JPH10505233A - シルコウイルス由来の植物転写調節因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はシルコウイルス起源の転写調節因子及び転写調節因子様配列に関する。本出願において使用されるように、シルコウイルスグループはサブテレーニアン・クローバ・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）、ココナット・フォリア・ディケイ・ウイルス（ＣＦＤＶ）、バナナ・バンチ・トップ・ウイルス（ＢＢＴＶ）、ミルク・ベッチ・ドゥオルフ・ウイルス（ＭＤＶ）及びファバ・ビーン・ネクロティック・イエロー・ウイルス（ＦＢＮＹＶ）を含むと考えられる。本発明の転写調節因子及び転写調節因子様配列は、外来遺伝子の発現を促進し又はコントロールするため、植物、殊にマメ科植物の遺伝子工学において有用である。本発明の転写調節因子及び転写調節因子様配列は、異なるタイプの植物組織において異なるレベルの発現を容易にする場合にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 シルコウイルス由来の植物転写調節因子 本発明は一般的に植物中で機能し得る新規な転写調節因子及び転写調節因子様 配列に関する。より詳しくは、本発明はウイルス起源の、より具体的にはシルコ ウイルス起源の転写調節因子及び転写調節因子様配列に関する。本発明の転写調 節因子及び転写調節因子様配列は外来遺伝子の発現の容易化あるいはコントロー ルなどの植物、特にマメ科の植物の遺伝子工学において有用である。本発明の転 写調節因子及び転写調節因子様配列は異なるタイプの植物組織における異なるレ ベルの発現を容易にする場合にも有用である。 本出願書類で著者により参照された出版物の文献上の詳細は明細書の末尾に集 めてある。本出願書類中で参照されたヌクレオチド配列に対する配列番号は文献 の後に規定している。 本出願書類を通じて、文脈上別義に解する必要がある場合を除き、語「含む(c omprise)」、やその変形「含む(comprises)」や「含んでいる（comprising）」 は、述べられている要素又は個体又は要素群又は個体群を含むことを意味するが その他の要素又は個体又は要素群又は個体群を排除することを意味するものでは ないと理解すべきである。 転写調節因子は分子であり、一般的にはヌクレオチド系の分子であり、転写の レベルで遺伝子配列の発現を容易にしたり調節したりする。転写調節因子は他の 転写エフェクターや転写促進因子の中でも特にプロモーター及び終結配列及びポ リアデニル化配列を含む。 プロモーターは細胞中でＲＮＡポリメラーゼがそれに結合してＲＮＡ合成を開 始する特殊なヌクレオチド配列である。プロモーターはＲＮＡ合成の開始位置及 びポリメラーゼにより媒介されるＲＮＡ合成を開始させるための遺伝的シグナル を含む。さらに、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質がプロモーターの隣に結合 しそしてそのプロモーターへのポリメラーゼの結合に悪影響を与えることにより ＲＮＡ合成の開始を阻害したり刺激したりするものと考えられている。ターミネ ーター配列とは終結配列及びポリアデニル化配列を指し、機能的ｍＲＮＡの転写 に要求される。終結配列は遺伝子の下流（即ち、３’−末端側）に位置し、ＲＮ ＡポリメラーゼによってｍＲＮＡの合成を停止させるためのシグナルとして認識 される。ポリアデニル化配列は転写後に行われる真核生物ｍＲＮＡ分子のポリア デニル化のために必要なシグナルである。 植物において外来遺伝子の発現を容易にするために広く用いられているウイル スプロモーターはカリフラウワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロ モーター（オデル(Odell)ら，1985）であり、これは二本鎖ＤＮＡ植物ウイルス 由来のものである。植物及び植物細胞におけるこのプロモーターの使用は充分に 文献で実証されている（ベンフィー及びチュア(Benfey and Chua，1990; ヒギン ス及びスペンサー(Higgins and Spencer，1991)。しかしながら、このプロモー ターの明らかな有用性にもかかわらず、それはすべての植物では機能せず、特に マメ科植物ではほとんど機能し得ない。従って、植物でそして特にマメ科植物で 機能し得るウイルス起源のような他のプロモーターを探し出す必要がある。また 、植物細胞中 で遺伝子又は他の遺伝子配列の発現のレベルを調節する必要もある。 このような事情から、本発明の一つの側面はシルコウイルスプロモーター又は シルコウイルスプロモーター様配列を含み、かつ植物細胞中で機能することがで きる遺伝子構築物に関する。 本発明の関連する側面では、シルコウイルスプロモーター又はシルコウイルス プロモーター様配列及び終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含む遺伝子構 築物が提供される。これらの配列は植物細胞中で機能することができるものであ る。 シルコウイルスは双球形でない(non-geminated)一本鎖(ss)ＤＮＡ植物ウイル ス（表１）であり、二本鎖ゲノムを持つカウリモウイルス及び他の唯一の知られ たssＤＮＡ植物ウイルスであって双球形の粒子を持つジェミニウイルスとも異な っている(チュー(Chu)ら，1994)。本明細書で使用するとき、シルコウイルス群 はサブテレーニアン・クローバ・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）(チュー及び ヘルムス(Chu and Helms)，1988)、ココナット・フォリア・ディケイ・ウイルス （ＣＦＤＶ）（ローデ(Rhode)ら，1990）、バナナ・バンキー・トップ・ウイル ス（ＢＢＴＶ）（トーマス及びディーツゲン(Thomas and Dietzgen)，1991; ハ ーディング(Harding)ら，1991; 1993; バーンズ(Burns)ら，1993）及びミルク− ベッチ・ドゥオーフ・ウイルス（ＭＤＶ）（イソガイ(Isogai)ら，1992; サノ(S ano)ら，1993）及びファバ・ビーン・ネクロティック・イエローズ・ウイルス（ ＦＢＮＹＶ）（カツール(Katul)ら，1993）を含むものと考える。 特に好ましい態様では、本発明に従って使用することを意図するシルコウイル スは３個以上のＤＮＡ成分又はＤＮＡセグメントを含んでいる。 本発明は、シルコウイルス群の代表としてサブテレーニアン・クローバ・スタ ント・ウイルス（以下には「ＳＣＳＶ」と短縮する）を特に取り上げ、以下には これに関して記述する。このことは、しかしながら、ＳＣＳＶへの言及が本発明 の範囲に含まれるシルコウイルス群の他のすべての適当なメンバーへの言及を含 んでいるという理解の基になされるものである。ＳＣＳＶなどのシルコウイルス 群の好ましいメンバーは３個以上のＤＮＡ成分またはＤＮＡセグメントを含んで いる。以下の「ＳＣＳＶ」への言及もまた、このウイルスの自然に生じる突然変 異体又は人工的に誘導された突然変異体、このウイルスの誘導体、部分、断片、 ホモログ、又はアナログなどであって、なお少なくとも１個の適当なプロモータ ー及び／又は終結配列及び／又はポリアデニル化配列を保持しているものすべて を含みそしてこれらのすべてに拡張される。 従って、本発明の特に好ましい態様は、ＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプ ロモーター様配列を含む遺伝子構築物であって、植物細胞中で機能し得る遺伝子 構築物を意図する。 本発明の関連する側面は、ＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプロモーター様 配列及び終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含む遺伝子構築物であって、 これらの配列が植物細胞中で機能し得る 遺伝子構築物に関する。 「遺伝子構築物」という言葉は、その最も広い意味で用いられ、単離された核 酸分子、ベクター、発現ベクター又は二成分ベクターなどの如何なる組換え核酸 分子をも含む。それはシルコウイルスプロモーターのみを含んでいてもよく、又 は調節配列及び／又はレポータ配列と共に１又は２以上のプロモーターを含んで いてもよい。 遺伝子構築物は二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでもよく、直鎖状でも共有結合 的に閉じた環状であってもよい。上に述べたように、それはプロモーター又はプ ロモーター様配列のみを含んでいてもよく又はＳＣＳＶと関連するプロモーター を含む他の異種の又は同種の転写調節配列及び／又は異種の構造遺伝子配列を保 持していてもよい。「同種の」とは、自然界でＳＣＳＶプロモーターと関連して いる遺伝子配列を意味する。「異種の」とは、そのプロモーターに関しては「外 来の」遺伝子、あるいはＳＣＳＶプロモーターとは他の方法では正常には関連し ない遺伝子を意味する。好ましい１態様では、外来遺伝子はＳＣＳＶにとっても 外来である。外来遺伝子の例としては、昆虫や他の害虫の侵略に対して抵抗性を 高める遺伝子、殺虫剤や除草剤に対する抵抗性を高める遺伝子、霜抵抗性を高め る遺伝子、花や花弁の色を変える遺伝子、特に切り花の、老化速度を遅くする遺 伝子、ある種のタンパク質及び／又はリボザイムのレベルを増加または高める遺 伝子などが含まれる。より具体的には、外来遺伝子には以下のものが含まれる。 ａ）植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫及び他の病原体に対する抵抗性 遺伝子、 ｂ）アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・モトル・ウイルス、サブテ レーニアン・クローバ・レッド・リーフ・ウイルス、ポテト・リーフロル・ウイ ルス、トマト・スポッテッド・ウィルト・ウイルス、ビーン・イエロー・モザイ ク・ウイルス、ホワイト・クローバ・モザイク・ウイルス、クローバ・イエロー ・ベイン・ウイルス、ポテト・ウイルス類ｘ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・ モザイク・ウイルス、ライス・ラッグド・スタント・ウイルス及びバーリー・イ エロー・ドゥオーフ・ウイルスからの合成遺伝子及びこれらのウイルスに対する 合成遺伝子を含む植物ウイルス耐性遺伝子、 ｃ）ヒマワリ高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価を高める遺伝子、 ｄ）鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ）抗体遺伝子、 ｆ）穀類チオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ）ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアーナ・アラータ(Nicotiana alata)由来の プロテイナーゼ阻害剤遺伝子を含む昆虫抵抗性遺伝子、 ｈ）カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する耐性を与える遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子、 ｉ）ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ）植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコ ードする遺伝子。 本発明は、植物細胞中で働くことができる同一ま又は異種のシルコウイルスプ ロモーターに機能的に連結された二つの異種遺伝子を含む遺伝子構築物をさらに 含んでいる。このプロモーター又は異種のプロモーター類は３個以上の成分又は セグメントを含む１つのゲノムを持つシルコウイルス由来のものであることが好 ましい。このプロモーター又は異種のプロモーター類はＳＣＳＶ由来のものであ ることがより好ましく、配列番号１〜７（以下を見よ）により規定されるような ＳＣＳＶのセグメント１〜７から選択されるものであることが特に好ましい。こ の遺伝子構築物は異種遺伝子の一方又は両方に機能的に連結している一つの終結 配列又はポリアデニル化配列を含むこともできる。一つの態様では、終結配列及 び／又はポリアデニル化配列は各遺伝子について同一である。別の態様では終結 配列及び／又はポリアデニル化配列は各遺伝子について異なっている。終結配列 及びポリアデニル化配列が配列番号１〜７（以下を見よ）により規定されたよう なＳＣＳＶのセグメント１〜７から選択されることが最も好ましい。さらに別の 態様では少なくとも一つの終結配列及びポリアデニル化配列はフラベリア・ビデ ンティス(Flaveria bidentis)のＭｅＡ３遺伝子由来のものである（以下を見よ ）。 「転写調節因子」という語は最も広い意味で用いられ、プロモーター類、終結 配列類、ポリアデニル化配列類、及び遺伝配列の転写の他のエフェクター類や促 進因子類を含むものである。本発明の考えるプロモーター類については、終結配 列及びポリアデニル化配列はＳＣＳＶ起源のものであってもよく、そしてＳＣＳ Ｖ由来の対応 するプロモーターと自然に組み合わされていてもよくあるいはＳＣＳＶの他のプ ロモーターと組み合わされていてもよい。また、終結配列及び／又はポリアデニ ル化配列はＳＣＳＶ起源以外のものから由来してもよい。特に好ましいターミネ ーターは、Ｃ４光合成のＮＡＤＰ−リンゴ酸酵素をコードするフラベリア・ビデ ンティスのＭｅＡ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列を含むものである（ハチ(Hat chi)，1987）。ＭｅＡ遺伝子のターミネーター領域のヌクレオチド配列を図１５ に示す。ＳＣＳＶプロモーターの、例えばエフ・ビデンティスＭｅＡ遺伝子ター ミネーター配列との組み合わせは、ターミネーター配列を持たない構築物に比べ て特に単子葉植物中で高レベルの発現を引き起こす。 外来遺伝子は内因性植物遺伝子産物のレベルを減少させやすいようにアンチセ ンスの方向であってもよい。なお、「遺伝子」とは長さが１０塩基対であっても よく、長さが数十の塩基対であってもよく、長さが数１００の塩基対であっても よく、あるいは全長又は全長に近い遺伝子であってもよいが、プロモーターに関 しては逆方向である。外来遺伝子は標的遺伝子の同時抑制のために「センス」方 向に置かれてもよい。 本発明の別の側面によれば、植物細胞中で機能し得るＳＣＳＶプロモーター又 はＳＣＳＶプロモーター様配列を含みかつ異種遺伝子が該プロモーターに機能的 に連結するように該遺伝子を挿入しやすくするための該プロモーターの下流の制 限エンドヌクレアーゼ部位を少なくとも一つ含む遺伝子構築物が提供される。別 の態様では、遺伝子構築物は植物細胞中で機能し得るＳＣＳＶプロモーター又は ＳＣＳＶプロモーター様配列及び該プロモーターに機能的に連結している異種遺 伝子とを含んでいる。両態様共に、「遺伝子」とはアンチセンス技法において有 用なオリゴヌクレオチド類及びリボザイム類の合成を指令する遺伝子を含んでい る。 本発明のさらなる態様においては、植物細胞中で機能し得るＳＣＳＶプロモー ター又はＳＣＳＶプロモーター様配列を含みかつ異種遺伝子が該プロモーターに 機能的に連結するように該遺伝子を挿入しやすくするための該プロモーターの下 流の制限エンドヌクレアーゼ部位を少なくとも一つ含みかつ同一配列が該異種遺 伝子の発現を容易にするため該異種遺伝子に関して該同一配列が３’末端に在る ように配置された終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含んでいる遺伝子構 築物が提供される。この終結配列はＳＣＳＶ由来のものが好ましい。また、ター ミネーター配列はエフ・ビデンティスＭｅＡ３遺伝子由来のものであることが好 ましい。 本発明の対象となる植物は単子葉植物と双子葉植物の両者を含む。本発明はマ メ科植物及び非マメ科植物にも適用されるが、マメ科植物の方が好ましい。 ＳＣＳＶゲノムはセグメント１〜７と記述される少なくとも７個の異なる環状 ssＤＮＡ成分を含んでいる。これらのセグメントの大きさは、約９８８ヌクレオ チドから約１０２２ヌクレオチドの範囲にある。ＳＣＳＶのこの７個のＤＮＡ成 分はそれぞれウイルスのセンス配列の主要なオープンリーディングフレーム一つ と保存された潜在的ステム−ループ構造を含む種々の長さの非コード領域とを含 んでいる（図１及び図２、表２）。各転写ユニットは転写の開始と終末にそれぞ れ対応する典型的なＴＡＴＡボックス及びポリアデニル化シグナルを含んでいる （図２、表２）。 ＤＮＡ類は環状であるから、非コード領域の配列はＤＮＡ成分が異なれば異な るところのプロモーター類とターミネーターシグナル類を含んでいる（表２）。 セグメント２及びセグメント６における二つのレプリカーゼ関連タンパク質遺伝 子のＴＡＴＡボックスとステム−ループとはその他の遺伝子のものとは全く異な っている。対照的に、セグメント１、３、４、５及び７では、ステム−ループと ＴＡＴＡボックスは同一である。全てのＤＮＡは、セグメント２及び６のＤＮＡ を除き、非コード領域に共通配列（共通領域として知られている）を共有しても いる（図１及び図２）。 本発明は、従って、ＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント７上の７個のプロモ ーターのそれぞれに及び終結配列及びポリアデニル化配列にまで及ぶものである 。セグメント１〜セグメント７のヌクレオチド配列を図６に示し、そしてそれぞ れ配列番号１〜配列番号７に規定されている。 セグメント５はＮ末端アミノ酸配列及びアミノ酸組成のデータに基づきコート タンパク質遺伝子と同定された（チュー(Chu)ら，1993ａ）。セグメント２及び セグメント６は特徴的なＮＴＰ−結合モチーフを含むタンパク質をコードしてお り、従って仮のウイルス複製−関連タンパク質（ＲＡＰ）遺伝子であると予想さ れる。残りの４個のＤＮＡ成分は、それらの特色のある推定アミノ酸配列からは 相互に関連がなくあるいはセグメント２、５及び６にも関連がない。ＳＣＳＶの ＤＮＡ類はジェミニウイルス類のゲノムとは、推定アミノ酸レベルでは一部相同 性が認められるものの、ヌクレオチド配列においては有意の相同性を持っていな い。 ＳＣＳＶの複製能力が実証されてきた（チュー(Chu)ら，1993ｂ）。ＳＣＳＶ ビリオンのＤＮＡは一本鎖であり、その転写物はウイルス・センスであるから、 脱外被後の最初の生合成現象と思われるものは宿主のＤＮＡポリメラーゼを用い る複製型ＤＮＡの合成であるように思われる。（ＳＣＳＶのＤＮＡ類は二本鎖Ｄ ＮＡ合成における自己プライマーとなる能力を有する(チュー及びヘルムス(Chu and Helms)，1988)。宿主のＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ転写を開始するプロモ ーターに結合し続いてウイルス増殖に必要なウイルスタンパク質の合成を行う。 本発明の特に好ましい態様においては、配列番号：１、配列番号：２、配列番 号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：７の中から 選択される一つのヌクレオチド配列を含むＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプ ロモーター様配列及び／又は同一物を含む遺伝子構築物が提供される。 本明細書で用いられる「プロモーター様配列」とは、自然に生ずるＳＣＳＶプ ロモーターの機能的変異体、誘導体、部分、断片、ホモログ又はアナログなどの 全てを含むものである。本明細書で提供されるプロモーター様配列は、該プロモ ーター様配列が対応する野生型のＳＣＳＶプロモーターと比較したとき、少なく とも３５％の 、好ましくは少なくとも４５％の、より好ましくは少なくとも５５％の、さらに より好ましくは少なくとも６７〜７０％の、そしてさらに一層好ましくは８５〜 ９５％又はそれ以上のプロモーター活性を保持している限り、ＳＣＳＶプロモー ターに対する１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加を含む ものである。 さらに別の態様では、ＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプロモーター様配列 を含みかつ植物細胞中で機能し得る遺伝子構築物であって、該プロモーター又は プロモーター様配列が配列番号：１から配列番号：７までのいずれか１個の全部 又は部分に相当するか又は配列番号：１から配列番号：７までの少なくとも１個 に高い厳格条件から低い厳格条件に及ぶ厳格条件(stringency conditions)の範 囲でハイブリダイズすることができるものである遺伝子構築物が提供される。便 宜上、ＳＣＳＶプロモーターの変異体、誘導体、部分、断片、ホモログ又はアナ ログは植物細胞中で機能を有しかつ配列番号：１から配列番号：７までの少なく とも１個に少なくとも高いところから低いところまでの厳格条件の範囲の下でハ イブリダイズすることができるものと定義される。 特に好ましい態様では、この遺伝子構築物はＳＣＳＶ起源由来の又は非ＳＣＳ Ｖ起源由来の終結配列及び／又はポリアデニル化配列をさらに含みそして該プロ モーターに機能的に連結された遺伝子の発現を高め又はその他の方法により促進 する。 厳格性のレベルを規定するために、参照により本明細書にインコーポレートさ れるサムブルック(Sambrook)ら(1989)を参照するのが 便利である。ここにあるページ９．５２−９．５７の洗浄操作が高い厳格性と考 えられる。低い厳格性は０．１−０．５％ w/vＳＤＳ中３７−４５℃で２−３時 間であるとここに定義される。ハイブリダイゼーションに用いられる核酸の起源 及び濃度により、０．２５−０．５％ w/vＳＤＳ中４５℃以上で２−３時間と考 えられる中程度の厳格条件やサムブルックら（1989）によって開示された高い厳 格条件などの別の厳格性の条件を採用してもよい。 本発明の別の態様は植物細胞中で外来遺伝子を発現させる方法であって、該植 物細胞中で機能できかつ該外来遺伝子に機能的に連結されているＳＣＳＶプロモ ーター又はＳＣＳＶプロモーター様配列を含む遺伝子構築物を該植物細胞中に導 入することを含む方法、を提供する。さらなる態様においては、多重ＳＣＳＶプ ロモーター類が拮抗現象なしに一つ以上のトランスジーンをドライブするために 使用される。別の態様では、ＳＣＳＶプロモーターは外来遺伝子の発現を高める ためにＳＣＳＶセグメント２遺伝子と組み合わされる。さらに別の態様では、遺 伝子構築物は外来遺伝子の３’末端に位置する１以上の終結配列及び／又はポリ アデニル化配列をさらに含む。これらの配列は外来遺伝子の発現を高めあるいは 別の方法で容易にする。終結配列及び／又はポリアデニル化セグメントはＳＣＳ Ｖ由来のものであってもよくあるいはエフ・ビデンティスＭｅＡ遺伝子のような 別の起源由来のものであってもよい。 更に別の態様では、本発明はそのゲノム中に上記のように規定されたＳＣＳＶ プロモーター又はＳＣＳＶプロモーター様配列及び必要に応じて該プロモーター の下流にある遺伝子の発現を高めるため の終結配列及び／又はポリアデニル化配列を保持するトランスジェニック植物を 提供する。このトランスジェニック植物はＳＣＳＶプロモーターの下流の遺伝子 、オリゴヌクレオチド又はリボザイムなどの遺伝子配列の発現により特性の変化 を示す。 本発明は以下の図面及び／又は実施例を参照することによりさらに説明するが 、これらに限定されるものではない。ＳＣＳＶ由来のプロモーター領域に本明細 書で言及するときはＳＣＳＶに対しては“Ｓ”と、ゲノムセグメント番号（例え ば、１，３，４，５及び７）、及び非コード領域に対しては“ｎｃ”と略記する 。例えば、ＳＣＳＶゲノムセグメント１由来のプロモーターは“Ｓ１ｎｃ”と記 述される。特定のＳＣＳＶゲノムセグメントに対するターミネーター配列は例え ば次のように示される。すなわち、セグメント１及び５のターミネーター配列に 対してはそれぞれ“ＳＣ１Ｔｒ”又は“ＳＣ５Ｔｒ”となる。ＳＣＳＶプロモー ター、ＧＵＳのようなレポーター遺伝子及びＳＣＳＶ由来のものなどのターミネ ーター配列を含む遺伝子構築物は、“ＳＣＳＶ：ＧＵＳ：ＳＣＴｒ”又は“ＳＣ ＳＶ：ＧＵＳ：ＳＣＳＶＴｒ”と略記される。具体的なプロモーターと終結配列 は、上記のように、例えば“Ｓ４ｎｃ：ＧＵＳ：ＳＣＴｒ”又は“Ｓ４ｎｃ：Ｇ ＵＳ：Ｍｅ３”と記述される。後者の構築物では、本明細書で“Ｍｅ３”と記述 するフラベリア・ビデンティスのＭｅＡ遺伝子由来のターミネーター配列が用い られている。 図面の簡単な説明 図１は典型的ジェミニウイルス及びＳＣＳＶの代表的ＤＮＡ成分 中に見出される構造及び転写ユニットを示す。両者とも一本鎖ＤＮＡゲノムを含 む。 図２は直鎖状のＳＣＳＶのゲノム中に見出される７個のＤＮＡセグメントを示 す。これは各ＤＮＡ上にあるステム−ループ構造、共通領域、オープンリーディ ングフレーム（ＯＲＦ）、ＴＡＴＡボックス及び終結シグナル及びポリアデニル 化シグナルを指示する。 図３はタバコ植物中への形質転換のための、７個のＳＣＳＶ・ＤＮＡの非コー ド領域とβ−グルキュロニダーゼ（ＧＵＳ）の融合発現ベクターの構築を示す。 増幅したＰＣＲ断片を指摘したＢａｍＨＩ（Ｂ）及びＮｃｏＩ（Ｎ）部位でｐＨ Ｗ９中のＧＵＳ遺伝子の前に別々にクローニングした。得られた組換えｐＨＷ９ ベクターをＥｃｏＲＩ部位で切断しレシピエントであるＰＧＡ４７０二重ベクタ ーのＥｃｏＲＩ部位中にクローニングした。 図４は原形質体を用いる研究のための、セグメント５プロモーター及びセグメ ント７プロモーターとＧＵＳとの融合発現ベクター及びそれらの欠失誘導体の構 築を示す。全長の非コード領域に相当するＤＮＡをＰＣＲで取得しそして指摘し たＳａｌＩ部位で平滑末端連結によりｐＫＧＯ中のＧＵＳの前にクローニングし た。欠失誘導体は全長配列を含むｐＫＧＯクローンをベクターについてはＨｉｎ ｄIII又はＰｓｔＩで消化することにより、またＳＣＳＶ配列については示した ような適当な制限酵素で消化することにより取得した。欠失したｐＫＧＯ構築物 を、必要なときは末端を充填した後再度連結した。 図５はサブテレーニアン・クローバ植物中に形質転換するためのセグメント７ プロモーター（５７ｎｃ）：ＧＵＳ融合遺伝子を含む組換え二重ｐＴＡＢ１０ベ クター（ｐＢＳ１５０）遺伝子の構築を示す。５７ｎｃ：ＧＵＳ発現カセットを ｐＫＧＯ構築物（図４）からＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで消化して切取りそし てこのＤＮＡを末端充填した後ＥｃｏＲＩ部位でｐＴＡＢ１０に平滑末端連結を 行った。 図６は７個の環状ＳＣＳＶ・ＤＮＡの完全な配列を示す。発現カセットの構築 に使用された各ＤＮＡ上の非コード領域の配列は下線で示す。 図７はＳＣＳＶセグメント７プロモーター（Ｓ７ｎｃ）：ＧＵＳ融合発現カセ ットで形質転換されたトランスジェニック・タバコ及びトランスジェニック・サ ブテレーニアン・クローバの葉についての組織化学的染色により検出されたＧＵ Ｓ発現を示す。 図８Ａから８Ｆまでは、トランスジェニック植物のＧＵＳ活性に対する組織化 学的染色の明視野（bright field）における写真である。Ｓ１ｎｃ、Ｓ３ｎｃ、 Ｓ４ｎｃ、Ｓ５ｎｃ及びＳ７ｎｃプロモーター領域と呼ぶセグメント１、３、４ 、５及び７由来のＳＣＳＶプロモーター領域を含むＧＵＳ融合構築物で形質転換 されたタバコ植物及び形質転換されていない植物（ＮＴ）の染色された葉の断片 （Ｌ）、茎の切片（Ｓ）、根（Ｒ）及び花粉（Ｐ）の明視野における曝露である 。青色への変化はＧＵＳの発現を示す。葉、茎又は根 の各断片は独立の形質転換体を表し（ただし、容易に分けることができなかった Ｓ５ｎｃの先端２個の根断片を除く）、そして花粉試料は２以上の形質転換体の 混合物であった。図８ａは形質転換されていない植物（ＮＴ）と比較したときの Ｓ４ｎｃまたはＳ５ｎｃ領域で形質転換した植物中でのＧＵＳ発現の相違をしめ す。 図９Ａから９Ｅまでは、トランスジェニック植物中でのＧＵＳ活性に対する組 織化学的染色を示す暗視野における写真である。成分１（Ｓ１ｎｃ）、成分３（ Ｓ３ｎｃ）、成分４（Ｓ４ｎｃ）、成分５（Ｓ５ｎｃ）及び成分７（Ｓ７ｎｃ） プロモーター領域を含むＧＵＳ融合構築物で形質転換されたタバコ植物の染色・ 包埋された茎部分の横（Ｔ）及び縦（Ｌ）薄片を暗い場所で見た。ピンクの結晶 はＧＵＳの発現を示す。横切片及び縦切片用に用いられた茎部分は独立の形質転 換体を表す。拡大は、Ｓ１ｎｃＴ及びＬ、Ｓ３ｎｃＬ、Ｓ４ｎｃＴ、Ｓ５ｎｃＴ 及びＬ、及びＳ７ｎｃＬでは３７５倍、Ｓ３ｎｃＴでは４８０倍、Ｓ４ｎｃＬで は２００倍、そしてＳ７ｎｃＴでは３００倍である。 図１０はＧＵＳ発現の蛍光定量試験を示すグラフである。蛍光定量試験は成分 １（Ｓ１ｎｃ）、成分３（Ｓ３ｎｃ）、成分４（Ｓ４ｎｃ）、成分５（Ｓ５ｎｃ ）及び成分７（Ｓ７ｎｃ）プロモーター領域を含むＧＵＳ融合構築物で形質転換 されたタバコ植物の葉抽出物についてなされた。各カラムは独立の形質転換体を 表す。ＧＵＳ活性は４−メチルウムベリフェリル（methylumbelliferyl）β−Ｄ −グルキュロナイド（ＭＳＧ）を基質とし、ラボシステムス・フルオロスカンを 用いて５又は１０分間隔で６０分間（又はＳ４ｎｃに ついては３０分間）測定した。ＧＵＳ活性の比はタンパク質のｍｇ当たり分当た りの蛍光定量の単位（Ｆ１．Ｕ．）として表される。１０００Ｆ１．Ｕ．は４− メチルウムベリフェロン（ＭＵ）の８２５ｐｍｏｌにほぼ等しい。 図１１はタバコ原形質体中でＧＵＳ発現を指令することができるＳＣＳＶセグ メント２プロモーター（Ｓ２ｎｃ）構築物を表す図である。セグメント２ＤＮＡ のＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片をプロモーターを持たないＧＵＳベクターであるｐＫ ＧＯ．に融合した。Ｐｒはプロモーターを、ｓｅｇ２はＳＣＳＶのセグメント２ を表す。 図１２ａ及び１２ｂはＳＣＳＶ：ＧＵＳ：ＳＣＳＶＴｒ発現ベクターの構築を 示す図である。ＳＣＳＶ（ＳＣ３Ｔｒ）のセグメント３及びセグメント５（ＳＣ ５Ｔｒ）に対する終結配列／ポリアデニル化配列をＰＣＲで増幅し、それぞれの 制限酵素で切断し、ついで指示したように組換えｐＫＧＯベクター中にクローニ ングした。このＳＣ３Ｔｒ構築物をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片としてＳ１ｎｃ： ＧＵＳ：ＯＣＳ３’を含むｐＫＧＯベクター中にクローニングしてＳ１ｎｃ：Ｇ ＵＳ：ＳＣ３Ｔｒを作成した。ＳＣ５Ｔｒ構築物はＥｃｏＲＶ断片としてＳ４ｎ ｃ：ＧＵＳ：ＯＣＳ３’を含むベクターｐＫＧＯ中にクローニングしてＳ４ｎｃ ：ＧＵＳ：ＳＣ５Ｔｒを作成した。 図１３Ａから１３Ｄまでは、ＳＣＳＶセグメント４プロモーター（Ｓ４ｎｃ） により指令されるポテト植物組織中でのＧＵＳ発現を示す写真である。Ａは茎、 Ｂは葉、Ｃは芽茎、およびＤは塊茎であ る。 図１４はＳＣＳＶセグメント７プロモーター（Ｓ７ｎｃ）により指令された綿 の葉中でのＧＵＳ発現を表す写真である。 図１５はフラベリア・ビデンティスのＭｅＡ遺伝子（Ｍｅ３）のＭｅＡ３’タ ーミネーター配列を示す。停止コドンは配列の最初に太字タイプで示す。この配 列はＥｃｏＲＩ部位、ＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＧ．．．を含むようにキメラ構築 物中で遺伝子工学的処理がなされた。こうしてこのキメラ構築物はＡＡＴＴＣＧ ＴＴＴＡＧで始まる配列を含むこととなった。 図１６は、指示されたフラベリア・ビデンティスのＭｅＡ遺伝子調節要素を含 むＧＵＳ発現ベクター（ＭＥ２０及びＭＥ２９）を表す図である。 図１７は、発現カセットＳ４ｎｃ：ＧＵＳ：Ｍｅ３’を含むＳ４ｎｃプラスミ ドｐＢＳ２３７の構築を示す図である。プラスミドｐＢＳ２１８をＥｃｏＲＩで 消化してＯＣＳ３’領域を除きついでＥｃｏＲＩで連結した。 図１８はＳ１ｎｃ：ｎｐｔII：ＳＣ３Ｔｒ発現カセットを含むプラスミドｐＢ Ｓ２４６の構築を示す図である。ＳａｌＩ−ＳａｌＩ断片は約８．５〜９ｋｂｐ であり、Ｂ_Lは約０．５ｋｂｐであり、Ｂ_Rは約０．６ｋｂｐである。ＳＣ１ｎｃ ：ｎｐｔII：ＳＣ３Ｔｒは約１．７ｋｂｐである。 図１９ａ−ｃは、ｐＫＨＡＮ２及びｐＫＳＢ．ｂａｒ１からのプラスミドｐＫ ＨＡＮ４の構築を示す図である。ｐＫＨＡＮ４は、ｐＫＨＡＮ２由来のＳ７ｎｃ （５７２ｂｐ）、ｎｐｔIIコード領域（９７８ｂｐ）及びビシリン(vicillin)３ ’末端（２７６ｂｐ）を含むＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩセグメントを二重プラス ミドｐＫＳＢ．ｂａｒ１中に挿入してｐＫＨＡＮ４を作成した。ｐＫＨＡＮ２は 、ｐ３５ＳＫＮ由来のｎｐｔIIコード領域（９７８ｂｐ、ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ 断片）をｐＫＨＡＮ１のＡｓｐ７１８部位（クレノウ断片で平滑化したもの）中 にクローニングしてｐＫＨＡＮ２を作成した。ＳＣＳＶ ＰｒｏはＳ７ｎｃであ り、ｐＫＳＢ．Ｂａｒ１はＥｃｏＲＩで消化し連結したｐＴＡＢ１０．ＭＣＳｏ ｒｉ１Ｂである。 図２０は、３５Ｓプロモーター：ＮＰＴII：３５Ｓターミネーター配列（３５ ＳＰｒｍ：ＮＰＴII：３５ＳＴｒｍ）又はＳ１ｎｃ：ＮＰＴII：ＳＣ３Ｔｒ発現 カセットを含む二重ベクターで形質転換されたカナマイシン耐性タバコ植物の再 生培地上での選択を表す写真である。（図中、略字は、それぞれ３５ＳＰｒｍＮ ＰＴII３５ＳＴｒｍ及びＳＣ１ＰｒｍＮＰＴIIＳＣ３Ｔｒｍである。） 図２１は、ＳＣＳＶ・ＤＮＡの転写調節シグナルを利用するクローニングベク ターを表す図である。 図２２は、ＳＣＳＶセグメント２ダイマー構築物ｐＢＳ２を表す図である。こ の構築物はＳＣＳＶセグメント２ＤＮＡ（セグメント２転写ユニットの全機能を 含む）の縦列反復をｐＧＥＭ７のポリリ ンカー部位中へクローニングしついでｐＭＣＰ３二重ベクターの縮小物(カーン( Khan)ら，1994年))中にクローニングすることによって作成された。 ＳＣＳＶ転写調節要素により促進された転写活性は表１９に要約して示す。 実施例１ ＳＣＳＶ・ＤＮＡ配列の決定 配列決定のためにＳＣＳＶ(チュー(Chu)ら，1993a)のＦ単離物を使用した。Ｓ ＣＳＶゲノム成分の全長クローン類はチュー(Chu)ら(1993a)によって記載された ように複製型（ＲＦ）ＤＮＡから作成した。他のクローン類は既知配列からデザ インされたＳＣＳＶ特異的プライマーを用いＰＣＲによってこのＲＦから作成し た。 ジデオキシ・チェイン・ターミネーション法（サンガー(Sanger)ら，1977）を 用いて、Ｍ１３ssＤＮＡ鋳型(サムブルック(Sambrook)ら，1989)又は上述のクロ ーン類からＣＴＡＢ法（デル サル(Del Sal)ら，1989）で調製したdsＤＮＡ鋳 型の配列決定を行った。配列分析はウィスコンシン大学遺伝子コンピューターグ ループ配列分析ソフトウエアパッケージ（デバロー(Deveareaux)ら，1984）を用 いて行った。 実施例２ プラスミドの構築 使用したＤＮＡ操作技法はサムブルック(Sambrook)ら（1989）に より記載されたとおりであった。ＳＣＳＶの７個のＤＮＡセグメントすべての全 非コード領域を、プラロミドベクター中にクローニングするための適当な制限酵 素認識部位を持つ特定のプライマー（表８を見よ）を用いＰＣＲによって増幅し た。増幅されたＤＮＡ断片を、適当な向きでプロモーターを持たないＧＵＳレポ ーター遺伝子の上流にある各発現ベクター中に別々にクローニングして、図３及 び図４に示すようなＳＣＳＶプロモーター−ＧＵＳ融合構築物を作成した。この 発現ベクターｐＨＷ９（図３）を二重ベクターｐＧＡ４７０（アン(An)ら，1985 ）中にクローニングした後、タバコの形質転換に使用した。発現ベクターｐＫＧ Ｏは原形質体中でのＧＵＳ発現（図４）に用いられ、そして二重ベクターｐＴＡ Ｂ１０はサブテレーニアン・クローバの形質転換に用いられた（図５）。ｐＫＧ ＯはＧＵＳ遺伝子を含むｐＫＩＷＩ１０１（ヤンセン及びガードナー(Janssen a nd Gardner)ら，1989）のＸｈｏＩ断片及びＯＣＳターミネーター配列をｐＪＫ Ｋｍ（カーシュマン及びクレーマー(Kirschman and Cramer)，1988）のＳａｌＩ 部位中にクローニングすることにより構築された。ＧＵＳと融合した３５Ｓプロ モーターを含む対応するプラスミド類をコントロールとして用いた。クローン類 の結合は配列決定によりチェックした。プロモーターを持たないＧＵＳ構築物は コントロールとして使用した。 ＳＣＳＶセグメント５及び７プロモーター類の欠失誘導体は全長非コード配列 を所望の欠失が得られるように適当な酵素で消化することにより作成した（図４ ）。 トランス活性化(transactivation)の現象を研究するため、Ｓ５ ｎｃ：ＧＵＳ発現カセットを組換えｐＫＧＯ構築物から切り出し、３５Ｓプロモ ーターから発現される seg２ＲＡＰコード領域を含むｐＧＥＭプラスミド中にク ローニングした。この結果得られるプラスミドはＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ 発現カセットと３５Ｓプロモーター： seg２ＲＡＰ発現カセットの両方を保持し ており、これを原形質体中に電気穿孔法により導入した。 実施例３ 原形質体分離及び一時的遺伝子発現 組換えプラスミドをアルカリ溶解法により大腸菌から抽出し、ついでキアゲン (Qiagen)プラスミド・ハンドブックに記載のようにキアゲン・カラムを通して精 製した。 細胞懸濁培養を用いてニコチアナ・プルムバギニホリア(Nicotiana plumbagin ifolia)（ラスト(Last)ら，1991）及びサブテレーニアン・クローバｃｖ．ウー ゲネラップ(Woogenellup)原形質体(チュー(Chu)ら，1993b)を単離した。精製し たプラスミドをテイラー及びラーキン(Taylor and Larkin)(1988)により記載さ れたようにサブテレーニアン・クローバ又はニコチアナ・プルムバギニホリアの 原形質体中に電気穿孔法により導入した。３日後に原形質体を収穫し、一時的な ＧＵＳ活性を４−メチルウムベリフェリルβ−グルキュロナイドを基質として使 用して蛍光定量的に測定した（下記を見よ）。実験はすべて１処理当たり２連の 試料を用いて行った。 実施例４ ＳＣＳＶ−プロモーター−ＧＵＳ融合構築物を用いる タバコの形質転換 種々のＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ発現カセットを含む組換えｐＧＡ４７０ 二重構築物をナーゲル(Nagel)ら(1990)により記載されたように電気穿孔法によ りアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株ＬＢＡ４４０４（ホエキーマ(Hoe kema)ら，1983）中に別々に導入して形質転換した。ニコチアナ・タバクム(Nico tiana tobacum)cv．ウィスコンシン３８はエリス(Ellis)ら、(1987)により記載 されたように形質転換し再増殖させた。 実施例５ サブテレーニアン・クローバの ＳＣＳＶ−プロモーター−ＧＵＳ融合構築物による形質転換 Ｓ７ｎｃ：ＧＵＳ融合構築物（ｐＢＳ１５０）を含む組換えｐＴＡＢ１０二重 ベクターをアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株ＡＧＬ１（ラゾ(Lazo)ら ，1991）中に３親交配（ディッタ(Ditta)ら，1980）により形質転換した。サブ テレーニアン・クローバｃv.ラリサはアグロバクテリウム媒介形質転換により形 質転換され、カーン(Khan)ら（1994）の方法により再生させた。 実施例６ ＧＵＳ試験 原形質体を収穫直後に 0.3％v/v のトリトンＸ-100の存在下に超音波破壊によ り溶解した。可溶性抽出物のＧＵＳ活性は４−メチルウムベリフェリルβ−Ｄ− グルキュロナイド（ＭＵＧ）を基質とする蛍光定量試験で測定した（ジェファー ソン(Jefferson)ら，1987）。蛍光はラボシステムス・フルオロスカンII分光光 度計を用いて 測定した。 完全な形質転換組織中でのＧＵＳ発現は、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリル−β−グルキュロン酸(Ｘ-gluc)(ジェファーソン(Jefferson)ら，1987)中 での組織化学的染色により、またＭＵＧを用いる可溶性抽出物の蛍光定量試験に より検出された。 実施例７ ＳＣＳＶ非コード領域の配列 ７個の既知の環状ＳＣＳＶ・ＤＮＡ全ての完全な配列を決定した（図６）。各Ｄ ＮＡはプロモーター活性のためのシグナル（ＴＡＴＡボックス）を持つ非コード 領域を一つ含んでいる（表２）。これらの配列はこれまで記載も単離もされてい ないものである。これらのプロモーターを含む非コード領域の配列を比較すると 、セグメント３及びセグメント５が最も類似しており、これらのＤＮＡの非コー ド領域中の平均４９１ヌクレオチドのうち２５８の保存ヌクレオチドを共有して いる。セグメント３、４、５及び７はそれらの間で１７０の保存塩基を含んでい るが、セグメント１、３、４、５及び７間では僅か１５２塩基しか保存されてい ない。ＳＣＳＶ・ＤＮＡの非コード領域における配列の変動から、異種ＳＣＳＶ 遺伝子の転写及び複製は別々に調節されている可能性が示唆される。 実施例８ 原形質体中でのＳＣＳＶプロモーター類の一時的活性 ２個のＳＣＳＶ・ＤＮＡ非コード領域のプロモーター活性は、サブテレーニア ン・クローバ原形質体（表３）及びタバコ原形質体（ 表４）中でＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ融合構築物を用いてＧＵＳを一時的に 発現させることにより直接的に証明された。これらの結果により、セグメント５ プロモーター及びセグメント７プロモーターが他のＳＣＳＶ・ＤＮＡ成分の非存 在下において機能を有することが示された。ＳＣＳＶプロモーターは天然の宿主 （サブテレーニアン・クローバ）の原形質体中でも非宿主（タバコ）の原形質体 中でも機能を有する。タバコの原形質体中では、セグメント７プロモーターは活 性の点では３５Ｓプロモーターに類似していたが、セグメント５（コートタンパ ク質）プロモーターは一貫してＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性の約半分を示 した（表４）。しかしながら、両プロモーターの活性はサブテレーニアン・クロ ーバ原形質体中でより高く、セグメント７プロモーターの活性は３５Ｓプロモー ターのそれの７倍を示した（表３）。このことはＳＣＳＶプロモーター類が広く 用いられている３５Ｓプロモーターよりもある種のマメ科植物中ではより良く働 くことを示唆する。セグメント７プロモーターの活性は試験された他のものより もサブテレーニアン・クローバ原形質体中でより一層変動するようにも見えた。 ＧＵＳに融合されたセグメント５及びセグメント７の非コード領域の種々の欠 失誘導体を含むプラスミド類も構築され（図４）そして電気穿孔法により原形質 体中に導入された（表５）。これらの構築物でトランスフェクトされた原形質体 のＧＵＳ試験から、ステム−ループも共通領域もプロモーター活性には必要がな いことが示された。ただし共通領域は完全な活性には必要であった（表５）。高 レベルのプロモーター活性に要求されるＤＮＡ配列は、３５Ｓプロモーター（オ デル(Odell)ら，1985）などの他のプロモーター類に 要求されるものよりも小さい３００ｂｐよりも少ないように見える。 実施例９ ＳＣＳＶセグメント２遺伝子産物による ＳＣＳＶプロモーター活性のトランス活性化（transactivation） ３５Ｓプロモーター： seg２ＲＡＰ遺伝子構築物と同時電気穿孔法導入がなさ れたとき、セグメント５プロモーターによりドライブされるＧＵＳの活性はサブ テレーニアン・クローバ原形質体及びタバコ原形質体の両方で明らかに約２倍だ け増加した（表６）。セグメント７プロモーター活性も３５Ｓ： seg２ＲＡＰ構 築物ど同時電気穿孔法導入がなされたとき増加するが、これを確認するためには さらに実験が必要である。 ＧＵＳ活性のトランス活性化はＳ５ｎｃ：ＧＵＳ構築物がセグメント２ＤＮＡ の縦列反復（ダイマー）を含む二重ベクタープラスミド（ｐＢＳ２）と同時電気 穿孔法導入がなされたときも明らかに観察された（表６）。ＳＣＳＶセグメント ２ダイマー構築物ｐＢＳ２の地図は図２２に示す。この構築物は、ＳＣＳＶセグ メント２ＤＮＡ（seg２転写ユニットの全機能を含む）の縦列反復をｐＧＥＭ７ のポリリンカー部位中にクローニングした後、これを次にｐＭＣＰ３二重ベクタ ーの縮小物（カーン(Khan)ら，1994）中にクローニングすることによって作成し た。この結果は、異なるＳＣＳＶプロモーターが両者とも同時に発現されること を示唆する。こうして、異種のＳＣＳＶプロモーター類は、植物中で３５Ｓプロ モーターとの組み合わせにおいて使用され得るか又は多重導入遺伝子(multiple transgenes)の同時発現を容易にするよう同時に使用され得るので ある。逆に、３５Ｓプロモーターが多重で使用され又は多重コピー導入遺伝子中 で使用されるときは、導入遺伝子(transgene)活性の減少が観察された（リン(Li nn)ら，1990、マツケとマツケ(Matzke and Matzke)，1991、シャイト(Scheid)ら ，1991、カルバルホ(Carvalho)ら，1992）。 実施例１０ トランスジェニック植物中でのＳＣＳＶプロモーター類の活性 ＳＣＳＶプロモーター類は、セグメント２及びセグメント６由来のものを除き 、すべてがタバコ植物中で導入遺伝子の発現をドライブできることが示された（ 図７）。ＭＵＧ試験で測定されたこのプロモーター類の活性レベルは植物により 、そしてプロモーターにより変動したが、３５Ｓプロモーターの活性レベルより も一般に低い（図７）。 インタクトなトランスジェニックタバコ組織の組織化学的染色により、Ｓ４ｎ ｃプロモーターの活性は構成的であるように見えそしてＧＵＳ活性はすべての植 物器官中で検出されることが示された。その他は、発現が花粉中でも検出される が一般的には導管組織に限定される。 Ｓ７ｎｃ：ＧＵＳ遺伝子構築物を発現するトランスジェニック・サブテレーニ アン・クローバ植物では、組織化学的染色によりＧＵＳ活性が葉、茎及び葉柄に 見出される。ＧＵＳ活性の分布は大部分構成的であるが、一部の組織ではこの活 性の多くは導管組織中にある（図７）。これらの植物では、プロモーター活性の レベルも植物 により変動するが、この活性は一般に３５Ｓプロモーターの活性に匹敵する。 これらの結果は、ＳＣＳＶプロモーターが広いタイプの植物や組織中で１以上 の外来遺伝子の発現を独立に又は同時にコントロールするために使用することが できるプロモーターの選択という手段を提供していることを示すものである。マ メ科植物は適用の主要な標的である。これらのプロモーター類の活性も seg２遺 伝子産物の存在により増大させることができる。従って、これらのプロモーター 類は、発現のレベルにおいて及び３５Ｓプロモーターの一部の欠陥を克服する点 においての両面でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに勝る重要な利点を有するように 見える。これらは広範囲のトランスジェニック適用において適用可能である。 実施例１１ トランスジェニック植物中での ＳＣＳＶプロモーター活性のより詳細な性質 ５個（セグメント１、３、４、５及び７）のＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ融 合カセットで形質転換されたタバコのトランスジェニック植物について組織化学 的（図８及び図９）及び蛍光定量的（図 １０）試験の両者によりＧＵＳ活性の試験をした。組織培養をした若い温室育ち の植物から得た試料は同一のＧＵＳ発現パターンを示した。ＧＵＳ活性は、根、 茎、葉、葉柄及び花の全ての部分を含む植物のすべての部分で観察された。プロ モーター５構築物は他のプロモーターに比べて花粉では比較的低いＧＵＳ発現を 示した。蛍光定量試験の結果は、セグメント４プロモーターが残りのものの１０ 倍又はそれ以上の活性を示し、最も高い発現体であったことを示した以前のデー タを確認したが、それでもなお３５Ｓプロモーターのそれよりも低いものである 。セグメント１、３、５及び７プロモーターの発現レベルはタバコ中では師管部 (phloem)特異的なプロモーターである rolＣのそれ（シュムリング(Schmulling) ら，1989、スガヤ(Sugaya)ら，1989）と同定度であった。プロモーターを持たな いＧＵＳ構築物で形質転換された植物はいずれの試験方法でもＧＵＳを発現しな かった。組織化学的試験ではすべてのプロモーター構築物の発現が導管組織内で 最高であることが示され、高い発現体はより導管に限定的であった低い発現体よ りもより構成的であった（図８）。一般に、プロモーター１、３、５及び７構築 物は大部分導管組織内で発現される。特に、プロモーター１及び３構築物による ＧＵＳ発現は主に師管部組織に限定される。しかしながら、すべてのプロモータ ーについての葉の組織化学的染色はこれらの組織内でのＧＵＳ発現がしみだらけ （構成的でありかつ導管に限定的である）であり、そして同一植物の葉の間でも 変動することが少なくないことを示した。暗視野顕微鏡(ジャコブソン−ライア ン(Jacobsen-Lyon)ら,1995)も厳密に導管−限定的なものはないことを示した（ 図９）。 セグメント７プロモーター：ＧＵＳ遺伝子を発現する２０個の一次トランスジ ェニック・サブテレーニアン・クローバ植物についてさらに組織化学的試験によ り解析した（表９）。これらの試験により、ＧＵＳ活性が根、茎、葉及び葉柄な どのすべての植物部分で観察されることが示された。ＧＵＳ発現は導管で最高で あり、一部の葉は他の器官よりもより構成的でありしみだらけであった、そして ＧＵＳ高発現植物は低発現植物よりも一層構成的であった。組織培養で温室育ち の植物の試料は同一のＧＵＳ発現パターンを示した。 実施例１２ ＳＣＳＶセグメント２ＤＮＡ中でのプロモーター活性の検出 実験により、ＳＣＳＶセグメント２及び６ＤＮＡ由来の非コード領域はトラン スジェニック・タバコ内でＧＵＳ遺伝子の発現をドライブすることができないこ とが分かった。これらの領域はヌクレオチド長がそれぞれ僅か１７９及び１５９ しかなく、従ってプロモーター活性のためには付加的な配列が要求されるように 思われる。この仮説をテストするために、ヌクレオチド５２６〜５４６のＤＮＡ 断片からなる新たなセグメント２プロモーター配列を構築し、そしてプロモータ ーを持たないＧＵＳベクターｐＫＧＯに融合した（図１１）。この融合構築物を タバコ原形質体中に電気穿孔法により導入した。セグメント５プロモーター：Ｇ ＵＳ構築物のＧＵＳ活性に類似のレベルで、電気穿孔法処理タバコ原形質体中で もＧＵＳ活性が検出された（表１０）。 上記のＳＲｎｃプロモーター：ＧＵＳ融合ＤＮＡを含む二重ベク ター(binary vector)も、実施例４に記述したようにタバコ植物中に形質転換し た。数個の形質転換タバコ植物の組織化学的染色により、ＧＵＳ発現が主に導管 であることが示された。これらの結果から、ＳＣＳＶセグメント２ＤＮＡコード 領域からの付加的配列がプロモーター機能のためには必要であることが分かった 。ＳＣＳＶセグメント６はＳＣＳＶセグメント２の変種であるから、このＤＮＡ の非コード領域及びコード領域の一部を含む同様な構築物は活性なプロモーター となるであろうことが予想される。こうして、すべてのＳＣＳＶプロモーターは 植物中で遺伝子発現をドライブするのに適していることが予期される。 実施例１３ＳＣＳＶの転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナルによる 遺伝子発現の増強 効果的な遺伝子発現には、プロモーターのみでなく該遺伝子のコード領域の３ ’末端における特異的ヌクレオチド配列−終結シグナル及びポリアデニル化シグ ナルとして知られている（メッシング(Messing)ら，1983、ジョシ(Joshi)，1987 b、ギル及びプラウドフット(Gil and Proudfoot)，1984、ロットニー(Rothnie) ら，1994）−の存在も要求される。これらの特異的配列はＲＮＡポリメラーゼに 転写を停止させそしてＲＮＡ転写物のさらなるプロセスを行わせるためのシグナ ルとして必要である。終結シグナル及びポリアデニル化シグナルの活性は転写効 率及び転写されつつあるＲＮＡの安定性に影響するかも知れない。広く用いられ ている終結配列／ポリアデニル化配列は、例えばＮＯＳ遺伝子（デピッカー(Dep icker)ら， 1982）、ＯＣＳ遺伝子（ジャンセン及びガードナー(Janssen and Gardner)，198 9）及びＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子（ピートルザック(Pietrzak)ら，1986）由来のも のである。 ＳＣＳＶ・ＤＮＡセグメント（又は成分）はそれぞれ非コード領域に終結シグ ナル配列及びポリアデニル化シグナル配列を含むターミネーター配列を含んでい る（表１１、図２）。ＳＣＳＶ・ＤＮＡ中の終結シグナル／ポリアデニル化シグ ナルの活性を明らかにするために、セグメント３又はセグメント５のポリアデニ ル化シグナル及び終結シグナル（図１２）のいずれかを含むＧＵＳ発現ベクター を構築し、タバコ原形質体中での一時的発現を行わせた。それぞれのターミネー ター配列を、プライマー中に幾つかの制限部位を取り込ませて、ＰＣＲにより増 幅した（図１２）。増幅されたターミネーター断片を指示された制限酵素で切断 し、Ｓ１ｎｃプロモーター：ＧＵＳ：ＯＣＳ３’又はＳ４ｎｃプロモーター：Ｇ ＵＳ：ＯＣＳ３’構築物のいずれかを含むｐＫＧＯ組換えプラスミド中にクロー ニングし、それからＯＣＳ３’配列を欠失させた（図１２）。その結果得られた Ｓ１ｎｃ：ＧＵＳ：Ｓ３Ｔｒ構築物（ここに、セグメント１プロモーターはＧＵ Ｓ活性に影響を持たないヌクレオチド６４１−７８２のＨｉｎｄIII断片の欠失 を有している）及びＳ４ｎｃ：ＧＵＳ：Ｓ５Ｔｒ構築物を電気穿孔法でタバコ原 形質体中へ導入し、ＧＵＳ活性について試験した。その結果、同じ構築物中で普 通に用いられるＯＣＳ終結配列／ポリアデニル化配列の代わりにＳＣＳＶ終結配 列／ポリアデニル化配列が使用されたときは、ＧＵＳ活性は２〜３倍に増加した （表１２）。同じ実験で、Ｓ１ｎｃ：ＧＵＳ：Ｓ３Ｔｒ構築物は３５Ｓ：ＧＵＳ ：ＯＣＳ３’構築物よりも ２倍高い活性を示した（図１２）。これらの結果は、ＳＣＳＶ・ＤＮＡ成分はそ れぞれ異なる終結及びポリアデニル化シグナル配列を含んでおり、これらをＳＣ ＳＶプロモーターと種々組み合わせて使用して植物中での外来遺伝子の発現を調 節し及び／又は増強することができることを明らかにする。ＳＣＳＶプロモータ ー配列と同様に、ＳＣＳＶ終結配列／ポリアデニル化配列は現在利用可能な終結 配列／ポリアデニル化配列に比して、そのサイズの小さいこと（１６０〜１７０ ヌクレオチド）そして種々の強度のそして種々の組織特異性を持つ広範囲の転写 調節因子を遺伝子操作のために利用可能であることなどの点でこれらに勝る長所 を有している。上の結果はまた、ＳＣＳＶターミネーター配列との組み合わせに よるＳＣＳＶプロモーターの使用が通常の転写ターミネーター配列の一つとの組 み合わせによる３５Ｓプロモーターを使用する構築物よりも高レベルの遺伝子発 現をもたらすことを明らかにする。 実施例１４ トランスジェニック・ポテト植物における ＳＣＳＶプロモーター類の活性 ｐＨＷ９にクローニングされたＳ４ｎｃ：ＧＵＳ：ＮＯＳ融合構築物を含むｐ ＧＡ４７０二重ベクター(binary vector)（図３）を使用してポテト植物を形質 転換した。ｐＨＷ９はｐＨＷ８（ドルフェラス(Dolferus)ら，1994）から、これ にｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）由来のポリリンカーを挿入して、誘導される。この組換 え二重ベクターを電気穿孔法によりアグロバクテリウム・トゥメファシエンスＬ ＢＡ４４０４株中に形質転換させた（ナゲル(Nagel)ら，1990）。 ポテト栽培変種アトランティック及びポテト栽培変種セバゴを形質転換し、次の 修正を除き実質的にはウェンツラー(Wenzler)ら（1989）の記載通りに再生(rege nerated)させた。葉部分の代わりに茎部分を形質転換に使用し、そして同時培養 （co-cultivation）の間ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を２．２４ｍｇ／ｌの 代わりに１０ｍｇ／ｌ使用した。同時培養の後、ステージＩ培地をセフォタクシ ムの１００ｍｇ／ｌと共に添加したが、カナマイシンやカルベニシリンは添加し なかった。ステージII培地は２ｍｇ／ｌのＢＡＰ、５ｍｇ／ｌのＧＡ３、１００ ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのセフォタクシムを含んでいた。 栽培変種アトランティック５個と栽培変種セバゴ１個を含む６個の形質転換植 物を移植し、小さな塊茎が形成されるまで温室で１０〜１１週間生育させた。こ の植物の異なる部分から採取した組織を組織化学的ＧＵＳ染色により試験した。 その結果は、根、走出枝(stolon)、塊茎、茎及び葉などの植物部分のすべてにお いてＧＵＳが高度に発現したことを示した。しかし、その発現は導管で優勢であ り、これには樹皮下の形成細胞層(cambium)、師管部(phloem elements)及び一部 の木質部(xylem elements)などが含まれる（図１３）。他のトランスジェニック 宿主の場合と同様に、ＧＵＳ活性の高い植物材料の導管以外の組織におけるＧＵ Ｓ発現は、特に若い塊茎では、３５Ｓ：ＧＵＳ：ＮＯＳ構築物で形質転換させた 植物と比べたとき、活性の低い組織におけるよりもよりはっきりしていた。塊茎 におけるＳＣＳＶプロモーターにより指令されたＧＵＳ発現は３５Ｓ：ＧＵＳ構 築物の発現と少なくとも同じ高さであった。 実施例１５ トランスジェニック綿植物における ＳＣＳＶセグメント７プロモーターの活性 ｐＨＷ９にクローニングされたＳ７ｎｃ：ＧＵＳ：ＮＯＳ融合構築物を含むｐ ＧＡ４７０二重ベクターを用いて綿植物を形質転換させた。この組換え二重ベク ターを３親交配（triparental mating）法によりアグロバクテリウム・トゥメフ ァシエンスＡＧＬ１株中に形質転換させた。綿（Gossypium hirsutum）cv．coke r 315を形質転換させ、カズンズ(Cousins)ら（1991）により記載された方法で再 生させた。 形質転換植物を温室で生育させ１８個の独立のトランスジェニック植物から採 取した葉組織について組織化学的染色によりＧＵＳ活性を試験した。ＧＵＳ活性 は植物間で変動した。これらの植物の中の５個は、３５Ｓプロモーターでドライ ブされたＧＵＳ発現と同様な範囲で強いＧＵＳ発現を示し、導管組織で優勢であ った（図１４）。ＧＵＳ活性はゴシポル（gossypol）腺内で特に強かった。他の トランスジェニック宿主類の場合と同様に、高度に発現される組織におけるＧＵ Ｓ染色も構成的であった。 これらの植物から採取した様々な組織を、次に染色し、そして根、茎、葉柄、 花弁及び他の導管を有する花の部分などを含むすべての器官中で導管発現が観察 された。発現は若い花の蕾中で特に高かった。これらの系統(lines)の一つから 得た苗木類(seedlings)についてＧＵＳ活性をスクリーニングした。１０個の子 孫のすべてが 根及び葉に強い染色を示したが、このことはこの遺伝子が遺伝されること及びこ の系統がおそらく２個以上の独立の挿入部位を含むことを示すものである。 実施例１６ 形質転換されたＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ発現カセットの トランスジェニック植物内での安定性 種々のＳＣＳＶプロモーター類によりドライブされるＧＵＳ発現のトランスジ ェニック・タバコ及びトランスジェニック・サブクローバ中における安定性につ いて、サブテレーニアン・クローバ植物及びタバコ植物のＴ１世代苗木の中でさ らに分析された。 タバコについて、１０個の独立のトランスジェニック系統由来のＴ１苗木を組 織化学的染色により試験した。その結果は、５個（セグメント１、３、４、５及 び７）のプロモーターによりドライブされたＧＵＳ遺伝子の発現がすべてＴ１苗 木中で安定であり、発現のパターンは同令のＴ０植物組織とＴ１植物組織の間で すべての場合に維持されることを示した。導管組織が未だ十分に分化していない 極めて若い茎では、プロモーターからの発現はすべて極めて高く、茎組織のすべ てにわたって検出された。樹令につれそして導管束の分化が進むにつれて徐々に 導管限定が現れる。Ｔ０植物については、セグメント４プロモーターに媒介され るＧＵＳ発現は他のものよりも一層構成的であった。 Ｓ７ｎｃ：ＧＵＳ融合構築物を発現する１５個の独立のトランス ジェニック・サブクローバ植物由来の５０個の２−３月令Ｔ１苗木について、組 織化学的試験及び蛍光定量的試験によりＧＵＳ活性を試験した。その結果は、セ グメント７プロモーターによりドライブされるＧＵＳ遺伝子の発現がＴ１苗木中 で安定であり、発現のパターンが同令のＴ０植物組織とＴ１植物組織との間で維 持されることを示した。ＧＵＳ発現は一般に３：１の予想比で分離することが見 出された。蛍光定量試験によるこの予備的結果は、このセグメント７プロモータ ー構築物が葉及び葉柄中で３５Ｓプロモーターのそれよりも幾らか低いＧＵＳ活 性を持つことを示唆する組織化学的データを確認するものであった（表１３）。 しかしながら、サブテレーニアン・クローバ茎中のＧＵＳ活性は葉柄におけるそ れよりも３倍高くそして葉におけるそれよりも６倍高かった（表１４）。試験の 時点におけるこの植物の樹令は２〜３月であった。 実施例１７ 大豆の葉におけるＳＣＳＶプロモーターの一時的活性 使用したＳＣＳＶプロモーター：ＧＵＳ構築物（表１５）は、前述したように 、プロモーターを持たないＧＵＳプラスミドであるｐＫＧＯ（図４、ｐＪＫＫｍ ｆ（−）ＫＩＷＩＧＵＳ：ＯＣＳ）から誘導された。ただし、３５Ｓプロモータ ー：ＧＵＳ構築物はｐＧＵＳであった。ｐＧＵＳはｐＫＩＷＩ１０１由来のＧＵ Ｓ遺伝子を植物発現ベクターであるｐＤＨ５１（ピートルザク(Pietrzak)ら，19 86）中にクローニングすることにより誘導される。 大豆組織中での一時的ＧＵＳ発現のために、ＧＵＳ構築物を上記 のようにビオラッド・ビオリスティックＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システ ムを用い粒子砲撃法により組織中に導入した。１：１の比の１μｍ及び５μｍの 金粒子３ｍｇプラス６μｇのＤＮＡを含む５０μｌの懸濁液をそれぞれ３枚の葉 を含むプレート上に打ち込んだ。これらの実験に用いた十分に広げた葉は２４日 令の大豆植物ｃｖ．ウエインから調製された。粒子砲撃後、Ｘ−Ｇｌｕｃで葉の 真空浸潤（クレーグ(Craig)ら，1992）により２４時間後のＧＵＳ活性を測定し た。 その結果（表１５）は、大豆葉での一時的発現においては、ＳＣＳＶセグメン ト４プロモーターは、それぞれのプラスミドを大豆葉中に打ち込んだとき、３５ Ｓプロモーター（１０〜１５スポット／葉１枚）よりもより活性であった（２５ 〜３５スポット／葉１枚）。 実施例１８ カルスに特異的な発現のためのＳＣＳＶプロモーターのテスト ７個のＳＣＳＶ非コード配列のすべてを、プロモーターを持たないＧＵＳベク ターであるｐＨＷ９中にクローニングした。それぞれが７個のＳＣＳＶプロモー ター：ＧＵＳ融合構築物の一つを含む二重ベクターをアグロバクテリウム媒介遺 伝子移転によりタバコ組織中に形質転換した。形質転換の２〜３週間後に、形質 転換された若芽（shoots）の原基を含むカルスを組織化学的ＧＵＳ染色に付した 。セグメント１で形質転換されたカルスで最も良い発現が観察され、ついでＳ４ ｎｃ：ＧＵＳ：ＯＣＳ構築物が続いた。この結果は、セグメント１プロモーター が選択可能なマーカー遺伝子発現にとっ て最も適しておりそしてセグメント４プロモーターが遺伝子発現にとって最も良 いことを示唆する。 実施例１９ フラベリア・ビデンティスＭｅＡ遺伝子の調節配列の性質 フラベリア・ヒデンティス（キティ(Chitty)ら，1994）では、ＭｅＡ遺伝子は Ｃ４光合成に適応したＮＡＤＰ−リンゴ酸酵素をコードする遺伝子である。この 遺伝子の構造及び推定的なプロモーター配列及び転写終結／ポリアデニル化シグ ナル配列が単離され、ターミネーター配列配列が決定された（図１５）。フラベ リア・ヒデンティスＭｅＡ遺伝子の推定的プロモーター要素（ＭｅＡ５’配列〔 ＭｅＡ５’〕及びターミネーターＭｅＡ３’配列〔ＭｅＡ３’〕）の潜在的な活 性について、ＧＵＳ発現ベクターを用いるトランスジェニック・フラベリア・ヒ デンティス植物中で研究した（図１６）。ＭｅＡ３’ターミネーター配列の長鎖 版（ＭｅＡ３’Ｌ＝停止コドンから５．５ｋｂ）をこれらの実験に用いた。図１ ６では、ＧＵＳ発現カセットＭＥ２０を二重ベクターｐＧＡ４７０（アン（An） ら，1985）に連結し、一方ＭＥ２９をｐＧＡ４８２（アン（An）ら，1986）中に クローニングする。キティ(Chitty)ら(1994)の記載のようにして、植物をこれら のベクターで形質転換した。 形質転換した植物のＧＵＳ活性を組織化学的染色及び蛍光定量試験により研究 し、フラベリア・ヒデンティス植物の葉におけるＧＵＳの高レベル発現にこの遺 伝子のＭｅＡ３’配列が必要であることが示された（表１６）。この遺伝子の５ ’配列は葉における遺伝子発現に寄与するようには見えず、分裂組織及び茎中で はＯＣＳ３’ のような適当な転写終結シグナル配列／ポリアデニル化シグナル配列の存在の下 に発現を指令するように見える（表１６）。 実施例２０ 単子葉植物における遺伝子発現を増強するため、 ＳＣＳＶプロモーター構築物中での ＭｅＡ３’終結シグナル配列／ポリアデニル化シグナル配列の使用 多くの遺伝子調節要素は５’末端に位置するので、ＭｅＡ３’配列の活性は、 ＳＣＳＶプロモーターにより指令される遺伝子発現を増強するという目的でＳ４ ｎｃＳＣＳＶプロモーターと組み合わせて試験する。これらの実験では、ＭｅＡ ３’ターミネーター配列の短鎖版（ＭｅＡ３’Ｓ＝停止コドンから９００塩基） を用いて、ＯＣＳ３’、ＳＣＳＶセグメント５の３’（ＳＣ５Ｔｒ）又はＭｅＡ ３’転写終結／ポリアデニル化シグナル配列のいずれかを持つＳ４ｎｃプロモー ターを含むＧＵＳ発現ベクターを調製した。これらの構築物は、上述のように、 プロモーターを持たないＧＵＳプラスミドであるｐＫＧＯから誘導された。Ｓ４ ｎｃ：ＧＵＳ：ＭｅＡ３’を含む組換えプラスミドｐＢＳ２３７は図１７に示す 。これらの構築物によって与えられるＧＵＳ活性はジャポニカ稲カルスｃｖ．タ イペイ３０９中で試験された。これらの構築物をビオラッド・ビオリスティック ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（ビオーラド・ラボラトリース）を用 いる粒子砲撃により稲カルス中に導入し、大豆葉やタバコ原形質体などの双子葉 植物組織中で得られた結果と比較した（表１７）。稲粒子砲撃実験では、１：１ の比の１μｍ及び５μｍの金粒子４ｍｇプラス５μｇのＤＮＡを総容量５０μｌ でカルスの６枚のプレート上に砲撃した。このＤＮＡはＧＵＳ遺伝子を含む各ベ クターの選択マーカー遺伝子を含むベクターへの比が４：１モル比となるように 作成された。選択マーカーを含むベクターはｐＴＲＡ１５１（ゼング(Zheng)ら ，1991）であった。各プレートには成熟胚から誘導された５０〜１００個の新鮮 な二次カルスを含ませた。ＤＮＡ砲撃の４０時間後に、１００ｍＭリン酸緩衝液 中の０．３％ｗ／ｖＸ−Ｇｌｕｃ溶液中にカルスを置くことによりＧＵＳ活性を 検出した。１夜インキュベーションした後、青色のスポットを数えた。 タバコ及び大豆中での一時的ＧＵＳ発現に対しては、ＧＵＳ構築物のみを原形 質体及び葉組織中にそれぞれ導入した。電気穿孔法導入後、タバコ原形質体につ いて前述のようにＧＵＳ活性を試験した。この構築物を前述のように粒子砲撃に より大豆組織中に導入した。 その結果は、単子葉植物である稲の組織では、ＳＣＳＶターミネーターと比べ てＭｅＡ３’構築物では１６倍高い活性が得られた（表１７）。同様な実験で、 ユビキティン(ubiquitin)プロモーター：ＧＵＳ：ＮＯＳカセット（クリステン セン(Christensen)ら，1992）を含む高発現したＧＵＳ構築物はＳＣ４：ＧＵＳ ：ＭｅＡ３’構築物よりも約４倍高い活性を有する。 双子葉植物の組織では、タバコ原形質体及び大豆葉においてこれらの構築物は 両者とも同様な活性を示した。しかしながら、両者の活性はタバコ原形質体中で はＯＣＳターミネーターで得られた活性よりも２倍高かった（表１７）。 これらの結果は、単子葉植物中でＳＣＳＶプロモーターにより指令される遺伝 子発現を可能とするためにＭｅＡ３’配列を使用することができることを示唆す るものである。 実施例２１トランスジェニック植物において選択可能マーカー遺伝子をドライ ブするためＳＣＳＶプロモーター及びターミネーターを含む新規な ベクターの使用 形質転換及び再生の後にトランスジェニック植物を選択するための基礎として の選択可能マーカー遺伝子をドライブするためにＳＣＳＶプロモーターを使用す ることの妥当性について、タバコ植物で検討した。使用された選択可能マーカー はカナマイシン耐性遺伝子、ｎｐｔIIである。このｎｐｔII遺伝子に融合したＳ ＣＳＶセグメント１（ｐＢＳ２４６）（図１８）又はＳＣＳＶセグメント７プロ モーター（ｐＫＨＡＮ４）（図１９）のいずれかを含む二重ベクターをそれぞれ ｐＡＲＴ２７（グリーブ(Gleave)，1992）及びｐＫＳＢ．ｂａｒ１（図１９）か ら構築した。これらを別々にタバコ植物中に形質転換し（エリス(Ellis)ら，198 7）、トランスジェニック植物と思われるものを１００μｇ／ｍｌカナマイシン を用いるカナマイシン選択の下で選択した（図２０）。カナマイシン耐性をトラ ンスジェニック植物内でｎｐｔII遺伝子活性（マクドンネル(McDonnell)ら，198 7）に対するドット・ブロット試験及び１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む根 定着用培地（rooting medium）中でのトランスジェニック植物の生存により確認 した。その結果は、同一実 験における３５Ｓプロモーター構築物の使用と同様に少なくとも多数のカナマイ シン耐性植物をＳＣＳＶセグメントプロモーター構築物が作成したこと示した。 従って、ＳＣＳＶセグメントプロモーター構築物はカナマイシン耐性に基づきト ランスジェニック・タバコ植物を選択するのに３５Ｓプロモーターと同様に有効 である（表１８）。ｐＫＨＡＮ４で形質転換されたタバコは再生培地において１ ００μｇ／ｍｌカナマイシンに耐性でありそして根定着用培地において５０μｇ ／ｍｌカナマイシンに耐性である。ｐＫＨＡＮ４を作成するために使用したｐＫ ＳＢ．ｂａｒ１及びｐＫＨＡＮ２の制限地図を図１９に示す。 実施例２２ 新規な植物遺伝子発現ベクター系の開発 目的の有用遺伝子をドライブするＳＣＳＶセグメント４プロモーター及びＳＣ ＳＶセグメント５ターミネーターを含む新規な発現ベベクター（ｐＩＣＡＮ１） （図２１）をｐＧＥＭ誘導体から構築した。得られた発現カセットは二重ベクタ ーであるｐＢＳ２４６及びｐＫＨＡＮ４中に挿入することができる。次いで、こ うして得られた二重ベクターを使用して経済的に重要な植物、殊に綿、サブクロ ーバ、ポテト及びホワイトクローバなどをカナマイシン選択の下で形質転換する ことができる。ＳＣＳＶプロモーターとターミネーターの異種組み合わせから他 の二重ベクターを構築して植物遺伝子発現用の全範囲をカバーする二重ベクター 系を作成することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１２月２日 【補正内容】 １． 植物細胞中で機能することができる多重成分シルコウイルス由来のシルコ ウイルスプロモーターを含む遺伝子構築物であって、該シルコウイルスが多重成 分ＤＮＡゲノムを含むものである遺伝子構築物。 ２． シルコウイルスゲノムが３個以上のＤＮＡ成分又はＤＮＡセグメントを含 むものである、請求項１記載の遺伝子構築物。 ３． シルコウイルスがサブテレーニアン・クローバ・スタント・ウイルス（Ｓ ＣＳＶ）である、請求項２記載の遺伝子構築物。 ４． プロモーターが配列番号：１〜配列番号：７により規定されたＳＣＳＶの セグメント１〜セグメント７の一つから選択されるものである又はプロモーター が低い厳格条件の下でそれにハイブリダイズすることができるものである、請求 項３記載の遺伝子構築物。 ５． 遺伝子が機能し得るように該プロモーターに連結されるとき該配列が機能 し得るように該遺伝子に連結されるような終結配列及び／又はポリアデニル化配 列をさらに含む、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の遺伝 子構築物。 ６． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がＳＣＳＶ起源のも のである、請求項５記載の遺伝子構築物。 ７． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列が配列番号：１〜配列番号：７に より規定されたＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント７の一つから選択されるも のである、又は終結配列及び／又はポリアデニル化配列が低い厳格条件の下でそ れにハイブリダイズすることができるものである、請求項５記載の遺伝子構築物 。 ８． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がフラベリア・ビデンティス(Fla veria bidentis)ＭｅＡ遺伝子由来のものである、請求項５記載の遺伝子構築物 。 ９． 該プロモーターに機能し得るように連結された異種遺伝子をさらに含む、 請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の遺伝子構築物。 合成を開始させるための遺伝的シグナルを含む。さらに、配列特異的なＤＮＡ結 合タンパク質がプロモーターの隣に結合しそしてそのプロモーターへのポリメラ ーゼの結合に悪影響を与えることによりＲＮＡ合成の開始を阻害したり刺激した りするものと考えられている。ターミネーター配列とは終結配列及びポリアデニ ル化配列を指し、機能的ｍＲＮＡの転写に要求される。終結配列は遺伝子の下流 （即ち、３’−末端側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡの合成 を停止させるためのシグナルとして認識される。ポリアデニル化配列は転写後に 行われる真核生物ｍＲＮＡ分子のポリアデニル化のために必要なシグナルである 。 植物において外来遺伝子の発現を容易にするために広く用いられているウイル スプロモーターはカリフラウワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロ モーター（オデル(Odell)ら，1985）であり、これは二本鎖ＤＮＡ植物ウイルス 由来のものである。植物及び植物細胞におけるこのプロモーターの使用は充分に 文献で実証されている（ベンフィー及びチュア(Benfey and Chua，1990; ヒギン ス及びスペンサー(Higgins and Spencer，1991）。しかしながら、このプロモー ターの明らかな有用性にもかかわらず、それはすべての植物では機能せず、特に マメ科植物ではほとんど機能し得ない。従って、植物でそして特にマメ科植物で 機能し得るウイルス起源のような他のプロモーターを探し出す必要がある。また 、植物細胞中で遺伝子又は他の遺伝子配列の発現のレベルを調節する必要もある 。 このような事情から、本発明の一つの側面はシルコウイルスプロモーター又は シルコウイルスプロモーター様配列を含み、かつ植物細胞中で機能することがで きる遺伝子構築物であって、該シルコウイルスが多コンポーネントＤＮＡゲノム を含むものである遺伝子構築物に関する。 本発明の関連する側面では、シルコウイルスプロモーター又はシルコウイルス プロモーター様配列及び終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含む遺伝子構 築物が提供される。これらの配列は植物細胞中で機能することができるものであ る。 シルコウイルスは双球形でない(non-geminated)一本鎖(ss)ＤＮＡ植物ウイル ス（表１）であり、二本鎖ゲノムを持つカウリモウイルス及び他の唯一の知られ たssＤＮＡ植物ウイルスであって双球形の粒子を持つジェミニウイルスとも異な っている(チュー(Chu)ら，1994)。本明細書で使用するとき、シルコウイルス群 はサブテレーニアン・クローバ・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）(チュー及び ヘルムス(Chu and Helms)，1988)、バナナ・バンキー・トップ・ウィルス（ＢＢ ＴＶ）（トーマス及びディーツゲン(Thomas and Dietzgen)，1991; ハーディン グ(Harding)ら，1991; 1993; バーンズ(Burns)ら，1993）及びミルク−ベッチ・ ドゥオーフ・ウイルス（ＭＤＶ）（イソガイ(Isogai)ら，1992，サノ(Sano)ら， 1993）及びファバ・ビーン・ネクロティック・イエローズ・ウイルス（ＦＢＮＹ Ｖ）（カツール(Katul)ら，1993）を含むものと考える。 特に好ましい態様では、本発明に従って使用することを意図するシルコウイル スは３個以上のＤＮＡ成分又はＤＮＡセグメントを含んでいる。 本発明は、シルコウイルス群の代表としてサブテレーニアン・クローバ・スタ ント・ウイルス（以下には「ＳＣＳＶ」と短縮する）を特に取り上げ、以下には これに関して記述する。このことは、しかしながら、ＳＣＳＶへの言及が本発明 の範囲に含まれるシルコウイルス群の他のすべての適当なメンバーへの言及を含 んでいるという理解の基になされるものである。ＳＣＳＶなどのシルコウイルス 群の好ましいメンバーは３個以上のＤＮＡ成分またはＤＮＡセグメントを含んで いる。以下の「ＳＣＳＶ」への言及もまた、このウイルスの自然に生じる突然変 異体又は人工的に誘導された突然変異体、このウイルスの誘導体、部分、断片、 ホモログ、又はアナログなどであって、なお少なくとも１個の適当なプロモータ ー及び／又は終結配列及び／又はポリアデニル化配列を保持しているものすべて を含みそしてこれらのすべてに拡張される。 従って、本発明の特に好ましい態様は、ＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプ ロモーター様配列を含む遺伝子構築物であって、植物細胞中で機能し得る遺伝子 構築物を意図する。 本発明の関連する側面は、ＳＣＳＶプロモーター又はＳＣＳＶプロモーター様 配列及び終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含む遺伝子構築物であって、 これらの配列が植物細胞中で機能し得る遺伝子構築物に関する。 「遺伝子構築物」という言葉は、その最も広い意味で用いられ、単離された核 酸分子、ベクター、発現ベクター又は二成分ベクターなどの如何なる組換え核酸 分子をも含む。それはシルコウイルスプロモーターのみを含んでいてもよく、又 は調節配列及び／又はレポータ配列と共に１又は２以上のプロモーターを含んで いてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ベビンク，ペトラ クリスティナ オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、ラインハム 2602、 22 アーチバルド ストリート、フラット 20 (72)発明者 スリン，ブライアン ピーター オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、リベット 2611、カ ービーン ストリート 45 (72)発明者 キース，ポール コンラッド オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、カーチン 2605、モ アヘッド ストリート 10 (72)発明者 チュー，ポール ウィング ゲイ オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、フローリー 2615、 ヒューレット カーキット 25 (72)発明者 ウォーターハウス，ピーター マイケル オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、オコンナー 2601、 バンジン ストリート ５ (72)発明者 カン，ラフィクル イスラム オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、ギララング 2617、 ドットウェル ストリート ４ (72)発明者 ラーキン，フィリップ ジョン オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、ウェストン 2611、 マッキンス ストリート 82 (72)発明者 テイラー，ウィリアム クラーク オーストラリア、ニュー サウス ウェー ルズ バンゲンドール 2621 マックス リーフ ロード、アール・エム・ビー 401 (72)発明者 マーシャル，ジェリー スチュワート オーストラリア、オーストラリアン キャ ピタル テリトリー、アランダ 2614、バ ナンビラ ストリート 45

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 植物細胞中で機能することができるシルコウイルスプロモーターを含む遺 伝子構築物。 ２． シルコウイルスゲノムが３個以上のＤＮＡ成分又はＤＮＡセグメントを含 むものである、請求項１記載の遺伝子構築物。 ３． シルコウイルスがサブテレーニアン・クローバ・スタント・ウイルス（Ｓ ＣＳＶ）である、請求項２記載の遺伝子構築物。 ４． プロモーターが配列番号：１〜配列番号：７により規定されたＳＣＳＶの セグメント１〜セグメント７の一つから選択されるものである又はプロモーター が低い厳格条件の下でそれにハイブリダイズすることができるものである、請求 項３記載の遺伝子構築物。 ５． 遺伝子が機能し得るように該プロモーターに連結されるとき該配列が機能 し得るように該遺伝子に連結されるような終結配列及び／又はポリアデニル化配 列をさらに含む、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の遺伝 子構築物。 ６． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がＳＣＳＶ起源のものである、請 求項５記載の遺伝子構築物。 ７． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列が配列番号：１〜配列番号：７に より規定されたＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント ７の一つから選択されるものである、又は終結配列及び／又はポリアデニル化配 列が低い厳格条件の下でそれにハイブリダイズすることができるものである、請 求項５記載の遺伝子構築物。 ８． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がフラベリア・ビデンティス(Fla veria bidentis)ＭｅＡ遺伝子由来のものである、請求項５記載の遺伝子構築物 。 ９． 該プロモーターに機能し得るように連結された異種遺伝子をさらに含む、 請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載の遺伝子構築物。 １０． 該プロモーター及び該終結配列及び／又はポリアデニル化配列に機能し 得るように連結された異種遺伝子をさらに含む、請求項５記載の遺伝子構築物。 １１． 該プロモーター及び該終結配列及び／又はポリアデニル化配列に機能し 得るように連結された異種遺伝子をさらに含む、請求項６又は請求項７又は請求 項８に記載の遺伝子構築物。 １２． 異種遺伝子が下記のものから選択されるものである、請求項９又は請求 項１０又は請求項１１に記載の遺伝子構築物、 ａ） 植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫類及び他の病原体類に対する耐 性遺伝子、 ｂ） アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・ク ローバ・モトル・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・レッド・リーフ・ウ イルス、ポテト・リーフロル・ウイルス、トマト・スポッテッド・ウィルト・ウ イルス、ビーン・イエロー・モザイク・ウイルス、ホワイト・クローバ・モザイ ク・ウイルス、クローバ・イエロー・ベイン・ウイルス、ポテト・ウイルス類ｘ ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・モザイク・ウイルス、ライス・ラッグド・ス タント・ウイルス及びバーリイ・イエロー・ドゥオルフ・ウイルスなどからの及 びこれらに対する合成遺伝子を含む植物ウイルス耐性遺伝子、 ｃ） ヒマワリの高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価値を高めるための遺 伝子、 ｄ） 鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ） 抗体遺伝子、 ｆ） 穀類のチオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ） ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアナ・アラタ(Nicotiana alata)由来のプロ テイナーゼ阻害剤遺伝子を含む昆虫耐性遺伝子、 ｈ） カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する抵抗性を与える遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子、 ｉ） ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ） 植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコードする遺伝 子。 １３． 植物細胞中で機能することができるＳＣＳＶプロモーター 、該プロモーターに機能的に連結した異種遺伝子の挿入を容易にするため該プロ モーターの下流にある少なくとも１個の制限エンドヌクレアーゼ部位及び必要な 場合には該遺伝子が該制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入されるとき該異種遺伝 子の３’末端に位置する終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含む遺伝子構 築物。 １４． このプロモーターが配列番号：１〜配列番号：７により規定されたＳＣ ＳＶのセグメント１〜セグメント７の一つから選択されるものであり、又はこの プロモーターが低い厳格条件の下でこれらにハイブリダイズすることができるも のである、請求項１３記載の遺伝子構築物。 １５． この終結配列及び／又はポリアデニル化配列がＳＣＳＶ起源のものであ る、請求項１３又は請求項１４に記載の遺伝子構築物。 １６． この終結配列及び／又はポリアデニル化配列が配列番号：１〜配列番号 ：７により規定されたＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント７の一つから選択さ れるものであり、又はこの終結配列及び／又はポリアデニル化配列が低い厳格条 件の下でこれらにハイブリダイズすることができるものである、請求項１５記載 の遺伝子構築物。 １７． この終結配列及び／又はポリアデニル化配列がフラベリア・ビデンティ スＭｅＡ遺伝子由来のものである、請求項１３記載の遺伝子構築物。 １８． 下記のものから選択される異種遺伝子をさらに含む請求項１３記載の遺 伝子構築物、 ａ） 植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫類及び他の病原体類に対する耐 性遺伝子、 ｂ） アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・モトル・ウイルス、サブテ レーニアン・クローバ・レッド・リーフ・ウイルス、ポテト・リーフロル・ウイ ルス、トマト・スポッテッド・ウィルト・ウイルス、ビーン・イエロー・モザイ ク・ウイルス、ホワイト・クローバ・モザイク・ウイルス、クローバ・イエロー ・ベイン・ウイルス、ポテト・ウイルス類ｘ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・ モザイク・ウイルス、ライス・ラッグド・スタント・ウイルス及びバーリイ・イ エロー・ドゥオルフ・ウイルスなどからの及びこれらに対する合成遺伝子を含む 植物ウイルス耐性遺伝子、 ｃ） ヒマワリの高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価値を高めるための遺 伝子、 ｄ） 鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ） 抗体遺伝子、 ｆ） 穀類のチオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ） ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアナ・アラタ由来のプロテイナーゼ阻害剤遺 伝子を含む昆虫耐性遺伝子、 ｈ） カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する抵抗性を与える遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子、 ｉ） ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ） 植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコードする遺伝 子。 １９． 植物細胞中で機能することができる同一の又は異なるシルコウイルスプ ロモーター類に機能できるように連結された２個以上の異種遺伝子を含む遺伝子 構築物。 ２０． このプロモーター又は異なるプロモーター類が３個以上の成分又はセグ メントを含むゲノムを持つシルコウイルス由来のものである、請求項１９記載の 遺伝子構築物。 ２１． このプロモーター又は異なるプロモーター類がサブテレーニアン・ク ローバ・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）由来のものである、請求項２０記載の 遺伝子構築物。 ２２． このプロモーター又は異なるプロモーター類が配列番号：１〜配列番号 ：７により規定されたＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント７の一つから選択さ れるものであり、又はこのプロモーターが低い厳格条件の下で配列番号：１〜配 列番号：７の少なくとも一つにハイブリダイズすることができるものである、請 求項２１記載の遺伝子構築物。 ２３． 該異種遺伝子の１個以上と機能できるように連結された終結配列及び／ 又はポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１９又 は請求項２０又は請求項２１又は請求項２２に記載の遺伝子構築物。 ２４． この終結配列及び／又はポリアデニル化配列が各遺伝子に対して同一で ある、請求項２３記載の遺伝子構築物。 ２５． この終結配列及び／又はポリアデニル化配列が各遺伝子に対して異なる ものである、請求項２３記載の遺伝子構築物。 ２６． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列の少なくとも一つが配列番号： １〜配列番号：７により規定されたＳＣＳＶのセグメント１〜セグメント７から 選択されるものであり、かつこの終結配列及び／又はポリアデニル化配列が低い 厳格条件の下で配列番号：１〜配列番号：７の少なくとも一つにハイブリダイズ することができるものである、請求項２４又は請求項２５に記載の遺伝子構築物 。 ２７． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列の少なくとも一つがフラベリア ・ビデンティスのＭｅＡ遺伝子由来のものである、請求項２４又は請求項２５に 記載の遺伝子構築物。 ２８． 異種遺伝子が下記のものから選択されるものである請求項１９記載の遺 伝子構築物、 ａ） 植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫類及び他の病原体類に対する耐 性遺伝子、 ｂ） アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・モトル・ウイルス、サブテ レーニアン・クローバ ・レッド・リーフ・ウイルス、ポテト・リーフロル・ウイルス、トマト・スポッ テッド・ウィルト・ウイルス、ビーン・イエロー・モザイク・ウイルス、ホワイ ト・クローバ・モザイク・ウイルス、クローバ・イエロー・ベイン・ウイルス、 ポテト・ウイルス類ｘ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・モザイク・ウイルス、 ライス・ラッグド・スタント・ウイルス及びバーリイ・イエロー・ドゥオルフ・ ウイルスなどからの及びこれらに対する合成遺伝子を含む植物ウイルス耐性遺伝 子、 ｃ） ヒマワリの高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価値を高めるための遺 伝子、 ｄ） 鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ） 抗体遺伝子、 ｆ） 穀類のチオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ） ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアナ・アラタ由来のプロテイナーゼ阻害剤遺 伝子を含む昆虫耐性遺伝子、 ｈ） カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する抵抗性を与える遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子、 ｉ） ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ） 植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコードする遺伝 子。 ２９． 植物細胞中で外来遺伝子を発現させる方法であって、該植物細胞中に請 求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載の遺伝子 構築物を導入することを含み、かつ機能できるように該遺伝子構築物上のプロモ ーターに連結された該外来遺伝子をさらに含む方法。 ３０． この外来遺伝子が下記のものから選択されるものである請求項２９記載 の方法、 ａ） 植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫類及び他の病原体類に対する耐 性遺伝子、 ｂ） アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・モトル・ウイルス、サブテ レーニアン・クローバ・レッド・リーフ・ウイルス、ポテト・リーフロル・ウイ ルス、トマト・スポッテッド・ウィルト・ウイルス、ビーン・イエロー・モザイ ク・ウイルス、ホワイト・クローバ・モザイク・ウイルス、クローバ・イエロー ・ベイン・ウイルス、ポテト・ウイルス類ｘ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・ モザイク・ウイルス、ライス・ラッグド・スタント・ウイルス及びバーリイ・イ エロー・ドゥオルフ・ウイルスなどからの及びこれらに対する合成遺伝子を含む 植物ウイルス耐性遺伝子、 ｃ） ヒマワリの高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価値を高めるための遺 伝子、 ｄ） 鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ） 抗体遺伝子、 ｆ） 穀類のチオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ） ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアナ・アラタ由来のプロテイナーゼ阻害剤遺 伝子を含む昆虫耐性遺伝子、 ｈ） カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する抵抗性を与える遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子、 ｉ） ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ） 植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコードする遺伝 子。 ３１． 植物細胞中で２個以上の外来遺伝子を発現させる方法であって、該植物 細胞中に請求項１９〜請求項２８のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を導入す ることを含む方法。 ３２． ＳＣＳＶプロモーター及び機能できるようにそれに連結された異種遺伝 子及び必要な場合は終結配列及び／又はポリアデニル化配列を含むトランスジェ ニック植物。 ３３． 該異種遺伝子が下記のものから選択されるものである請求項３２記載の トランスジェニック植物、 ａ） 植物ウイルス類、細菌類、カビ類、線虫類及び他の病原体類に対する耐 性遺伝子、 ｂ） アルファルファ・モザイク・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・ スタント・ウイルス、サブテレーニアン・クローバ・モトル・ウイルス、サブテ レーニアン・クローバ・レッド・リーフ・ウイルス、ポテト・リーフロル・ウイ ルス、トマト・スポッテッド・ウィルト・ウイルス、ビーン・イエロー・モザイ ク・ウイルス、ホワイト・クローバ ・モザイク・ウイルス、クローバ・イエロー・ベイン・ウイルス、ポテト・ウイ ルス類ｘ，ｙ，ｓ，ｍ及びａ、カカムバー・モザイク・ウイルス、ライス・ラッ グド・スタント・ウイルス及びバーリイ・イエロー・ドゥオルフ・ウイルスなど からの及びこれらに対する合成遺伝子を含む植物ウイルス耐性遺伝子、 ｃ） ヒマワリの高硫黄遺伝子ＳＦ８などの植物の栄養価値を高めるための遺 伝子、 ｄ） 鼓腸症耐性遺伝子、 ｅ） 抗体遺伝子、 ｆ） 穀類のチオニン及びリボゾーム不活性化タンパク質遺伝子、 ｇ） ＢＴ毒素遺伝子及びニコチアナ・アラタ由来のプロテイナーゼ阻害剤遺 伝子を含む昆虫耐性遺伝子、 ｈ） カナマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン及びハイグロ マイシンに対する抵抗性を与える遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子、 ｉ） ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子及び色素遺伝子などのレポーター遺伝子、 ｊ） 植物細胞中で遺伝子の発現を調節する調節タンパク質をコードする遺伝 子。 ３４． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がＳＣＳＶ由来のものである請 求項３２又は請求項３３に記載のトランスジェニック植物。 ３５． 終結配列及び／又はポリアデニル化配列がフラベリア・ビ デンティスＭｅＡ遺伝子由来のものである請求項３２又は請求項３３に記載のト ランスジェニック植物。 ３６． 請求項１９〜請求項２８のいずれか１項に記載の遺伝子構築物を含むト ランスジェニック植物。 ３７． 配列番号：１〜配列番号：７から選択される単離された核酸分子又は低 い厳格条件の下で配列番号：１〜配列番号：７の少なくとも一つとハイブリダイ ズすることができる核酸分子。 ３８． 植物細胞中で機能できるようにＳＣＳＶプロモーターに連結された外来 遺伝子の発現レベルを高める方法であって、該細胞中に１個の遺伝子構築物、又 は発現させるべき遺伝子とその産物が該遺伝子の発現を高め又はトランス活性化 することができる別の遺伝子とからなる２個の異なる遺伝子構築物を導入するこ とを含む方法。 ３９． トランス活性化する遺伝子が配列番号：１〜配列番号：７から選択され るものである、又は低い厳格条件の下でそれらにハイブリダイズすることができ る遺伝子である、請求項３８記載の方法。