JPH10509328A - ケラチノサイト増殖因子−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。そのようなポリペプチドを、傷害の治癒を刺激し、瘢痕を減少させ、毛髪の喪失を防ぐよう使用される上皮細胞増殖を刺激するために利用する方法をもまた開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよび癌、乾癬、カポジ肉腫、ケロイド、網膜症および再狭搾などの増殖性疾患を治療するための治療剤としてのその使用もまた開示する。ＫＧＦ−２のコーディング配列における変異および宿主由来のサンプル中のＫＧＦ−２タンパク質の濃度の変化を検出するための診断方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ケラチノサイト増殖因子−２ 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの 製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＫＧＦ− ２」と呼ぶ、ケラチノサイト増殖因子−２である。本発明はまた、そのようなポ リペプチドの作用を阻害することにも関する。 線維芽細胞増殖因子ファミリーは軟組織（soft-tissue）の増殖および再生に 関連する増殖因子の大きなファミリーとして現れた。現在該ファミリーには、タ ンパク質レベルでの多様な程度のホモロジーを共有し、１つの例外はあるが、同 様の広範なマイトジェンスペクトルを有する、すなわち、それらは中胚葉および 神経外胚葉由来の多様な細胞の増殖を促進するおよび／または脈管形成を促進す るようであるいくつかのメンバーが含まれる。 該ファミリーの多様なメンバーの発現パターンは発生のある段階の非常に限ら れた発現から多様な組織および器官において遍在する発現にまでわたり、非常に 多彩である。全てのメンバーはヘパリンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンお よびグリコサミノグリカンに結合し、細胞外マトリクスに強く集中するようであ る。ＫＧＦはもともとは配列のホモロジーまたは因子の精製およびクローニング によってＦＧＦファミリーの一員として同定された。 ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）は培養マウスケラチノサイト株のマイトジ ェンとして単離された（ルービン（Ｒubin，Ｊ．Ｓ．）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、 ８６：８０２−８０６（１９８９））。ＦＧＦファミリーの他のメンバーと異な り、間充織由来の細胞に殆ど活性を有さないが、上皮細胞の増殖を刺激する。ケ ラチノサイト増殖因子遺伝子は１９４のアミノ酸ポリペプチドをコードする（フ ィンチ（Ｆinch，Ｐ．Ｗ．）ら、Ｓcience、２４５：７５２−７５５（１９８９ ））。 Ｎ末端の６４のアミノ酸は独特であるが、該タンパク質の残りはｂＦＧＦに約３ ０％のホモロジーを有する。ＫＧＦはＦＧＦファミリーの中で最も逸脱したメン バーである。その分子は疎水性シグナル配列を有し、効果的に分泌される。翻訳 後の修飾にはシグナル配列の開裂および１つの部位でのＮ結合したグリコシル化 を含み、その結果２８kＤaのタンパク質となる。ケラチノサイト増殖因子は皮膚 および胎児の肺由来の線維芽細胞により産生される（ルービンら（１９８９）） 。ケラチノサイト増殖因子ｍＲＮＡは成人腎臓、結腸および腸骨に発現するが脳 または肺には発現しないことが見いだされている（フィンチら、Ｓcience、２４ ５：７５２−７５５（１９８９））。ＫＧＦはＦＧＦタンパク質ファミリー内の 保存領域を示す。ＫＧＦはＦＧＦ−２受容体に高アフィニティーで結合する。 本発明のポリペプチドはＦＧＦのファミリーのメンバーであると推定的に同定 され、特に、該ポリペプチドはＦＧＦファミリの他のメンバーとのアミノ酸配列 ホモロジーの結果としてＫＧＦ−２であると推定的に同定されている。 本発明の１つの態様により、ＫＧＦ−２である新規な成熟ポリペプチドならび に生物学的に活性であり、診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナロ グおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。 本発明の１つの態様により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含 め、ヒトＫＧＦ−２をコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのアン チセンスアナログ、ならびに生物学的に活性であって、診断上または治療上有用 なそのフラグメントを提供する。 本発明の他の態様により、ＫＧＦ−２タンパク質の組換え産生において試薬と して有用なクローニングプラスミドおよび発現プラスミドなどの組換えベクター を用いた組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法、ならびにヒトＫ ＧＦ−２の核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を提供する。 本発明のさらに別の態様により、例えば上皮細胞増殖を傷害の治癒のために刺 激することおよび毛小胞の産生を刺激することおよび皮膚傷害の治癒を刺激する ことなどのための治療上の目的のためそのようなポリペプチドまたはそのような ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。 本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供 する。 本発明のさらに別の態様により、ヒトＫＧＦ−２配列に特異的にハイブリダイ ズする十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。 本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニ ストを提供する。該アンタゴニストは、例えば傷害治癒プロセスにおいて瘢痕（ scarring）を減少させること、腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ および腫瘍の増殖を妨害および／または治療することなどのそのようなポリペプ チドの作用を抑制するのに使用するものである。 本発明のさらに別の態様により、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異またはそのよう な配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現に関連した疾患またはその疾 患の罹患し易さを検出する診断アッセイを提供する。 本発明の別の態様により、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの 製造に関連したイン・ビトロでの目的のためにそのようなポリペプチドまたはそ のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する 。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら かであろう。 以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含 される本発明の範囲を限定しようとするものではない。 図１は、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡおよび対応する推定アミノ酸配列を 説明する。最初の３６アミノ酸残基は推定リーダー配列（下線を記す）を表わす 。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。配列決定の不正確さはポリ ヌクレオチド配列を決定しようとする際の共通の問題である。配列決定は、３７ ３自動化ＤＮＡシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ、インク(Ａppli ed Ｂiosystems，Ｉnc.))を使用して行った。配列決定の正確さは、９７％以上 であると予想される。 図２は、本発明のポリペプチドと他の線維芽細胞増殖因子との間のアミノ酸配 列比較を説明する。 本発明の一つの態様により、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有す る成熟ポリペプチド、または１９９４年１２月１６日にＡＴＣＣ受託番号第７５ ９７７号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ チドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト前立腺および胎 児の肺から得られる。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの断片は最初にヒト 正常前立腺由来のライブラリーから単離された。全長タンパク質をコードするオ ープン・リーディング・フレームはランダムにプライミングされたヒト胎児肺ｃ ＤＮＡライブラリーから引き続き単離した。それは、構造上、ＦＧＦファミリー に関係がある。それは２０８個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ ンリーディングフレームを含み、そのうち最初の３６アミノ酸残基が推定リーダ ー配列であり、それゆえ成熟タンパク質は１７２アミノ酸を含む。そのタンパク 質は、ヒトケラチノサイト増殖因子に対し、２０６アミノ酸長にわたり、４５％ の同一性および８２％の類似性をもって、最も高い程度のホモロジーを示す。 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、こ のＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮ Ａは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コーディング鎖ま たは非コーディング(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコード するコーディング配列は、図１（配列番号：２）に示すコーディング配列または 寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってよく、あるいは遺伝コー ドの重複または縮重の結果として、図１（配列番号：１）のＤＮＡまたは寄託さ れたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であって もよい。 図１（配列番号：２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコ ードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが 含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコ ーディング配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列と いったような付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列( ま た場合により、付加的コーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーディ ング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'および／または３'といった ような非コーディング配列。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリ ペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、 付加的コーディングおよび／または非コーディング配列が含まれるポリヌクレオ チドを包含する。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変 異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在す るアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る 。 従って、本発明には、図１（配列番号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチド または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの 変異体が含まれ、これらの変異体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまた は寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン ト、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、 欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。 先に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）に示すコー ディング配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコーデ ィング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有し得る。 当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオ チドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、 これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。 本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポ リペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞から のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に 、 同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有する ポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型 のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチ ドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク 質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、 また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タン パク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ 配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方 を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする マーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そ のマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するため の、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であって よく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合 には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは 、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( ウイルソン（Ｗilson,Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。 本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性 がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本 発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイ ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくと も９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう ことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズ するポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたc ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしく は活性を保持するポリペプチドをコードする。 本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ ペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への 便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求 されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオ チドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾す る際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売す るには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与され ない。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する、または 寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さ らにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に 関する。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナロ グ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしく は活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテ イン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造する ことができるプロプロテインが含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまた はそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型 アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コー ドによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくても よいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、 または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合 物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの 、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使 用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成 熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導 体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。 「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存 在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きて いる動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され ていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同 じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌク レオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチ ドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは 組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術 による製造にも関する。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本 発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス フォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラ スミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プ ロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＫＧＦ−２遺伝 子を増幅するのに適するよう修飾された従来の栄養培地で培養することができる 。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に 使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用 することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発 現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。その ようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４ ０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラス ミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニ ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡ が含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であっ て、生存可能である限り、使用することができる。 適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般 には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部 位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ れる。 発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能 に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、 以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacま たはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞または それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモー ター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終 結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。 さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼ またはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリン またはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選 択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカ ー遺伝子を含むのが好ましい。 上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制 御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、 その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。 適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞 ；Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、 ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物 細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思 われる。 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含む 組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入 されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む 。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動 可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターお よびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベク ターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キアゲン( Ｑiagen)）、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、 pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ （ストラタジーン(Ｓtratagene)）；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３ −３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア(Ｐharmacia)）。真核生物用: p ＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶ Ｋ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファルマシア)。しかし、他のいずれのプラ スミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である 限り、使用することができる。 プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝 子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およ びＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、 Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには 、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後 期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ ベルの範囲内である。 さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿 主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞 であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築 物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ− デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行 うことができる。(デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッ ティー（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオ ロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology）（１９８６）)。 宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、 従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発 明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系も また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・ク ローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌab oratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、（１９８９）により記載されており、この開示は、 本明細書の一部を構成する。 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エン ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡ のシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側 にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル スエンハンサーが含まれる。 通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリ ン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転 写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キ ナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ ョックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構 造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の 細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共 に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所 望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与え るＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。 細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構 造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーター を有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベク ターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内で の増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよ び複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿 主には、大腸菌（Ｅ.coli）、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）、サ ルモネラ・ティフィムリウム （Ｓalmonella typhimurium）、ならびにシュード モナス（Ｐseudomonas）属、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）属、および スタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、 他のものもまた、選択物質として使用することができる。 代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは 、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素 を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の 複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemica ls）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオ テク (Ｐromega Ｂiotec)、マディソン、ウィスコンシン、米国)が含まれる。これら のpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列 と組み合わせる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度 まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により 破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理 、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊 でき、そのような方法は、当業者に周知である。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用 することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃell 、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣ ＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、 例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺 乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、 またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド ナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列 もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列 、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与える ことができる。 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出 、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト グラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト グラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製するこ とができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配 置を 完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー( ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物 であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、 グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチ ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。 本発明のポリペプチドは新規血管の成長または脈管形成を刺激するために使用 される。特に、本発明のポリペプチドはケラチノサイト細胞の成長および増殖を 刺激する。従って、本発明のポリペプチドは傷害の治癒を刺激することおよび毛 髪喪失を防ぐことに関連するケラチノサイトを刺激することに使用する。 本発明のポリペプチドはまた、上皮細胞増殖を刺激することによって皮膚の傷 害を治癒することに使用してよい。 本発明のポリペプチドはまた、例えば筋肉細胞および神経組織、前立腺細胞お よび肺細胞などの細胞の分化を刺激するのに使用してよい。 １〜３６までのアミノ酸をコードするＫＧＦ−２のシグナル配列は、一般的に ハイブリダイゼーションおよび／またはコンピューターサーチ演算方式によって 分泌されたタンパク質を同定するのに使用してよい。 ＫＧＦ−２のヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションによって５'配列を 単離するために使用することができる。ついで、本来のプロモーター／エンハン サー配列の制御下でＫＧＦ−２遺伝子を含むプラスミドは内在性の細胞およびウ イルスのＫＧＦ−２遺伝子発現のトランスアクチベーターの同定を目的としたイ ン・ビトロの研究において使用することができる。 ＫＧＦ−２タンパク質はまた、ＫＧＦ−２受容体に作用を及ぼすペプチドミメ ティックス（peptido-mimetics）を同定するよう設計された実験において正のコ ントロールとして使用してよい。 本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチドまたはそのようなポ リペプチドをコードするポリヌクレオチドを科学的研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡ ベクターの製造に関連したイン・ビトロでの目的のためおよびヒトの疾患の診断 薬および治療薬を提供する目的のために利用する方法を提供する。 全長のＫＧＦ−２遺伝子のフラグメントをｃＤＮＡライブラリーのハイブリダ イゼーションプローブとして使用して全長ＫＧＦ−２遺伝子を単離し、これらの 遺伝子と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離す る。一般的にこのタイプのプローブは少なくとも２０塩基を有する。しかしなが ら、好ましくは、該プローブは少なくとも３０塩基を有し、一般的には５０塩基 を越えず、しかし一層多数の塩基を有していてよい。該プローブはまた、全長の 転写物に対応するクローン、および制御領域およびプロモーター領域、エキソン およびイントロンを含む完全なＫＧＦ−２遺伝子を含む単一または複数のゲノム クローンを同定するのに使用してよい。スクリーニングの例にはオリゴヌクレオ チドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用することによるＫＧＦ−２ 遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列 を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーに該 プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに使用する。 本発明はＫＧＦ−２ポリペプチドの受容体の同定方法を提供する。該受容体を コードする遺伝子は当業者に公知の多数の方法、例えば、リガンドパンニングお よびＦＡＣＳソーティング（コリガン（Ｃoligan）ら、カレント・プロトコール ズ・イン・イムン（Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun．）、１（２）、第５章、 （１９９１））などにより同定することができる。好ましくは、発現クローニン グを用い、その際、ポリアデニル化したＲＮＡを該ポリペプチドに応答性の細胞 から調製し、ついでこのＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブラリーをプールに 分け、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答性でない他の細胞にトランスフェ クションするために使用する。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクシ ョンした細胞を標識したポリペプチドにさらす。該ポリペプチドはヨウ素化また は 部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位を含めることを含む多様な手段によ って標識することができる。固定およびインキュベーションの後でスライドをオ ートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同定し、ついでサブプールを 調製し、ついで相互作用性のサブ−プールおよび再スクリーニング方法を用いて 再度トランスフェクションし、最終的に推定受容体をコードする単一クローンを 産生する。 受容体の同定のための別法として、標識したポリペプチドを細胞膜または受容 体分子を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋した物質 をＰＡＧＥ分析によって分離し、ついでＸ−線フィルムにさらす。ポリペプチド の受容体を含む標識した複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分離し、タ ンパク質マイクロシークエンシングにかける。マイクロシークエンシングから得 たアミノ酸配列を推定受容体をコードする遺伝子を同定するためｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするための縮重したオリゴヌクレオチドプローブのセッ トを設計するのに使用する。 本発明はＫＧＦ−２の作用をアゴナイズするかまたはＫＧＦ−２の機能をブロ ックするものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。そのよ うなアッセイの例には、哺乳動物のケラチノサイト細胞、スクリーニングすべき 化合物、および³［Ｈ］チミジンを、ケラチノサイト細胞が通常増殖する細胞培 養条件下で混合することを含む。コントロールアッセイはスクリーニングすべき 化合物の不在下で行い、該化合物の存在下でのケラチノサイトの増殖量と比較し て該化合物がケラチノサイトの増殖を刺激するかどうかを決定する。 アンタゴニストをスクリーニングするため、同じアッセイをＫＧＦ−２の存在 下で準備し、ついでケラチノサイト増殖を妨害する化合物の能力を測定し、アン タゴニストの能力を決定する。ケラチノサイト細胞増殖の量は³［Ｈ］チミジン の取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定する 。 他の方法において、ＫＧＦ−２受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物 を該化合物の存在下で標識したＫＧＦ−２とともにインキュベーションする。つ いで、この相互作用を増強またはブロックする化合物の能力を測定することがで きる。別のやり方として、ＫＧＦ−２と受容体との相互作用の後の公知の第二メ ッセンジャー系の応答を測定し、該化合物の存在下または不在下において比較す る。そのような第二メッセンジャー系には以下に限られるものではないが、ｃＡ ＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解 が含まれる。 可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストの例には、該ポリペプチドに結合する 、抗体、また幾つかの場合にはオリゴヌクレオチドが含まれる。かわりに、可能 性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストはＫＧＦ−２受容体に結合するＫＧＦ−２の 変異体の形態であってよく、しかしながら、第２メッセンジャー応答を引き出さ ないことから、ＫＧＦ−２アンタゴニストの作用を有効にブロックする。 別の可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって 調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重 らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御 することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ への結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌク レオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のア ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを 、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−リ ー（Lee）ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃo oney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan ）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、 転写およびＫＧＦ−２の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド は、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＫＧＦ− ２ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Ｏkano）、Ｊ. Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチドズ・ア ズ・アンチセンス・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏigodeoxynucleotide s asＡntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐress）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ （１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、 アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＫＧＦ−２の 産生を阻害することができる。 可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストには、ＫＧＦ−２受容体に結合する、 および該受容体の結合部位を占め、それによってＫＧＦ−２に近づき難くして正 常な生物学的活性を妨げる小分子が含まれる。。小分子の例には、これらに限定 されるものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。 ＫＧＦ−２アンタゴニストを腫瘍中の新規血管成長または脈管形成の誘導を妨 害するのに使用する。ＫＧＦ−２によって刺激された脈管形成はまた、糖尿病性 網膜症を含む本発明のアンタゴニストによって治療される、および慢性関節リウ マチなどの病理学組織の成長の抑制によって治療されるいくつかの病理に貢献す る。 ＫＧＦ−２のアンタゴニストはまた、ボーマン嚢を満たす細胞塊を形成する糸 球体上皮細胞の顕著な増殖によって特徴づけられる糸球体腎炎を治療するために 使用してよい。 アンタゴニストはまた手術後のケロイドの形成、心筋梗塞後の線維症、肺線維 症に関連する線維傷害および再狭搾において見られる瘢痕組織の過剰増殖を抑制 するために使用してもよい。ＫＧＦ−２アンタゴニストはまた、癌およびカポジ 肉腫を含むＫＧＦ−２によって刺激される他の増殖性の疾患を治療するのに使用 してよい。 ＫＧＦ−２アンタゴニストはまた、上皮細胞増殖によって特徴づけられる角膜 およびブドウ膜の炎症の深層の慢性浸潤である角膜炎を治療するのに使用してよ い。 該アンタゴニストを例えば以下に記載するような製薬学的に許容し得る担体と ともに組成物において使用してよい。 本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、適当な製薬学的 担体と組み合わせて医薬組成物を含むよう使用することができる。そのような組 成物は、治療上有効な量の該ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストお よび薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、 これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロ ース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。 その製剤は、投与方法に適合すべきである。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１ つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を 規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに 、本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物 と共に使用することができる。 該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経 路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体 的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、そ れらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、そ れらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多 くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k g〜約１mg／kg(体重)である。局所投与の具体的な場合においての用量は１cm²あ たり０.１μｇから９mgである。 該ＫＧＦ−２ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニ ストまたはアゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのよう なポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することが できる。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボにおいてポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を 該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である 。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子 の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。 同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにお ける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当業界で 知られているように、細胞をイン・ビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン ・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを 含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができ る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法 および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を 操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運 搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボにおいて操作するために使用す ることができるアデノウイルスであってもよい。他の運搬ビヒクルの例にはＨＳ Ｖ−に基づいたベクター系、アデノ関連ウイルスベクターおよび不活性ビヒクル （例えばデキストランコートしたフェライト粒子）が含まれる。 本発明はまた、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異の存在に関係がある疾患、または 疾患に対する感受率を検出するための診断アッセイの一部としての、ＫＧＦ−２ 遺伝子の使用にも関する。 ＫＧＦ−２遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、Ｄ ＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば 、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮ Ａは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(サイキ（ Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を利用することに より、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的 に使用することができる。例としては、ＫＧＦ−２をコードする核酸に相補的な ＰＣＲプライマーを使用して、ＫＧＦ−２変異を同定して分析することができる 。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズに おける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射 能標識化ＫＧＦ−２のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＫＧＦ−２のアンチ センスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全 に対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、または融解温度の相違に より、対合していない二本鎖と区別することができる。 ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲル でのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げる ことができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視 覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、変性ホルムアミド 勾配ゲル上で区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動 度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々 な位置で遅延される(例えば、ミエーズ（Ｍyers）ら、Ｓcience、２３０：１２ ４２（１９８５）を参照)。 特定の位置での配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌ クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、 コットン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９ ８５）)。 従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ ン、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およびサザンブロッティングとい ったような方法により成し遂げることができる。 さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ 分析により検出することもできる。 本発明はまた、さまざまな組織中のＫＧＦ−２タンパク質のレベルの変化を検 出するための診断アッセイにも関する。なぜなら正常なコントロール組織サンプ ルに比較した該タンパク質の過剰発現は、例えば腫瘍などの疾患または疾患の罹 患し易さの存在を検出するからである。宿主由来のサンプル中のＫＧＦ−２タン パク質のレベルを検出するために使用するアッセイは当業者によく知られており 、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩ ＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ （コリガンら、カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー、１（２）、第 ６章、（１９９１））にはまずＫＧＦ−２抗原に特異的な抗体、好ましくはモノ クロー ナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体を該モノクローナル抗体 に対して調製する。リポーター抗体に放射能、蛍光または本例においては西洋ワ サビペルオキシダーゼ酵素などの検出可能な試薬を結合させる。サンプルを宿主 から採り、ついで固相支持体（例えばポリスチレン皿、該サンプル中のタンパク 質を結合させる）上でインキュベーションする。ついで皿上の遊離タンパク質結 合部位をウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質とインキュベーショ ンすることによりカバーする。ついで、モノクローナル抗体をインキュベーショ ンすると、その間にモノクローナル抗体がポリスチレン皿に付着したＫＧＦ−２ タンパク質に結合する。未結合のモノクローナル抗体をすべてバッファーで洗い 流す。ついで西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れ ると、ＫＧＦ−２に結合したモノクローナル抗体に対してリポーター抗体が結合 する。ついで未結合のリポーター抗体を洗い流す。ペルオキシダーゼ基質をつい で該皿に加え、所定の時間において発色する量が、標準曲線に比較した際の患者 のサンプルの所定量に存在するＫＧＦ−２タンパク質の量の測定値である。 競合アッセイを使用してよく、その際、ＫＧＦ−２に特異的な抗体を固相支持 体に結合させ、標識したＫＧＦ−２および宿主由来のサンプルを該固相支持体を 通過させ、例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーなどによって検出さ れたレベルの量を該サンプル中のＫＧＦ−２の量に相関させることができる。 「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイと同様である。「サンドイッ チ」アッセイではＫＧＦ−２を固相支持体を通過させ、固相支持体に結合した抗 体に結合する。第二抗体をついでＫＧＦ−２に結合させる。標識されており、第 二抗体に特異的である第三抗体をついで固相支持体を通過させて第二抗体に結合 させ、ついでその量を定量することができる。 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色 体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。実際の 配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置 をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマ ッ ピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階で ある。 簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳さ れていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上の エキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程 を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む 体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応する ヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与 えるであろう。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成 することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他 のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソー ティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特 異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ セレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ ーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ る。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することが できる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分な信号 強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが 得られたクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２, ０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、おそ らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の概説には、 ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）： ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニックス（a Ｍanual of Ｂasic Ｔec hniques）、パーガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８ ８）を参照。 ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的 位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え ば、マクジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マ ン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシ ティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary)を介してオンラインで利用できる)に見い出される。 次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分 析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノ ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全 てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ の変異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する 染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺 伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析およ び２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対す る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト 化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成 物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメン トの製造に使用することができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチ ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして 得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ リペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプ チドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような 抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する ことができる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗 体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(コ ーラー（Ｋohler）およびミルスタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２ ５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技 術(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、およ びヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(コー ル（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャ ンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン ・アール・リス・インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁において)が 含まれる。 単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し 得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプ チド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。 本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのよ うな実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこ とわらない限り、重量単位である。 以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および ／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限 定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手 可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触 媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており 、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう に使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築 のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中 、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に 適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間 のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えるこ とができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して 、所望のフラグメントを単離する。 切断したフラグメントのサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎuclei c Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ ポリア クリルアミドゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そ のような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナ ーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレ オチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ れていないフラグメントにライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ ル結合を形成する過程をいう(マニアチスら、同上、１４６頁)。特にことわらな い限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等 モル量の０.５μg当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、 既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。 外在性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に細胞が外在性ＤＮＡによって「形 質転換」されたという。外在性ＤＮＡは組み込まれて（共有結合して）細胞のゲ ノムを構成する染色体間（inter-chromosomal）ＤＮＡであってもなくてもよい 。例えば、原核生物および酵母では、外在性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソー ム要素の上に維持される。真核生物細胞に関しては、安定して形質転換されたま たはトランスフェクションされた細胞は、染色体複製により娘細胞によって外在 性ＤＮＡが遺伝されるように外在性のＤＮＡが染色体に組み込まれたものである 。この能力は外在性のＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローン を確立する真核生物細胞の能力によって証明される。形質転換の例はグラハム( Ｇraham，Ｆ.)およびバン・デア・エブ（Ｖan der Ｅb，Ａ.）、Ｖirology５２ ：４５６−４５７（１９７３））中に示されている。 「トランスダクション」または「トランスデュースされた」という語は、外来 ＤＮＡを細胞が取り込み、その外来ＤＮＡを自らの染色体に組み込むプロセスを いう。トランスダクションは例えば、トランスフェクション（細胞がＤＮＡを取 り込む様々な技術）、または感染（ウイルスがＤＮＡを細胞に移すのに使用され る）によって行うことができる。 実施例１ ＫＧＦ−２の細菌発現および精製 最初に、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列(ＡＴＣＣ第７５９７７号)を、プ ロセシングしたＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ（シグナルペプチド配列を含む）配列の５' および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅 する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、続くＡfl III制限酵素部位を、続いて、推定開始コドンの後に続くコド ンから始まるＫＧＦ−２コーディング配列の３０ヌクレオチドを含む。３'配列 ： は、Ｈind III部位に対する相補的配列、および続くＫＧＦ−２の２６ヌクレオ チドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−６０（キアゲン、 インク）（Ｑiagen Ｉnc.）、チャタワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア、 ９１３１１)の制限酵素部位に一致する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性(Ａmp^r) 、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター( Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位部位 をコードする。ついでpＱＥ−６０ベクターをＮco ＩおよびＨind IIIで消化す る。増幅した配列をpＱＥ−６０にライゲーションし、ついでインフレームで挿 入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５／rep４（キア ゲン、インク）であるＥ.coli株をサンブルック（Ｓambrook，Ｊ.）ら、モレキ ュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュア ル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス (Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress)、（１９８９）に記載された方法によって トランスフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含 み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与 える。トランスフォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により 同定しついでアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。所望の構築 物を含むクローンを、Ａmp(１００μg／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方を補 った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を 使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、 ０.４〜０.６の間の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させる。次いで、ＩＰ ＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１m Ｍとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏを クリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３ −４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットを カオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、こ の溶液から、該タンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ヘパリンアフ ィニティーカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＫＧＦ−２を精製 する(ホチュ リ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８ ４）)。高い塩濃度バッファーによりカラムからＫＧＦ−２(純度７５％)を溶出 する。 実施例２ 切断された形態のＫＧＦ−２の細菌発現および精製 最初に、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列(ＡＴＣＣ第７５９７７号)を、切 断された形態のＫＧＦ−２ポリペプチドの配列の５'および３'末端に対応するＰ ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。該切断形態には該ポリ ペプチドから３６アミノ酸シグナルペプチド配列を差し引いたものを含み、全長 のタンパク質のアミノ酸３７を構成するシステイン残基の直前にメチオニンおよ びアラニン残基が付加されている。該５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配 列： を有し、続くＮco Ｉ制限酵素部位を、続いて、ＫＧＦ−２コーディング配列の ２４ヌクレオチドを含む。３'配列： は、Ｈind III部位に対する相補的配列、および続くＫＧＦ−２の２６ヌクレオ チドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−６０（キアゲン、 インク、チャタワース、カリフォルニア、）の制限酵素部位に一致する。pＱＥ −６０は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能 なプロモーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈ isタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついでpＱＥ−６０をＮco Ｉおよ びＨind IIIで消化する。増幅した配列をpＱＥ−６０にライゲーションし、つい でインフレームで挿入する。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ １５／rep４（キアゲン、インク）であるＥ.coli株をサンブルックら、モレキュ ラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ ラボラトリー・プレス、（１９８９）に記載された方法によってトランスフォー ムした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、la cＩリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランス フォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでア ンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し 、制限分析によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａmp(１００μg ／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方を補った、ＬＢ培地中での液体培養で一晩 増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００ 〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の間の光学密度６００( Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ ガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧは、la cＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加さ せることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させた。次いで、細胞を 遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグア ニジンＨＣl中で可溶化する。清澄後、この溶液から、該タンパク質による強固 な結合を可能にする条件下、ヘパリンアフィニティーカラムでのクロマトグラフ ィーにより、可溶化したＫＧＦ−２を精製する(ホチュリら、Ｊ．Ｃhromatograp hy４１１：１７７−１８４（１９８４）)。高い塩濃度バッファーによりカラム からＫＧＦ−２を溶出する。 実施例３ バキュロウイルス発現システムを用いてのＫＧＦ−２のクローニングおよび発現 完全な長さのＫＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５ ９７７号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ ライマーを利用して増幅する。 その５'プライマーは、配列： を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞における 翻訳の開始に有効な信号に似ている６ヌクレオチド(コザック（Ｋozak,Ｍ.）、 Ｊ.Ｍol.Ｂiol．１９６：９４７−９５０（１９８７）)を含み、またこの直ぐ後 は、ＫＧＦ−２遺伝子の最初の１７ヌクレオチド(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に 下線を引いてある)である。 その３'プライマーは、配列： を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Ａsp ７１８の切断部位、およびＫＧＦ− ２遺伝子の３'の非翻訳配列に対して相補的な１９ヌクレオチドを含む。増幅さ れた配列を、市販のキット(キアゲン、インク、チャタワース、カリフォルニア) を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントをエ ンドヌクレアーゼ Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８で消化し、再度１％アガロース ゲル上で精製した。このフラグメントをＦ２と名付ける。 ベクター pＡ２(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウ イルス発現系を用いてのＫＧＦ−２タンパク質の発現に使用する(概説には、サ マーズ（Ｓummers,Ｍ.Ｄ.）およびスミス（Ｓmith,Ｇ.Ｅ.）１９８７、ア・マニ ュアル・オブ・メソッズ・フォー・バキュロウイルス・ベクターズ・アンド・イ ンセクト・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures）、Ｔexas Ａgric ultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベ クターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニアポリヘドロシスウイル ス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌク レアーゼ Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８の認識部位を含む。シミアンウイルス(Ｓ Ｖ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウ イルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、 ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化信号が続くポリヘドリンプロモーターと同 じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfected)野生型ウイルス ＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポ リヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、 例えば、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＲＧ１の代わりに使 用することができるであろう(ラッコゥ（Ｌuckow,Ｖ.Ａ.）およびサマーズ、Ｖi rology、１７０：３１−３９)。 プラスミドを制限酵素Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８で消化する。次いで、ＤＮ Ａを１％アガロースゲルから市販のキット(キアゲン、インク、チャタワース、 カリフォルニア)を使用して、単離する。このベクター ＤＮＡをＶ２と名付ける 。 フラグメント Ｆ２およびプラスミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲー ションする。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォームして、ＫＧＦ −２遺伝子を有するプラスミド(pＢacＫＧＦ−２)を含む細菌を、クローニング オリゴヌクレオチドの両方でＰＣＲを使用して同定する。クローニングされたフ ラグメントの配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。 リポフェクション法(フェルグナー（Ｆelgner）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミドpＢac ＫＧＦ−２ ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧold^TMバキュロ ウイルス ＤＮＡ」、ファーミンゲン（Ｐharmingen）、サン・ディエゴ（Ｓan Ｄiego）、カリフォルニア)１.０μgと共に同時トランスフェクションする。 ＢaculoＧold^TMウイルス ＤＮＡ １μgおよびプラスミド pＢacＫＧＦ−２５ μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(ライフ・テクノロジーズ・インク（Ｌif e Ｔechnologies Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリーランド )５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、 リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して 、室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を 、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９ 昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動 かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間 インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレート から除去して、１０％ ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。 そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。 ４日後、上清を集めて、サマーズおよびスミス(上記)により記載されたように して、プラークアッセイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(ライフ・テクオ ロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ)を含むアガロースゲルを使用したが、こ のことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。 (「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガ イド、およびライフ／テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグにより配布さ れたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見出すことができる)。 ４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加えて、青色に染色されたプラークを エッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒天 を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる。その 寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を 、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これら の培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。 Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。 その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＧＰＲを感 染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含ま ないＳＦ９００ II 培地(ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ) に替える。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓ シス テイン５μＣi(アマシャム (Ａmersham))を加える。その細胞をさらに１６時間 インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を 、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。 実施例４ ＣＯＳ細胞における組換えＫＧＦ−２の発現 プラスミド、ＫＧＦ−２ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０ 開始点、２）アンピリ シン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベ クター pcＤＮＡＩ／Ａmp(インビトロゲン(Ｉnvitrogen))から得られる。完全な Ｇ−タンパク質結合性受容体の前駆体およびその３'末端にイン・フレームで融 合したＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、そのベクターのポリリンカ ー領域にクローン化することから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモータ ーの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タ ンパク質から得られるエピトープに対応する(ウィルソン、ニマン（Ｈ.Ｎiman） 、ハイテン（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、コノリー（Ｍ. Ｃonnolly）、およびラーナー（Ｒ.Ｌerner）、１９８４、Ｃell ３７、７６７) 。ＨＡタグを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質 を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。 プラスミド構築方法を以下に記載する： ＫＧＦ−２をコードするＡＴＣＣ第７５９７７号のＤＮＡ配列を、２つのプラ イマーを用いてのＰＣＲにより構築する： ５'プライマー配列： は開始コドンから出発するＫＧＦ−２のコーディング配列の３０ヌクレオチドが 続くＨind III部位を含む； ３'配列は： は、Ｘba Ｉ制限酵素部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、お よびＫＧＦ−２コーディング配列の最後の３２ヌクレオチド(終止コドンは含ま れていない)を含む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｈind III部位、ＫＧＦ−２コーデ ィング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の 翻訳終結コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラ グメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、Ｈind IIIおよびＸba Ｉ制限酵 素で消化して、ライゲーションする。そのライゲーション混合物をＥ.coli株 Ｘ Ｌ １ Ｂlue(ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア)にトランスフォームし 、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、 耐性コロニーを選択する。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離 して、正しいフラグメントの存在に関してＰＣＲおよび制限分析により試験する 。組換えＫＧＦ−２の発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯ Ｓ細胞を発現ベクターでトランスフェクションする。(サンブルック、フリッチ （Ｅ.Ｆritsch）、マニアチス（Ｔ.Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング ：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレ ス、（１９８９）)。ＫＧＦ−２ ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免 疫沈降法により検出する(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アン チボディーズ（Ａntibodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaborator y Ｍanual）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８８）)。 トランスフェクションから２日後、タンパク質を³⁵Ｓ−システインで８時間標識 化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０ mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ Ｄ ＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))で溶菌する(ウィルソンら、同上 ３７：７ ６７（１９８４）)。ＣＯＳ細胞ライゼートおよび上清から得られた³⁵Ｓ−シス テイン標識化タンパク質を、ＨＡポリクローナル抗体で免疫沈降させて、１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離する。 実施例５ イン・ビトロでの組換えＫＧＦ−２の転写および翻訳 ＰＣＲ産物はpＡ２ベクター中のクローニングされたｃＤＮＡ由来であり、Ｋ ＧＦ−２の昆虫細胞発現に使用する。このＰＣＲに使用したプライマーは： 最初のプライマーはＡＴＧ開始コドンに対するＴ３プロモーターの５'の配列 を含む。第２のプライマーはＫＧＦ−２のオープン・リーディング・フレームの ３'端に相補的であり、終止コドンの逆相補的な配列をコードする。 得られたＰＣＲ産物はキアゲンから市販され入手可能であるキットを用いて精 製する。このＤＮＡの０.５μgをイン・ビトロの転写反応の鋳型として使用する 。その反応をＴＮＴという名でプロメガから市販されており入手可能であるキッ トにて行う。そのアッセイを放射性標識したメチオニンを基質として、試薬の指 示された量の１／２だけを使用したことを除いては３３℃で１.５時間反応を進 行させてキットの指示に従って行う。 その反応物の５μlを１０−１５％の変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳 動により分離する。そのゲルを３０分間、水：メタノール：酢酸をそれぞれ６： ３：１の容量の混合物中で固定する。ついでそのゲル減圧下加熱乾燥させ、引き 続いてＸ−線フィルムに１６時間さらす。そのフィルムを現像して概念的には翻 訳されたＫＧＦ−２にサイズで一致する放射性タンパク質のバンドの存在が示さ れ、それによってＫＧＦ−２のクローニングされたｃＤＮＡが期待される大きさ のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含むことが示唆 された。 先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後 記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 16/22 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＢＬ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＢＮ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該 ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレ オチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号に含まれるcＤＮＡによりコードされる アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、ア ナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド； よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。 ２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオ チド。 ５．該ポリヌクレオチドが、配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペ プチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ６．該ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号のcＤＮＡによ りコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド 。 ７．配列番号：１に示すコーディング配列を有する、請求項１に記載のポリヌ クレオチド。 ８．ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号として寄託されたポリペプチドのコーデ ィング配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。 １０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。 １１．ポリペプチドを製造する方法であって、該ＤＮＡによりコードされるポ リペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞から発現させることを含む方法。 １２．ポリペプチドを発現させることが可能である細胞を製造する方法であっ て、細胞を請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作することを含む方法。 １３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であって、Ｋ ＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ。 １４．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および そのフラグメント、アナログおよび誘導体；および （ii）ＡＴＣＣ受託番号第７５９７７号のcＤＮＡによりコードされるポリペプ チド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体； よりなる群から選択されるポリペプチド。 １５．該ポリペプチドが配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ である請求項１４に記載のポリペプチド。 １６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。 １７．請求項１４に記載のポリペプチドに対して有効なアゴニストである化合 物。 １８．請求項１４に記載のポリペプチドに対して有効なアンタゴニストである 化合物。 １９．ＫＧＦ−２を必要とする患者の治療方法であって、請求項１４に記載の ポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 ２０．ＫＧＦ−２を阻害する必要がある患者の治療方法であって、請求項１８ に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 ２１．ポリペプチドの治療上有効な量を該ポリペプチドをコードするＤＮＡを 該患者に与えて、該ポリペプチドをイン・ビボで発現させることによって投与す る、請求項１９に記載の方法。 ２２．ＫＧＦ−２に対するアゴニストとして活性のある化合物を同定する方法 であって、 （ａ）スクリーニングされるべき化合物を、細胞を含む反応混合物と、該細胞が ＫＧＦ−２によって通常刺激される条件下で混合し、その際、該反応混合物は増 殖するにつれて該細胞に組み込まれる標識を含み； （ｂ）該細胞の増殖の程度を決定して、該化合物が有効なアゴニストであるかど うかを確認する ことを含む方法。 ２３．ＫＧＦ−２を工程（ａ）の混合物に加え、ＫＧＦ−２に対するアンタゴ ニストとして活性のある化合物を同定するための請求項２２に記載の方法。 ２４．請求項１４に記載のポリペプチドの過小発現に関連のある疾患または該 疾患の罹患し易さを診断する方法であって、 宿主由来のサンプルから該ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し；つい で 該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定する ことを含む方法。 ２５．宿主由来のサンプル中の請求項１４に記載のポリペプチドの存在を分析 することを含む診断方法。