JPH10504447A - インターロイキン−１β変換酵素の結晶構造および変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インターロイキン-１β変換酵素(「ICE」)は、不活性前駆体を前炎症性サイトカインである、インターロイキン-１βにプロセシングする。インヒビターと復合化して結晶化したヒトICEの高解像度構造がＸ線回析により決定される。活性部位は、10キロダルトンのサブユニットと20キロダルトンのサブユニットとの両方にまたがる。補助的結合部位は、結晶の２回対称軸に隣接するp10およびp20サブユニット由来の残基から構成される。この酵素の構造座標は、新規なクラスのICEインヒビターを設計するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン-１β変換酵素の結晶構造および変異体 発明の技術分野 本発明は、インターロイキン-１β変換酵素(「ICE」)の結晶に関し、そしてよ り詳細には、Ｘ線回折により得られたICEの高分解構造に関する。本発明はまた 、ICEの変異体にも関する。さらに、本発明は、ICEおよびその変異体の構造座標 を用いてICEの活性部位および補助的結合部位に結合する化合物のスクリーニン グおよび設計する方法に関する。 背景技術分野 インターロイキン-１(「IL-1」)は、線維芽細胞の分化および増殖、滑膜細胞 および軟骨細胞によるプロスタグランジン、コラゲナーゼおよびホスホリパーゼ の産生、好塩基球および好酸球の脱顆粒ならびに好中球の活性化を刺激する主要 な前炎症性(proinflammatory)タンパク質および免疫調節タンパク質である。Opp enheim、J.H.ら、Immunology Today、７、45〜56頁(1986)。このように、インタ ーロイキン-１は、慢性および急性の炎症性疾患および自己免疫疾患の病因に関 与する。IL-１は末梢血液単球により主に産生され、そして２つの異なるアゴニ スト形態(IL-1αおよびIL-1β)で存在する。Mosely,B.S.ら、Proc ．Nat．Acad. Sci. 、84、4572〜4576頁(1987)；Lonnemann G.ら、Eur ．J．Immunol.、19、1531 〜1536頁(1989)。 IL-1βは生物学的に不活性な前駆体であるpIL-1βとして合成される。pIL-1β は従来のリーダー配列を有さない33kDaのポリペプチドであり、そしてシグナル ペプチターゼによりプロセシングされない。March,C.J.、Nature、315、641〜64 7頁(1985)。その代わり、pIL-１βは、Asp116とAla117との間でインターロイキ ン-１β変換酵素(「ICE」)により切断され、血清および滑液中に見出される生物 学的に活性な分子量17kDaのＣ末端フラグメントを産生する。Sleath,P.R.ら、J. Biol ．Chem. 、265、14526〜14528頁(1992)；Howard,A.D.ら、J ．Immunol.、147 、2964〜2969頁(1991)。ICEによるプロセシングはまた、細胞膜を通しての成 熟IL-1βの輸送に必要である。 ICEは主に単球中に局在するシステインプロテアーゼである。これは前駆体IL- １βを成熟形態に変換する。Black,R.A.ら、FEBS Lett.、247、386〜390頁(1989 )；Kostura,M.J.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA、86、5227〜5231頁(1989)。I CEまたはそのホモログはまた、細胞死またはアポトーシスの調節に関与するよう である。Yuan,J.ら、Cell、75、641〜652頁(1993)；Miura,M.ら、Cell、75、653 〜660頁(1993)；Nett-Fiordalisi,M.A.ら、J ．Cell．Biochem.、17B、117頁(199 3)。特に、ICEまたはICEホモログは、アルツハイマー病およびパーキンソン病の ような神経発生性(neurogenerative)疾患におけるアポトーシスの調節に関連す ると考えられる。Marx,J.およびM.Baringa、Science、259、760〜762頁(1993)； Gagliardini,V.ら、Science、263、826〜828頁(1994)。 ICEは、２つのサブユニットp20およびp10(それぞれ、分子量20kDaおよび10kDa )からなるヘテロダイマーとして以前に記載されている。これらのサブユニット は、自触反応性である活性化機構を介してp30形態を経由し、45kDaのプロ酵素(p 45)から得られる。Thornberry,N.A.ら、Nature、356、768〜774頁(1992)。ICEプ ロ酵素はいくつかの機能的ドメインに分けられている：プロドメイン(p14)、ｐ2 2/20サブユニット、ポリペプチドリンカーおよびp10サブユニットである。Thorn berryら、前出；Casanoら、Genomics、20、474〜481頁(1994)。 完全長p45はそのcDNAおよびアミノ酸配列により特徴付けられている。PCT特許 出願第WO 91/15577号および同第WO 94/00154号。p20およびp10のcDNAおよびアミ ノ酸配列もまた、公知である。Thornberryら、前出。マウスICEおよびラットICE もまた、配列決定され、クローン化されている。これらは、ヒトICEに対して高 いアミノ酸配列相同性および核酸配列相同性を有する。Miller,D.K.ら、Ann ．N. Y．Acad．Sci. 、696、133〜148頁(1993)；Molineaux,S.M.ら、Proc ．Nat．Acad ．Sci. 、90、1809〜1813頁(1993)。しかし、ICEの一次構造の知識をもってして もその３次構造は予測できない。ICEとその基質であるpIL-1βあるいは他の基質 またはインヒビターとの構造的、コンホメーション的および化学的相互作用の理 解も得られない。 ICEインヒビターは、炎症またはアポトーシスあるいはその両方の制御に有用 なクラスの化合物を表す。ICEのペプチドインヒビターまたはペプチジルインヒ ビターが記載されている。PCT特許出願第WO 91/15577号；同第WO 93/05071号； 同第Wo 93/09135号；同第WO 93/14777号および同第WO 93/16710号；ならびに欧 州特許出願第0 547 699号。しかし、そのペプチドの性質により、典型的には、 このようなインヒビターは、低い経口吸収率、低い安定性および迅速な代謝のよ うな望ましくない薬理学的特性により特徴付けられる。Plattner,J.J.およびD.W .Norbeck、Drug Discovery Technologies、C.R.ClarkおよびW.H.Moos編(Ellis H orwood、Chichester、England、1990)、92〜126頁。これは効果的な薬剤へのこ れらの開発を妨げる。 発明の要旨 本発明は上記問題を解決する。 本発明の目的は、インターロイキン-１β変換酵素(「ICE」)の３次元構造を解 明し、そしてその構造座標を決定することである。 本発明の目的は、ICE結晶の構造座標を使用してこの酵素の活性部位および１ つ以上の補助的結合部位の原子の詳細を明らかにすることである。 本発明の目的はまた、ICEの結晶構造座標を使用して異なるICE結晶またはICE の変異体、ホモログまたは共複合体(co-complex)の結晶構造を解明することであ る。 本発明のさらなる目的は、野生型ICEと比較して１つ以上の異なる特性により 特徴付けられるインターロイキン-１β変換酵素変異体を提供することである。 これらの特性は、表面荷電の変化、サブユニット解離安定性の増加、基質特異性 の変化またはより高い比活性を包含する。ICE変異体はICEの酵素活性に最も重要 なアミノ酸を同定するのに有用である。次には、この情報によりペプチドICEイ ンヒビターと比較して改善されたICEのインヒビターの設計が可能となる。 本発明の目的はまた、ICEまたはその変異体またはホモログまたは共複合体の 構造座標および原子の詳細を用いて、ペプチドICEインヒビターの望ましくない 物理的特性および薬学的特性を回避するICEのインヒビターを設計、コンピュー ター評価、合成および使用することである。 図面の簡単な説明 図１は、p20/p10インターロイキン-１β変換酵素ヘテロダイマーのひも状の図 を表す。活性部位は図の上端部、大まかには示された側鎖のクラスターの中心で ある。 図２は、インターロイキン-１β変換酵素の(p20)₂/(p10)₂テトラマーの空間充 填モデルを表す。２つのp20サブユニット(暗い陰)は２つのp10サブユニット(明 るい陰)と接触している。左上および右下の黒い陰は、テトラマーの２つの活性 部位の各々において結合したテトラペプチドアルデヒドインヒビターを表す。結 晶学的２回対称軸は図面の平面に対してほぼ垂直であり、そして２つのp10サブ ユニット間の界面の中心の小さな穴を通って伸びる。各サブユニットのＮ末端お よびＣ末端は表示されている。 図３は、野生型インターロイキン-１β変換酵素の活性と比較した細胞内でのp IL-１βのプロセッシングにおける種々のインターロイキン-１β変換酵素変異体 の活性のグラフを表示する。試験した特定の変異体は、特異的アミノ酸およびそ の残基番号を列挙する命名法を用いて、Ｘ軸上に示される。例えば、「C285S」 はアミノ酸Cys-285のセリンによる置換を示す。活性レベルは16時間(斜線棒)お よび24時間(黒棒)で測定した。 表の簡単な説明 表Ａは、ICEサブユニット間のテトラマー界面接触を構成し、そして補助的結 合部位の部分を構成するICEのアミノ酸を列挙する。 表Ｂは、テトラペプチドインヒビターに複合したICE結晶からのＸ線回折によ り得られたICEの原子構造座標を列挙する。 略語および定義 略語 アミノ酸 A = Ala = アラニン V = Val = バリン L = Leu = ロイシン I = Ile = イソロイシン P = Pro = プロリン F = Phe = フェニルアラニン W = Trp = トリプトファン M = Met = メチオニン G = Gly = グリシン S = Ser = セリン T = Thr = トレオニン C = Cys = システイン Y = Tyr = チロシン N = Asn = アスパラギン Q = Gln = グルタミン D = Asp = アスパラギン酸 E = Glu = グルタミン酸 K = Lys = リジン R = Arg = アルギニン H = His = ヒスチジン 定義 以下の用語もまた、本明細書中で使用される： 用語「天然に存在するアミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸のＬ-異性体 を意味する。天然に存在するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシ ン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロ シン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、 アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ-カルボキシグルタミン酸、アル ギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本出願でいう 全てのアミノ酸はＬ体である。 用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で天然に見出されないアミノ酸を 意味する。本明細書で使用される非天然アミノ酸の例として、セレノシステイン およびセレノメチオニンのラセミ混合物が挙げられる。さらに、非天然アミノ酸 どして、ノル-ロイシン、パラ-ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン 、パラ-フルオロフェニルアラニン、3-アミノ-2-ベンジルプロピオン酸、ホモア ルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ-フェニルアラニンが挙げられる。 用語「正に荷電したアミノ酸」は、正常な生理学的条件下で正に荷電した側鎖 を有する任意の天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸を包含する。正に 荷電した天然に存在するアミノ酸の例は、アルギニン、リジンおよびヒスチジン である。 用語「負に荷電したアミノ酸」は、正常な生理学的条件下で負に荷電した側鎖 を有する任意の天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸を包含する。負に 荷電した天然に存在するアミノ酸の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸で ある。 用語「疎水性アミノ酸」とは、比較的水に不溶性である非荷電の非極性側鎖を 有する任意のアミノ酸を意味する。天然に存在する疎水性アミノ酸の例は、アラ ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ トファンおよびメチオニンである。 用語「親水性アミノ酸」とは、比較的水に可溶性である非荷電の極性側鎖を有 する任意のアミノ酸を意味する。天然に存在する親水性アミノ酸の例は、セリン (以下)、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、およびシステイン である。 用語「変異体」とは、Thornberry,N.A.ら、Nature、356、768〜774頁(1992)に よる野生型ヒトICE配列からの少なくとも１つのアミノ酸の置換により特徴付け されるICEポリペプチド(すなわち、野生型ヒトICEの生物学的活性を示すポリペ プチド)をいう。このような変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的変異 誘発によりそのコード配列中で既に変異されたICE cDNAの発現により調製され得 る。 ICE変異体はまた、非天然アミノ酸のICEタンパク質への部位特異的取り込みに より、Noren,C.J.ら、science、244、182〜188頁(1989)の一般的な生合成方法 を用いて生成され得る。この方法において、野生型ICE中の目的のアミノ酸をコ ードするコドンは、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発(以下で詳細に説明され る)を用いて、「ブランク(blank)」のナンセンスコドンであるTAGに置換される 。次いで、このコドンを指向するサプレッサーtRNAは、所望の非天然アミノ酸を 用いてインビトロで化学的にアミノアシル化される。次いで、アミノアシル化tR NAは、インビトロ翻訳系に加えられて部位特異的に取り込まれた非天然アミノ酸 を有する変異体ICE酵素を生ずる。 セレノシステインまたはセレノメチオニンは、栄養要求性E.coli株におけるIC EをコードするcDNAの発現により野生型ICEまたは変異体ICE中に取り込まれ得る 。Hendrickson,W.A.ら、EMBO J.、9(5)、1665〜1672頁(1990)。この方法におい て、野生型ICE cDNAまたは変異誘発ICE cDNAは、天然システインまたは天然メチ オニンのいずれか(または両方)は涸渇しているがセレノシステインまたはセレノ メチオニン(または両方)が富化されている増殖培地上の宿主生物中で発現され得 る。 用語「表面荷電の変化」とは、野生型ICEに比較した生理学的pHでの変異体ポ リペプチドの１つ以上の荷電単位の変化を意味する。これは、好ましくは少なく とも１つ以上の野生型ICEのアミノ酸における、生理学的pHで元の野生型側鎖と 異なる荷電を有する側鎖を有するアミノ酸への変異により達成される。 表面荷電の変化は、置換されたアミノ酸を有するポリペプチド分子の等電点(p I)を測定し、そしてこれを野生型ICE分子の等電点と比較することにより決定さ れる。 用語「高比活性」とは、Pennington,M.W.およびN.A.Thornberry、Peptide Res . 、7(2)、72〜76頁(1994)により記載されるアッセイを用いて、基質Ac-Tyr-Val- Ala-Asp-アミノメチルクマリンの加水分解についての二次速度定数(k_cat/K_m)が2 5℃で７×10⁴Ｍ^-1s^-1より大きい場合のICEの比活性をいう。あるいは、ICEの比 活性は、基質Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-p-ニトロアニリンの加水分解をモニターする ことにより決定され得る。Reiter,L.A.、Intr ．J．Peptide Protein Res.、43、 8796頁(1994)。 用語「基質特異性の変化」とは、野生型ICEと比較した変異体ICEの基質を切断 する能力の変化をいう。基質特異性は、Thornberryら、前出に記載されるように 、 蛍光原ペプチド基質または非修飾ペプチド基質のICEによる加水分解により測定 され得る。基質特異性の変化したICE変異体は、類似のペプチド基質X₁-Tyr-Val- Ala-Asp-X₃についてのk_cat/K_mよりも大きい基質X₁-Tyr-Val-Ala-X₂-X₃について の二次速度定数(k_cat/K_m)を示す。両方の基質において、X₁は、アセチルのよう なアミノ保護基であり；X₂は、Ｌ-アスパラギン酸以外の天然または非天然のア ミノ酸残基であり；そしてX₃は、アミノメチルクマリンまたはP-ニトロアリンの ようなカルボキシル保護基である。 ICEの「カイネティック形態」とは、遊離形態または非結合形態の酵素の状態 あるいはその活性部位または補助的活性部位のいずれかで化学的実体と結合した 酵素の状態をいう。 「競合」インヒビターは、ICEの基質が結合するのと同じICEのカイネティック 形態に結合し、従ってICEの活性部位について基質と直接競合することによりICE 活性を阻害するインヒビターである。競合阻害は、基質濃度を上昇させることに より完全に逆転され得る。 「不競合」インヒビターは、基質が結合するのと異なる酵素のカイネティック 形態に結合することによりICEを阻害するインヒビターである。このようなイン ヒビターは、既に基質と結合したICEに結合し、そして遊離した酵素には結合し ない。不競合阻害は、基質濃度を上昇させることによって、完全には逆転しない 。 「非競合」インヒビターはICEの遊離形態または基質結合形態のいずれかに結 合するインヒビターである。 当業者は、Segel,I.H.、Enzyme Kinetics、J.Wiley & Sons、(1975)による標 準式を用いるコンピューター適合酵素カイネティックデータにより、インヒビタ ーを競合的、不競合的、または非競合的であることを同定し得る。本発明による 不競合インヒビターまたは非競合インヒビターは補助的結合部位に結合し得るこ とがまた理解されるべきである。 用語「ホモログ」とは、Thornberryら、前出およびCasanoら、前出により定義 されるように、ICEまたはICEの任意の機能的ドメインと少なくとも30％のアミノ 酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。 用語「サブユニット解離」とは、野生型ICEの非常い高い希釈度または10nMよ り低い酵素の濃度で、テトラペプチド基質の存在下でアッセイしたときに酵素活 性が時間依存性喪失を示す事実をいう。希釈された不活性な混合物の再濃縮は、 ICE活性の完全な回復を生じる。野生型ICEは、１と10nMとの間のサブユニット解 離についてのKdを示す。酵素活性は、PenningtonおよびThornberry、前出のアッ セイに従って種々の酵素濃度でICEの活性を測定することにより決定される。酵 素濃度は活性部位の滴定により測定される。 用語「共複合体」とは、化学的実体または化合物と共有結合または非共有結合 したICEまたはICEの変異体またはホモログを意味する。 用語「〜との結合」とは、化学的実体または化合物あるいはそれらの一部とIC E分子またはその一部との間の近接状態をいう。結合は、水素結合あるいはファ ンデルワースまたは静電相互作用により並置がエネルギー的に好ましい非共有結 合または共有結合であり得る。 用語「βシート」とは、拡大ジグジグ(zig zig)コンホメーションに伸びるポ リペプチド鎖のコンホメーションをいう。「平行」に延びるポリペプチド鎖部分 は全て同じ方向に延びる。「逆平行」に延びるポリペプチド鎖は、平行線とは反 対の方向に延びる。 用語「活性部位」または「活性部位部分」とは、ICE内の以下の部位の任意の 部位または全ての部位をいう：基質結合部位；テトラペプチドインヒビターが結 合する部位および基質の切断が起こる部位。活性部位は、Thornberryら、前出に よる配列および番号付け(配列番号１)を用いて、少なくともアミノ酸残基173、1 76、177、178、179、180、236、237、238、239、244、248、283、284、285、290 、338、339、340、341、342、343、344、345、348、352、381および383により特 徴付けられる。 用語「補助的結合部位」または「補助的結合部位部分」とは、表Ａにより、IC Eの２回対称軸に隣接するが活性部位の外にあるアミノ酸残基を含むICEの結合部 位をいう。補助的結合部位は、基質切断部位ではないが、ICE阻害位置であり得 る。 補助的結合部位は、Thornberryら、前出による配列および番号付け(配列番号 １)を用いて、少なくともアミノ酸残基 により特徴付けられる。 用語「P結合ポケット」とは、ICE分子上の結合サブサイトまたは結合部位部分 をいう。ICE基質のアミノ酸残基は、開裂容易な(scissile)結合(すなわち、プロ テアーゼにより切断される結合)に関するそれらの位置に従って命名される。残 基は、基質の開裂容易な結合からＮ末端側に伸びる残基に対して、P1、P2などと 命名される。残基は、基質の開裂容易な結合からＣ末端側に伸びる残基に対して 、P1'、P2'などと命名される。 基質のP残基またはP'残基に対応するICEインヒビター部分はまた、基質との類 似性によりP1、P1'などと表示される。P1、P1'などと表示されたICE分子の残基 を受ける結合サブサイトは、「S1部位」「P1'結合ポケット」などと称される。S chechter,I.およびA.Berger、「プロテアーゼにおける活性部位の大きさ」、Bio chem ．Biophys．Res．Commun. 、27、157〜162頁(1967)。 ICE活性部位の「PI結合ポケット」は、アミノ酸残基Arg-179、His-237、Gln-2 83およびArg-341により囲まれる空間として定義される。 ICE活性部位の「P2結合ポケット」は、アミノ酸残基Pro-290、Val-338およびT rp-340により囲まれる空間と定義される。 ICE活性部位の「P3結合ポケット」は、アミノ酸残基Pro-177、Arg-178、Thr-1 80、Arg-341およびPro-343により囲まれる空間と定義される。 ICE活性部位の「P4結合ポケット」は、アミノ酸残基Trp-340、His-342、Met-3 45、Val-348、Arg-352、Asp-381およびArg-383により囲まれる空間と定義される 。 ICE活性部位の「P'結合ポケット」はアミノ酸残基Phe-173、Ile-176、His-237 、Gly-238、Ile-239、Cys-244およびHis-248により囲まれる空間と定義される。 用語「２回対称軸を越えるサブユニットP10相互作用」とは、表Ａによる界面 接触の少なくとも50％を有することを意味する。 用語「構造座標」とは、結晶形態におけるICE分子の原子(分散中心)によるＸ 線単色ビームの回折で得られるパターンに関する数式から得られる数学的座標を いう。分散データは、結晶の反復単位の電子密度地図を計算するために使用され る。電子密度地図は、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立するために使 用される。 用語「重原子誘導体」とは、ICEの結晶の化学的に修飾された形態を生成する 方法をいう。実際には、結晶は、結晶を通って拡散し得、そしてタンパク質の表 面に結合し得る重金属原子塩、または有機金属化合物(例えば、塩化鉛、チオマ レイン酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニル)を含有する溶液中に浸される。 結合した重金属原子(単数または複数)の位置(単数または複数)は、浸漬した結晶 のＸ線回折分析により決定され得る。次に、この情報を用いて、酵素の３次元構 造を構築するために使用される位相情報が作成される。Blundel,T.L.およびN.L. Johnson、Protein Crystallography、Academic Press(1976)。 Ｘ線結晶学により決定された構造座標のセットは標準誤差を有することが当業 者に理解される。本発明の目的のために、骨格原子を用いて表Ｂに列挙した構造 座標に重ね合わせた場合に、0.75Å未満のタンパク質骨格原子(Ｎ、Ｃα、Ｃお よびＯ)の二乗平均平方根偏差を有するICEまたはICEホモログまたはICE変異体の 構造座標の任意のセットは、同一であると考えられるべきである。 用語「単位格子」とは、基本的な平行六面体形のブロックをいう。結晶の全容 積はこのようなブロックの規則的な組立により構築され得る。各単位格子はパタ ーンの単位の完全な表示からなり、この反復により結晶が構築される。 用語「空間群」とは、結晶の対称要素の配置をいう。 用語「分子置換」とは、観察された未知結晶の回折パターンを説明するのに最 適なように、未知結晶の単位格子内で、その構造座標(例えば、表ＢのICE座標) が公知である分子を方向付けし、そして位置付けすることにより、その構造座標 が知られていないICE結晶の仮のモデルを作製する工程を包含する方法をいう。 次いで、位相がこのモデルから算定され、そして観察された振幅と合成して、そ の座標が知られていない構造の近似フーリエ合成を得る。これは、次に任意のい くつかの形態の精製品に供され、最終的な正確な未知結晶の構造を提供し得る。 Lattman,E.、「回転関数および変換関数の使用」、Methods in Enzymology、115 、55-77頁(1985)；M.G.Rossman編、「分子置換方法」、Int ．Sci．Rev．Ser.、 第13号、Gordon & Breach、New York、(1972)。本発明により提供されるICEの構 造座標を用いて、分子置換を使用して、ICEの結晶的変異体またはホモログある いはICEの異なる結晶構造の構造座標を決定し得る。 発明の詳細な説明 本明細書に記載される本発明が、より十分に理解され得るために、以下の詳細 な説明を記載する。 本発明は、結晶化インターロイキン-１β変換酵素(「ICE」)、Ｘ-線結晶学に より決定されるICEの構造、ICE相同体および他の結晶形態のICEの構造を解析す るためのその構造の使用、ICEの変異体および共複合体、ならびにICEのインヒビ ターを設計するためのICEの構造の使用およびその相同体、変異体、および共複 合体の使用、に関する。 Ａ．ICE の構造 本発明は、ヒトICEの結晶およびそれから決定されるICEの構造を初めて提供す る。この結晶は、ポリエチレングリコール溶液からテトラペプチドインヒビター の存在下で形成された（grown）。結晶は、正方晶系の空間群対称P4₃2₁2を有す る。この結晶の単位格子は、直交空間a=b=65±５Åおよびc=162±５Åの大きさ を有する。結晶化ICEのＸ線結晶学で決定されたように、ICEの構造座標を表Ｂに 挙げる。 結晶パッキングは、ICEが(p20)₂/(p10)₂テトラマーであることを示す。テトラ マーでは、２つのp20サブユニットが２つの隣接したp10サブユニットに接し、結 晶学的２回対称軸を横切って相互作用する（図２）。この軸は溶液中のオリゴマ ー界面に対応する。ダイマー-ダイマー界面の大部分は、p20の残基291-297およ びp10の残基318-322および386-396からなる。 図１は、p20/p10 ICEヘテロダイマーのリボンによる描画を示す。図に示され るように、p20およびp10サブユニットは密に結合しており、そして活性部位は図 の上部、およそ、示した側鎖のクラスターの中央である。 酵素コアは、６鎖のβシートであり、５つは平行鎖（１、２、３、４、および ７と番号を付す）であり、１鎖は逆平行鎖（８と番号を付す）である。６つのα ヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦで示す）は、β鎖に対して、およそ 平行に位置する。p20の最後の７残基およびp10の最初の７残基は、このコンパク ト構造からはみ出しており、そして２つの逆平行β鎖[５（残基291-297）]およ び６（残基317-323）］を形成する。数個の重要な残基をICEのp45アミノ酸配列 においてそれらの位置に従って標識する（Thornberry ら、上述）。 ICEの構造に関する本発明者らの見解により、酵素の活性部位、および補助的 結合部位の同定が、初めて可能になった。あるICE分子由来のp10サブユニットは 、別の分子由来のp20サブユニットに接触し、そしてともに活性部位を作製する 。活性部位はp20サブユニットおよびp10サブユニットの両方にわたり、両方のサ ブユニット由来のアミノ酸残基を含有する。活性部位部分は、少なくともアミノ 酸残基 を特徴とする（Thornberry ら、上述（配列番号１）に従う配列番号づけを用いる ）。 補助的結合部位は、２回対称軸を横切って相互作用するp10サブユニット上の アミノ酸残基により形成される。補助的結合部位部分は、少なくともアミノ酸残 基 を特徴とする（Thornberry ら、上述（配列番号１）に従う配列番号づけを用いる ）。 Ｂ．ICEの構造座標の使用 本発明は、化学的実体および化合物を設計、選択および合成する分子設計技術 の使用を初めて可能にする。化学的実体および化合物には、ICEの活性部位また は補助的結合部位の全てまたは一部分に結合し得る阻害性化合物を含む。 本発明により可能なアプローチの際に、酵素に結合する化合物を設計し、そし て種々の方法において化合物の物理的特性（例えば、可溶性）を改変するために 、ICEの構造座標が使用される。例えば、本発明は、ICEの活性部位の全てまたは 一部分に結合することにより、ICE酵素の競合インヒビターとして作用する化合 物の設計を可能にする。本発明はまた、ICE酵素の不競合インヒビターとして作 用する化合物の設計を可能にする。これらのインヒビターは、基質に既に結合し たICEの補助的結合部位の全てまたは一部分に結合し得、そしてICE活性部位に対 してのみ競合する公知の競合インヒビターよりも強力であり、かつより非特異的 であり得る。同様に、ICEに結合して阻害する非競合性インヒビターは、別の化 学的実体に結合してもしなくても、本発明の構造座標を用いて設計され得る。 第二の設計アプローチは、候補ICEインヒビターと酵素との間の相互作用のた めの最適部位を決定するために、ICE結晶を種々の化学的実体からなる分子でプ ローブすることである。例えば、溶媒で飽和された結晶から回収された高分解能 のＸ線回折データは、各型の溶媒分子の位置の決定を可能にする。次いで、これ らの部位に強く結合する小さな分子が設計され得、そして合成され得、そしてIC Eインヒビター活性について試験され得る。Travis，J.，Science，262，1374頁 （1993）。 本発明はまた、基質またはICEに結合する他の化合物のICEとの化学反応におい て、寿命の短い反応中間体に異性化し得る化合物の開発を可能にする。従って、 他の分子との相互作用の間、ICEにおける構造変化の時間依存的解析が可能にな る。ICEの反応中間体はまた、ICEとの共複合体における反応産物から推定され得 る。このような情報は、公知のICEインヒビターの改良アナログの設計、またはI CE酵素およびICEインヒビター共複合体の反応中間体に基づく、新規なクラスの インヒビターの設計に有用である。このことは、高い特異性および高い安定性の 両方を有するICEインヒビターを設計するための新規な手段を提供する。 本発明により可能となり、容易となる別のアプローチは、小分子データベース を、ICE酵素に、全体的にまたは部分的に、結合し得る化学的実体または化合物 について、コンピューターでスクリーニングすることである。このスクリーニン グにおいて、結合部位に対するこのような実体または化合物の適合の特性は、形 状相補性または見積られた相互作用エネルギーのいずれかによって判断され得る 。Meng,E.C.ら、J.Comp.Chem.，13，505-524頁（1992）。 ICEが、１つより多くの結晶形態で結晶化され得るので、本発明により提供さ れるようなICEの構造座標またはその部分は、ICEのそれらの他の結晶形態の構造 を解析するために特に有用である。ICEの構造座標またはその部分はまた、ICE変 異体の構造、ICE共複合体の構造、またはICEの任意の機能ドメインに有意に相同 なアミノ酸配列を有する任意の他のタンパク質の結晶形態の構造を解析するため にもまた使用され得る。 この目的に用いられ得る１つの方法は、分子置換である。この方法では、未知 の結晶構造が、ICEの別の形態、ICE変異体、またはICE共複合体、またはICEの任 意の機能ドメインに有意に相同なアミノ酸配列を有する任意の他のタンパク質の 結晶形態であるかどうかを、表Ｂに提供するような本発明のICEの構造座標を用 いて、決定し得る。この方法は、未知の結晶についての正確な構造形態を、この ような情報を最初から決定しようとするよりも、より迅速におよび効率よく提供 する。 さらに、本発明によれば、ICE変異体は、公知のICEインヒビターとの共複合体 で結晶化され得る。次いで、このような複合体の一連の結晶構造は、分子置換に よって解析され得、そして野生型ICEの結晶構造と比較され得る。従って、酵素 の種々の結合部位内における改変の有力な部位が、同定され得る。この情報は、 ICEと化学的実体または化合物との間の最も有効な結合相互作用（例えば、増加 した疎水性相互作用）を決定する更なる手段を提供する。 上記に言及した全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を用いて研究し得、そし lecular Simulations，Inc.により配布））を用いて、2〜3Å分解能Ｘ線データ を対照に約0.20以下のＲ値に精密化し得る。例えば、Blundel & Jhonson、上述 ；Methods in Enzymology、第114および115巻、H.W.Wycoffら編、Academic Pres s(1985)。従って、この情報は公知のクラスのICEインヒビターを最適化するため に使用され得、さらに重要なことに、新規なクラスのICEインヒビターを設計し 、そして合成するために使用され得る。 本発明で提供されるICE変異体の構造座標はまた、機能、構造、あるいはその 両方においてICEに類似の関連タンパク質または酵素の同定を容易にする。それ によって、IL-1介在性疾患を処置または防止するための新規な治療様式をさらに 導く。 本発明のICEに結合または阻害する化合物の設計には、一般に、２つの要素を 考慮する必要がある。第一に、化合物は、物理的におよび構造的にICEに結合し 得なくてはならない。ICEのその基質との結合に重要な非共有結合分子間相互作 用には、水素結合、ファンデルワールス力、および疎水性相互作用が挙げられる 。 第二に、化合物は、ICEとの結合を可能にするコンホメーションを想定し得な ければならない。化合物の特定の部分は、このICEとの結合に直接的には関与し ないが、それらの部分は、それでも分子のコンホメーション全体にわたって影響 し得る。このことはまた、有効性に顕著な影響を及ぼす。このようなコンホメー ションの必要条件としては、全てのまたは一部の結合部位（例えば、ICEの活性 部位または補助的結合部位）に関する化学的実体あるいは化合物の三次元構造お よび配向全体、またはICEと直接相互作用するいくらかの化学的実体を含む化合 物の官能基間の間隔が挙げられる。 ICEに対する化学化合物の潜在的阻害効果または結合効果は、それが実際に合 成される前に分析され得、そしてコンピューターモデリング技術を使用して、試 験され得る。所定の化合物の理論的構造が、その化合物とICEとの間に不十分な 相互作用および結合があることを示唆する場合、その化合物の合成および試験は 回避される。しかし、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すならば、 分子は合成され得、そしてThornberryら（上述）の蛍光基質アッセイを用いて、 ICEに結合する能力および阻害する能力について試験され得る。この方法では、 効力のない化合物の合成を回避し得る。 ICEの阻害性化合物またはICEの他の結合化合物は、コンピューターで評価され 得、そして化学的実体またはフラグメントが、ICEの個々の結合ポケットまたは 他の領域と結合するそれらの能力についてスクリーニングおよび選択される一連 の工程の手段によって設計され得る。 当業者は、化学的実体またはフラグメントを、ICE、より詳細にはICEの活性部 位または補助的結合部位の個々の結合ポケットと結合するそれらの能力について スクリーニングするいくつかの方法の１つを用い得る。このプロセスは、例えば 、表ＢのICE座標に基づくコンピュータースクリーニングの際に、活性部位の視 覚的検討によって開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学的 実体は、種々の配向で位置づけられ得、または上記で規定したICEの個々の結合 ポケットに連結され得る。連結は、QuantaおよびSybylのようなソフトウエアを 用いて達成され得、その後標準的な分子機構力場(molecular mechanics forcefi eld)(例えば、CHARMM、AMBER)を用いて、エネルギーの最小化および分子動力学 を行う。 専門化されたコンピュータープログラムはまた、フラグメントまたは化学的実 体を選択するプロセスを補助し得る。これらのプログラムには、以下が挙げられ る： 一旦、適切な化学的実体またはフラグメントが選択されると、化学的実体また はフラグメントは、単一の化合物またはインヒビターに組み立てられ得る。組立 はICEの構造座標に関してコンピュータースクリーン上で示される３次元画像で の、フラグメントの相互関係の視覚的検討により、プロセスされ得る。この後、 QusntaまたはSybylのようなソフトウエアを用いて、マニュアルによるモデル構 築を行う。 個々の化学的実体またはフラグメントを接触させるにおいて、当業者を補助し 得る有用なプログラムには、以下が挙げられる。 上記のように、一度に１つのフラグメントまたは化学的実体から段階様式でIC Eインヒビターを構築する代わりに、阻害化合物または他のICE結合化合物は、空 の活性部位（または、必要に応じて公知のインヒビターのいくつかの部分を含む ）を用いて全体的にまたは「新しく（de novo）」設計され得る。これらの方法 には、以下が挙げられる： 他の分子モデリング技術がまた、本発明について使用され得る。例えば、Cohe n，N.C.ら、「Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemi stry，J.Med.Chem.，33，883-894頁（1990）を参照のこと。また、Navia，M.A. およびM.A.Murcko，「The Use of Structural Information in Drug Design」， Current Opinions in Structural Biology，2，202-210頁（1992）も参照のこと 。 一旦、化合物が上記の方法によって設計または選択されると、化合物がICEに 結合し得る有効性は、コンピューター評価によって試験され得、そして最適化さ れ得る。例えば、ICEインヒビターとして機能するように設計または選択された 化合物は、天然の基質に結合する場合に、活性部位により占有される容量に重複 しない容量を好ましくは検討（traverse）すべきである。有効なICEインヒビー は、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間のエネルギー（すなわち、小さ な結合のひずみ力において、比較的小さな相違を示すべきである。従って、最も 有効なICEインヒビターは、約10kcal/molを超えない、好ましくは約７kcal/mol を超えない結合のひずみ力を伴って設計されるべきである。ICEインヒビターは 、全体にわたる結合エネルギーが類似の１より多いコンホメーションで、酵素と 交互作用し得る。それらの場合、結合のひずみ力は、遊離化合物のエネルギーと インヒビターが酵素に結合する場合に観察されるコンホメーションの平均エネル ギーとの間の相違になる。 ICEに結合するように設計または選択された化合物は、その結合状態において 、好ましくは標的酵素との反発する静電相互作用を有さないようにコンピュータ ーにより最適化される。このような非相補的(例えば、静電気)相互作用として、 反発する、荷電−荷電相互作用、双極子−双極子相互作用、および荷電−双極子 相互作用が挙げられる。具体的には、インヒビターがICEに結合した場合のイン ヒビターと酵素との間の全ての静電気相互作用を総合すると、好ましくは結合の エ ンタルピーに対して中立的または好適な貢献がなされる。 化合物のひずみ力および静電相互作用を評価する特定のコンピューターソフト が当該分野で利用可能である。このような用途のために設計されたプログラムの 例として、：Gaussian 92、改訂版Ｃ［M.J.Frisch、Gaussian、Inc.、Pittsburg aphics 汎用コンピューターIRIS 4D/35またはIBM RISC/6000 汎用コンピュータ ーモデル550を用いて実行され得る。他のハードウェアおよびソフトウェアのパ ッケージは当業者に公知である。 一旦、ICE結合化合物が上記のように最適に選択または設計されると、次にそ の結合特性を改善または改変するためにその化合物の原子または側基のいくつか において置換が作製される。一般に、最初の置換は保存的である。すなわち置換 基は元の基とほぼ同じサイズ、形状、疎水性および荷電を有する。勿論、当該分 野でコンホメーションを変えることが公知の化合物は避けるべきであることが理 解されるべきである。このように置換された化学的化合物は、次いで上記の詳細 に説明されたコンピューター法と同一の方法により、ICEに適合する効力につい て分析される。 Ｃ．ICEの変異体 本発明はまた、ICEの変異体を可能にし、そしてそれらの結晶構造の解明を可 能にする。より詳細には、本発明によって、ICEの結晶構造に基づくICEの活性部 位、補助的結合部位および界面の位置により、変異のための所望の部位の同定が 可能となる。 例えば、変異は、野生型ICEの部位、すなわち補助的結合部位または活性部位 のみのうちの特定の部位または組合わせを指向し得る。あるいは、界面部位上の 位置が変異誘発のために選択される。同様に、酵素表面上または近傍の位置のみ が置換され、野生型酵素と比較して１以上の荷電単位の表面荷電の変化が生じ得 る。あるいは、ICEのアミノ酸残基は、その親水性または疎水性の特徴に基づい て選択され得る。 このような変異体は、野生型ICEと比較したいくつかの異なる特性のいずれか により特徴付けられる。例えば、このような変異体は、１以上の荷電単位の表面 荷電の変化を有し得るか、またはサブユニット解離に対する安定性の増加を有し 得る。あるいは、このような変異体は、野生型ICEと比較して基質特異性の変化 を有し得るか、あるいは野生型ICEよりも高い比活性を有し得る。 本発明により調製されるICE変異体は、多くの方法により調製され得る。例え ば、ICEの野生型配列は、本発明を用いて変異に望ましいと同定された部位にお いて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発または他の従来の技術(例えば、欠失) 手段により変異され得る。あるいは、ICEの変異体は、特定のアミノ酸の、天然 に存在しないアミノ酸での部位特異的置換により作製され得る。さらに、ICE変 異体は、アミノ酸残基、すなわち特定のシステインまたはメチオニン残基の、セ レノシステインまたはセレノメチオニンとの置換により作製され得る。これは、 天然システインまたはメチオニンのいずれか(あるいは両方)を涸渇させたがセレ ノシステインまたはセレノメチオニン(あるいは両方)を富化した増殖培地上で、 野生型ポリペプチドまたは変異体ポリペプチドのいずれかを発現し得る宿主生物 を増殖させることにより達成され得る。 変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて、ICEをコードするDNA配列中に導入 され得る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に隣接するヌクレオチ ド配列を含む。変異は、ICE(p45)の完全長DNA配列、あるいはp30、またはp20、 またはp10ポリペプチドをコードする任意の配列中に作製され得る。 本発明に従って、上記方法または当該分野で公知の代替方法により産生される 変異ICE DNA配列は、発現ベクターを用いて発現され得る。当該分野で周知であ るように、発現ベクターは、典型的には宿主ゲノムから独立した宿主細胞中での 自己複製を可能にするエレメント、および選択目的のための１つ以上の表現型マ ーカーを含む。所望のICE変異体コード配列を囲むDNA配列の挿入の前または後に 、発現ベクターはまた、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻 訳開始シグナル、および必要に応じてリプレッサー遺伝子または種々のアクチベ ー ター遺伝子ならびに終止シグナルをコードする制御配列を含む。いくつかの実施 態様において、産生された変異体の分泌が所望される場合、「シグナル配列」を コードするヌクレオチドがICE変異体コード配列の前に挿入され得る。制御配列 の制御下での発現のためには、所望のDNA配列は、制御配列に作動可能に連結さ れなければならない。すなわち、ICE変異体をコードし、かつ制御配列の制御下 のこの配列の発現およびこのICE配列によりコードされる所望の産物の産生を可 能にする適切なリーディングフレームを維持するDNA配列の前に適切な開始シグ ナルを有さなければならない。 広範な周知の利用可能な発現ベクターは、いずれも本発明の変異されたICEコ ード配列を発現するのに有用である。 これらは、例えば、SV40の種々の公知の誘導体、公知の細菌プラスミド(例え ば、col E1、pCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体を包含するE.coli由来の プラスミド)、より広い宿主域のプラスミド(例えば、RP4、ファージDNA(例えば 、多くのファージλの誘導体(例えば、NM989)および他のDNAファージ(例えば、M 13および繊維状１本鎖DNAファージ))、２μプラスミドまたはそれらの誘導体の ような酵母プラスミドならびにプラスミドおよびファージDNAの組合わせから得 られるベクター(例えば、ファージDNAまたは他の発現コントロール配列を利用す るために改変されているプラスミド)のような、染色体DNA配列、非染色体DNA配 列および合成DNA配列のセグメントからなるベクターを包含する。本発明の好適 な実施態様において、本発明者らはE.coliベクターを利用する。 さらに、DNA配列に作動可能に連結した場合、その発現を制御する、任意の広 範な発現制御配列が、本発明による変異されたDNA配列を発現するためにこれら のベクター中で使用される。このような有用な発現制御配列として、例えば、動 物細胞用のSV40の初期プロモーターおよび後期プロモーター、lac系、trp系、TA C系またはTRC系、fdコートタンパク質のλファージ制御領域の主要なオペレータ ー領域およびプロモーター領域(すべてE.coli用)、3-ホスホグリセレートキナー ゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター( 例えば、Pho5)、酵母用酵母α-交配因子のプロモーター、ならびに原核生物細胞 または真核生物細胞あるいはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが 公知である他の配列およびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明の好適な実 施態様において、本発明者らは、E.coli発現またはサル腎臓細胞株であるCOS-1 における真核生物発現のいずれかを利用する。 広範な種の宿主がまた、本発明による変異ICEの産生に有用である。これらの 宿主として、例えば、E.coli、BacillusおよびStreptomycesのような細菌、酵母 のような真菌、CHO細胞およびCOS-1細胞のような動物細胞、植物細胞およびトラ ンスジェニック宿主細胞が挙げられる。好適な実施態様において、宿主細胞はE. coli またはCOS-１細胞である。 すべての発現ベクターおよび発現系が、本発明の変異DNA配列を発現し、そし て改変ICEまたはICE変異体を産生するのに、同じ様式で機能するとは限らないこ とが理解されるべきである。全ての宿主が同一の発現系を用いて等しく良好に機 能するわけではない。しかし、当業者は、実験を行うことなくそして本発明の範 囲を逸脱することなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主から選択し 得る。例えば、ベクターの選択の際に重要な考慮事項は、所定の宿主におけるベ クターの複製能力である。ベクターのコピー数、コピー数の制御能力、および抗 生物質マーカーのようなベクターによりコードされる他のいずれかのタンパク質 の発現もまた考慮されねばならない。 発現制御配列の選択の際、種々の要因がまた考慮されるべきである。これらは 、例えば、系の相対的強度、その制御能力、本発明の改変ICEをコードするDNA配 列との適合性、特に潜在的二次構造に関する適合性がまた考慮されるべきである 。 宿主は、選択されたベクターとの適合性、宿主に対する改変ICEの毒性、成熟 産物を分泌する能力、タンパク質を適切に折り畳む能力およびテトラマーを形成 する能力、発酵要求性、宿主からの改変ICEの精製の容易さおよび安全性の考察 により選択されるべきである。これらのパラメーター内で、当業者は有用な量の 変異ICEを産生し得る、種々のベクター/発現制御系/宿主の組合わせを選択し得 る。 これらの系で産生される変異ICEは、野生型ICEを精製するために使用される工 程およびストラテジーを包含する種々の従来の工程およびストラテジーにより精 製され得る。 一旦、ICE変異が所望の位置(すなわち、活性部位または補助的結合部位)で作 製されると、変異体は、目的のいくつかの特性のいずれかについて試験され得る 。 例えば、変異体は、生理学的pHにおける荷電の変化についてスクリーニングさ れ得る。これは野生型親の等電点(pI)と比較した変異ICEの等電点を測定するこ とにより決定される。等電点は、Wellner,D.、Analyt ．Chem.、43、597頁(1971) の方法によるゲル電気泳動により測定される。表面荷電が変化した変異体は、本 発明の構造情報により提供されるように、酵素の表面に位置する置換アミノ酸お よび変化したpIを有するICEポリペプチドである。 さらに、変異体は、野生型ICEと比較して高い比活性についてスクリーニング され得る。変異体は、Pennington & Thornberry、前出のアッセイを用いて、基 質Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-アミノメチルクマリンの加水分解の二次速度定数(K_cat/K_m )が、25℃で７×10⁴Ｍ^-1s^-1より高い場合、高い比活性を示す。 変異体は、Thornberry ら、前出に記載のように、蛍光発生ペプチド基質または 非修飾ICEペプチド基質の加水分解を測定することにより、ICE基質特異性の変化 について試験される。基質特異性の変化した酵素は、基質X₁-Tyr-Val-Ala-X₂-X₃ についての二次速度定数(k_cat/K_m)が類似のペプチド基質X₁-Tyr-Val-Ala-Asp-X₃ についての(k_cat/K_m)よりも高い酵素である。X₁は、アセチルのようなアミノ保 護基であり；X₂は、Ｌ-アスパラギン酸塩以外の天然または非天然のアミノ酸残 基であり；X₃は、アミノメチルクマリンまたはp-ニトロアニリンのようなカルボ キシル保護基である。 さらなる目的の特性はまた、サブユニット解離に対する安定性の上昇した変異 体を包含する。サブユニット解離に対する安定性が上昇したICE変異体は、１〜1 0nMの間のKdを示す野生型ICEと比較して、10nMより低い酵素の濃度において酵素 活性の喪失を示さない。 本明細書中で記載される発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が 記載される。これらの実施例は例示の目的のみのためであって、そしていかなる 方法においても本発明を限定するものとは考えられないことは言うまでもない。 実施例１ ICE の結晶構造 活性ヒトICEのp30前駆体(p45のAsn 120からHis 404までの残基(Thornberryら 、前出))をコードするcDNAを、P_Lプロモーター発現ベクター(Dr.J.Mankovichに より提供された)にクローン化し、温度変化の誘発によりE.coliで発現させた。 P_Lプロモーターの前誘発抑制を、E.coli宿主JM109中での共レジデント(co-res ident)の適合プラスミド(pACYC184cI)上のcIリプレッサー遺伝子の同時発現によ って達成した。Yanish-Perron、Ｃ.ら、Gene、33、pp.103-199(1985;ATCC #5332 3)。プロモーターを28℃から42℃に温度を上げることで誘発し、この時点で、温 度感受性cIリプレッサー遺伝子生産物が変性し、そしてP_Lプロモーターにより指 示されて、遺伝子発現が開始する。さらに４時間、42℃で温度を維持することで 、結果として不活性ICE p30前駆生産物が、宿主細胞質中に、不活性封入小体の 形で、高レベルで蓄積された。 細胞を機械的に破壊し、そして不溶性画分を取り出した後、封入小体を、2M尿 素、25mMトリス、0.5mM DTT、0.1mM EDTAおよび0.1mM PMSF(pH7.5)中で４℃で懸 濁して洗浄し、続いて遠心分離した。その封入小体を、7M尿素を含む上記緩衝液 で可溶化し、遠心分離し、そして同じ緩衝液中でサイズ排除クロマトグラフィー に供した。SDS-PAGEおよびＮ末端配列分析により同定したp30画分を、プールし 、カラム緩衝液を用いて0.3mg/mlに希釈した。この後、尿素の濃度が20mM未満に なるまで、４℃で25mMトリスおよび１mM DTT(pH7.5)に対して透析を行い、それ によって酵素を再生させる。 タンパク質を、４℃で限外濾過することで３〜５mg/mlに濃縮し、続いて室温 でのインキュベーションを行う。p30前駆体が消滅し、同時にp20およびp10サブ ユニットが出現することが、SDS-PAGEによってモニターされ、これは酵素の自己 触媒プロセシングが起こっている証拠である。ICE酵素活性を、37℃でのスクシ ニル-Tyr-Val-Ala-Asp-p-ニトロアニリド基質の加水分解によってアッセイし、 これは、サブユニットへの変換と密接に相関した。 自己プロセシングICEを、２倍モル過剰のテトラペプチドアルデヒドインヒビ ター(アセチル-Tyr-Val-Ala-Asp-H)を加えることにより、十分に阻害した。タン パク質-インヒビター複合体試料を濃縮し、結晶化実験のための最終調製におい て、サイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。 インヒビターとの複合体中のICEの結晶を、蒸気拡散により成長させた。Davie s、D.R.およびD.M Segal、Meth.Enzymol.、22、p.266(1971)。タンパク質(50mM クエン酸塩、2.0mM DTT、(pH6.5)中20mg/ml)を等量の貯蔵(reservoir)緩衝液(15 %(w/v)PEG 4K、400mM LiSO₄、200mM Hepesナトリウム、5mMカコジル酸ナトリウ ム、0.5% β-オクチルグルコシド(pH7.0))と混ぜ、貯蔵溶液を４℃で静置させた 。結晶は６週間にわたって成長して正八面体(tetragonal bipyramids)を形成し 、そしてこれらを、データ収集または重原子誘導体化の前に18% PEG 4K、400mM LiSO₄、200mM Hepesナトリウム、5mMカコジナル酸ナトリウム、0.5% β-オクチ ルグルコシド(pH7.0)で平衡化した。 当業者は、上述の結晶化条件は変化させ得ることを認める。このような変化は 単独または組み合わせで用いられ得、そして５mg/mlと35mg/mlの間の最終タンパ ク質／インヒビター複合体濃度；ICE／インヒビターと沈澱剤との比のすべての 組み合わせ；１mMと200mMとの間のクエン酸塩濃度；０mMと10mMとの間のDTT濃度 ；β-メルカプトエタノールの任意の濃度；5.5と9.5との間のpH範囲；10％と25 ％(ｇ/100ml)との間のPEG濃度；2000と8000との間のPEG分子量；50mMと750mMと の間のLiSO₄濃度；５mMと395mMとの間のHEPES濃度；および任意の濃度またはタ イプの界面活性剤；-5℃と30℃との間の任意の温度；およびこれらの条件または その変化を用いるバッチ、リキッドブリッジ(liquid bridge)または透析法によ るICE／インヒビター複合体の結晶化を包含する。 すべてのＸ線データセットを、最終モデルの精密化のために用いられる2.2Å Synchrotronデータセットを除いて、R軸 IIC イメージプレートシステムに集め た。このデータを、荷電結合素子のCornell High Energy Synchrotron Source（ "CHESS"）に集め、DENZO Software Package（DENZO-An Oscillation Data Pro th、Yale University）を用いて構造因子振幅に換算(reduce)した。振動写真を 、メーカーより供給されるソフトウェア(Molecular Structures Corp.、Dallas 、Texas)を用いて積分し、構造因子振幅に換算した。 精密化された重原子パラメーターを、多重同形置換位相を計算するのに用いた 。 交差位相差フーリエ地図(cross-phased difference Fourier maps)にHg誘導体に 対する異常データを含むことは、その鏡像体よりもむしろP4₃2₁2である空間群を 示した。平均効果尺度(FOM)は、Hg誘導体の異常データを含めて、0.65〜3.5Å分 解能であった(表１)。 溶媒平滑化および位相拡張(CCP4-Collaborative Computing Project No.4、A Suite of Programs for Protein Crystallography；Daresbury Laboratory、War rington、WA4 4AD、U.K.(1979))は、マップを改良し、タンパク質コア中のいく つかの残基の同定を可能にした。モデル設計(Quanta、version 4.0b、Molecular Simulations Inc.、Burlington MA)、位置精密化(Brunger、A.T.、J.Acta Crys t. 、A46、pp.46-57(1990)；Brunger、A.T.ら、J.Acta Cryst.、A46、pp.585-93( 1990))、および位相組合せ(CCP4-Collaborative Computing Project、前出)のサ イクルを、モデルから計算される位相への切り替えがなされるまで行う。精密化 は-16℃、2.2Åのデータに対して続け(表１)、これによりタンパク質のより難解 なループ領域を構築が可能となった。 下表は、本発明に従ってICEの構成を決定するのに用いたICE誘導体のＸ線結晶 学データセットを要約する。 定義：R-マージは、反復強度測定間の、括弧内に示すデータセットに用いた結晶 の数との一致を示す。重原子結合部位の数を適切な場所に示す。R_cは、中心対称 性反射に対するCullis Ｒ因子であり、そして位相寄与率は、位相トライアング ルの平均閉鎖欠損に対する平均重原子散乱の比率である。Blundell、T.L.および Johnson、L.N.、Protein Crystallography、Academic Press、New York(1976)。 本発明に従ったICEテトラマーモデルは、７Åと2.2Åとの間の分解能で全ての 観測データに対して19%のＲ因子を有し、理想結合長さおよび結合角からの二乗 平均平方根偏差は、それぞれ0.011Åおよび2.84Åである。 実施例２ ICE の活性部位の確認 テトラマーICE分子中の活性部位の位置の確認するために、ICEの構造座標から 推定されるように、一連のp30 ICE変異体を生成した。 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を、単鎖DNAのウラシル富化(enrichment) を用いて、pcDNA3(Invitrogen)構築物で行った。Kunkel、T.A.、Proc.Nat.Acad. Sci. 、82、pp.488-492(1985)；Kunkel、T.A.ら、Meth.Enzymol.、154、pp.367-3 82(1987)。これは、M13変異誘発について元来説明された方法の変法である。Zol ler、M.J.およびM.Smith、Nucleic Acid Res.、10、pp.6487-6500(1983)；Zolle r、M.J.およびM.Smith、Meth.Enzymol.、100、pp.468-500(1983)。 変異誘発を、Muta-Gene Kit(BioRad)で提供される試薬を用いて行った。変異 誘発プライマーを、(+)コーディング配向で合成した。dut^-ung^- E.coliCJ326株 を、単鎖DNAのウラシル富化のために用い、MV1190株を伸長連結反応後のヘテロ 二重鎖DNAの選択のために用いた。全てのオリゴヌクレオチドを、applied Biosy stems 380DNAシンセサイザーで合成し、ポリアクリルアミド-尿素スラブゲル中 の電気泳動により精製した。30KDa ICE-コード化cDNA中で作製された変異を、ジ デオキシ法により、コード領域で完全に配列決定した。Sanger F.ら、Proc.Nat. Acad.Sci. 74、pp.5463-5467(1977)。COS-1細胞トランスフェクション、あるいはE.coli トランスフェクションの準備のため、変異DNAを、トランスフェクション の前にアルカリ溶菌およびセシウムグラジエント遠心分離により精製した。 各々の変異cDNAを、COS-1細胞株にトランスフェクトし、次いでインビトロでp IL-1βをプロセスする、すなわち成熟IL-1βを分泌する能力について試験した。 用いられるCOS-1細胞株を、MNCスタッファーベクター(B.Seed、Harverd Medical School)にクローン化したpIL-1βコード化cDNAで、あらかじめトランスフェク トした。そのスタッファーベクターは、続いて染色体への組み込みを生じた。pI L-1β生産を、培養培地に0.5mg/mlのG-418硫酸塩を添加することて維持した。 100mmの組織培養プレート中の約３×10⁶個のCOS-1細胞を、15μgのそれぞれの プラスミドでトランスフェクトした。DNAを200μlのDEAE-デキストランと混合し 、リン酸緩衝生理食塩水で４mlとし、プレートに加えた。細胞を37℃で30分間イ ンキュベートした。８mlの80μMクロロキン／無血清DMEM溶液を添加し、細胞を2 .5時間インキュベートした。この溶液を吸引し、細胞を10％DMSO／無血清DMEMで ２分間処理した。無血清培地で洗浄後、10mlの完全培地を添加した。馴化培地を 16時間および24時間でサンプリングした。このアッセイでの活性は、突然変異体 の転写、翻訳およびタンパク質の畳み込みの形成が停止されないことを要求する 。細胞溶解産物中に存在する変異ICEの量を、ウエスタンブロットにより抗p20ウ サギ抗血清を用いて決定した。この血清は136位〜150位(136および150を含む)の アミノ酸を認識し、また完全なp30前駆体も認識する。 細胞培地中の成熟IL-1βは、ELISA(R&D Systems)により検出した。試料を希釈 し、濃度をELISAアッセイのリニアレンジ(8〜60pg/ml)に達するようにした。バ ックグラウンドのIL-1βレベルを、ICE cDNAを欠く発現ベクターでトランスフェ クトした細胞中で決定し、この値を全ての他の濃度から差し引いた。％活性値を 、変異ICEでトランスフェクトした細胞から分泌されたIL-1βを野生型ICEでトラ ンスフェクトした細胞から分泌されたIL-1βで割った比として計算した。最終比 は、少なくとも２つの実験の平均である。これらのデータを図３に記録する。 これらのデータに基づいて、Cys-285またはHis-237の変異が、pIL-1βプロセ シング活性および自己プロセシングを失わせることが決定された。Pl AspをGlu に接触させるArg-179の変異もまた、活性を失わせる。基質のP'側鎖に接触し得 るCys-244のAlaへの変異は、酵素活性を著しく減少させる。対照的に、Cys-285 に近位の他の残基(Ser-332、-333、または-339およびHis-249を包含する)の変異 は、活性を失わせない。したがって、発明者らは、ICEの活性部位での種々の残 基の重要性を確認した。 実施例３ 未知のICE結晶構造を解明するための分子置換の使用 分子置換法を用いて、テトラペプチドアルデヒドインヒビターAc-Tyr-Val-Ala -Asp-H(実施例１で調製したように)との複合体中のICEの結晶と比べて、テトラ ペプチドアルデヒドインヒビターAc-Tyr-Val-Pro-Asp-Hとの複合体中のICEの結 晶の構造座標を決定した。テトラペプチドアルデヒドインヒビター、Ac-Tyr-Val -Ala-Asp-H("Ala")との複合体中のICEの結晶に対する条件と同一の条件下でテト ラペプチドアルデヒドインヒビター、Ac-Tyr-Val-Pro-Asp-H("Pro")との複合体 中のICEの結晶を成長させた。 2.8Å分解能のＸ線回析データをICE/Pro共複合体(co-complex)について収集し た。|F_pro-F_Ala|型の回析データ、および触媒を抑制するAla阻害酵素の精密化さ れたモデルから計算される位相とを組合わせた差電子密度地図を用いて、ICE/Pr o共複合体内で起こった構造変化の位置を決めた。 Ala複合体中の局在化された原子が、新しい配位子にスイッチすることで、ど こへ移動されシフトされようとも、負の(negative)特徴がマップにおいて見いだ された。局在化された原子が、構造の中へ導入され、シフトした原子の新しい位 置が示されたとき、正の(positive)特徴が見いだされた。 Ala内のP2結合ポケットに位置するアラニンをPro内のプロリンと置換すること により、ICE共複合体の構造の中へ２つのメチレン基を導入させた。これらの新 しい原子の位置を、結合ポケットP2内のアラニンのβ−炭素付近の正差電子密度 の存在により示した。付近の他の正のピークは、Ala複合体に対してPro複合体に おいて、新しい水分子の結合を示した。インヒビターのP4結合ポケット中に位置 するチロシン部分の近くに、正および負のピークの対が存在した。これらのピー クは、Ala複合体のそれらの位置に対してPro複合体のこれらの原子の位置におけ るシフトを示した。 これらのシフトを、上記の新しい原子を加えて、モデリングし、そして得られ た構造をＸ線データに対して精密化し、ProとICEとの共複合体の最終的な様相を 決定した。Pro複合体についての空間群(p4₃2₁2)および単位格子の大きさ(a=b=65 ±5Å c=162±5Å)は、Ala複合体について観測されたものと同じであった。 本発明により初めて知られたICE構造座標は、上記の方法を用いて、ICEのいか なる変異体、ホモログまたは共複合体の未知の構造をも解明するのに用いられ得 る。この方法は、ICEの活性部位または補助的結合部位での配位子または化学実 体の結合または配向を決定するのに用いられ得る。 本発明者は、本発明の多くの実施態様を記述したが、本発明者の基本実施例は 、変更され得、本発明の生産物およびプロセスを利用する他の実施態様を提供す ることは、明白である。従って、本発明の範囲は、実施例により示した特定の実 施態様よりも、添付の請求の範囲により定義されることが認められる。 このページに続く表Ａおよび表Ｂは、それぞれ本発明のICE分子のテトラマー 界面接触および構造座標を表にする。 1 以下の略語を、表Ｂで用いる。 「原子タイプ」は、座標が測定される元素を指す。欄中の最初の文字は元素を 規定する。 「Ｘ、Ｙ、Ｚ」は、測定された元素の原子位置を、結晶学的に規定する。 「Ｂ」は、原子中心の周りの原子の運動の尺度となる温度要因である。 153〜158(Lys-146)および184〜189(Ser-149)の番号のついた原子を、Ala残基 としてモデリングした。 1487〜1534の番号の付いた、かつ「残基」の欄に「Ald」と示される原子は、 テトラペプチドアルデヒドインヒビターに結合したCys-285である。 表Ｂに従ったICEについての構造座標は、数学的操作によりこのオリジナルセ ットから修正され得る。このような操作としては、以下が挙げられるが、これら に限定されない：生構造座標の結晶学的置換、生構造座標の分数化、一連の生構 造座標への整数の加算または減算、生構造座標の反転、およびそれらの組み合わ せ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリフィス， ジェイムズ ピー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02193， ウェストン，ウッド リッジ サークル 15 (72)発明者 キム， ユーニス イー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01701， フラミンガム，ウォーセスター ロード 1500 (72)発明者 リビングストン， デイビッド ジェイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02160， ニュートンビル，マディソン アベニュー 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．結晶が正方晶系の空間群対称P4₃2₁2を有する、インターロイキン-１β変換 酵素結晶。 ２．前記結晶が直方体形状の単位格子を有し、各単位格子がａ＝ｂ＝65±５Å、 そしてｃ＝162±５Åの大きさを有する、請求項１に記載のインターロイキン-１ β変換酵素結晶。 ３．前記酵素がテトラマーである、請求項１に記載のインターロイキン-１β変 換酵素結晶。 ４．前記テトラマーが、２つのp20サブユニットにより接触する２つの隣接したp 10サブユニットを有し、該p10サブユニットが前記結晶の２回対称軸を横切って 相互作用する、請求項３に記載のインターロイキン-１β変換酵素結晶。 ５．前記酵素が、少なくとも配列番号１のアミノ酸173、176、177、178、179、1 80、236、237、238、239、244、248、283、284、285、290、338、339、340、341 、342、343、344、345、348、352、381および383により特徴付けられる活性部位 部分により特徴付けられる、請求項４に記載のインターロイキン-１β変換酵素 結晶。 ６．前記活性部位部分が、前記p10およびp20サブユニット由来のアミノ酸を有す る、請求項５に記載のインターロイキン-１β変換酵素結晶。 ７．前記酵素が、少なくとも配列番号１のアミノ酸150、151、240、259、267、2 68、274、291、292、293、294、295、296、297、317、318、319、320、321、322 、323、324、325、327、334、335、367、371、374、375、377、378、380、382、 38 4、386、388、389、390、391、392、393、394、395および396により特徴付けら れる補助的結合部位部分により特徴付けられる、請求項４に記載のインターロイ キン-１β変換酵素結晶。 ８．前記補助的結合部位部分が、表Ａによる前記２回対称軸に隣接するアミノ酸 を有する、請求項７に記載のインターロイキン-１β変換酵素結晶。 ９．前記酵素が、表Ｂによる構造座標により特徴付けられる、請求項１〜８のい ずれかに記載のインターロイキン-１β変換酵素結晶。 １０．結晶の重原子誘導体であって、該結晶が、ICEの結晶、ICE変異体の結晶、 ICEホモログの結晶またはICEの共複合体の結晶からなる群より選択される、重原 子誘導体。 １１．前記誘導体が、チメロサール、チオリンゴ酸金、酢酸ウラニルおよび塩化 鉛からなる群より選択される化合物と、前記結晶との反応により形成される、請 求項１０に記載の重原子誘導体。 １２．インターロイキン-１β変換酵素の変異体、ホモログまたは共複合体の結 晶形態を、分子置換により解明するための、インターロイキン-１β変換酵素の 構造座標またはその一部の使用。 １３．インターロイキン-１β変換酵素の活性部位または補助的結合部位との結 合について、化学的実体をコンピューター評価するための、インターロイキン- １β変換酵素の構造座標の使用。 １４．インターロイキン-１β変換酵素の活性部位または補助的結合部位と結合 し得る化合物を設計するための、インターロイキン-１β変換酵素の構造座標の 使用。 １５．前記活性部位または前記補助的結合部位に結合する化学的実体により特徴 付けられる化合物が、インターロイキン-１β変換酵素のインヒビターである、 請求項１３または１４に記載のインターロイキン-１β変換酵素の構造座標の使 用。 １６．前記インヒビターが、インターロイキン-１β変換酵素の非競合的インヒ ビターまたは不競合的インヒビターである、請求項１５に記載の構造座標の使用 。 １７．インターロイキン-１β変換酵素の活性部位または補助的結合部位におけ るリガンドの配向を決定するための、インターロイキン-１β変換酵素の構造座 標の使用。 １８．インターロイキン-１β変換酵素の構造座標の使用あって、該酵素と、ICE 基質またはICEインヒビターである化合物との間の化学反応における中間体を同 定するための、構造座標の使用。 １９．前記構造座標が表Ｂによる、請求項１２〜１４または１７〜１８のいずれ かに記載の、インターロイキン-１β変換酵素の構造座標の使用。 ２０．前記構造座標が表Ｂによる、請求項１５に記載のインターロイキン-１β の構造座標の使用。 ２１．前記構造座標が表Ｂによる、請求項１６に記載のインターロイキン-１β の構造座標の使用。 ２２．活性部位または補助的結合部位中の１つ以上のアミノ酸が、天然に存在す るアミノ酸、非天然アミノ酸、セレノシステインおよびセレノメチオニンからな る群より選択される１つ以上のアミノ酸により置換されている、インターロイキ ン-１β変換酵素。 ２３．前記活性部位または前記補助的結合部位中の親水性アミノ酸または疎水性 アミノ酸が置換されている、請求項２２に記載のインターロイキン-１β変換酵 素。 ２４．前記活性部位アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸173、176、177、178、17 9、180、236、237、238、239、244、248、283、284、285、290、338、339、340 、341、342、343、345、348、352、381および383からなる群より選択される、請 求項２２に記載のインターロイキン-１β変換酵素。 ２５．前記補助的結合部位アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸150、151、240、2 59、267、268、274、291、292、293、294、295、296、297、317、318、319、320 、321、322、323、324、325、327、334、335、367、371、374、375、377、378、 380、382、384、386、388、389、390、391、392、393、394、395および396から なる群より選択される、請求項２２に記載のインターロイキン-１β変換酵素。 ２６．少なくとも１つのシステインアミノ酸が、セレノシステインまたはセレノ メチオニンからなる群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項２ ２に記載のインターロイキン-１β変換酵素。 ２７．少なくとも１つのメチオニンアミノ酸が、セレノシステインまたはセレノ メチオニンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されている、請求項２ ２に記載のインターロイキン-１β変換酵素。 ２８．前記酵素が結晶形態である、請求項２２〜２７のいずれかに記載のインタ ーロイキン-１β変換酵素。 ２９．前記酵素が、サブユニット解離に対する増加した安定性により特徴付けら れる、請求項２２に記載のインターロイキン-１β変換酵素。 ３０．前記酵素が、野生型酵素より高い比活性を有する、請求項２２に記載のイ ンターロイキン-１β変換酵素。 ３１．前記酵素が変化した基質特異性を有する、請求項２２に記載のインターロ イキン-１β変換酵素。 ３２．請求項２２に記載のインターロイキン-１β変換酵素の使用であって、化 学的化合物と該酵素との間の結合相互作用を測定するための、使用。 ３３．インターロイキン-１β変換酵素であって、該酵素の表面上、表面または その近傍の少なくとも１個のアミノ酸残基が置換されており、表面荷電の１以上 の荷電単位の変化が生じている、インターロイキン-１β変換酵素。