将样品离心处理，洗涤两次，将沉淀记数。通过将130nM未标记的ZTNF4加入125I-ZTNF4/TACI-Fc的混合物中，测定非特异性的结合。通过从在每种125I-ZTNF4浓度下结合的总cpm减去在未标记ZTNF4存在下结合的cpm来计算特异性结合。每种测试重复三次进行。结合常数采用GraphPadPrism软件(MacIntosh v.3.0)计算。
图4说明了125I-ZTNF4与多种TACI-Fc构建体的特异性结合。与每种构建体的结合都显示接近饱和，并且构建体TACI(d1-29)-Fc5、TACI(d1-29，d111-154)-Fc5、TACI(d1-29，d120-154)-Fc5与TACI(d1-29，d107-154)-Fc5的结合相比较则更高。将Bmax和Kd值计算出来，其结果总结在表7中。
表7
125I-ZTNF4与TACI-Fc构建体的结合
 
TACI-Fc构建体 Kd(nM) Bmax(nM)
TACI(d1-29)-Fc5 0.134 0.023
TACI(d1-29，d107-154)-Fc5 0.121 0.010
TACI(d1-29，d111-154)-Fc5 0.115 0.018
TACI(d1-29，d120-154)-Fc5 0.092 0.021
实施例5
循环ZTNF4的测定
采用电化学发光试验，测定有着疾病情况的(例如：SLE、类风湿性关节炎)个体相对于正常个体的ZTNF4水平。再用ORIGIN缓冲液(Igen，Gaithersburg，MD)中制备的10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml的人的可溶的ZTNF4，绘出标准曲线。将血清样品在ORIGIN缓冲液中稀释。将标准和样品与在ORIGIN Assay缓冲液(IGEN)稀释到1μg/ml的生物素化的兔抗人ZTNF4-NF BV抗体和用ORIGIN Assay缓冲液(IGEN)稀释到1μg/ml的ruthenylated兔抗人ZTNF4-NF BV多克隆抗体一起，在室温下温育2小时。温育后，将样品旋动并且将0.4mg/ml链酶抗生物素Dynabeads(Dynal，Oslo，挪威)以50μl/管加入到每个标准和样品中，在室温下温育30分钟。然后将样品旋动，并且根据生产商的说明书用Origin Analyzer(Igen)分析仪分析样品。Origin实验是以电化学发光为基础的并且以ECL显示读数。在一项研究中，从两种都已经进展为肾小球肾炎和自身免疫疾病晚期的NZBWF1/J和MRL/Mpj-Fas1pr小鼠得到的血清样品中检测到ZTNF4水平的增加。
ORIGIN ASSAY也被用于检测相对于正常个体循环水平的SLE患者血液中的ZTNF4的水平。用ORIGIN缓冲液(Igen)中制备的10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml的人的可溶的ZTNF4，绘出标准曲线。所有患者样品以25μl的最终体积重复三次进行。将标准和样品与用ORIGIN Assay缓冲液(IGEN)稀释到1μg/ml的捕捉抗体、生物素化的兔抗人ZTNF4-NF BV多克隆抗体和用ORIGIN Assay缓冲液(IGEN)稀释到1μg/ml的检测抗体、ruthenylated兔抗人ZTNF4-NF BV多克隆抗体一起，在室温下温育2小时。温育后，将样品旋动并且将0.4mg/ml链酶抗生物素Dynabeads(Dynal)以50μl/管加入到每个标准和样品中，在室温下温育30分钟。然后将样品旋动，并且根据生产商的说明书用Origin 1.5Analyzer(Igen)分析仪分析样品。
该实验包括28个正常对照样品和20个来自诊断为SLE的患者的样品。与正常对照血清供者相比较，从诊为SLE的患者的血清中观察到ZTNF4水平的提高。与任意人群参考血清样品相比较，ZTNF4水平被计算出在患者或对照样品中ZTNF4水平成倍提高。28个对照样品的平均值高于人群参考样品1.36倍，而20个SLE患者的样品的平均值则是4.92倍。20个SLE患者中的7个具有高于对照样品的平均值2倍的ZTNF4水平，而仅有一个对照个体高于对照样品的平均值2倍以上。
Figure IYZ000004137683900021
Figure IYZ000004137683900041
Figure IYZ000004137683900051
Figure IYZ000004137683900061
Figure IYZ000004137683900071
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Figure IYZ000004137683900101
Figure IYZ000004137683900111
Figure IYZ000004137683900121
Figure IYZ000004137683900131
Figure IYZ000004137683900151
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Figure IYZ000004137683900171
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Figure IYZ000004137683900241
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Figure IYZ000004137683900261
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Figure IYZ000004137683900311
Figure IYZ000004137683900321
Figure IYZ000004137683900341
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Figure IYZ000004137683900361
Figure IYZ000004137683900371
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Figure IYZ000004137683900421
Figure IYZ000004137683900431
Figure IYZ000004137683900451
Figure IYZ000004137683900461
Figure IYZ000004137683900481
Figure IYZ000004137683900491
Figure IYZ000004137683900501
Figure IYZ000004137683900531
Figure IYZ000004137683900541
Figure IYZ000004137683900551
Figure IYZ000004137683900561

Claims (35)

1.跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质在生产用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由下列部分组成：
(a)TACI受体部分，其由下列氨基酸残基组成：(i)SEQ IDNO：2的氨基酸残基30到110，或者(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到154，并且其中TACI受体部分至少与ZTNF2或ZTNF4之一结合，和
(b)包含免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白部分。
2.权利要求1所述的应用，其中免疫球蛋白部分包括重链恒定区。
3.权利要求2所述的应用，其中免疫球蛋白部分包括人的重链恒定区。
4.权利要求3所述的应用，其中重链恒定区是IgG1重链恒定区。
5.权利要求4所述的应用，其中免疫球蛋白部分是包括CH2和CH3结构域的IgG1 Fc片段。
6.权利要求5所述的应用，其中免疫球蛋白部分是包括SEQ IDNO：33氨基酸序列的IgG1 Fc片段。
7.权利要求6所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成。
8.权利要求1所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
9.权利要求1所述的应用，其中药物对体外培养的细胞给药。
10.权利要求1所述的应用，其中药物是包含TACI-免疫球蛋白融合蛋白质和制药上可接受的载体的药物组合物，并且其中药物组合物配制成适于对患有肿瘤的哺乳动物受治疗者给药。
11.权利要求10所述的应用，其中药物组合物的给药抑制哺乳动物受治疗者中B淋巴细胞的增殖。
12.跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质在生产用于在哺乳动物受治疗者中抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ IDNO：54的氨基酸序列组成。
13.权利要求12所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
14.一种TACI-免疫球蛋白融合蛋白质，其由下列部分组成：
(a)跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)受体部分，其中所述TACI受体部分是由下列氨基酸残基组成的多肽：(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到110，或者(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到154，并且其中TACI受体部分至少与ZTNF2或ZTNF4中之一结合，和
(b)包括免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白部分。
15.权利要求14所述的融合蛋白质，其中免疫球蛋白部分包括重链恒定区。
16.权利要求15所述的融合蛋白质，其中免疫球蛋白部分包括人的重链恒定区。
17.权利要求16所述的融合蛋白质，其中重链恒定区是IgG1重链恒定区。
18.权利要求17所述的融合蛋白质，其中免疫球蛋白部分是包括CH2和CH3结构域的IgG1 Fc片段。
19.权利要求18所述的融合蛋白质，其中免疫球蛋白部分是包括SEQ ID NO：33氨基酸序列的IgG1 Fc片段。
20.权利要求19所述的融合蛋白质，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成。
21.权利要求14所述的融合蛋白质，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
22.编码权利要求14所述的融合蛋白质的核酸分子。
23.权利要求22所述的核酸分子，其中核酸分子由SEQ ID NO：53的核苷酸序列组成。
24.一种药物组合物，它含有制药上可接受的载体和跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
26.跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质在生产用于在哺乳动物受治疗者中降低ZTNF4的循环血液水平的药物中的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由下列部分组成：
(a)TACI受体部分，其中所述TACI受体部分是由下列氨基酸残基组成的多肽：(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到110，或者(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基30到154，并且其中TACI受体部分与ZTNF4结合，和
(b)包括免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白部分。
27.权利要求26所述的应用，其中免疫球蛋白部分包括重链恒定区。
28.权利要求26所述的应用，其中免疫球蛋白部分包括人的重链恒定区。
29.权利要求28所述的应用，其中重链恒定区是IgG1重链恒定区。
30.权利要求29所述的应用，其中免疫球蛋白部分是包括CH2和CH3结构域的IgG1 Fc片段。
31.权利要求30所述的应用，其中免疫球蛋白部分是包括SEQ IDNO：33氨基酸序列的IgG1 Fc片段。
32.权利要求31所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成。
33.权利要求26所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
34.跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用剂(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白质在生产药物中的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成。
35.权利要求34所述的应用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白质是二聚体。
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第33-37行,说明书第99页第30-36行,说明书第100页第29-34行,实施例7,说明书第1页第20行-第2页第4行,说明书第56页，第21-29行,说明书第33页，第1-17行,说明书第38页第36行-第39页第10行.

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