JPH10503376A

JPH10503376A - 高発現の宿主細胞を選択する方法

Info

Publication number: JPH10503376A
Application number: JP8506644A
Authority: JP
Inventors: クローリー，クレイグ・ダブリュー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1998-03-31
Also published as: ATE353970T1; MX9700852A; AU704408B2; WO1996004391A1; DE69535389T2; CA2195303C; PT770136E; AU3204595A; JP4528940B2; EP0770136B1; DK0770136T3; EP0770136A1; IL114820A0; JP2006296438A; US5561053A; DE69535389D1; CA2195303A1; ES2282994T3

Abstract

(57)【要約】高レベルの所望のタンパク質を発現する組換え宿主細胞を選択する方法を記載する。この方法は、選択可能な遺伝子(好ましくは増幅可能な遺伝子)、および選択可能な遺伝子の３'に設けられた生成物遺伝子を含有するＤＮＡ構築物を有する真核宿主細胞を用いる。選択可能遺伝子はスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位により定められるイントロの内部に置かれ、選択可能遺伝子と生成物遺伝子は単一の転写制御領域の転写制御下にある。スプライスドナー部位は一般に有効なスプライスドナー部位であり、それ故転写制御領域を用いて生成物遺伝子の発現を制御する。トランスフェクトされた細胞を培養して、増幅剤を含む選択培地で生成物をコードする遺伝子を十分時間発現させて、増幅が起ることを可能にし、それによって所望の生成物を回収するか、または生成物遺伝子の多重コピーを有する細胞を同定する。

Description

【発明の詳細な説明】高発現の宿主細胞を選択する方法発明の背景発明の分野本発明は、高発現の宿主細胞を選択する方法、問題のタンパク質を高収量で製造する方法、および問題のタンパク質をコードする配列の多重コピーを有する真核細胞を製造する方法に関する。背景および関連技術の記述ＤＮＡを生きている宿主細胞に機能的な形で導入する方法の発見は、多くの基本的な生物学的課程を理解する鍵を提供し、重要なタンパク質および他の分子の商業的に有用な量での製造を可能にした。そのような遺伝子移入方法の一般的な成功にかかわらず、所望のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に入れ、その中で発現させる効率を制限するいくつかの一般的な問題が存在する。１つの問題は、いつ遺伝子を受け入れ細胞に首尾よく移すかを知ることである。第２の問題は、遺伝子を含むこれらの細胞と、移入課程で生き残ったが、その遺伝子を含まない細胞を区別することである。第３の問題は、その遺伝子を含み、その遺伝子によりコードされるタンパク質を高レベルで発現している細胞を同定し、単離することである。一般に、遺伝子を真核細胞に導入する公知の方法は、非常に効率的でないという傾向がある。ある培養物中の細胞のうち、わずかな割合のみが外から加えられたＤＮＡを取り込み、発現し、もっと少ない割合のみがそのＤＮＡを安定に維持する。所望のタンパク質をコードする生成物遺伝子を導入したこれらの細胞の同定は、同じ細胞に、選択可能なマーカーをコードする、選択可能な遺伝子と一般に呼ばれる他の遺伝子を導入することにより達成される。選択可能なマーカーは、抗生物質または他の薬剤に対する耐性を賦与する酵素、または宿主細胞における代謝的または異化的欠陥を補償する酵素等の、選ばれた特別の培養条件下に宿主細胞の増殖または生残りに必要なタンパク質である。例えば、真核細胞について一般的に用いられる選択可能な遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)、ジヒドロフォレートリダクターゼ(ＤＨＦＲ)、チミジンキナーゼ(ＫＫ)、ネオマイシン、プロマイシン、グルタミンシンテターゼ、およびアスパラギンシンテターゼを含む。選択可能マーカーをコードする第２の導入された遺伝子の宿主細胞による発現に基づいて、一つの遺伝子を導入した宿主細胞を同定する方法は、コトランスフェクテーション(またはコトランスフェクション)と呼ばれる。その方法では、所望のポリペブチドをコードする遺伝子および選択遺伝子を典型的には宿主細胞に同時に導入するが、それらは連続的に導入してもよい。同時コトランスフェクテーションの場合、所望のポリペブチドをコードする遺伝子および選択可能な遺伝子は、宿主細胞に導入する前に、単一のＤＮＡ分子に存在してもよく、或いは別のＤＮＡ分子に存在してもよい。Ｗigler等、Ｃell、１６：７７７(１９７９)。次に、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した細胞は、選択可能遺伝子によりコードされる選択可能マーカーを合成するこれらの細胞の増殖または生き残りを優先的に可能にする条件下に、該細胞を培養することにより同定され、または単離される。真核宿主細胞中に導入された遺伝子の発現のレベルは、遺伝子のコピー数、転写効率、メッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)プロセシング、安定性、および翻訳効率を含む多くの要因に左右される。従って、所望のポリペブチドの高レベル発現は、１以上のこれらの要因を最適化することを典型的には必要とするであろう。例えば、タンパク質生産のレベルは、遺伝子のコード配列を、高レベルの転写を与えるであろう「強力な」プロモータまたはエンハンサーに共有結合的に結合させることにより増加するかも知れない。プロモータおよびエンハンサーは、転写に関与する宿主細胞においてタンパク質と特異的に相互作用するヌクレオチド配列である。Ｋriegler、Ｍeth.Ｅnzymol.、１８５：５１２(１９９０)；Ｍaniati s等、Ｓcience、２３６：１２３７(１９８７)。プロモータは遺伝子コード配列の上流に位置して、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写を促進する。高レベル発現のため強力なプロモーターと同定されている真核プロモータには、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイスルメジャー後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉ−プロモーター、ラウスザルコーマウイルスロングターミナルリピートおよびヒトサイトメガロウイルス即時プロモータ(ＣＭＶ)がある。エンハンサーはリンクしたプロモータからの転写を刺激する。プロモーターとは異り、エンハンサーは、転写開始部位から下流に、またはプロモータから相当な距離で置かれた時、活性であるが、実際問題としてエンハンサーはプロモータと物理的および機能的にオーバーラップし得る。例えば、上に挙げた強力なプロモーターは強力なエンハンサーをも含む。Ｂendig、Ｇenetic Ｅngineering、７：９１(Ａcademic Ｐress、１９８８)。タンパク質生産のレベルは、宿主細胞中の遺伝子コピー数を増加させることによっても増加させ得る。大きい遺伝子コピー数を得る一つの方法は、例えばコトランスフェクテーションの間に選択可能な遺伝子に比べモル大過剰の生成物遺伝子を用いることにより、宿主細胞に多数の遺伝子コピーを直接的に導入することである。Ｋaufman、Ｍeth.Ｅnzymol.、１８５：５３７(１９９０)。しかしながら、この方法によれば少ない割合のコトランスフェクトされた細胞だけが生成物遺伝子を大コピー数で含むであろう。更に、そのような細胞を生成物遺伝子の少ないコピーを含む大部分の細胞から区別するための一般的に利用できる、便利な方法は存在しないので、労力のいる、時間のかかるスクリーニング法が、所望の高コピー数トランスフェクタントを同定するのに典型的には必要である。大きい遺伝子コピー数を得るもう一つの方法は、宿主細胞中で自主的に複製できるベクター中で遺伝子をクローニングすることを含む。そのようなベクターの例には、エプスタインバールウイルスまたは牛パピローマウイルスに由来する哺乳類発現ベクター、および酵母の２ミクロンプラスミドベクターがある。Ｓteph ensおよびＨentschel、Ｂiochem.Ｊ.、２４８：１(１９８７)；Ｙates等、Ｎatu re 、３１３：８１２(１９８５)；Ｂeggs、Ｇenetic Ｅngineering、２：１７５( Ａcademic Ｐres、１９８１)。高遺伝子コピー数を得るもう一つの方法は、宿主細胞中での遺伝子増幅を含む。遺伝子増幅は真核細胞中で比較的低頻度で自然に起る。Ｓchimke、Ｊ.Ｂiol. Ｃh em. 、２６３：５９８９(１９８８)。しかしながら遺伝子増幅は、宿主細胞を適当な選択圧にさらすことにより誘導され、または少くとも選択され得る。例えば、生成物遺伝子を増幅可能な遺伝子と共に宿主細胞中に導入し、次いで、コトランスフェクトされた細胞を、連続的に増加した濃度の選択剤にさらすことによりマーカー遺伝子の増幅について選択することは多くの場合可能である。その目的に最も広く用いられる増幅可能な遺伝子はＤＨＦＲ遺伝子であり、ジヒドロフォレートリダクターゼ酵素をコードする。ＤＨＦＲ遺伝子と組合せて用いる選択剤はメトトレキセート(Ｍtx)である。宿主細胞を、所望のタンパク質をコードする生成物遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子でコトランスフェクトし、Ｍtxを含む培地中で細胞をまず培養することにより、トランスフェクタントを同定する。野性型ＤＨＦＲ遺伝子を用いる場合、適当な宿主細胞は、ＵrlaubおよびＣhas in、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、７７：４２１６(１９８０)に記載の如く調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)セルラインである。次にトランスフェクトされた細胞を連続的により高い濃度のＭtxにさらす。これによってＤＨＦＲ遺伝子の多重コピー、および付随的に生成物遺伝子の多重コピーが合成される。Ｓchimke、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６３：５９８９(１９８８)；Ａxel等、米国特許第４,３９９,２１６号；Ａxel等、米国特許第４,６３４,６６５号。選択とその後の増幅を考慮に入れる遺伝的マーカーと共に遺伝子をコトランスフェクションすることに関する他の文献には、Ｊ .Ｓetlow編、Ｇenetic Ｅngineering(Ｐlenum Ｐress、ニューヨーク、第９巻( １９８７))中のＫaufman；ＫaufmanおよびＳcharp、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１５９：６０１(１９８２)；Ｒingold等、Ｊ.Ｍol.Ａppl.Ｇenet、１：１６５〜１７５( １９８１)；Ｋaufman等、Ｍol.Ｃell Ｂiol.、５：１７５０〜１７５９(１９８５)；ＫaetzelおよびＮilson、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６３：６２４４〜６２５１( １９８８)；Ｈung等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、８３：２６１〜２６４(１９８６)；Ｋaufman等、ＥＭＢＯＪ.、６：８７〜９３(１９８７)；Ｊohns tonおよびＫucey.Ｓcience、２４２：１５５１〜１５５４(１９８８)：Ｕrlanb 等、Ｃell、３３：４０５〜４１２(１９８３)がある。ＤＨＦＲ増幅法を他の種類の細胞に拡張するために、メトトレキセートに対して感受性の減少したタンパク質をコードする変異体ＤＨＦＲ遺伝子を、通常の数の内因性の野性型のＤＨＦＲ遺伝子を含む宿主細胞と組合せて用いてもよい。Ｓ imonsenおよびＬevinson、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、８０：２４９５ (１９８３)；Ｗigler等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、７７：３５６７〜３５７０(１９８０)：ＨaberおよびＳchimke、Ｓomatic Ｃell Ｇenetics、８：４９９〜５０８(１９８２)。別法として、宿主細胞を、生成物遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびneo^r遺伝子などの優性な(dominant)選択可能な遺伝子でコトランスフェクトしてもよい。Ｋ imおよびＷold．Ｃell、４２：１２９(１９８５)；Ｃapon等、米国特許第４,９６５,１９９号。ネオマイシン(または関連する薬剤Ｇ４１８)を含む培地中で細胞を先ず培養することにより、トランスフェクタントを同定し、次にこのように同定したトランスフェクタントを、連続的に増加する濃度のＭtxにさらすことによって、ＤＨＦＲ遺伝子および生成物遺伝子の増幅について選択する。この議論から認識されるであろうように、高レベルの所望のタンパク質を発現する組換え宿主細胞の選択は一般に多工程の方法である。第１段階では生成物遺伝子と選択可能な遺伝子を導入した最初のトランスフェクタントを選択する。次の段階でその最初のトランスフェクタントを、選択可能遺伝子の高レベル発現についてさらに選択し、次に生成物遺伝子の高レベル発現についてランダムスクリーニングにかける。高レベルの所望のタンパク質を発現する細胞を同定するために典型的には多数のトランスフェクタントをスクリーニングしなければならない。大多数のトランスフェクタントは最大レベルより少ない所望のタンパク質を産生する。更に、ＤＨＦＲトランスフォーマントにおけるＭtx耐性は、様々な程度の遺伝子増幅により少くとも部分的に与えられる。Ｓchimke、Ｃell、３７：７０５〜７１３(１９８４)。選択されなかった遺伝子の共発現の不適当さは、Ｗold等、Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ. 、７６：５６８４〜５６８８(１９７９)により報告されている。増幅されたＤＮＡの不安定性は、ＫaufmanおよびＳchimke、Ｍol.Ｃell Ｂiol. １：１０６９〜１０７６(１９８１)；ＨaberおよびＳchimke、Ｃell、２６：３５５〜３６２(１９８１)；およびＦedespiel等、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２５９：９１２７〜９１４０(１９８４)により報告されている。単一工程でそのような組換え宿主細胞を直接選択するいくつかの方法が記載されている。一つの方法は、宿主細胞を生成物遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子でコトランスフェクトし、高濃度のＭtxを含む培地中で直接培養することにより、高レベルのＤＨＦＲを発現する細胞を選択することを含む。その方法で選択された細胞の多くは、コトランスフェクトされた生成物遺伝子をも高レベルで発現する。Ｐag eおよびＳydenham、Ｂio／Ｔechnology、９：６４(１９９１)。単一工程選択についてのこの方法はその有用性が限定される或る欠点を有する。高レベルの選択剤を含む培地中で直接培養することにより得られた高発現細胞は、増殖および安定性が悪く、したがって長期の生産方法としてのそれらの有用性が限定される。ＰageおよびＳnyderman、Ｂio／Ｔechnology、９：６４(１９９１)。Ｍtxに対する高レベルの耐性についての単一工程選択は、増幅された遺伝子を含む細胞というよりも、変化したＭtx耐性ＤＨＦＲ酵素を有する細胞、または変化したＭtx輸送性を有する細胞を作り得る。Ｈaber等、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２５６：９５０１( １９８１)；ＡssarafおよびＳchimke、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、８４：７１５４(１９８７)。他の方法は、転写される領域の５'末端に生成物遺伝子および３'末端に選択可能な遺伝子を含むポリシストロン性のmＲＮＡ発現ベクターを使用することを含む。ポリシストロン性mＲＮＡの３'末端の選択可能な遺伝子の翻訳は効率が悪いので、そのようなベクターは生成物遺伝子を優先的に翻訳し、選択から生き残るために高レベルのポリシストロン性mＲＮＡを必要とする。Ｋaufman、Ｍeth.Ｅn zymol. ,１８５：４８７(１９９０)；Ｋanfman,Ｍeth.Ｅnzymol.、１８５：５３７(１９９０)；Ｋaufman等、ＥＭＢＯＪ.、６：１８７(１９８７)。従って高レベルの所望のタンパク質生成物を発現する細胞が、特定の選択可能な遺伝子と共に用いるのに適当な選択剤を含む培地中で最初のトランスフェクタントを培養することにより、単一工程で得られ得る。しかしながら、選択可能なマーカーの翻訳におよぼす上流の生成物の読み枠の予測できない影響のため、および上流の読み枠が時にはメトトレキセート増幅の間に除かれるので、これらのベクターの有用性は変わりやすい(Ｋaufman等、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１５９：６０１〜６２１(１９８２)；Ｌevinson、Ｍethods in Ｅnzymology、サンディエゴ：アカデミップレス(１９９０))。後のベクターは、生成物遺伝子と選択可能な遺伝子の間に位置するピコルナウイルスファミリーに由来する内部の翻訳開始部位を導入した( Ｐelleitier等、Ｎature、３３４：３２０(１９８８)；Ｊang等、Ｊ.Ｖirol.、６３：１６５１(１９８９))。単一工程選択のための第３の方法は、その内部に問題のタンパク質をコードする遺伝子が位置するイントロンを含む選択可能なＤＮＡ構築物の使用を含む。米国特許第５,０４３,２７０号、およびＡbrams等、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６４(２４)：１４０１６〜１４０２１(１９８９)を参照。さらに別の単一工程選択法においては、イントロン改変選択可能遺伝子および問題のタンパク質をコードする遺伝子で宿主細胞をコトランスフェクトする。１９９２年１０月１５日に公開されたＷＯ９２／１７５６６号を参照。イントロンが対応するmＲＮＡ前駆体から正しく低効率でスプライスされるような長さのイントロンを、選択可能な遺伝子の転写される領域に挿入することによりイントロン改変遺伝子を調製し、その結果、イントロン改変選択可能遺伝子から作られる選択可能なマーカーの量は、出発選択可能遺伝子から作られるそれよりも実質的に少ない。これらのベクターは組込まれたＤＮＡ構築物のインテグリティを保証するのに役立つが、選択可能な遺伝子とそのタンパク質遺伝子が別のプロモーターにより駆動されるので転写上の結合は達成されない。単一の転写単位を有する他の哺乳動物発現ベクターが記載されている。ネオマイシン耐性遺伝子が続く、内生のＭolony murine白血病ウイルス(Ｍ−ＭuＬＶ) スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の間にcＤＮＡが挿入されたレトロウイルスベクターが構築されている(Ｃepko等、Ｃell、３７：１０５３〜１０６２(１９８４))。このベクターを用いて、いくつかの種類の細胞のレトロウイルス感染後に様々な遺伝子生成物を発現させた。上記の欠点を心に留めて、単一のプロモーターから選択可能なマーカー(ＤＨＦＲ)および問題のタンパク質を発現させることにより、問題の生成物遺伝子でトランスフェクトされた安定なクローンの発現レベルに関する均一性のレベルを増加させるのが本発明の一つの目的である。高レベルの所望のタンパク質生成物を発現する安定な、組換え宿主細胞を選択する方法を提供するのが他の目的であり、その方法は実施するに早くそして便利であり、スクリーニングする必要のあるトランスフェクトされた細胞の数を減らす。さらに、高レベルの単一および２ユニットのポリペプチドが、安定な宿主細胞トランスフェクタントのクローンまたはプールから急速に作り出されることを可能にするのが一目的である。活性な組込み事象のために偏らせ(すなわちＤＮＡ構築物が宿主細胞のゲノムの領域中に挿入され、生成物遺伝子の高レベルの発現をもたらす)、様々な生成物遺伝子を改変の必要なしに収容することができる発現ベクターを提供するのが更なる目的である。発明の概要従って、本発明は、５'転写開始部位および３'転写終了部位、選択可能な遺伝子(好ましくは増幅可能な遺伝子)および選択可能な遺伝子の３'に設けられた生成物遺伝子、選択可能遺伝子と生成物遺伝子の両方の転写を制御する転写制御領域を含んでなり、選択可能な遺伝子はスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位によって定められるイントロンの内部に位置するＤＮＡ構築物( ＤＮＡ分子)に関する。スプライスドナー部位は本明細書で定義する有効なスプライスドナー配列を好ましくは有し、それによって、転写制御領域を用いて、生成物遺伝子の発現を制御する。他の態様において本発明は問題の生成物を製造する方法を提供し、その方法は、生成物遺伝子を発現させるよう、上記のＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた真核細胞を培養し、その生成物を回収することを含んでなる。更なる他の態様において、本発明は生成物遺伝子の多重コピーを有する真核細胞を製造する方法を提供し、その方法は上記したＤＮＡ構築物(選択可能遺伝子は増幅可能遺伝子である)で真核細胞をトランスフェクトし、増幅剤を含む選択培地中で増幅が起るのに十分な時間細胞を増幅させ、生成物遺伝子の多重コピーを有する細胞を選択することを含んでなる。好ましくは細胞のトランスフェクションはエレクトロポレーションを用いて行う。宿主細胞をトランスフェクションした後、大部分のトランスフェクタントは、選択可能な遺伝子によりコードされるタンパク質に特徴的な選択可能な表現型を示さないが、驚くべきことに少ない割合のトランスフェクタントは選択可能な表現型を示し、これらのトランスフェクタントの中で、大部分は、生成物遺伝子によりコードされる高レベルの所望の生成物を発現することが見出された。したがって本発明は高レベルの所望の生成物を発現する組換え宿主細胞の選択のための改良された方法を提供し、その方法は様々な真核宿主細胞について有用であり、存在する細胞選択技術に固有の問題を回避する。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｄは本発明に包含される様々なＤＮＡ構築物を模式的に説明する。大きい矢印は選択可能な遺伝子と生成物遺伝子を示し、点線によって作られたＶは、機能的なＳＤを含むベクターから切除される５'スプライスドナー部位(ＳＤ )および３'スプライスアクセプター部位(ＳＡ)の内部の前駆体ＲＮＡの領域を示す。転写制御領域、選択可能遺伝子、生成物遺伝子、および転写終了部位が図１Ａに描かれている。図１Ｂは実施例１のＤＮＡ構築物を示す。様々なスプライスドナー配列が描かれている。すなわち野性型rasスプライスドナー配列(ＷＴras) 、変異体rasスプライスドナー配列(ＭＵＴＡＮＴras)および非機能性のスプライスドナー配列(▲ＧＴ)。実施例１においてノーザンブロット分析に用いたプローブを図１Ｂに示す。図１Ｃは実施例２のＤＮＡ構築物を示し、図１Ｄは抗ＩgＥＶ_Hの発現に用いた実施例３のＤＮＡ構築物を示す。図２は実施例１で用いたコントロールＤＮＡ構築物を模式的に示す。図３Ａ〜Ｑは実施例１のＤＨＦＲ／イントロン−(ＷＴrasＳＤ)−tＰＡ発現ベクターのヌクレオチド配列(配列番号１)を示す。図４は、図１Ｂに示した３つのベクター(すなわち野性型のrasスプライスドナー配列(ＷＴras)、変異体rasスプライスドナー配列(ＭＵＴＡＮＴras)および非機能性のスプライスドナー配列(△ＧＴ)を有する)から、およびＳＶ４０プロモータの制御下のＤＨＦＲおよびＣＭＶプロモーターの制御下のtＰＡを有するコントロールベクター(図２参照)から平行して調製した線形化したデュプリケート・ミニプレプ（duplicate miniprep）ＤＮＡのエレクトロポレーション後に選択培地中で形成されたコロニーの数を示す棒グラフである。細胞をヌクレオシドを含まない培地中で選択し、自動コロニーカウンターで計数した。図５Ａ〜Ｃは図１Ｂに示すベクターから生じた安定なプールおよびコロニーからのtＰＡの発現を示す棒グラフである。図５Ａでは、各ベクタートランスフェクションからの１００以上のコロニーを混合し、２４ウエルプレートにプレートし、「飽和」時にtＰＡＥＬＩＳＡにより分析した。図５Ｂでは、ベクターのそれぞれに由来するランダムに選択した２０のコロニーを「飽和」時にtＰＡＥＬＩＳＡにより分析した。図５Ｃでは、図５Ａで述べたプール(△ＧＴプールを除く) を２００nＭのＭtxにさらし、ＤＨＦＲ増幅について選択し、次にプールし、tＰＡ発現について分析した。図６Ａ〜Ｐは、実施例２のＤＨＦＲ／イントロン−(ＷＴrasＳＤ)−ＴＮＦr− ＩgＧのヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。図７Ａ〜Ｂは、ジシストロン性またはコントロールベクターを用いたＴＮＦr −ＩgＧの発現を示す(実施例２参照)。ＴＮＦrを含むベクター(しかしその他の点では実施例１のtＰＡ発現について記載したものと同じ)を構築し(図１Ｃ参照) 、エレクトロポレーションによりdp１２.ＣＨＯ細胞に導入し、プールし、２００nＭのＭtx中での増幅にかける前(図７Ａ)および後(図７Ｂ)に、生成物発現につき分析した。図８は、実施例３の抗ＩgＥのＶ_Lの発現に用いたＤＮＡ構築物を、模式的に示す。図９Ａ〜Ｏは、実施例３の抗ＩgＥＶ_H発現ベクターのヌクレオチド配列(配列番号３)を示す。図１０Ａ〜Ｑは、実施例３の抗ＩgＥＶ_L発現ベクターのヌクレオチド配列(配列番号４)を示す。図１１は、実施例３の抗ＩgＥ発現を示す棒グラフである。重(Ｖ_H)および軽( Ｖ_L)鎖発現ベクターを構築し、ＣＨＯ細胞中にコエレクトロポレートし、クローンを選択し、抗体発現につきアッセイした。さらに２００nＭおよび１μＭのＭt x選択の前および後の発現に関して、プールを確立し、評価した。好ましい態様の記述定義：本明細書に開示する「ＤＮＡ構築物」は、単離物として、または他のＤＮＡ分子中に、例えば発現ベクターまたは真核宿主細胞の染色体中に組み込まれて提供され得る、天然に存在しないＤＮＡ分子を含む。本明細書で用いる「選択可能な遺伝子」の語は、選ばれた特定の細胞培養条件下での宿主細胞の増殖または生き残りに必要な選択可能なマーカーをコードするＤＮＡを言う。従って、選択可能な遺伝子でトランスホームされた宿主細胞は、トランスフェクトされない宿主細胞が増殖または生き残りできない或る細胞培養条件下に増殖または生き残りできるであろう。典型的には選択可能な遺伝子は薬剤に対する耐性を与え、または宿主細胞における代謝または異化欠損を補償する。選択可能な遺伝子の例を次の表に示す。Ｋaufman、Ｍethods in Ｅnzymology、１８５：５３７〜５６６(１９９０)もこれらのレビューのため参照。好ましい選択可能な遺伝子は増幅可能な遺伝子である。「増幅可能な遺伝子」なる語は、或る条件下に増幅される遺伝子(すなわち染色体内または染色体外の形で生き残る遺伝子のさらなるコピーが生じる)を言う。増幅可能な遺伝子は、これらの条件下に真核細胞の増殖に必要な酵素(すなわち増殖可能なマーカー)を通常コードする。例えば該遺伝子はそれによってトランスホームされた宿主細胞がＭtx中で増殖する場合増幅されるＤＨＦＲをコードし得る。Ｋaufmanによれば、上の表１の選択可能な遺伝子は増幅可能な遺伝子でもあると考え得る。増幅可能な遺伝子であると通常考えられない選択可能な遺伝子の例はネオマイシン耐性遺伝子である(Ｃepko等、上記)。本明細書で用いる「選択培地」とは、選択可能な遺伝子を有する真核細胞を増殖させるのに用いる栄養溶液を言い、したがって「選択剤」を含む。ＨamのＦ１０( Ｓigma)、ミニマルエッセンシャルメディウム([ＭＥＭ]、Ｓigma)、ＲＰＭ１− １６４０(シグマ)、およびＤulbeccoのＭodified Ｅagle培地([ＤＭＥＭ]、Ｓig ma)の商業的に入手し得る培地は例示的な栄養溶液である。更に、ＨamおよびＷa llace、Ｍeth.Ｅnz.、５８：４４(１９７９)；ＢarnesおよびＳato、Ａnal.Ｂio chem. 、１０２：２５５(１９８０)；米国特許第４,７６７,７０４号、第４,６５７,８６６号、第４,９２７,７６２号または第４,５６０,６５５号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；米国特許Ｒe第３０,９８５号；または米国特許第５,１２２,４６９号(これらすべての開示は本明細書の一部を構成する)に記載されたいずれの培地も培地として用い得る。これらのいずれの培地も、ホルモンおよび／または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子等の)、塩(食塩、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等の)、緩衝剤(ＨＥＰＥＳ等の)、ヌクレオシド(アデノシンおよびチミジン等の)、抗生物質(ジェンタマイシン剤などの)、微量元素(ミクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義された)、グルコースまたは等価なエネルギー源を必要に応じて補ってもよい。他の必要ないずれの補助物も当業者に知られ適当な濃度で含ませ得る。好ましい栄養溶液は牛胎児血清を含む。「選択剤」なる語は、特別な選択可能遺伝子を欠損した宿主細胞の増殖または生き残りを妨げる物質を言う。選択剤の例は上の表１に示されている。選択剤は、増殖可能な遺伝子がＤＨＦＲならＭtxなどの、増殖可能な遺伝子のコピーを増幅させるための薬品として本明細書における目的のために定義された「増幅剤」を好ましくは含む。増幅剤の例として表１を参照。本明細書で用いる「転写開始部位」の語は、一次的な転写、すなわちmＲＮＡ前駆体に導入された最初の核酸に対応するＤＮＡ構築物中の核酸を言い、その部位はＤＮＡ構築物の５'末端に、または５'末端に隣接して一般に設けられる。「転写終了部位」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼを転写終了させる、ＤＮＡ構築物の３'末端に通常示される、ＤＮＡの配列を言う。本明細書で用いる「転写制御領域」とは、選択可能な遺伝子と生成物遺伝子の転写を制御するＤＮＡ構築物の領域を言う。転写制御領域とは、構成性であっても誘導性であってもよいプロモーター配列(すなわちＲＮＡポリメラーゼの結合に関与して転写を開始させるＤＮＡの領域)、および場合によりエンハンサー(すなわちプロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpのシス作用性ＤＮＡ因子)を通常言う。本明細書で用いる「生成物遺伝子」とは、所望のタンパク質またはポリペプチド生成物をコードするＤＮＡを言う。宿主細胞で発現できるいずれの生成物遺伝子も用い得るが、本発明の方法は選択可能または増幅可能遺伝子でない生成物遺伝子の高レベル発現を得るのに特に適している。従って生成物遺伝子によりコードされるタンパク質は、典型的には、選択された特別な細胞培養条件下に宿主細胞の増殖または生き残りに必要でないものであろう。例えば、生成物遺伝子はペプチドを適切にコードし、またはその鎖長が高レベルの３次および／または４次構造を生ずるのに十分である、アミノ酸のポリペプチド配列をコードし得る。細菌のポリペプチドまたはタンパク質の例は、例えばアルカリホスホターゼおよびβ−ラクタマーゼを含む。哺乳動物のポリペプチドまたはタンパク質の例には、レニン；ヒト成長ホルモンおよび牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモンリリーシング因子；パラチロイドホルモン；チロイド刺激ホルモン；リポプロテイン；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；小胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；VIIIＣ因子、IX因子、組織因子、ウィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性のナトリウム排泄増加因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼまたはヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t− ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；ヘモポイエチン増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(r egulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−アルファ)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ムレリアン(mullerian)阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経向性因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィン−３,−４,−５,または−６(ＮＴ−３,ＮＴ−４,ＮＴ−５,またはＮＴ−６)、ＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経向性因子；血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ) ；aＦＧＦおよびbＦＧＦ等の腺維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(ＥＧＦ)；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ等のトランスフォーミング成長因子；インスリン様増殖因子−ＩおよびII(ＩＧＩ−ＩおよびＩＧＦ−II)；デス(１ −３)−ＩＧＦ−Ｉ(脳ＩＧＦ−Ｉ)；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９等のＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；オステオインダクティブ因子；イムノトキシン；骨のモルホジェネチックタンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン−アルファ、−ベータ、−ガンマ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン(ＩＬ)、例えばＩＬ−１〜ＩＬ〜１０；スーパーオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープのタンパク質等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；制御タンパク質；抗体；イムノアドヘシンおよび上記タンパク質の断片等のキメラポリペプチドがある。生成物遺伝子は好ましくは宿主に存在する遺伝子の発現を妨げるアンチセンス配列より成らない。好ましいタンパク質はＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＤＮアーゼ、t−ＰＡ等のプラスミノーゲン活性化因子、組織因子および因子VIII等の凝固因子、レラキシンおよびインスリン等のホルモン、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン、ＴＮＦ受容体ＩgＧイムノアドヘシン( ＴＮＦr−ＩgＧ)等のキメラタンパク質、または抗ＩgＥ等の抗体の治療用タンパク質である。本明細書で用いる「イントロン」の語は、遺伝子の転写される領域内部、またはメッセンジャーＲＮＡ前駆体内部に存在するヌクレオチド配列を言い、そのヌクレオチド配列は翻訳前に宿主細胞によりメッセンジャーＲＮＡ前駆体から切り出され、またはスプライスされることができる。本発明に用いるのに適したイントロンは、天然に存在する核酸からの精製またはデノボ合成等の周知のいくつかの方法のいずれかにより適切に調製される。多くの天然に存在する真核遺伝子中に存在するイントロンが同定され、特性決定されている。Ｍount.、Ｎuc.Ａcids Ｒes. 、１０：４５９(１９８２)。機能的なスプライス部位を含む人工的なイントロンも記載されている。Ｗiney等、Ｍol.Ｃell Ｂiol.、９：３２９(１９８９ )；Ｇatermann等、Ｍol.Ｃell Ｂiol.、９：１５２６(１９８９)。イントロンは、例えば天然に存在する核酸を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、またはイントロンの５'および３'末端での配列に相補的なプライマーを用いるＰＣＲクローニングにより、天然に存在する核酸得てもよい。或いは、一定の配列および長さを有するイントロンを有機化学の様々な方法を用いて合成的に調製してもよい。Ｎarang等、Ｍeth.Ｅnzymol.、６８：９０(１９７９)；Ｃarut hers等、Ｍeth.Ｅnzymol.、１５４：２８７(１９８５)；Ｆroehler等、Ｎuc.Ａc ids Ｒes. 、１４：５３９９(１９８６)。本明細書で用いる「スプライスドナー部位」または「ＳＤ」とは、イントロン５' 末端のエクソン−イントロン境界をすぐ近くで（immediately）囲むＤＮＡ配列を言い、「エクソン」はイントロンの５'側で核酸を含む。多くのスプライスドナー部位が特性決定されており、Ｏhshima等、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１９５：２４７〜２５９(１９８７)は、これらの総説を提供する。「有効なスプライスドナー配列」とは、スプライスドナー配列を有するメッセンジャーＲＮＡ前駆体のスプライシングの効率が、定量的ＰＣＲにより測定して、約８０〜９９％の間、好ましくは９０〜９５％の間である、スプライスドナー部位をコードする核酸配列を言う。有効なスプライスドナー配列の例は、野性型(ＷＴ)のrasスプライスドナー配列、および実施例３のＧＡＣ：ＧＴＡＡＧＴを含む。他の有効なスプライスドナー配列は、本明細書に開示するスプライシング効率測定の技術を用いて容易に選択できる。本明細書で用いる「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼチェインリアクション」の語は、米国特許第４,６８３,１９５号(１９８７年７月２８日発行)に記載されたインビトロ増幅法を言う。一般に、ＰＣＲ法は、増幅すべき核酸配列を含むテンプレート核酸に優先的にハイブリダイズできる２つのＤＮＡプライマーを用いる、プライマー伸長合成の繰返されたサイクルを含む。ＰＣＲ法は、全ゲノムＤＮＡ、細胞のＲＮＡから転写されたcＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡからの特別なＤＮＡ配列をクローンするのに用いることができる。ＷangおよびＭark、ＰＣＲＰrotocols中、７０〜７５頁(Ａcademic Ｐress、１９９０)；Ｓ charf、ＰＣＲＰrotocols中、８４〜９８頁；ＫawasakiおよびＷang、ＰＣＲＴechnology 中、８９〜９７頁(Ｓtockton Ｐress、１９８９)。逆転写−ポリメラーゼチェインリアクション(ＲＴ−ＰＣＲ)を用いて、スプライスされたおよびスプライスされないmＲＮＡ転写物の混合物を含むＲＮＡ試料を分析できる。イントロンをスパンするようデザインされた蛍光でタグ(tag)されたプライマーを用いて、スプライスされた、およびスプライスされない標的の両方を増幅する。その結果生じた増幅生成物をゲル電気泳動により次に分離し、適当なバンドの蛍光発光を測定することにより定量する。ＲＮＡ試料中に存在するスプライスされた、およびスプライスされない転写物の量を測定するため比較を行う。一つの好ましいスプライスドナー配列は「コンセンサススプライスドナー配列」である。その配列が進化的に高度に保存されたイントロンスプライス部位を囲むヌクレオチド配列を「コンセンサスプライスドナー配列」と言う。高級真核生物の mＲＮＡにおいては、５'スプライス部位は、コンセンサス配列ＡＧ：ＧＵＡＡＧＵ(コロンは解裂およびライゲーション部位を示す)内部にある。酵母のmＲＮＡでは、５'スプライス部位は、コンセンサス配列：ＧＵＡＵＧＵにより境を限られる。Ｐadgett等、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.、５５：１１１９(１９８６)。「スプライスアクセプター部位」または「ＳＡ」なる語は、イントロンの３'末端のイントロン−エクソン境界をすぐ近くで囲む配列を言い、エクソンはイントロンの３'側で核酸を含む。多くのスプライスアクセプター部位が特性決定されており、Ｏhshima等、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１９５：２４７〜２５９(１９８７)はこれらの総説を提供する。好ましいスプライスアクセプター部位は、スプライスアクセプター部位を有するメッセンジャーＲＮＡ前駆体のスプライシングの効率が定量的ＰＣＲで測定して約８０〜９９％の間、好ましくは９０〜９５％間であるスプライスアクセプター部位をコードする核酸配列を言う有効なスプライスアクセプター部位である。スプライスアクセプター部位はコンセン配列を含み得る。高級真核生物のmＲＮＡにおいては、３'スプライスアクセプター部位はコンセンサス配列(Ｕ／Ｃ)₁₁ＮＣＡＧ：Ｇの内部にある。酵母のmＲＮＡでは３'アクセプタースプライス部位はコンセンサス配列(Ｃ／Ｕ)ＡＧ：により境を限られる。Ｐod gett等、上書。本明細書で用いる「増幅を生ぜしめるのに十分な時間培養する」とは、ＤＮＡ構築物でトランスホームされた真核宿主を、増幅剤を含む細胞培養培地中で、宿主細胞中の増幅可能な遺伝子のコピー数が(および好ましくは生成物遺伝子のコピー数も)、この培養前のトランスホームされた細胞に比べて増加するまで、物理的に培養する行為を言う。本明細書で用いる「発現」なる語は、宿主細胞内部で起る転写または翻訳を言う。宿主細胞中の生成物遺伝子の発現レベルは、細胞中に存在する対応するmＲＮＡの量、または細胞により作られる生成物遺伝子によりコードされるタンパク質の量に基いて測定され得る。例えば、生成物遺伝子から転写されたmＲＮＡはノーザンハイブリダイゼーションにより望ましくは定量される。Ｓambrook等、Ｍo lecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、７.３〜７.５７(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress、１９８９)。生成物遺伝子によりコードされるタンパク質は、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることにより、またはタンパク質と反応できる抗体を用いて、ウエスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイ等のそのような活性と独立のアッセイを用いることにより定量できる。Ｓam brook等、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍannual、１８.１〜１８.８８(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress、１９８９)。発明の実施の形態問題のＲＮＡ配列のレベルを上昇させるため、転写される配列の安定性および／またはコピー数を高める方法および組成物を提供する。一般に本発明の方法は、所望のポリペプチドをコードする生成物遺伝子および選択可能な遺伝子(好ましくは増幅可能な遺伝子)の両方を含む発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトすることを含む。選択可能な遺伝子および生成物遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、細胞のＲＮＡから転写されたcＤＮＡから、またはインビトロ合成により得ることができる。例えば、選択可能な遺伝子または生成物遺伝子(またはそれによってコードされるタンパク質)を同定するよう設計されたプローブ(抗体または約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)でライブラリーをスクリーニングする。選択したプローブでcＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることは、Ｓambrook等、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍamual、(ニューヨーク：Ｃold Ｓpr ing Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress、１９８９)の１０〜１２章に記載されたような標準的な方法を用いて行い得る。選択可能な遺伝子または生成物遺伝子を単離する別の方法は、Ｓambrook等、上書の１４節に記載のようにＰＣＲ法を用いることである。本発明を実施する好ましい方法は、選択可能な遺伝子または生成物遺伝子を含むことが知られている様々な組織からのcＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いることである。プローブとして選択されたそのオリゴヌクレオチド配列は誤った陽性が最小限になるのに十分長く、十分明瞭であるべきである。そのオリゴヌクレオチドはスクリーニングしているライブラリー中のＤＮＡにハイブリダイズすることによりそれが検出できるよう一般に標識される。好ましい標識法は、当業界でよく知られているように、ポリヌクレオチドキナーゼで³² Ｐ標識したＡＴＰを用いてそのオリゴヌクレオチドを放射標識することである。しかし、ビオチニル化または酵素標識を含むがこれらに限定されない他の方法を用いてそのオリゴヌクレオチドを標識してもよい。時には、選択可能な遺伝子および生成物遺伝子をコードするＤＮＡの前に、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特別な解裂部位を有するシグナル配列を置く。一般にシグナル配列は発現ベクターの成分であってもよく、または発現ベクターに挿入される選択可能な遺伝子または生成物遺伝子の一部であってもよい。ヘテロロガスなシグナル配列を用いるなら、好ましくは、宿主細胞により認識されおよびプロセシングされる(すなわちシグナルペプチダーゼにより解裂される)ものである。酵母分泌の場合、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(ＳaccharomycesおよびＫluyveromyces のα因子リーダーを含み、後者は１９９１年４月２３日に発行された米国特許第５,０１０,１８２号に記載されている)、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ.albicansグルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日に公開されたＥＰ３６２,１７９号)または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ／１３６４６号に記載されたシグナルにより置換されてもよい。哺乳動物細胞発現においては、問題のタンパク質の天然のシグナル配列で十分であるが、同じ、または関連する種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ウイルスの分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgＤシグナル等の、他の哺乳類シグナル配列が適し得る。そのような前駆体領域のＤＮＡを選択可能な遺伝子または生成物遺伝子に読み枠内でライゲートする。図１Ａに示すように、選択可能な遺伝子はＤＮＡ構築物の５'末端に一般に設け、この選択可能な遺伝子の後に生成物遺伝子を置く。それ故、完全な長さの( スプライスされない)メッセージは第一オープンリーディングフレームとしてＤＨＦＲを含み、それ故ＤＨＦＲタンパク質を生じて、安定なトランスフェクタントの選択を可能にする。その完全長のメッセージは、相当な量の問題のタンパク質を生ずるとは予期されない。何故ならジシストロン性のメッセージにおける第２のＡＵＧは哺乳動物細胞のにおける翻訳の有効でないイニシエーターであるからである(Ｋozak.Ｊ.Ｃell Ｂiol.、１１５：８８７〜９０３[１９９１])。選択可能な遺伝子はイントロン内部に置く。イントロンは多くの真核遺伝子内部に通常存在する、非コード性ヌクレオチド配列であり、スプライシングと総称される多段階工程で新しく転写されたmＲＮＡ前駆体から除去される。単一の機構が哺乳動物、植物および酵母細胞におけるmＲＮＡ前駆体のスプライシングに関与すると考えられる。一般に、プライシングの過程は、イントロンの５'および３'末端が正しく解裂し、生じたmＲＮＡの末端が正確に結合することを必要とし、その結果タンパク質合成のための適当な読み枠を有する成熟mＲＮＡが作られる。様々な、天然に存在する、および合成的に構築された変異体遺伝子の分析により、５'および３'スプライス部位におけるコンセンサス配列内部の場所の多くでのヌクレオチドの変化は成熟mＲＮＡの合成を減少させ、または消滅させるという効果が示された。Ｓharp.Ｓcience、２３５：７６６(１９８７ )；Ｐadgett等、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.、５５：１１１９(１９８６)；Ｇreen、Ａ nn.Ｒev.Ｇenet .、２０：６７１(１９８６)。変異の研究により、スプライシング部位を含むＲＮＡ２次構造はスプライシングの効率に影響することが示された。Ｓolnick、Ｃell、４３：６６７(１９８５)；Ｋonarska等、Ｃell、４２：１６５(１９８５)。イントロンの長さはスプライシングの効率にも影響し得る。ラビットのβ−グロビン遺伝子の大きいイントロン内部の異なる大きさの欠失変異を行うことにより、Ｗieringa等は、正しいスプライシングに必要な最小のイントロンの長さは約６９ヌクレオチドであることを決定した。Ｃell、３７：９１５(１９８４)。アデノウイルＥＩＡ領域のイントロンの同様な研究は、約７８ヌクレオチドのイントロンの長さは正しいスプライシングが起るのを可能にするが、しかし低効率であることを示した。イントロンの長さを９１ヌクレオチドに増加させると正常なスプライシング効率を回復させ、一方イントロンを６３ヌクレオチドにトランケートすると正しいスプライシングを消滅させる。Ｕlfendahl等、Ｎuc.Ａcids. Ｒes. 、１３：６２９９(１９８５)。本発明において有用であるために、イントロンは、mＲＮＡからのイントロンのスプライシングが有効であるような長さを有さなければならない。異った長さのイントロンの調製はルーチンな事項であり、de novo合成または存在するイントロンのインビトロの欠失による変異等の周知の方法を含む。典型的にはイントロンは少くとも１５０ヌクレオチドの長さを有する。何故ならこれより短いイントロンは非効率的にスプライスされる傾向があるからである。イントロンの長さの上限は３０ＫＢ以上までであり得る。しかしながら一般的な提案としてイントロンは一般に長さで約１０ＫＢ未満である。イントロンを修飾して、インビトロで核酸を修飾するための様々な、いずれかの知られた方法を用いて、イントロン内部に通常は存在しない選択可能な遺伝子を含ませる。典型的には、イントロンを先ず制限エンドヌクレアーゼで解裂させ、次に宿主細胞発現のため、例えばＤＮＡリガーゼ酵素によりライゲーションにより、生じた制限断片を選択可能な遺伝子に正しい方向で共有結合的に結合させることにより、選択可能遺伝子をイントロン中へ導入する。該ＤＮＡ構築物はジシストロン性である。すなわち選択可能な遺伝子および生成物遺伝子は両方とも単一の転写制御領域の転写制御下にある。上述したように転写制御領域はプロモーターを含む。酵母宿主に用いる適当なプロモーター配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼ用プロモーター(Ｈitzeman等、Ｊ.Ｂiol. Ｃhem. 、２５５：２０７３[１９８０])、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデハイドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルクキナーゼ等の他の解糖系の酵素(Ｈess等、Ｊ.Ａdn Ｅnzyme Ｒeq.、７：１４９[１９６８]；およびＨolland、Ｂiochemistry、１７：４９００[１９７８])を含む。増殖条件によりコントロールされる転写という更なる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートジヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、Ｈitezeman等ＥＰ７３ ,６５７Ａにさらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に有利に使用される。発現制御配列は真核生物について知られている。事実上すべての真核遺伝子は転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８６塩基上流に見出される他の配列はＣＸＣＡＡＴ(Ｘは任意のヌクレオチドである)領域である。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの生成物遺伝子転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(１９８９年７月５日に公開された英国特許第２,２１１, ５０４号)、アデノウイルス(アデノウイルス２等の)、ウシパヒローマウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルおよび最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のウイルスのゲノムから得られるプロモーター、ヘテロロガスな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーター、および生成物遺伝子と正常に関連するプロモーターからのプロモーターによりコントロールされる。但しそのようなプロモーターが宿主細胞系と両立することを条件とする。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起源をも含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる。Ｆiers等、Ｎature、２７３：１１３(１９７８)；ＭulliganおよびＢerg、Ｓcience、２０９：１４２２〜１４２７(１９８０)；Ｐavlakis等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、７８：７３９８〜７４０２(１９８１)。ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)の即時プロモーターはＨindIIIＥ制限断片として便利に得られる。Ｇreenaway等、Ｇene 、１８：３５５〜３６０(１９８２)。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するシステムは米国特許第４,４１９, ４４６号に開示されている。このシステムの改変が米国特許第４,６０１,９７８号に記載されている。サル細胞における免疫インターフェロンをコードするcＤＮＡを発現させることに関するＧray等、Ｎature、２９５：５０３〜５０８(１９８２)；単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞中でのヒトβ−インターフェロンcＤＮＡの発現に関するＲeys等、Ｎatur e 、２９７：５９８〜６０１(１９８２)；培養したマウスおよびラビット細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するＣanaaniおよびＢerg.、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ. 、７９：５１６６〜５１７０(１９８２)；プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートを用いるＣＶ −１モンキー腎細胞、チキン胚腺維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈela細胞、マウスＮＩＨ細胞における細菌のＣＡＴ配列の発現に関するＧorman 等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.、７９：６７７７〜６７８１(１９８２) を参照。好ましくは、高等真核生物における転写制御領域はエンハンサー配列を含む。エンハンサーは、イントロン内部に(Ｂanerji等、Ｃell、３３：７２９[１９８３])並びにコード配列自体の内部に(Ｏsborne等、Ｍol.Ｃell Ｂio.、４：１２９３[１９８４])、転写単位の５'側に(Ｌainins等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ .Ｓ.Ａ. 、７８：９９３[１９８１])および３'側に(Ｌusky等、Ｍol.Ｃell Ｂio. 、３：１１０８[１９８３])に見出され、比較的方向および位置に依存しない。多くのエンハンサーが哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、 α−フェトプロテインおよびインスリン)から今や知られている。しかしながら典型的には真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いるであろう。例としては、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー(bp１００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー(ＣＭＶ)、複製起源の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。真核プロモーターの活性化のための促進因子についてのＹaniv、Ｎature、２９７：１７〜１８(１９８２)も参照。エンハンサーは生成物遺伝子の５'または３'側の位置でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５'側の部位に位置する。ＤＮＡ構築物は、転写制御領域の後に転写開始領域、および生成物遺伝子の後に転写終了領域を有する(図１Ａを参照)。これらの配列は周知の技術を用いてＤＮＡ構築物中に設けられる。ＤＮＡ構築物は、複製起源(すなわちベクターが１以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列)および所望により１以上の更なる選択可能な遺伝子等の他の成分を有し得る発現ベクターの部分を通常形成する。所望のコーデイング配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を解裂させ、処理し、所望の形に再ライゲートして、必要なプラスミドを作る。一般に、クローニングベクターにおいては、複製起源は宿主の染色体ＤＮＡと独立にベクターが複製できるものであり、複製起源または自律複製配列(autonom ously replicating sequence)を含む。そのような配列はよく知られている。２ μプラスミドの複製起源は酵母に適しており、様々なウイルスの起源(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)が哺乳動物におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起源成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない(ＳＶ４０起源は初期プロモーターを含む故にのみ典型的に用い得る)。大ていの発現ベクターは「シャトル」ベクターである。すなわちそれは少くとも１種類の生物中で複製できるが、発現のため他の生物中にトランスフェクトできる。例えばあるベクターをＥ.coli中でクローニングし、次に同じベクターを、それが宿主細胞染色体と独立に複製できなくても発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するための分析のために、トランスフォーマントからプラスミドを調製し、制限により分析し、および／またはＭessing等、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、９：３０９(１９８１)の方法により、またはＭaxam等、Ｍethods in Ｅnzymology、６５：４９９(１９８０)の方法により配列決定する。上に論じたように調製したＤＮＡ構築物を有する発現ベクターを真核宿主細胞中にトランスホームする。ベクターをクローニングし、または発現するための適当な宿主細胞は酵母またはより高等な真核細胞である。糸状菌、酵母等の真核性微生物は生成物遺伝子を含むベクターについての適した宿主である。Ｓaccharomyces cerevisiae、または一般的なパン酵母は、低級真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかしながら多くの他の属、種、および株、例えばＳ.pombe[ＢeachおよびＮurse、Ｎature、２９０：１４０(１９８１)]、Ｋluyveromyces lactis[Ｌouvencourt等、Ｊ.Ｂacteriol.、７３７(１９８３)]、yarrowia[ＥＰ第４０２,２２６号]、Ｐichia pastoris[ＥＰ第１８３,０７０号]、Ｔrichoderma reesia[ＥＰ第２４４,２３４号]、Ｎeurosp ora crassa[Ｃase等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U.S.A.、７６：５２５９〜５２６３(１９７９)]およびＡ.nidnlans[Ｂallance等、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃo mmun. 、１１２：２８４〜２８９(１９８３)；Ｔilburn等、Ｇene.、２６：２０５〜２２１(１９８３)；Ｙelton等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U.S.A.、８１：１４７０〜１４７４(１９８４)]およびＡ.niger[ＫellyおよびＨynes、ＥＭＢＯＪ. 、４：４７５〜４７９(１９８５)]等のＡspergillus宿主が一般的に利用でき、有用である。生成物遺伝子の発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。そのような宿主細胞は複雑なプロセッシングができ、グリコシル化活性を有する。原理的には、脊椎または非脊椎培養からのいずれの高等真核細胞培養も使用できる。非脊椎細胞の例は植物および昆虫細胞を含む。様々なバキュロウイルス株および変種およびＳpodoptera frugiperda(毛虫)、Ａedes aegypti(カ)、Ａedes alb opictus(カ)、Ｄrosphila melanogaster(ミバエ)、およびＢombyx mori cell等の宿主からの対応する許容性の昆虫細胞が同定されている。例えば、Ｌuckow等、Ｂio／Ｔechnology、６：４７〜５５(１９８８)；Ｍiller等、Ｇenetic Ｅngi neering (Ｓetlow,Ｊ.Ｋ等編)中、８巻(Ｐlenum Ｐublishing、１９８６)、２７７〜２７９頁；およびＭaeda等、Ｎature、３１５：５９２〜５９４(１９８５) を参照。様々なそのようなウイルス株、例えばＡutographa californica ＮＰＶのＬ−１変種およびＢombyx mori ＮＰＶのＢm−５株が広く利用でき、そのようなウイルスは本発明によるウイルスとして、特にＳpodoptera frugiperdaのトランスフェクションに用い得る。木綿、とうもろこし、じゃがいも、大豆、ペチュニア、トマトおよび煙草の植物細胞培養物は宿主として用い得る。典型的には、前もって生成物遺伝子を含むよう操作された細菌のＡgrobacterivm tumefaciensのある株とインキュベートすることにより植物細胞をトランスフェクトする。Ａ.tumefaciensと植物細胞培養をインキュベートする間に、生成物遺伝子は植物宿主細胞に移され、植物細胞はトランスフェクトされ、適当な条件下に生成物遺伝子を発現する。更に、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列等の植物細胞と両立する、制御およびシグナル配列が利用できる。Ｄepicker等、Ｊ.Ｍol.Ａppl. Ｇen. 、１：５６１(１９８２)。更に、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流の領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織において植物で発現可能な遺伝子転写レベルを活性化させ、または増加させることができる。１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ第３２１,１９６号。しかしながら脊椎動物が最も興味があり、培養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖が近年ルーチンな方法となった[Ｔissue Ｃulture、Ａcademic Ｐress 、ＫruseおよびＰatterson編(１９７３)]。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０でトランスフォームされたサルの腎臓ＣＶ１ライン(ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１)；ヒトの胎児の腎臓ライン(懸濁液培養における増殖のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇraham等、Ｊ.Ｇen.Ｖirol.、３６：５９[１９７７]；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０) ；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、ＵrlaubおよびＣhasi n、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U.S.A.、７７：４２１６[１９８０])；dp１２.ＣＨＯ細胞(１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ第３０７,２４７号)；マウスセルトリー細胞(ＴＭ４、Ｍather、Ｂiol.Ｒeprod.、２３：２４３〜２５１(１９８０)]；サルの腎細胞(ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０)；アフリカングリーンモンキー腎細胞(ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７)；ヒトのくびの癌細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２)；犬の腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４)；バッファロラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２、ＨＢ８０６５) ；マウス乳房腫瘍(ＭＭＴＯ６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Ｍather 等、Ａnnals Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓci.、３８３：４４〜６８[１９８２])；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌ライン(ＨepＧ２)である。宿主細胞を本発明の上記発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフォームし、プロモーターを誘導するのに適するよう改変された従来の栄養培地中で培養し、トランスフォーマントを選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させる。Ｓhaw等、Ｇene、２３：３１５(１９８３)および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ８９／０５８５９号に記載されたように、或る植物細胞のトランスフォーメーションのためにＡgrobacterium tumefaciensによる感染を用いる。そのような細胞壁を有しない哺乳動物細胞の場合、Ｇrahamおよびvan der Ｅb、Ｖir ology 、５２：４５６〜４５７(１９７８)のリン酸カルシウム沈澱法を用い得る。哺乳動物細胞宿主システムトランスフォーメーションの一般的な様相は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４,３９９,２１６号にＡxelによって記載されている。酵母へのトランスフォーメーションは、Ｖan Ｓolingen等、Ｊ. Ｂact. 、１３０：９４６(１９７７)およびＨsiao等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U .S.A. 、７６：３８２９(１９７９)の方法に従って典型的には行なわれる。しかしながら核注入による、またはプロトプラスト融合法による等のＤＮＡを細胞中に導入する他の方法も用い得る。好ましい態様においては、ＤＮＡはエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入される。特許請求した発明を実施するのに用なエレクトロポレーション技術の総説については、Ａndreason、Ｊ.Ｔiss.Ｃult.Ｍeth.、１５：５６〜６２( １９９３)を参照。ＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するエレクトロポレーション技術は、リン酸カルシウム沈澱技術がＤＮＡを分解し、コンカテマーを形成する限りにおいて、それより好ましい。生成物遺伝子を発現させるのに用いる哺乳動物細胞は、上の定義の項で論じたような様々な培地中で培養し得る。培地はＤＮＡ構築物をとり入れた(染色体内または染色体外要素として)トランスホームされた宿主細胞を選択するために用いる選択剤を含む。トランスフォームされた真核細胞の選択を行うために、宿主細胞を細胞培養プレート中で増殖させ、選択可能な遺伝子(およびしたがって生成物)遺伝子を発現する個々のコロニーを単離し、栄養素が使い尽くされるまで増殖培地中で増殖させ得る。宿主細胞を次に転写および／または下に論ずるトランスフォーメーションについて分析する。温度、pＨ等の培養条件は発現のために選択された宿主細胞について以前から用いられた条件であり、当業者に明らかであろう。遺伝子増幅および／または発現は、例えば、従来のサザーンブロッティング、 mＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッテイング(Ｔhomas、Ｐroc.Ｎatl .Ａcad.Ｓci.U.S.A. 、７７：５２０１〜５２０５[１９８０])、ドットブロッティング(ＤＮＡ分析)または本明細書で提供する配列に基づく適当に標識したプローブを用いるin situハイブリダイゼーションにより試料中で直接に測定し得る。様々な標識を用い得、最も一般的にはラジオアイソトープ、特に³²Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン改変ヌクレオチドの使用等他の技術も用い得る。ビオチンはアビジンまたは抗体への結合部位として働き、それらは、放射性同位体、蛍光、酵素等の様々な標識により標識され得る。或は、ＤＮＡデュープレクス、ＲＮＡデュープレクス、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュープレクス又はＤＮＡ−タンパク質デュープレクスを含む特異的なデュープレクスを認識できる抗体を用いてもよい。抗体を標識し、アッセイをデュープレックスが表面に結合するところで行い、したがって表面でのデュープレックス形成により、デュープレックスに結合した抗体の存在を検出できる。或いは、遺伝子発現を、組織断片の免疫組織化学的染色、細胞培養物また体液の分析等の免疫学的方法により測定して、生成物遺伝子の発現を直接定量してもよい。免疫組織化学的染色技術の場合、細胞試料を典型的には脱水および固定により調製し、カップルする遺伝子生成物に特異的な標識した抗体と反応させる。標識は酵素標識、蛍光標識、発光標識等、通常視覚的に検知可能である。本発明に用いるのに適した特に感度の高い染色技術がＨsu等、Ａm.Ｊ.Ｃlin.Ｐath.、７５：７３４〜７３８(１９８０)により記載されている。好ましい態様において、mＲＮＡを定量的ＰＣＲにより分析し(スプライシングの効率を測定するため)、タンパク質発現を実施例１に記載のようにＥＬＩＳＡを用いて測定する。問題の生成物を、好ましくは分泌ポリペプチドとして培地から回収するが、分泌シグナルなしに直接発現した場合には宿主細胞溶解物からも回収し得る。生成物遺伝子がヒト起源のもの以外の組換え細胞において発現した場合、問題の生成物はヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを全く含まない。しかしながら問題の生成物を組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから精製し、問題の生成物に関して実質的に均一な生産物を得ることが必要である。第一段階として、培地または溶解物を遠心分離し、細胞破片を除去する。その後問題の生成物を、混入した可溶性のタンパク質およびポリペプチドから、例えば免疫アフィニティーまたはイオン交換カラムによる分別；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥ等のカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル電気泳動；ＩgＧ等の混入物を除去するため問題の生産物を結合するプラスミノーゲンカラム、およびプロテインＡセファローズカラムによるクロマトグラフィーにより精製する。次の実施例は説明のためにのみ提供され、本発明を限定することを意図しない。本明細書に引用したすべての特許および文献は本明細書の一部を構成する。実施例１ジシストロン性発現ベクターを用いるtＰＡの製造単一のプロモーターから選択可能なマーカー(ＤＨＦＲ等の)および問題のタンパク質を発現させることにより、安定なクローンの発現レベルに関して均一性のレベルを増加させることを探究した。サイトメガロウイルス即時プロモーター(ＣＭＶ)と問題のポリペプチドをコードするcＤＮＡの間にイントロンを含むベクターpＲＫ(Ｓuva等、Ｓcience、２３７：８９３〜８９６[１９８７])に由来するベクターを構築した。pＲＫのイントロンは長さ１３９のヌクレオチドであり、サイトメガロウイルス即時遺伝子(ＣＭＶＩＥ)由来のスプライスドナー部位、およびＩgＧ重鎖可変領域（Ｖ_H）遺伝子からのスプライスアクセプター部位(Ｅaton等、Ｂiochem.、２５：８３４３[ １９８６])を有する。ＤＨＦＲ／イントロンベクターは、ＥcoＲＶリンカーをpＲＫ７のイントロンに存在するＢＳＴＸＩ部位中に挿入することにより構築した。マウスＤＨＦＲコーディング断片を含む８３０塩基対の断片を挿入して、スプライスドナー部位を含む配列においてのみ異るＤＨＦＲイントロン発現ベクターを得た。これらの配列をオーバラッピングＰＣＲ突然変異誘発により変化させて、正常なおよび突然変異Ｒas遺伝子のエクソン３および４の間に見出されるスプライスドナー部位ににマッチした配列を得た。ＰＣＲも用いてスプライスドナー部位を破壊するために用いた。マウスのＤＨＦＲ cＤＮＡ断片(Ｓimonsen等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U.S.A . 、８０：２４９５〜２４９９[１９８３])をスプライスドナー部位の５９ヌクレオチド下流でこのベクターのイントロン中に挿入した。このベクターのスプライスドナー部位を突然変異誘発により変えて、トランスフェクトされた細胞におけるスプライスメッセージの非スプライスメッセージの比を変化させた。単一のヌクレオチド変化(ＧからＡへ)によって、正常なras遺伝子に見出される比較的有効なスプライスドナー部位を有効でないスプライス部位に変えることが以前に示された(Ｃohen等、Ｎature、３３４：１１９〜１２４[１９８８])。この効果がr as遺伝子について示され、これらの配列がヒト成長ホルモン構築物に何時移されるか確められた(Ｃohen等、Ｃell、５８：４６１〜４７２[１９８９])。更に、非機能性の５'スプライス部位(ＧＴからＣＡへ)がコントロール(△ＧＴ)として構築された。ポリリンカーを３'スプライス部位の３５ヌクレオチド下流に挿入し、問題のcＤＮＡを受け入れた。tＰＡを含むベクター(Ｐennica等、Ｎature、３０１：２１４〜２２１[１９８３])をポリアデニル化部位の下流にリニアライズした後、それをＣＨＯ細胞に導入した(Ｐotter等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.U .S.A. 、８１：７１６１[１９８４])。ＤＨＦＲ／イントロン、tＰＡおよび(a)野性型ras(ＷＴras)すなわち図３(配列番号１)、(b)変異体ras、または(c)非機能性スプライスドナー部位(△ＧＴ)を含むプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりＣＨＯＤＨＦＲマイナス細胞に導入した。イントロンベクターを制限エンドヌクレアーゼ処理によりポリアデニル化部位の下流にそれぞれリニアライズした。コントロールベクターを第２のポリアデニル化部位の下流にリニアライズした。そのＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出後にエタノール沈澱し、２０μlの１／１０トリスＥＤＴＡに再懸濁した。次に１０μgのＤＮＡを、氷上で１０分間、１mlのＰＢＳ中の１０⁷ＣＨＯ.dp１２細胞(１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７,２４７号)とインキュベートした後、ＢＲＬＣell Ｐoratorを用いて４００ボルトおよび３３０μfでエレクトロポレーションした。細胞を１０分間氷に戻した後、非選択培地にプレートした。２４時間後、細胞をヌクレオシドを含まない培地で育て、プールされた安定なＤＨＦＲ₊コロニーを選択した。プールしたＤＨＦＲ₊コロニーを溶菌して、mＲＮＡを調製した。 mＲＮＡを調製するために、３つのベクター(その本質的な構成を図１Ｂに示す )の安定なトランスフェクションに由来する２００以上のクローンのプールから増殖した５×１０⁷の細胞およびトランスフェクトされないＣＨＯ細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをオリゴーＤＴセルロース(Ｃollaborative Ｂiomedical Ｐroducts)で精製した。１０μgのmＲＮＡを、１.２％アガロース、６.６％ホルムアルデヒド上でmＲＮＡをランさせ、ナイロンフィルター(Ｓtratagene Ｄural on−ＵＶ menbrane)にそれを移すことを含むノーザンブロッティングに次に付し、予備ハイブリダイズし、プローブし、製造者の指示に従って洗滌した。そのフィルターを、(a)完全長のメッセージ、(b)完全長メッセージとスプライスされたメッセージの両方、または(c)ベータアクチンを検出するプローブ(図１Ｂに示す)を用いて連続的にプローブした。長いプローブでプローブすると有効なスプライスドナー部位(すなわちＷＴras)を含むベクターはスプライスされた生成物について予想された大きさのmＲＮＡを主に生成することを示し、一方他の２つのベクターは大きさで非スプライスメッセージに対応するmＲＮＡを主に生じた。ＤＨＦＲプローブは完全長のメッセージのみを検知し、ＷＴrasスプライスドナー由来のベクターはＤＨＦＲ陽性の表現型を与える非常にわずかの完全長メッセージを生ずることを示した。図４は上記した３つのイントロベクターによる２回のエレクトロポレーションの後に得られた、およびtＰＡを駆動するＣＭＶプロモーターおよびＤＨＦＲを駆動させるＳＶ４０プロモーターを有する従来のベクター(図２参照)からのＤＨＦＲ陽性のコロニーの数を示す。コロニー数の増加はスプライスドナー部位の改変により蓄積する完全長メッセージの増加とパラレルである。従来のベクターは効率的にコロニーを作り出し、△ＧＴ構築物とは有意に異ならない。 tＰＡ発現レベルを、２４ウエルディッシュ中の１mlのＦ１２：ＤＭＥＭ(５０：５０、５％ＦＢＳと共に)に集密近くまで細胞を播種することにより測定した。細胞の増殖は培地が使い尽くされるまで続いた。次に培地をtＰＡ製造につきＥＬＩＳＡにより分析した。簡単に言うと抗tＰＡ抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウエル上にコートし、培地試料をウエルに加え、その後洗滌した。抗体(tＰＡ)の結合を、西洋ワサビパーオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)ラベルした抗t−ＰＡ抗体を用いて次に定量した。図５Ａは図４に示した各グループのクローンをプールした後の分泌されたtＰＡタンパク質の力価を示す。コロニー数はスプライスドナー機能の弱まりと共に増加するが、tＰＡ発現に関しては逆が見られた。発現レベルは認められたＲＮＡ生成物と一致する。一層多くのジシストロン性のメッセージがスプライスされるにつれて増加した量のメッセージが第１オープンリーディングフレームとして tＰＡを含み、tＰＡ発現を増加させる。スプライスドナー部位におけるＧＴからＣＡへの変異は、検出できないレベルのt−ＰＡを発現するＤＨＦＲ陽性コロニーの豊富化をもたらし、これは第２のＡＵＧの効率的でない利用のためであろう。重要なことには、図５Ａは、ジシストロン性のベクターの一つ(ＷＴrasＳＤの場合)から得られる発現レベルは、tＰＡを駆動するＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＤＨＦＲをコントロールするＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、およびtＰＡおよびＤＨＦＲの発現をコントロールするＳＶ４０ポリアデニル化部位を含むコントロールベクターで得られるレベルより、約３倍高いことをも示す。更に、プールにおける発現の均一性が研究された。図５Ｂは、ＷＴrasスプライスドナー由来ジシストロン性ベクターにより作られた２０のコロニーのすべてが検出可能なレベルのtＰＡを発現し、一方コントロールベクターにより作られた２０のコロニーのうち４のみがtＰＡを発現することを示す。非スプライシング(△ＧＴ)ベクターでトランスフェクトされたクローンはいずれもＥＬＩＳＡにより検出可能なtＰＡレベルを発現しなかった。この発見は、従来のベクターにより作られた比較的わずかなコロニーしか有用なレベルのタンパク質を作らないという以前の観察と一致する。 tＰＡの発現はプールのメトトレキセート増幅の後に増加した。図５Ｃは、２００nＭＭtxにかけた場合、ジシストロン性由来のプールの２つ(すなわちＷＴr asおよび変異体rasＳＤ部位)が発現を顕著に増加させた(８.４および７.７倍)が、従来のベクターにより作られたプールはわずかに増加させた(２.８倍)ことを示す。従来のベクターと比較して最良のジシストロン性(ＷＴrasＳＤ)ベクターを用いて９倍という全体の増加が増幅後得られた。栄養素に富む生産培地における最高発現の増幅したプールの増殖は、４.２μg／ml tＰＡという力価を生じた。スプライスドナー配列を操作すると、スプライスされたメッセージの完全長のメッセージに対する割合および選択培地において形成するコロニー数が変化することが示された。ジシストロン性発現ベクターは、高レベルの組換えタンパク質を発現するクローンを生じることも示された。驚くべきことに、これらの細胞中で形成されるＲＮＡ前駆体からＤＨＦＲ遺伝子がスプライスされる効率にかかわらず、ＤＨＦＲ⁺についての選択により有効なＷＴrasスプライスドナー部位を有する高発現体を単離することが可能であった。実施例２ジシストロン性発現ベクターを用いるＴＮＦr−ＩgＧ製造このアプローチの一般的な応用性を証明するために、問題のＤＮＡとして、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)を結合できるイムノアドヘシン(ＴＮＦr−ＩgＧ)(Ａshkenaz i等、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Sci.U.S.A.、８８：１０５３５〜１０５３９[１９９１ ])を含むジシストロン性ベクター系において第２の生成物を評価した。生成物遺伝子がイムノアドヘシンＴＮＦr−ＩgＧをコードすることを除いては、実施例１に記載の実験を本質的に繰返した。ＴＮＦr−ＩgＧ cＤＮＡ、および(a)ＷＴr as、すなわち図６(配列番号２)、(b)変異体rasまたは(c)非機能性スプライスドナー部位を含むプラスミドＤＮＡを、実施例１について論じたようにdp１２.ＣＨＯ細胞中に導入した。ＤＮＡ構築物の説明について図１Ｃを参照。これらの３つのベクターにより作られたＤＨＦＲ陽性コロニーの数はtＰＡ構築物について見られたものと類似していることが発見された。ＴＮＦr−ＩgＧの発現もtＰＡ構築物について見られたものとパラレルであった（図７Ａ）。構築物の２つからのプールの増幅は、イムノアドヘシンの発現の著しい増加を示した (９.６および６.８倍)(図７Ｂ)。これらの増幅されたプールの最良のものは、栄養素に豊む生産培地で増殖させた場合、９.５μg／mlを発現した。このように、ジシストロン性発現ベクターは、高レベルの組換えタンパク質を発現させるクローンを作ることが再び示された。更に、予期に反して、高生成物を発現する宿主ＤＨＦＲ⁺細胞の単離が有効なスプライスドナー部位(すなわちＷＴrasスプライスドナー部位)を用いて可能であることが発見された。実施例３ジシストロン性発現ベクターを用いる抗体製造抗体発現についての本システムの有用性を、ＩgＥに対する抗体(Ｐresta等、Ｊournal of lmmunology 、１５１：２６２３〜〜２６３２[１９９３])の製造を試験することにより評価した。さらに転写開始に関するシステムの柔軟性を、前のベクターに存在したＣＭＶプロモーター／エンハンサーを、ＳＶ４０ウイルスの初期領域に由来するプロモーター／エンハンサー(Ｇriffin,Ｂ.、ＳＶ４０およびポリオーマウイルスの構造およびゲノム組織、Ｊ.Ｔooze編、ＤＮＡＴumor Ｖivuses中、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク)で置換することにより試験した。該抗体の重鎖を、前のtＰＡおよびＴＮＦr−ＩgＧ構築物に記載したようにＤＨＦＲの下流に挿入した。さらに、実施例１および２で試験したベクターに存在するスプライスドナー部位よりも、そのコンセンサススプライスドナー部位により密にマッチする、新しいスプライスドナー部位配列(ＧＡＣ：ＧＴＡＡＧＴ)を、ベクター中に入れた。生じた発現ベクターを図１Ｄおよび９に示す。このベクターは前に試験したベクターより少ないコロニーを作り、主にスプライスされたＲＮＡ生成物を作ることが発見された。ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの制御下の抗体の軽鎖およびポリＡ、並びにＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡを有する第２のベクターを構築した。これらのベクターを、ポリＡシグナルの下流で唯一のＨpaＩ部位でリニアライズし、１０：３の軽鎖ベクター：重鎖ベクターの割合で混合し、最適化されたプロトコール(実施例１および２で論じたような)を用いてＣＨＯ細胞中にエレクトロポレートした。図１１は、ハイグロマイシンＢにおける選択後のＤＨＦＲ発現についての選択後、コロニーおよびプールにより発現された抗体のレベルを示す。分析したコロニーの２０すべてが富培地中で増殖させた場合高レベルの抗体を発現し、互いに４倍しか異ならなかった。抗体産生コロニーのプールを作り、それが作られた後短い時間にアッセイした。そのプールは生産性の顕著な減少なしに６週間連続的に増殖し、その安定性は大規模培養からg量のタンパク質を作るのに十分であることを示した。そのプールを２００nＭおよび１μＭのメトトレキセート増幅に付し、抗体力価の２倍以上の増加を達成した。１μＭＭtx耐性プールは、懸濁培養で最適条件下に増殖させた場合４１mg／Ｌの力価を達成した。発現した抗体の構造を調べた。２００nＭメトトレキセート耐性プールにより、および従来のベクター(Ｐresta等、[１９９３]、上書)により作られたよく特性決定された発現クローンにより発現されたタンパク質をＳ³⁵システインおよびメチオニンで代謝的に標識した。特に、細胞の集密３５mmプレートを、血清を含まない、システインおよびメチオニンを含まないＦ１２：ＤＭＥＭ中で５０μＣ iの各Ｓ−３５メチオニンおよびＳ−３５システイン(Ａmersham)で代謝的に標識した。一時間後、栄養素に富む生産培地を加え、標識したタンパク質をさらに６時間培地中に「チエイス」させた。タンパク質を非還元で１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル(Ｎovex)で、またはＢ−メルカプトエタノールによる還元後実験した。乾燥したゲルを１６時間フイルムにさらした。ＣＨＯコントロール細胞も標識した。抗体タンパク質の大部分は、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する適切にジサルファイド結合した抗体分子と一致する、約１５５キロダルトンの分子量で分泌する。還元によって、分子量は２２.５および５５キロダルトンの２つのほぼ等しい量のタンパク質にシフトする。該プールから生じるタンパク質は、よく特性決定された発現クローンにより製造される抗体と区別できず、プールにより発現される重または軽鎖の明らかな増加はない。結論本明細書に記載する有効な発現系は、プロモーター／エンハンサー因子、その後の選択可能なマーカーコード配列を有するイントロン、その後の問題のcＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルよりなるベクターを用いる。いくつかのスプライスドナー部位配列を、コロニー数および問題のcＤＮＡの発現に及ぼすそれらの影響について試験した。非機能性のスプライスドナー部位、Ｈarvey Ｒas遺伝子の変異体(変異体ras)および正常(ＷＴras)形のエクソン３および４の間のイントロンに見出されるスプライスドナー部位、並びに他の有効なＳＤ部位(実施例３参照)を用いた。ベクターを設計してジシストロン性一次転写物の発現を行わせた。トランスフェクトされた細胞内部で、転写物のいくつかは完全長であるが、残りはスプライスされてＤＨＦＲコード配列を切り出す。スプライスドナー部位が弱められ、または破壊された場合、コロニー数の増加が認められる。発現レベルは逆のパターンを示し、最も有効なスプライスドナー部位が最高レベルtＰＡ、ＴＮＦrイムノアドヘシンまたは抗ＩgＥＶ_Hを作る。 rasスプライスドナー部位イントロンＤＨＦＲベクターにより作られるクローンの発現の均一性を、ＤＨＦＲおよびtＰＡ各々について別のプロモーター／エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを有する従来のベクターから作られるクローンと比較した。ＤＨＦＲイントロンベクターは、従来のベクターにより作られるものより、発現に関しずっと均一であるコロニーを生ずる。従来のベクターから作られる非発現性ベクターは、ゲノムへの組込中のプラスミドのtＰＡまたはＴＮＦr−ＩgＧドメインの切断の結果、またはtＰＡまたはＴＮＦr−ＩgＧ発現を駆動するプロモーター因子のメチル化の結果かも知れない(Ｂusslinger等、Ｃell、３４：１９７〜２０６[１９８３]；Ｗatt等、Ｇenes and Ｄevelopmen t 、２：１１３６〜１１４３[１９８８])。メチル化またはＤＨＦＲ−イントロンベクターにおける切断によるプロモーターの沈黙化は、それらをＤＨＦＲ陽性の表現型を与えることを不可能にしやすいであろう。ＤＨＦＲ−イントロンベクターにより作られたプールはメトトレキセート中で増幅でき、８.４倍(tＰＡ)または９.８倍(ＴＮＦr−ＩgＧ)発現を増加させることが見出された。従来のベクターからのプールは同様に増幅された場合、tＰＡおよびＴＮＦr−ＩgＧについてわずか２.８および３倍増加させた。増幅したプールは、従来のベクター増幅プールと比較した場合、９倍高いtＰＡレベルおよび１５倍高いＴＮＦr−ＩgＧレベルをもたらした。いかなる理論にも限定されるものではないが、ジシストロン性ベクターに由来するメトトレキセート耐性プールの発現の増加は、ＤＨＦＲおよび生成物の転写結合のためらしい；細胞がＤＨＦＲ発現の増加について選択された場合、それらは生成物を過発現する。従来のアプローチは選択可能マーカーおよびcＤＮＡ発現結合を欠き、それ故メトトレキセート増幅は、生成物発現の同時増加なしにＤＨＦＲ過発現をしばしば生ずる。増幅したtＰＡおよびＴＮＦr−ＩgＧプールを、選択および増幅に用いた培地から、栄養素に富む生産培地に移した場合、４および６.３倍という更なる発現の増加が得られた。実施例３において、発現ベクターは、コンセンサススプライスドナー配列により密にマッチするスプライスドナー部位を有し、下流に挿入したヒト化抗ＩgＥ抗体の重鎖を有する。このベクターをリニアライズし、第２のリニアライズされたベクターとコエレクトポレートした。その第２ベクターはハイグロマイシン耐性遺伝子および抗体の軽鎖を、自身のプロモーター／エンハンサーおよびポリＡシグナルの制御下に発現させる。重鎖ジシストロン性発現ベクターに比べ過剰の軽鎖発現ベクターを用い、軽鎖発現に偏らせた。ハイグロマイシンＢおよびＤＨＦＲ選択後にクローンおよびプールを作った。クローンはプールと同じように比較的終始変わらない、高レベルの抗体を発現することが見出された。懸濁液培養における最適条件下に増殖させた場合１μＭのプールは４１mg／Ｌという力価を与えた。抗ＩgＥ抗体を、代謝的標識およびその後の還元的および非還元的条件下のＳＤＳ／ＰＡＧＥにより評価し、それが、十分特性決定されたクローン細胞ラインにより発現されるタンパク質と区別できないことが見出された。遊離の軽鎖がクローンに関するプール中に認められないという発見が特に重要である。高レベルの組換えタンパク質を早く、そして他の発現系で必要とされるものより少ない努力で製造する、ＣＨＯ細胞についての安定な発現システムが開発された。そのベクターシステムは終始変わらず高レベルを発現する安定なクローンを発生し、それによって高度に生産性のクローンラインを得るためにスクリーニングしなければならないクローン数を減少させる。或いは、プールを用いて高レベルのタンパク質に対するモデレート(moderate)を都合よく作った。この方法は多くの関連タンパク質を発現させ、比較しなければならない場合特に有用であり得る。この説に限定されるものではないが、非常に有効なスプライスドナー部位を有するベクターは非常に生産性のクローンを作ることが可能である。何故ならわずかな転写物がスプライスされずに残るので、高レベルのＲＮＡの産生をもたらす組込みの事象のみが、選択培地中でコロニーを生ずるに十分なＤＨＦＲタンパク質を作るからである。そのようなクローンからの高レベルのスプライスされたメッセージを、豊富な量の問題のタンパク質に次に翻訳する。従来のベクターを導入することにより同時に作ったクローンのプールは、低レベルのタンパク質を発現し、長期間の発現に関して不安定であり、細胞をメトトレキセート増幅に付した場合、発現をあまり増加させなかった。高レベルの、単一および多数のサブユニットポリペプチドが、安定なトランスフェクタントのクローンまたはプールから急速に生成することを可能にするという点で、本発明で開発したシステムは多才である。この発現システムは、一時的発現システムの利点(研究量のタンパク質の急速な労力の不必要な発現)を、非常に生産性の高い安定な製造細胞ラインの同時の発生と組み合わせる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．転写開始部位、転写終了部位、選択可能な遺伝子、選択可能な遺伝子の３' に設けられた生成物遺伝子、選択可能な遺伝子および生成物遺伝子の両方の転写を制御する転写制御鎖を含んでなり、選択可能な遺伝子はイントロンのスプライスドナー部位５'を有するイントロンの内部に位置し、そのスプライスドナー部位は転写制御領域を用いて生成物遺伝子の発現を制御するＤＮＡ構築物。２．スプライスドナー部位が有効なスプライスドナー配列を含有する請求項１に記載のＤＮＡ構築物。３．スプライスドナー部位がコンセンサススプライスドナー配列を含有する請求項２に記載のＤＮＡ構築物。４．スプライスドナー部位が配列ＧＡＣＧＴＡＡＧＴを含有する請求項２に記載のＤＮＡ構築物。５．選択可能な遺伝子が増幅可能な遺伝子である請求項１に記載のＤＮＡ構築物。６．増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲである請求項５に記載のＤＮＡ構築物。７．転写制御領域がプロモーターおよびエンハンサーを含有する請求項１に記載のＤＮＡ構築物。８．請求項１に記載のＤＮＡ構築物を含有するベクター。９．ＤＮＡ構築物の選択可能な遺伝子が増幅可能な遺伝子である請求項８に記載のベクター。１０．真核宿主中で複製できる請求項８に記載のベクター。１１．請求項１０に記載のベクターを含有する真核宿主細胞。１２．請求項５のＤＮＡ構築物を含有する真核宿主細胞。１３．ベクターを宿主細胞にエレクトロポレーションにより導入する請求項１１に記載の宿主細胞。１４．宿主細胞の染色体に組込まれた請求項１に記載のＤＮＡ構築物を含有する真核宿主細胞。１５．哺乳動物細胞である請求項１４に記載の宿主細胞。１６．請求項１１に記載の宿主細胞を培養して生成物遺伝子を発現させ、宿主細胞培養から生成物を回収することを含んでなる問題のタンパク質の製造方法。１７．培地から生成物を回収することを更に含んでなる請求項１６に記載の方法。１８．選択可能な遺伝子が増幅可能な遺伝子であり、スプライスドナー部位が有効なスプライスドナー配列を含有する請求項１６に記載の方法。１９．請求項１２に記載の宿主細胞を培養して、十分な時間増幅剤を含有する選択培地中で生成物遺伝子を発現させて、増幅を起こさせ、生成物を回収することを含んでなる問題の生成物の製造方法。２０．真核細胞を請求項５に記載のＤＮＡ構築物でトランスホームし、増幅剤を含む選択培地中で増幅が起こるのに十分な時間増殖させ、生成物遺伝子の多重コピーを有する細胞を選択することを含んでなる、生成物遺伝子の多重コピーを有する真核細胞の製造方法。２１．問題の生成物を選択した細胞から回収することを更に含んでなる請求項２０に記載の方法。