JPH10509031A - 試料中の標的微生物の検出用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、２４時間未満で液化環境又は生物試料中の標的微生物を検出するための培地に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 試料中の標的微生物の検出用培地 発明の技術分野 本発明は化学、生物学及び微生物学の分野であり、汚染している可能性のある 材料の試料中の標的微生物を検出するための新規手段に関する。発明の背景 微生物は生物試料やその増殖に適した環境媒体に偏在する。しかし、微生物に は高等生物に有害なものもあり、公衆衛生を維持するためにはその存在の検出手 段が重要である。速度と特異性に関して種々の利点を提供する多数の手段が種々 の微生物の検出手段として利用可能である。 全微生物は所定の増殖及び生殖要件をもつ。一般に、微生物が増殖するために は、光又は炭素化合物等のエネルギー源と、炭素、窒素、硫黄及びリン並びに微 量の他の無機質を含む原料源が必要である。更に、微生物は適当な温度、ｐＨ、 塩分及び酸素濃度を維持した適切な環境に存在していなければならない。 微生物の存在を検出するために使用されている一般方法は、増殖を維持するた めに必要な全成分を含む培地に試料を加えることにより実施される。試料は未処 理でもよいし、培地に加える前に膜濾過等の方法により前処理してもよい。培地 は標的微生物以外の微生物の増殖を抑制する抗微生物剤又は抗生物質等の薬剤を 加えてもよいし、加えなくてもよい。通常は、これらの培地は汚染性微生物から 干渉阻害されないように滅菌され、微生物を検出可能な濃度まで増殖させるため には２４〜４８時間といったかなり長時間のインキュベーションが通常必要であ る。更に、これらの方法では一旦増殖を検出してから標的微生物に固有の種々の 物性又は生化学的特性に特異的な１種以上の試験を使用して標的微生物を同定し なければならない。従って、これらの方法は労働集約的で時間消費的である。 検出方法を簡単且つ迅速にするために努力が払われている。例えば、個々の微 生物の特異的代謝副生物を測定する試みがなされている。これらの方法は、電気 インピーダンスアッセイ、ＡＴＰアッセイ、抗体系アッセイ及び炭素１４標識基 質アッセイを含む。標的微生物の増殖をモニターするために、標的微生物の増殖 の検出後のみに変色する微生物増殖指標も使用されている。これらの指標は一般 に標的微生物により産生される代謝副生物と化学的に反応し、培地中で変色する 。増殖に伴うｐＨ変化の存在下で変色する薬剤の例としては、フェノールレッド 、ブロモクレゾールブルー及びニュートラルレッドが挙げられる。例えば、Ｇｏ ｌｂｅｒの米国特許第３，２０６，３１７号は、標的微生物により産生される酸 性老廃物の存在下で変色する薬剤であるフェノールレッドを使用している。Ｂｅ ｒｇｅｒらの米国特許第３，４９６，０６６号は細菌を色素に変換する化合物（ 例えばトロピノン及びジオキサン）を使用しており、Ｂｏｃｈｎｅｒの米国特許 第４，１２９，４８３号は化学的に還元されると変色を生じる非生物分解性物質 （テトラゾリウム）の使用を記載している。これらの例のいずれにおいても指標 は必要栄養源として機能しない化合物である。 Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号は、栄養源として機能するだ けでなく、代謝されると変色する栄養指標の使用を記載している。その開示内容 を参考資料として本明細書の一部とするこの特許は、標的細菌により代謝される と、培地に変色又は他の検出可能な変化をもたらす部分を遊離する栄養指標を含 有する培地を提供する。この方法は特定種又は群の細菌に固有の酵素特異性を利 用している。標的微生物の増殖を選択するために抗生物質の使用が示唆されてお り、液体系アッセイの具体例が挙げられている。Ｋｉｌｉａｎら，Ａｃｔａ．Ｐ ａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ ．Ｓｅｃｔ．Ｂ §７ ２７１−２７ ６（１９７９）及びＤａｍａｒｅら，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５０：１ ７３６（１９８５）等の従来使用されている他の方法は抗生物質を含まない寒天 系培地の使用を報告している。発明の要約 本発明は１８〜２４時間といった短時間で液化環境又は生物試料中の標的微生 物の有無の検出が可能な培地に関する。例えば、インキュベーション時間の開始 から約１８時間以内に大腸菌及び他の大腸菌群を高特異性で検出することができ る。従って、本発明の培地は大腸菌の試験結果を得るために約２４時間を要した 従来の培地と区別される。このような培地は、栄養源と増殖指標の両者の量を種 々に変えて調製することができる。但し、本発明は従来使用されているよりも多 量のアミノ酸、ビタミン及び元素成分を提供する。本発明の培地の他の特徴は、 代謝損傷細菌の回収を助けるピルビン酸ナトリウムの使用、熱平衡期間の使用、 少量の塩化ナトリウムの使用、適切な量の他の代謝物の提供等である。 培地は、栄養指標の存在下で標的微生物の生存及び生殖を維持するように作用 し得る有効量のビタミン、アミノ酸、微量元素及び塩を含有する。試料中の全大 腸菌群及び大腸菌の検出に本発明で最適であることが判明した培地は、アンモニ ウムイオン源（例えば最終試料濃度約４．５〜５．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム ）、緩衝液（例えば約６．０〜７．５ｇ／ｌのＨＥＰＥＳ遊離酸及び４．７〜５ ．８ｇ／ｌのＨＥＰＥＳナトリウム塩）、約０．１３〜０．１６ｇ／ｌのＤ−グ ルコン酸、亜硫酸源（例えば約０．０３６〜０．０４４ｇ／ｌの亜硫酸ナトリウ ム）、抗真菌剤（例えば約０．０００９〜０．００１１ｇ／ｌのアンホテリシン Ｂ）、マグネシウムイオン源（例えば約０．０９〜０．１１ｇ／ｌの硫酸マグネ シウム）、栄養指標（例えば約０．４５０〜０．５５０ｇ／ｌのオルトニトロフ ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及び約０．０６７〜０．０８ ５ｇ／ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ））、 亜鉛イオン源（例えば約０．０００４５〜０．０００５５ｇ／ｌの硫酸亜鉛）、 及びマンガンイオン源（例えば約０．０００４５〜０．０００５５ｇ／ｌの硫酸 マンガン）を含む。 更に、下記成分が下記最少量で提供される。各成分の最大又は最適量は下記量 の数倍（例えば３〜１０倍、更には２０倍）であり得る。具体的には、このよう な培地は少なくとも約１．１〜１．７ｇ／ｌの総窒素分をもつ。標的微生物の増 殖に必要なアミノ酸を提供する。全アミノ酸を提供する必要はなく、各アミノ酸 の相対量は可変である。当業者であれば、純粋源でなく天然源のこのようなアミ ノ酸を使用できることが理解されよう。アミノ酸は種々の源から提供できる。一 般には、標的微生物により内因的に合成できない必須アミノ酸のみを提供しなけ ればならない。これらのアミノ酸は天然源（例えば完全生物の抽出物）から混合 物として提供してもよいし、精製形態で提供してもよい。天然混合物は様々な量 のこのようなアミノ酸及びビタミンを含有し得る（下記参照）。一般参考として 、このようなアミノ酸及びビタミンの特定量を下記に示す。これらの量は参考に 過ぎず、本発明を制限するものではない。当業者であれば、アミノ酸とビタミン の多種多様の組み合わせを本発明の培地で使用できることが理解されよう。下記 一覧はこのような例の一例に過ぎない。アミノ酸含量は、少なくとも下記アミノ 酸を少なくともほぼ指定量で含むことが好ましい。アラニン（０．０２５ｇ／ｌ ）、アルキニン（０．０３ｇ／ｌ）、アスパラギン酸（０．０５６ｇ／ｌ）、グ ルタミン酸（０．１ｇ／ｌ）、グリシン（０．０１５ｇ／ｌ）、プロリン（０． ０９ｇ／ｌ）、シスチン（０．００２ｇ／ｌ）、ヒスチジン（０．００６ｇ／ｌ ）、イソロイシン（０．０１ｇ．／ｌ）、ロイシン（０．０３ｇ／ｌ）、リシン （０．０３ｇ／ｌ）、メチオニン（０．０１ｇ／ｌ）、フェニルアラニン（０． ０１８ｇ／ｌ）、セリン（０．０２９ｇ／ｌ）、トレオニン（０．０１８ｇ／ｌ ）、トリプトファン（０．００３ｇ／ｌ）、チロシン（０．００６４ｇ／ｌ）及 びバリン（０．０２３ｇ／ｌ）。 標的微生物の増殖を助けるために他の無機化合物を配合してもよい。これらの 化合物は（上記種々の化学物質源で提供されない程度までの）下記成分、即ち鉄 （例えば少なくとも約０．００１６５μｇ／ｌ）、カルシウム（例えば少なくと も約０．０００３ｇ／ｌ）、リン酸塩（例えば少なくとも約０．１ｇ／ｌ）、カ リウム（例えば少なくとも約０．００７ｇ／ｌ、好ましくは約０．０５ｇ／ｌ） 、ナトリウム（例えば少なくとも約０．０３ｇ／ｌ）、並びに微量のコバルト、 銅、鉛、マグネシウム、マンガン、塩化物、錫及び亜鉛を含む。 標的微生物の増殖に必要なビタミンも提供し得る。これらのビタミンは純粋形 態でもよいし、より複雑な培地の一部として提供してもよい。このようなビタミ ンは少なくとも下記量で存在し得る。ビオチン（０．００００５ｍｇ／ｌ）、シ アノコバラミン（微量）、コリン（０．０５ｍｇ／ｌ）、イノシトール（０．０ ６０ｍｇ／ｌ）、ニコチン酸（０．０１４ｍｇ／ｌ）、ナイアシン（０．００３ ８５ｍｇ／ｌ）、ＰＡＢＡ（０．０２ｍｇ／ｌ）、葉酸（０．００００７５ｍｇ ／ｌ）、パントテン酸（０．０１０９５ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン（０．００１ ５ｍｇ／ｌ）、リボフラビン（０．００２８ｍｇ／ｌ）、チアミン（０．００３ ７ｍｇ／ｌ）及びチミジン（０．０１０ｍｇ／ｌ）。 当業者であれば、有機炭素、窒素、微量元素、ビタミン及びアミノ酸を多数の 形態で提供できることが理解されよう。一般に、ビタミン及びアミノ酸の量を少 なくとも上記特定量程度にすると好適であるが、当業者であれば、各成分の実際 の濃度を変更し、ある成分の量の減少を別の成分の量の増加により相殺できるこ とが理解できよう。特定標的微生物の増殖要件が分かっている場合には特にこの ようにできる。標的微生物により内因的に合成される成分は量を減らすか又は削 除してもよい。このような成分の合計量が上記例に示した合計量を著しく上回る ことが最も好ましい。検出特異性を維持しながら短時間（１８時間）で微生物を 検出できるようにするには、上記量の約５〜１０倍の量が特に有効である。 このような培地の他の成分としては、グラム陽性非標的微生物に作用する抗生 物質、グラム陰性非標的微生物に作用する抗生物質、栄養指標の代謝を触媒する 酵素インデューサー、ＤＮＡ前駆物質、アミノ酸前駆物質、並びにカリウム及び リンの補充源が挙げられる。 栄養指標は、増殖中に検出可能な特性シグナルが培地で発生するまで標的微生 物の増殖を維持するのに十分な量で培地中に存在する。ビタミン、アミノ酸、微 量元素、塩及び栄養指標成分の組み合わせにより標的微生物の十分な増殖が可能 になり、約２４時間未満で試料に検出可能な変化を観察することができる。栄養 指標は標的微生物により代謝される場合のみに試料の検出可能な特性を変化させ る。従って、栄養指標は試料中の微生物の有無を確認するために使用することが できる。栄養指標は培地中で標的微生物によってのみ代謝されなければならない 。栄養指標を代謝することが可能な他の微生物が試料中に存在する場合には、特 異的抗生物質を使用してその増殖を抑制しなければならない。更に、栄養指標は 標的微生物に特異的な型の唯一の栄養源であることが好ましいが、培地は培地の 特異性を低下させないような量であれば他の特異的栄養源を含んでいてもよい。 例えば、栄養指標は標的微生物の唯一の炭素源であり得る。あるいは、標的微生 物により優先的に使用されない他の炭素源（例えばアミノ酸）が存在していても よい。所望により、標的微生物により優先的に使用される少量の別の炭素源が存 在していてもよいが、提供量はこのような炭素源の不在下よりも培地の特異性を 低下させないような量とする。 「標的微生物」なる用語は、存在の有無を判定しようとする１種以上の微生物 を意味する。この用語は単一微生物（例えば大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕ ｍｏｎｉａ）、微生物属、複数の関連微生物種（例えば大腸菌群）、又は共通の 特性をもつ更に大きい微生物群（例えば全グラム陰性菌）を指すことができる。 本発明は、固有の酵素特異性又は種々の群、科もしくは種の微生物に固有の他の 特性を利用するように培地と方法を構成するものである。従って、栄養指標は標 的としてどの微生物を選択するかによって変化し得る。但し、「標的微生物」な る用語が全微生物を含む訳ではない。 「１８時間」なる用語は、１００ｍｌ当たり約１〜１０個の大腸菌群細菌を含 む液体試料の約９５％が検出可能な特性変化を示すために必要な時間を意味する 。温度、存在する酵素インデューサーの量及び種類、培地に提供される栄養源の 量、並びに細菌の相対健康状態は、いずれも検出時間に影響する。アミノ酸、ビ タミン及び微量元素等の栄養源の供給量は標的微生物の増殖速度、従って検出時 間に影響し得る。培地を添加後に約３５℃のインキュベーション温度まで試料を 熱平衡させると、検出に必要な時間を短縮することができる。酵素インデューサ ーの量も検出時間を短縮できる。培地中に存在する酵素インデューサーは、栄養 指標を代謝する酵素の活性又は発現を誘導するように機能する物質である。この ようなインデューサーとしては、β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ活性を誘導する イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と、β−グルコシダーゼ 活性を誘導するエチル−β−Ｄ−チオグルコシドが挙げられる。微生物の相対健 康状態も検出に必要な時間に影響する。従って、損傷生物の回収を助けることが できるピルビン酸塩等の物質を加えると、検出を速めることができる。試料中に 多数の標的微生物（即ち１００ｍｌ試料当たり微生物１０未満）が存在する場合 にも、より迅速な検出が可能である。本発明で提供される培地は、少量の標的微 生物（即ち１００ｍｌ当たり１０未満）を１８〜２４時間以内に少なくとも９５ ％検出することができる。このような能力は標準方法を使用して測定することが できる。 「培地」なる用語は、標的微生物の増殖及び生殖を維持するために必要な栄養 源の全部又は実質的に全部を含む固体、粉末又は液体混合物を意味する。本発明 は滅菌培地（即ちこのような培地では、培地を単独又は無菌希釈剤と共にインキ ュベーション後に増殖が生じない）と非滅菌培地の両者を含む。 「液化」なる用語は実質的に液体形態を意味するが、液体分が少なくとも１０ ％の固体物質の微粉砕又は均質化試料も含む。この用語は寒天で形成されるよう なゲル化培地は除外する。 「環境」及び「生物」なる用語は、藻類、真菌類及び細菌類を含む１種以上の 生命形態を生息させることが可能な物質から抽出するか又はこのような物質に由 来することを意味する。非限定的な例としては、リクレーション設備用水、海水 、飲料水、下水及び食品が挙げられる。 「接種」なる用語は、液化環境又は生物試料を本発明の培地と混合する時点又 はその付近を意味する。２種の物質を実質的に混合する時点を意味する。 「有効量」なる用語は、特定時間内で標的微生物の増殖及び生殖を可能にする か又は助長する範囲内の量である。即ち、微生物を培地に適応させ、生殖に必要 な成分を合成させ、その後、生殖させる量である。この量は特定量ではなく、試 料寸法や標的微生物の濃度等の因子に応じて変化し得る。一般に、この用語は１ ｍｌ試料当たり標的微生物１００個未満、より好ましくは１００ｍｌ試料当たり 微生物１００個未満、更には１００ｍｌ試料当たり微生物１個を検出するために 必要な量を示す。 「ビタミン」、「アミノ酸」、「微量元素」及び「塩」なる用語は、有機であ るか無機であるかを問わずに当業者により各範疇で分類される全分子、化合物及 び物質を意味し、前記範疇は生命を維持するために必要であるか又は生命の維持 を誘導し得る如何なる物質も除外しない。 「抗生物質」なる用語は、１種以上の種又は群の非標的微生物の増殖及び生殖 を阻止又は阻害する分子又はペプチドを意味する。例は当業者に周知であるが、 この用語は、細菌増殖を特異的又は非特異的に阻害又は阻止し得る洗剤を除外す る。本発明で有用であり得る特定抗生物質の例としては、コリスチン、ナリジキ シン酸及びアンシオマイシンが挙げられる。 「栄養指標」なる用語は、標的微生物の必須栄養源である部分と、培地又は試 料中に観察可能な特性変化を誘導又は発生する部分を含む分子又は物質を意味す る。栄養指標は色原体に結合した栄養源を含む。栄養源は必須ビタミン、無機質 （例えばリン酸）、微量元素、アミノ酸又は炭水化物エネルギー源（例えばラク トース）を提供し得る。微生物の栄養要求は、生殖に備えて栄養源が蓄積される 相（遅滞期）から比較的速い速度で実際に生殖が行われる相（対数期）まで微生 物が進行するにつれて増加する。従って、栄養指標は試料中に検出可能な特性変 化を生じる増殖期間中に最適に代謝される。好ましくは、栄養指標は栄養部分と 色原体を含む。色原体は、適正なエネルギー源により適正に励起されると、可視 域で観察可能な変色又は蛍光を生じる任意の部分を含む。非限定的な例としては 、オルトニトロフェニル、フェノールフタレイン及び４−メチルウンベリフェロ ン部分が挙げられる。栄養指標は単独の必須栄養源を提供してもよいが、培地の 適切な選択性及び感受性が維持される限り、他のこのような栄養源も提供しても よい。 「検出可能な特性シグナル」なる用語は、人体感覚の１種以上により検出可能 な試料中の任意の変化を含む。この用語の例としては、可視又は非可視波長域に おける変色、固体、液体及び気体等の状態変化、ガス発生、又は臭いの変化等が 挙げられる。 好適態様において、培地は代謝損傷細胞の増殖を助けるために十分なピルビン 酸ナトリウムを含む。「代謝損傷」なる用語は、細胞代謝が外傷により最適又は 生体恒常状態から変化する場合を含む。「代謝損傷」の例としては、過剰の熱、 冷温、塩素化又は乾燥条件への細胞暴露の場合が挙げられる。 別の好適態様では、栄養指標は微生物特異的培地を変色させる。変色は可視波 長域に現れてもよいし、外部紫外線源の照射後に可視波長域に出現する蛍光でも よい。変色は一般に栄養指標からの色原部分の酵素遊離に起因する。この部分は 栄養指標の栄養部分と結合すると呈色し、非結合形態の場合（即ち栄養部分とも はや結合していない場合）には無色である。栄養部分と結合し得る色原部分の非 限定的な例としては、栄養指標から遊離すると黄変するオルトニトロフェニル部 分、栄養指標から遊離すると赤変するフェノールフタレイン部分、栄養指標から 遊離すると、約３６６ｎｍで励起時に蛍光になる４−メチルウンベリフェロン部 分、及び栄養指標から遊離すると青変するブロモクロロインドール部分が挙げら れる。 「微生物特異的培地」なる用語は、標的微生物のみを実質的に増殖させること ができる培地を意味する。これは、標的微生物以外の微生物の増殖を阻害するた めに特異的な１種以上の抗生物質を含有する培地と、このような抗生物質の代わ り又はそれに加えて、標的微生物以外の微生物により実質的な程度まで代謝され ないことが好ましい１種以上の栄養指標を含有する培地を含む。この関連で使用 する「実質的」なる用語は、標準方法により測定した場合に培地が標的微生物を まだ特異的（即ち少なくとも９５％、更には９８％の精度）且つ高感度（即ち少 なくとも９５％、更には９８％の検出レベル）で検出できることを意味する。 更に別の好適態様では、微生物は大腸菌群細菌であり、又はより特定的には標 的微生物は大腸菌である。他の好適態様は栄養指標の選択を含む。１好適態様で は、栄養指標はβ−Ｄ−グルクロニダーゼ基質であり、例えばオルトニトロフェ ニル−β−Ｄ−グルクロニド、β−ナフタルアミド−β−Ｄ−グルクロニド、α −ナフトール−β−Ｄ−グルクロニド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ −グルクロニドである。あるいは、栄養指標はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質で あり、例えばオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び４−メチ ルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドである。栄養指標はβ−Ｄ− グルコシダーゼ基質でもよく、例えばオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルコー スである。更に別の態様では、栄養指標は例えばオルトニトロフェニル−β−Ｌ −ピロニドニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ−ピロニドニル、α−ナフトール −β−Ｌ−ピロニドニル及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−ピロニドニ ル等のＬ−ピロニドニルアミノベプチダーゼ基質でもよいし、栄養指標は例えば Ｌ−アラニン−β−Ｌ−オルトニトロフェニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ− アラニン、α−ナフトール−β−Ｌ−アラニン及び４−メチルウンベリフェリル −β−Ｌ−アラニン等のＬ−アラニンアミノペプチダーゼ基質でもよい。 「大腸菌群」なる用語は、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、一般にヒトの胃 腸管に生息する非胞子形成グラム陰性、オキシダーゼ陰性桿菌群の任意のものを 意味する。この群は、これらの菌が水中に存在していると、当業者が糞便汚染の 推定証拠であるとみなす肺炎桿菌及び大腸菌や、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ ｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ及びＳｅｒｒａｔｉ ａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａを含む。 好ましくは、培地は標的微生物以外の微生物が栄養指標を代謝するのを阻止す る１種以上の抗生物質も含有する。即ち、培地は標的微生物以外の微生物の増殖 の特異的阻害剤であり、このような微生物の少なくとも数種の増殖を有効に阻止 する抗生物質を含有する。より好ましくは、これらの抗生物質は１種以上のグラ ム陽性及びグラム陰性非大腸菌群細菌に作用する。他の細菌及び酵母に対して有 用であり得るこのような抗微生物剤の例としては、コリスチン、ナリジキシン酸 、アンシオマイシン及びアンホテリシンＢが挙げられる。 本発明の別の特徴は、環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無の検出方法 であり、該方法は好ましくは、微生物特異的培地の添加後に試料を液体インキュ ベーター中でインキュベーション温度まで加温する段階を含む。より好ましくは 、インキュベーション温度は約３５℃である。「液体インキュベーター」なる用 語は特定温度又は温度範囲まで加温した液体を意味する。これは例えば任意形態 の水浴を含み得る。培地は空気インキュベーターよりも液体インキュベーターの ほうが迅速に最適インキュベーション温度に到達することができるので、このよ うなインキュベーターは従来使用されていた空気インキュベーターよりも有利で ある。 本発明は更に、２４時間以内に環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無を 検出する方法にも関する。本方法を使用すると、僅か約１８時間以内に大腸菌及 び他の大腸菌群を検出することができる。本方法では、まず試料を本発明の培地 と混合し、試料と培地の混合物をインキュベーション温度、好ましくは３５℃ま で約２０分間加温する。次に試料を空気インキュベーターに移して好ましくは３ ５℃で約１８時間保温する。培地は、大腸菌群微生物が増殖及び生殖できるよう に有効量のビタミン、アミノ酸、微量元素及び塩を含有する。更に、培地は大腸 菌群細菌の増殖を維持し、標的微生物により代謝されると検出可能な特性シグナ ルを発生する有効量の栄養指標を含有する。次に試料をモニターし、検出可能な 特性が変化したか否かを調べる。好ましくは、培地は試料中に潜在的に存在する 非大腸菌群の増殖を阻害又は阻止するために十分な量の１種以上の抗生物質も含 有する。 他の態様では、本発明はその開示内容を参考資料として本明細書の一部とする Ｎａｑｕｉらの米国特許出願第０８／２０１，１１０号に記載されている装置を 使用する。定量段階は、環境又は生物試料を液体形態で提供する段階を含む。Ｎ ａｑｕｉらに記載されている試料保持袋に試料を分配し、培地と混合して標的細 菌の増殖を可能にし、助長する。混合物をインキュベートし、変色の量及び品質 を検出する。得られた量及び品質を細菌濃度が分かっている一連の試料と比較す る。 本発明は標的微生物の存在を判定するための最適化培地を提供する。ビタミン 及びアミノ酸の供給量を増加した結果、微生物、例えば細菌は本発明の培地のほ うが現在入手可能な培地よりも著しく迅速に増殖する。従って、より迅速に試験 結果を入手できる。迅速に結果が得られるため、実験室の費用と時間の両者を節 約できる。速度が増すため、公衆衛生への脅威も緩和され、飲料水源及びリクレ ーション設備用水等の場所で所定の微生物の存在に対処する早期警戒及び救済対 策が可能になる。更に、本発明の方法は微生物特異的栄養指標を使用できるので 、一般に確認試験が不要になる。更に、本発明は滅菌培地を使用する必要がない 。 本発明の他の特徴及び利点は、好適態様に関する以下の説明及び請求の範囲か ら容易に理解されよう。好適態様の説明の簡単な説明 以下の記載では、化学、生物学及び微生物学分野の当業者に公知の種々の方法 を引用する。引用するこのような公知方法を掲載している刊行物及び他の資料は 、その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とする。本発明の組成物、 方法及び生成物は生物及び環境試料に適用することができ、化学、生物学及び微 生物学分野で微生物を検出するために有用である。酵素特異性に基づく微生物の検出 特定微生物は多数の栄養源からその栄養を摂取する。他方、特定の資源を代謝 する能力は特定微生物又は特定群の微生物に固有であり得る。複数の科、群又は 種の微生物が、他の微生物には欠損している所定の栄養に対する酵素特異性を共 有する場合もある。特定微生物の代謝特性を利用することにより、これらの酵素 系、従って、これらの酵素系自体を示す微生物の存在を試験することができる。 Ｅｄｂｅｒｇ，前出参照。特定群の微生物に特異的な多数の酵素が同定されてお り、今後も更に同定されると思われる。グラム陰性菌 グラム陰性菌はその外側細胞膜の一部として内毒素を含む。グラム陰性菌は環 境又は生物試料と医薬品及び他の医療品を汚染する恐れがある。従って、グラム 陰性菌が存在するか否かを試験するために有効なスクリーニング法を利用できる ことが重要である。 グラム陰性菌にはＬ−アラニンアミノペプチダーゼ酵素活性をもつ１群がある 。グラム陰性菌の有無を試験するためには、Ｌ−アラニン−β−オルトニトロフ ェニル、β−ナフタルアミド−β−Ｌ−アラニン、α−ナフトール−β−Ｌ−ア ラニン及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｌ−アラニン等の栄養指標を培地 中で栄養指標として使用することができる。培地から全グラム陽性菌を除去する ために有用な抗生物質は当業者に周知である。従って、グラム陽性菌を除去する 抗生物質を含有する培地中でＬ−アラニンアミノペプチダーゼ活性の栄養指標を 使用することにより、任意のグラム陰性菌の存在を検出することができる。腸球菌 酵素β−Ｄ−グルコシダーゼは腸球菌群の細菌に存在する。この酵素はβ−グ ルコシドに結合した色原又は蛍光原部分を含む適当な栄養指標の加水分解を触媒 することができる。この性質を利用して試料中の腸球菌の有無を指示することが できる。腸球菌の存在を指示するには、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ− グルコピラノシド等の栄養指標を使用することができる。β−Ｄ−グルコシダー ゼ活性を発現する他の微生物の増殖は、これらの非標的微生物の増殖を維持し且 つ腸球菌の増殖を実質的に阻害しない抗生物質を含有する培地を提供することに より阻害することができる。このような抗生物質の例は硫酸アミカシン、バシト ラシン及びアンホテリシンＢである。更に、約９．６の高ｐＨ又は約４５℃の高 温の増殖環境を提供することによっても、他の生物の増殖を阻害することができ る。腸球菌はこの高ｐＨ及び高温で増殖することができるので、このような条件 下で腸球菌を特異的に検出することができる。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） この種はリン酸オルトニトロフェニルを代謝することができる。従って、増殖 培地が唯一のリン酸源としてこの栄養指標を含む場合、黄色ブドウ球菌は増殖す るが、リン酸オルトニトロフェニルを代謝することができない微生物は増殖しな い。オルトニトロフェニル部分の遊離により変色が生じる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ この種はその硫黄源としてＳＯ₄を必要とし、この種は硫酸フェノールフタレ インを代謝することができる。従って、この種は硫酸フェノールフタレインを唯 一の硫黄源とする選択培地中で増殖し、着色部分の遊離により特徴的変色を生じ る。大腸菌検出 酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼは大腸菌に存在する。大腸菌を検出するために 培地で使用可能な栄養指標の例は、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニ ド、β−ナフタルアミド−β−Ｄ−グルクロニド、α−ナフトール−β−Ｄ−グ ルクロニド又はメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド等の栄養指標で ある。グラム陰性菌及び酵母から大腸菌を選択するために、約０．０００１重量 ％〜０．０１重量％の抗生物質バンコマイシン及びアンシオマイシンを加えても よい。 Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４．９２５，７８９号は、約２４時間インキュベー ション後に試料中で大腸菌を特異的に検出することができる液体系細菌増殖培地 について報告している。同特許は、容量１００ｍｌ中でＩＣＦＵ（コロニー形成 単位）の存在を検出する特異性を報告している。他方、Ｅｄｂｅｒｇの具体例に 対比すると、本発明に記載の他の培地又は方法を使用する場合には大腸菌等の細 菌を含む全大腸菌群を約１８時間以内に検出することができ、しかも驚くべきこ とに容量１００ｍｌ当たり１ＣＦＵを検出する特異性を維持することができる。 具体的には、本発明は細胞増殖を助長するためにビタミン及びアミノ酸の配合量 を増加した培地に関する。例えば、ビタミン及びアミノ酸の量をＥｄｂｅｒｇに より記載されている培地の量よりも増加すると、より短い検出時間が得られる。 大腸菌を検出するためには以下の化合物を含有する培地が特に有用であり、より 迅速な増殖速度と優れた特異性により、２４時間以内の検出が可能である。指定 量の５〜１０倍のレベルの量の配合剤Ｉを提供すると、１８時間以内に大腸菌を 検出することができる。 特定アミノ及びビタミンと数種の元素を記載するが、当業者であれば特異性を 低下させずに各成分の相対量を大幅に変更できることが理解されよう。 本発明の培地の更に特定的な例では、配合剤Ｉは表Ｉに示す量の１０倍の量（ ±１０％）で配合剤IIと共に提供される。これを本明細書では培地２と呼ぶ。全大腸菌群細菌 酵素に基づく栄養指標検出システムは、１８時間以内に容量１００ｍｌ中に１ 個の大腸菌群細菌を検出する特異性をもつ。培地中で一次炭水化物源としてオル トニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を使用する場合に は、１８時間後に試験培地中に強い黄変が出現するか否か培地をモニターするこ とにより、全大腸菌群細菌を検出することができる。酵素β−Ｄ−ガラクトシダ ーゼは全大腸閑細菌に存在し、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ シドの加水分解を触媒するように作用する。この反応は不可逆的であると共に、 大腸菌群細菌の存在に極めて感受性である。全大腸菌群のうちで大腸菌が存在す る場合には、３６６ｎｍ域の紫外線ランプを試料の近くに置くと培地は蛍光青変 する。この蛍光は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵ Ｇ）の加水分解により蛍光化合物４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）を生じる ためであり、反応は９７％を上回る大腸菌株に存在する酵素β−Ｄ−グルクロニ ダーゼにより触媒される。 最高速度の細菌増殖と酵素活性を生じるように培地を最適化すると、最大速度 且つ最低費用で検出を達成することができる。更に、代謝損傷細菌の回収及び増 殖を助けるために、ピルビン酸ナトリウムを培地に添加してもよい。通常は約０ ．０００５重量％の量で十分である。また、試料を乾燥インキュベーターに入れ る前に約３５℃の水浴に２０分間浸して試料と培地の混合物を約３５℃まで熱平 衡させると、検出所要時間は著しく短縮する。水中の大腸菌群細菌の分析 飲料水及びリクレーション設備用水中の大腸菌群細菌の存在を検出することは 重要である。水中に抗菌剤が存在する場合には、チオ硫酸ナトリウム又はＥＤＴ Ａナトリウム等の中和剤を加えると有用な場合もある。あるいは、標準方法に従 って試料を調製することにより、大腸菌群細菌の存在を検出することもできる。 水試料１００ｍｌを収集し、試料に増殖培地を加え、細菌増殖を誘導する温度（ 通常は３５℃）で試料をインキュベートすると、約１８時間後に試料の変色によ り大腸菌群細菌の存在が示される。試料と培地の混合後２２時間までの任意の時 点で陽性結果が生じることもある。比較的高濃度の大腸菌群細菌の存在下では著 しく迅速に結果が表れる場合もある。本発明に記載の培地及び方法を使用すると 、容量１００ｍｌ中大腸菌群細菌１個の存在を測定することができる。色原部分 色原部分を含む多数の基質が特異的酵素活性を示す標的微生物を含む試料中で 特徴的変色を示すことは立証されている。例えばβ−Ｄ−グルクロニダーゼの存 在下では、大腸菌が存在する場合にはオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロ ニドは黄変し、４−メチルウンベリフェリルグルクロニドは３６６ｎｍで励起後 に蛍光を発生し、ブロモクロロインドール−β−Ｄ−グルクロニドは青変する。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在下では、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ クトピラノシドは黄変し、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラ ノシドは３６６ｎｍで励起後に蛍光を発生する。 所定の組み合わせは大腸菌と全大腸菌群細菌の存在を検出するのに有効である ことが立証されている。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドは オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと併用することができる。 大腸菌群細菌が存在する場合には、溶液は可視波長域内で黄変する。大腸菌と他 の大腸菌群細菌が存在する場合には、試料溶液は黄変すると共に、３６６ｎｍで 励起後に蛍光を発生する。 栄養指標は当業者に周知の方法により製造することができる。方法は一般に栄 養部分を色原部分に結合して栄養指標とすることを特徴とする。このような方法 の例はＥｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号に記載されている。現在利用可能な検出方法 飲料水中の微生物の存在を調査するために広く受け入れられている２種の標準 方法は、多重管発酵を最高確率数分析（ＭＰＮ）試験及び膜濾過（ＭＦ）試験と 組み合わせた方法である。大腸菌群細菌を検出するためのこれらの方法のプロト コルは、推定試験と確認試験を併用し、完了までにおよそ４８〜９６時間を要す る。また、１ｍｌ当たり５００個を越える非大腸菌群細菌が存在する場合には偽 陽性又は偽陰性示度を生じる恐れがあるので、試験の結果が混乱する。 Ｅｄｂｅｒｇの米国特許第４，９２５，７８９号に記載されているＣＯＬＩＬ ＥＲＴ（登録商標）試験の発明は、従来利用可能であった方法よりも著しく前進 した。この方法を使用すると、試料１００ｍｌ当たり微生物１個程度の低濃度の 試料中の大腸菌群細菌を検出することができる。この方法は、微生物同定のため に推定段階と確認段階の併用を特徴とする。従って、検出速度が著しく速く、非 大腸菌群細菌の増殖を著しく制限する種々の選択物質が培地中に存在するため、 偽陰性又は偽陽性示度を得る可能性が著しく低下する。他方、本発明の培地は従 来使用されている培地の少なくとも２倍の濃度のアミノ酸、ビタミン、微量元素 及び塩を使用するものである。驚くべきことに、このように培地を変更すると、 特異性を低下せずに著しく迅速な検出が得られる。 本発明は、試料中の大腸菌群細菌及び大腸菌を検出する既存方法と同等の性能 であった。検出方法 液体試料を上記培地と混合し、培地を含む液体試料を適当なインキュベーショ ン用容器に入れ、液体試料と培地の混合物をインキュベートし、検出可能な特性 シグナルの量及び品質を観察し、検出可能な特性シグナルの量及び品質を最高確 率数値と比較することにより、液体試料中に存在する標的微生物の数を定量する ことができる。この定量方法は、変化した特性の量及び品質、好ましくは変色を 最高確率数値と比較することを特徴とし、最高確率数値は既知細菌濃度の試料と 濃度及び特性変化を相関させておいた試料から得られる。例えばＶａｎｄｅｒｚ ａｎｔとＳｐｌｉｔｔｓｔｏｅｓｓｅｒ編，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｘａｍｉｎ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄｓ，第３版 ，１９９２参照。最高確率数法は、他の 方法の検出可能な限界を下回る細菌濃度を定量することができる。最高確率数は 、試料の１種以上の希釈液中で結果が陽性又は陰性として報告される応答から推 定される。この方法は、全試料が陽性結果を提供する必要はなく、通常は各希釈 液の少なくとも３個の試料が必要である。多数の最高確率数値表が入手可能であ る。このような系列の１例は、その開示内容を参考資料として本明細書の一部と するｄｅ Ｍａｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：６７（１ ９７５）に記載されている。最高確率数の推定は、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｗ ａｔｅｒ Ｗｏｒｋｓ Ａｓｓｏｃ． ３４：５７２（１９４２）に報告されてい る一般式：ＭＰＮ／ｇ＝Ｐ／（ＮＴ）を使用して実施することができ、式中、Ｐ は陽性試験管数であり、Ｎは全陰性試験管中の試料の合計量であり、Ｔは全試験 管中の試料の合計量である。量はグラムで表される。 Ｎａｑｕｉらはその開示内容を参考資料として本明細書の一部とする係属米国 特許出願第０８／２０１，１１０号において、液体試料中の細菌数の精密定量法 を記載している。同発明は、液体試料を保持する新規装置を使用している。同装 置は、液体試料を収容するように設計された袋から構成されることを特徴とし、 １種以上の寸法の各アリコートを試験できるように、袋の内側の分離した区画に 液体試料を分配する。同出願に記載されている発明は更に、培地を加えて微生物 の増殖を助長し、約２５０°Ｆ〜３５０°Ｆの温度で約５秒間同発明の袋をヒー トシールし、試料を適当な温度で適当な時間インキュベートして微生物を増殖さ せ、結果を記録及び分析することにより、試料中に存在する微生物を定量するこ とができる。定量段階は、変色の量及び品質を検出し、生存可能な合計細菌の濃 度が分かっている一連の試料で得られた結果と前記量及び品質を比較することに より行われる。実験１ 損傷生物プロトコル 下記プロトコルは米国ＥＰＡ手順による。この手順に従い、損傷微生物の試料 を収集した。この手順は、本発明の培地と従来技術の培地で結果を得るために必 要な特異性及び時間を比較するのに使用する試料の適正なサンプリング及び管理 を確保するための手段として記載する。 １．外部源（例えば廃水処理施設）から新鮮な一次排水２リットルを得る。 ２．排水をＷｈａｔｍａｎ−４０（１５０ｍｍ直径）フィルターに通す。 ３．塩素損傷に先立って濾液を室温にする。 ４．排水のｐＨと温度を調べた後、チオ硫酸ナトリウムを含まない２１個のポ リスチレン容器に４９．５ｍｌアリコートを分配する。 ５．試料をＲｏｔｏ−Ｍｉｘ ５０８００プラットフォーム（設定２）に載せ て室温で震盪する。 ６．ＮａＯＣｌ（次亜塩素酸ナトリウム）溶液（５〜６％）を最終濃度５ｐｐ ｍで各試料に分注する。すぐに１個の試料の合計及び遊離塩素濃度を調べる。 ７．２分後に１０％チオ硫酸ナトリウム溶液２５μｌを第１の試料に加える。 最初の添加後２分間隔で同一量のチオ硫酸ナトリウムを残りの試料に加える。 ８．チオ硫酸ナトリウムの添加の直前に損傷の中間点及び最後の試料中の合計 及び遊離塩素濃度を測定する。 ９．ｍＥｎｄｏプレートで膜濾過により各試料中の生存大腸菌群細菌の数を測 定し、ｍＥｎｄｏプレートで膜濾過（希釈必要）により未処理排水中の大腸菌群 細菌の原濃度を測定する。 １０．インキュベーションから２２〜２４時間後に各ｍＥｎｄｏプレート（大 腸菌の選択培地）上の大腸菌群細菌の数を計数する。合計大腸菌群細菌濃度が２ Ｌｏｇ１０〜４Ｌｏｇ１０低下した適当な試料を選択し、この試料の２倍系列希 釈液を調製する。実施する希釈回数は存在する生存大腸菌群細菌の数に依存し、 大腸菌群細菌を含まない少なくとも２種の希釈液が必要である。損傷生物の有無の検出 本実験の趣旨は、培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地が塩素化一次 排水からの損傷大腸菌群細菌及び大腸菌の存在を検出する相対性能を比較するこ とである。２種の培地を比較するために実施した手順は、まず各希釈塩素化排水 試料を試験培地に接種することから出発し、各希釈液１ｍｌを３本のＣｏｌｉｌ ｅｒｔ（登録商標）試験管に接種し、各希釈液１ｍｌを３本の培地２試験管に接 種した。次に、培地２試験管を３５℃±０．５℃水浴中で２０分間熱平衡させ、 Ｃｏｌｉｌｅｒｔ試験管は３５℃±０．５℃乾燥インキュベーターに入れた。２ ０分後に培地２試験管を３５℃乾燥インキュベーターに入れた。その後、色と蛍 光をモニターした処、培地２では１８時間、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地 では２４時間で結果が記録された。無作為抽出した陽性培地２試料をＥＭＢ寒天 に画線培養し、単離し、ＡＰＩ ２０Ｅを用いて更に同定した。結果 これらの試験ではジョージア州、メーン州、コネクティカット州及びカリフォ ルニア州の４種の別々の地理的に多様な地点からの７種の排水を使用した。合計 ２０１本の培地２試験管と２０１本のＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管に処 理済み排水希釈液を接種した。次の結果が得られた。 カイ二乗検定試験による分析の結果、これらの値は９５％信頼性指数限界内で 有意差ゼロであった。ＡＰＩ ２０Ｅキットを使用して合計４３個の陽性培地２ 試料を分析した処、４３個の試料はいずれも大腸菌群細菌を含んでいた。これら のデータから明らかなように、培地２は１８時間インキュベーション後に、２４ 時間インキュベーション後のＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地と同等数の損傷 大腸菌群細菌及び大腸菌を検出した。従って、本発明の培地はＣｏｌｉｌｅｒｔ （登録商標）培地と同等の特異性であり、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地は 検出に２４時間かかるが、本発明の培地は１８時間で微生物を検出することがで きる。実験２ 損傷生物ＭＰＮ法とＬＴＢ法の比較 本実験の趣旨は、培地２が塩素化一次排水から損傷大腸菌群細菌及び大腸菌の 存在を検出する性能をラウリルトリプトースブロス（ＬＴＢ）（ＥＰＡリファレ ンス）法と比較することである。まず各希釈液１００μｌを１０本の培地２試験 管（各１０ｍｌ）に加え、各希釈液１００μｌを１０本のＬＴＢ試験管（１倍濃 度）に加えて各希釈試料を試験培地に接種することにより試験結果を得た。次に 、培地２試験管を３５℃水浴中で２０分間熱平衡させた。ＬＴＢ試験管は直接３ ５℃乾燥インキュベーターに入れた。２０分後に培地２試験管を３５℃乾燥イン キュベーターに入れた。その後、色と蛍光をモニターした処、培地２では１８時 間で結果が記録された。無作為抽出陽性培地２試料をＥＭＢ寒天に画線培養し、 単離し、ＡＰＩ ２０Ｅを用いて更に同定した。次に、２４及び４８時間インキ ュベーション後にＬＴＢ試料にガスが存在するか否かを調べた。ガスが存在して いた場合には、試料をＢＧＬＢ（ブリリアントグリーンラクトースブロス）１０ ｍｌ及び大腸菌と４−メチルウンベリフェロングルクロニドブロス（ＥＣ−ＭＵ Ｇ）１０ｍｌに接種した。ＢＧＬＢ試験管を３５℃乾燥インキュベーターで２４ 〜４８時間インキュベートした。ＥＣ−ＭＵＧ試験管は４４．５℃水浴中で２４ 時間インキュベートした。ＢＧＬＢ試験管にガスが存在するならば、大腸菌群細 菌が存在する。ＥＣ−ＭＵＧ試験管にガスと蛍光が存在するならば、大腸菌が存 在する。ＢＧＬＢ及びＥＣ−ＭＵＧ試験管がインキュベーションを終了後に実験 は完了する。結果 本試験ではメーン州とカリフォルニア州の２種の一次排水地点からの２種の排 水を使用した。合計２４０本の培地２ＭＰＮ試験管を２４０本のＬＴＢ試験管と 比較した。結果は以下の通りである。 カイ二乗検定試験による分析の結果、これらの値は９５％信頼性指数限界内で 有意差ゼロであった。ＡＰＩ ２０Ｅキットを使用して合計４６個の陽性培地２ 試料を分析した処、４６個の試料はいずれも大腸菌群細菌を含んでいた。従って 、培地２はＬＴＢ法よりも一次排水から損傷大腸菌群細菌及び大腸菌を回収する 性能が優れている。実験３ 従属栄養干渉 本実験の趣旨は、培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）培地が高濃度の従 属栄養細菌の存在下で非損傷大腸菌群細菌及び大腸菌を検出する性能を試験する ことである。以下の手順に従った。まず各１００ｍｌの培地２及びＣｏｌｉｌｅ ｒｔ（登録商標）試験管に１〜１０ＣＦＵの下記細菌：大腸菌（ＡＴＣＣ２５９ ２２）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＡＴＣＣ８０９０）、Ｋ ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）及びＥｎｔ ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＡＴＣＣ３３４５７）を接種した。第２ 組の試料でこの段階を繰り返した。第２組の試験管にはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈ ｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ（ＡＴＣＣ３５６５４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ１０１４５）又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ ｒｅｆａｃｉｅｎｓ（天然単離体）を１６，０００〜１０，０００ＣＦＵ／ｍｌ の濃度範囲で接種した。培地２及びＣｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験管にＡ． ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ又は Ｐ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ単独を接種し、偽陽性結果を試験した。培地２試 験管を３５℃水浴中で２０分間熱平衡させ、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）試験 管は３５℃乾燥インキュベーターに入れた。２０分後に培地２試験管を３５℃乾 燥インキュベーターに入れた。その後、色と蛍光をモニターした処、培地２では １８時間、Ｃｏｌｉｌｅｒｔ（登録商標）では２４時間で結果が記録された。結果 下記結果が得られた。 従属栄養細菌の存在下及び不在下の大腸菌群 本試験では合計３６本の培地２及び３６本のＣｏｌｉｌｅｒｔ試験管を試験し た。各３６本の試験管のうち９本が大腸菌を含んでいた。従属栄養細菌単独 本試験では合計２４本の培地２と２４本のＣｏｌｉｌｅｒｔ試験管を試験した 。 下記請求の範囲には他の態様も含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者 タウンゼント，デヴィッド・イー アメリカ合衆国メイン州04074，スカボロ ー，チャーチ・ストリート 29

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液化環境又は生物試料中の標的微生物の有無の検出を可能にする標的微生物 特異的培地であって、 ａ）１００ｍｌ当たり１０個未満の微生物を含む試料で１８時間以内に試料中の 検出可能な変化を観察できるような速度で前記標的微生物の生存及び生殖を可能 にするように作用し得る有効量のビタミン、アミノ酸、元素及び塩成分と、 （ｂ）標的微生物の増殖中に培地中に検出可能な特性シグナルを発生するために 十分な量で提供され、標的微生物により代謝されると試料の検出可能な特性を変 化させ、試料中の標的微生物の有無を確認できるように作用し得る有効量の１種 以上の栄養指標を含む前記標的微生物特異的培地。 ２．前記栄養指標が前記微生物特異的培地を変色させる請求項１に記載の培地。 ３．前記栄養指標が可視波長域で前記微生物特異的培地を変色させる請求項２に 記載の培地。 ４．励起光源に暴露後に蛍光発光することが可能であり、可視波長域で検出可能 な部分を含む請求項２に記載の培地。 ５．前記微生物が大腸菌群である請求項１に記載の培地。 ６．前記微生物が大腸菌である請求項５に記載の培地。 ７．前記栄養指標がβ−Ｄ−グルクロニダーゼ基質である請求項１に記載の培地 。 ８．前記β−Ｄ−グルクロニダーゼ基質がオルトニトロフェニル−β−Ｄ−グル クロニド、β−ナフタルアミド−β−Ｄ−グルクロニド、α−ナフトール−β− Ｄ−グルクロニド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドから 構成される群から選択される請求項７に記載の培地。 ９．前記栄養指標がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質である請求項１に記載の培地 。 １０．前記β−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質がオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガ ラクトピラノシド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ドから構成される群から選択される請求項９に記載の培地。 １１．前記栄養指標がβ−グルコシダーゼ基質である請求項１に記載の培地。 １２．前記栄養指標がＬ−ピロニドニルアミノペプチダーゼ基質である請求項１ に記載の培地。 １３．前記栄養指標がＬ−アラニンアミノペプチダーゼ基質である請求項１に記 載の培地。 １４．非標的微生物が前記栄養指標を代謝するのを阻止する抗生物質を更に含む 請求項１に記載の培地。 １５．前記抗生物質がグラム陽性微生物又は非標的グラム陰性微生物に作用する 請求項１４に記載の培地。 １６．非滅菌水溶性粉末を含む請求項１に記載の培地。 １７．代謝損傷細胞の回収を助けるために十分な量のピルビン酸ナトリウムを更 に含む請求項１に記載の培地。 １８．１８時間以内に液体試料中の大腸菌群細菌を検出できるように有効量の下 記成分： ａ）窒素、 ｂ）微生物増殖に必要であるか又は微生物増殖を誘導することができ、アラニン 、アルギニン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジ ン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ ン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから構成される 群から選択されるアミノ酸、 ｃ）カルシウム、塩化物、コバルト、銅、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、リ ン酸塩、カリウム、ナトリウム、硫酸塩、硫黄、錫、亜鉛、ビオチン、コリン、 葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ＰＡＢＡ、パントテン酸、ピリドキシン、リ ボフラビン、チアミン及びチミジンから構成される群から選択される成分、 ｄ）ビオチン、コリン、シアノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、 ＰＡＢＡ、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ナイアシン 及びチミジンから構成される群から選択されるビタミン、 ｅ）１種以上の酵素活性インデューサー、 ｆ）１種以上の栄養指標、並びに ｇ）１種以上のアミノ酸又はＤＮＡ前駆物質 の一部又は全部を含む請求項１に記載の培地。 １９．４．５〜５．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム又は等量のアンモニウムイオン 、６．０〜７．５ｇ／ｌのＨＥＰＥＳ遊離酸、４．７〜５．８ｇ／ｌのＨＥＰＥ Ｓナトリウム塩、０．１２〜０．１７ｇ／ｌのＤ−グルコン酸、０．０３６〜０ ．０４４ｇ／ｌの亜硫酸ナトリウム、０．００１〜０．００３ｇ／ｌのアンホテ リシンＢ又は等価有効量の抗真菌剤、０．０９〜０．１１ｇ／ｌの硫酸マグネシ ウム又はマグネシウムイオン等価源、０．４５０〜０．５５０ｇ／ｌのＯＮＰＧ 又は等量の栄養指標、０．０５〜０．１０ｇ／ｌのＭＵＧ又は等量の栄養指標、 ０．０００４〜０．０００６ｇ／ｌの硫酸亜鉛（七水和物）又は亜鉛イオン等価 源及び０．０００４〜０．０００６ｇ／ｌの硫酸マンガン又はマンガンイオン等 価源； アラニン少なくとも０．０２５ｇ／ｌ、アルギニン少なくとも０．０３０ｇ／ｌ 、アスパラギン酸少なくとも０．０５６ｇ／ｌ、グルタミン酸少なくとも０．１ ０２１ｇ／ｌ、グリシン少なくとも０．０１５ｇ／ｌ、シスチン少なくとも０． ００２ｇ／ｌ、ヒスチジン少なくとも０．００５８ｇ／ｌ、イソロイシン少なく とも０．０１４５ｇ／ｌ、ロイシン少なくとも０．０３０１ｇ／ｌ、リシン少な くとも０．０３４２ｇ／ｌ、メチオニン少なくとも０．０１１９ｇ／ｌ、フェニ ルアラニン少なくとも０．０１８１ｇ／ｌ、セリン少なくとも０．０２８７ｇ／ ｌ、トレオニン少なくとも０．０１８１ｇ／ｌ、トリプトファン少なくとも０． ００３６ｇ／ｌ、チロシン少なくとも０．００６４ｇ／ｌ及びバリン少なくとも ０．０２３５ｇ／ｌ； 鉄（少なくとも０．００１６５ｍｇ／ｌ）、カルシウム、リン酸塩、カリウム、 ナトリウム、塩化物、コバルト、銅、鉛及びマンガン； 並びにビオチン少なくとも０．００００５ｍｇ／ｌ、コリン少なくとも０．０５ ｍｇ／ｌ、葉酸少なくとも０．００００７５ｍｇ／ｌ、イノシトール少なくとも ０．０６ｍｇ／ｌ、ナイアシン少なくとも０．００３８５ｍｇ／ｌ、ＰＡＢＡ少 なくとも０．０２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸少なくとも０．０１０９５ｍｇ／ｌ 、ピリドキシン少なくとも０．００１５ｍｇ／ｌ、リボフラビン少なくとも０． ００２８ｍｇ／ｌ、チアミン少なくとも０．００３７ｍｇ／ｌ、チミジン少なく とも０．０１０ｍｇ／ｌ及び微量のシアノコバラミンを含む培地。 ２０．ａ）４．５〜５．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、６．０〜７．５ｇ／ｌの ＨＥＰＥＳ遊離酸及び４．７〜５．８ｇ／ｌのＨＥＰＥＳナトリウム塩に等量の １種以上の緩衝液、０．１３〜０．１６ｇ／ｌのＤ−グルコン酸、０．０３６〜 ０．０４４ｇ／ｌの亜硫酸ナトリウム、０．０００９〜０．００１１ｇ／ｌのア ンホテリシンＢ、０．０９〜０．１１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム、０．４５０〜 ０．５５０ｇ／ｌのオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮ ＰＧ）又は０．０５〜０．１０ｇ／ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ− グルクロニド（ＭＵＧ）に等量の１種以上の栄養指標、０．０００４〜０．００ ０６ｇ／ｌの硫酸亜鉛、及び０．０００４〜０．０００６ｇ／ｌの硫酸マンガン 、少なくとも１．１〜１．７ｇ／ｌの窒素分； ｂ）標的微生物の増殖に必要であり、増殖を助長するのに有効な量で提供され、 アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、 シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニ ルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから構 成される群から選択されるアミノ酸； ｃ）微生物の増殖を助けるために十分な量で提供され、鉄（少なくとも０．００ １６５ｍｇ／ｌ）、カルシウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、塩化物、コ バルト、銅、鉛及びマンガンから構成される群から選択される１種以上の作用物 質； ｄ）微生物の増殖を助けるために十分な量で提供され、ビオチン、コリン、シア ノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシン、ＰＡＢＡ、パン トテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン及びチミジンから構成される 群から選択される１種以上のビタミン；並びに ｅ）非大腸菌群微生物の増殖を阻害するように作用する１種以上の作用物質を含 む標的微生物特異的培地。 ２１．環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無の検出方法であって、前記液 体試料を乾燥インキュベーターに入れる前に前記液体試料を水浴中でインキュベ ーション温度まで熱平衡させる段階を含む前記方法。 ２２．前記インキュベーション温度が３０〜４１℃であり、１０分間よりも長く この温度に維持する請求項２１に記載の方法。 ２３．１８時間以内に環境又は生物液体試料中の標的微生物の有無を検出する方 法であって、 ａ）栄養指標の存在下で前記標的微生物の生存及び生殖を可能にするように作用 し得る有効量のビタミン、アミノ酸、元素及び塩成分と、増殖中に培地中に検出 可能な特性シグナルが発生するまで前記標的生物の増殖を維持するために十分な 量で提供され、標的微生物により代謝されると試料の検出可能な特性を変化させ 、試料中の標的微生物の有無を確認できるように作用し得る有効量の栄養指標と を含む培地と前記液体試料を混合する段階と、 ｂ）前記液体試料と培地の混合物を３０〜４１℃のインキュベーション温度まで 加温する段階と、 ｃ）試料をモニターし、前記検出可能な特性が変化したか否かを判定する段階を 含む前記方法。 ２４．前記モニターが２４時間未満である請求項２３に記載の方法。 ２５．前記培地が１種以上の潜在的非標的微生物の増殖を阻害する有効量の少な くとも１種の抗生物質を更に含む請求項２３に記載の方法。 ２６．前記インキュベーション温度が３０〜４１℃であり、前記液体試料を前記 インキュベーション温度に１０分間以上維持する請求項２３に記載の方法。 ２７．前記培地が ａ）アミノ窒素、 ｂ）微生物増殖に必要であるか又は微生物増殖を誘導することができ、アラニン 、アルギニン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジ ン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ ン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから構成される 群から選択されるアミノ酸、 ｃ）カルシウム、塩化物、コバルト、銅、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、リ ン酸塩、カリウム、ナトリウム、硫酸塩、硫黄、錫、亜鉛、ビオチン、コリン、 葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ＰＡＢＡ、パントテン酸、ピリドキシン、リ ボフラビン、チアミン及びチミジンから構成される群から選択される成分、 ｄ）ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２ 、ナイアシン及びパントテン酸から構成される群から選択されるビタミン、 ｅ）１種以上の酵素活性インデューサー、 ｆ）１種以上の栄養指標、並びに ｇ）１種以上のアミノ酸又はＤＮＡ前駆物質を含む請求項２３に記載の方法。 ２８．前記培地が ａ）４．５〜５．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、６．０〜７．５ｇ／ｌのＨＥＰ ＥＳ遊離酸及び４．７〜５．８ｇ／ｌのＨＥＰＥＳナトリウム塩に等量の１種以 上の緩衝液、０．１３〜０．１６ｇ／ｌのＤ−グルコン酸、０．０３６〜０．０ ４４ｇ／ｌの亜硫酸ナトリウム、０．０００９〜０．００１１ｇ／ｌのアンホテ リシンＢ、０．０９〜０．１１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム、０．４５０〜０．５ ５０ｇ／ｌのオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ） 又は０．０５〜０．１０ｇ／ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルク ロニド（ＭＵＧ）に等量の１種以上の栄養指標、０．０００４〜０．０００６ｇ ／ｌの硫酸亜鉛、及び０．０００４〜０．０００６ｇ／ｌの硫酸マンガン、少な くとも０．０６ｇ／ｌのアミノ窒素分を含む少なくとも１．１〜１．７ｇ／ｌの 窒素分； ｂ）標的微生物の増殖に必要であり、増殖を助長するのに有効な量で提供され、 アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、 シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニ ルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから構 成される群から選択されるアミノ酸； ｃ）微生物の増殖を助けるために十分な量で提供され、鉄（少なくとも０．００ １６５ｍｇ／ｌ）、カルシウム（少なくとも０．０００３ｇ／ｌ）、リン酸塩（ 少なくとも０．０００５ｇ／ｌ）、カリウム（少なくとも０．００４ｇ／ｌ）、 ナトリウム（少なくとも０．０３ｇ／ｌ）、塩化物、コバルト、銅、鉛及びマン ガンから構成される群から選択される１種以上の作用物質； ｄ）微生物の増殖を助けるために十分な量で提供され、ビオチン、コリン、シア ノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシン、ＰＡＢＡ、パン トテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン及びチミジンから構成される 群から選択される１種以上のビタミン；並びに ｅ）非大腸菌群微生物の増殖を阻害するように作用する１種以上の作用物質を含 む請求項２３に記載の方法。