JPH10239317A - 地帯現象抑制測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】試料中に被検物質が過剰に存在しても地帯現象
を防ぐことができ、よって陽性の試料を陰性と誤って判
定することを防止でき、そして特別な装置を使用するこ
となく、簡便かつ正確に試料中の被検物質の測定を行う
ことができる測定方法及び測定試薬を提供する。 【構成】試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固
定された面を有する担体の該面に試料を接触させる工
程、及び被検物質に対する特異的結合物質であって前記
担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異
的結合物質が固定された粒子を前記面に接触させる工程
を含む、前記面における前記粒子の分布状態から試料中
の被検物質の存在の測定を行う測定方法において、前記
担体に固定された特異的結合物質又は前記粒子に固定さ
れた特異的結合物質とは別に被検物質に対する特異的結
合物質を前記工程の一方又は両方において存在させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質に対する
特異的結合物質が固定された担体、及び被検物質に対す
る特異的結合物質が固定された粒子を用いて、担体の面
における粒子の分布状態から試料中の被検物質の存在の
測定を行う測定方法において、試料中に被検物質が過剰
に存在する場合でも、正確かつ簡便に測定を行うことが
できる測定方法及び測定試薬に関するものである。本発
明は、生命科学分野、特に臨床検査分野における疾病の
診断等に有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチ
ド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセ
プター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用
した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法は種々
のものが知られている。

【０００３】中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応
（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施さ
れている。この免疫学的測定方法として、抗体若しくは
抗原を固定した粒子の凝集を検出する間接凝集反応測定
法、又は抗原若しくは抗体に結合させた標識物質を検出
する放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ法）等が用いられてきた。

【０００４】これらの免疫学的測定方法のうち間接凝集
反応測定法は、簡易かつ安価な方法であることより汎用
されている。

【０００５】この間接凝集反応測定法は、被検物質に対
する抗体（被検物質が抗体の場合は抗原を使用すること
も可能）を固定した粒子（ラテックス粒子若しくはゼラ
チン粒子等の高分子粒子又は赤血球等）と被検物質を含
むと推定される試料を、マイクロタイタープレート等の
底面がＵ字状又はＶ字状になった測定容器内で混合し、
反応させて、被検物質を介して生じた粒子間の凝集の凝
集像を観察することにより、試料中の被検物質の存在の
有無を判定するものである。

【０００６】図３は、この間接凝集反応測定法等の試料
中の被検物質の存在の有無を粒子の分布状態により測定
する測定方法における粒子の分布状態の像を示したもの
である。

【０００７】

【図３】

【０００８】試料中に被検物質が存在しない（陰性）場
合、抗体（又は抗原）を固定した粒子は凝集を起こさな
いので重力によりそのまま沈降し、Ｕ字状又はＶ字状等
の測定容器の内壁面に沿って転がり落ちて（滑り落ち
て）、測定容器の底面中央部に集まる。従って、陰性の
場合、測定容器の上方から見ると、測定容器の底面中央
部に粒子が収束した像が観察される（図３のＡ）。一
方、試料中に被検物質が存在する（陽性）場合、抗体
（又は抗原）を固定した粒子は被検物質を介して三次元
的な凝集を起こして凝集塊を生成する。この凝集塊は、
凝集を起こしていない粒子に比べると測定容器の内壁面
上を転がり難く（滑り落ち難く）、転がり速度（滑り落
ち速度）が小さいので、測定容器の内壁面に広がった状
態で止まる。従って、陽性の場合、測定容器の上方から
見ると、粒子が測定容器底面に広がった状態、即ち「ボ
タン」状の凝集像が観察でき（図３のＢ）、試料中に被
検物質が存在することを確認できる。

【０００９】また、特開昭６４−６９９５４号公報に
は、検体試料中の被検物質である抗原又は抗体に対応す
る抗体又は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体試料
を加え、同時に又は次いでこの検体試料を洗浄すること
なく測定容器に固定させたものと同一の抗体又は抗原或
いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性担体粒子を
測定容器に加え、発現する凝集反応の有無により検体試
料中の被検物質である抗原又は抗体の有無を判定する免
疫学的測定方法が開示されている。この測定方法におい
て検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が存在
しない（陰性）場合の測定容器内の状態を上方から見る
と、図３のＡに示した凝集像と同様の像が観察される。
そして、検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）
が存在する（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から
見ると、図３のＢに示した凝集像と同様の像が観察され
る。この特開昭６４−６９９５４号公報に記載の測定方
法は、低濃度の被検物質を測定することができ、地帯現
象を抑制でき、かつ短時間で明瞭な凝集像を得ることが
できるという特徴を持つ測定方法である。

【００１０】更に、特開平２−１２４４６４号公報に
は、被測定物質（被検物質）に特異的に結合するか又は
これと競合する物質（抗体又は抗原等）を磁性粒子に固
定化した磁性マーカー粒子とサンプル溶液（試料）とを
混合し、この反応溶液に対し測定容器の所定の壁面領域
の外側に配置した磁石を作用させ、これにより所定の壁
面領域に集められた磁性マーカー粒子の分布状態に基づ
いてサンプル中の被測定物質を測定する免疫学的測定方
法が開示されている。この測定方法においてサンプル中
に被測定物質が存在しない（陰性）場合に測定容器内の
状態を上方から見ると、図３のＡに示した凝集像と同様
の像が観察され、サンプル中に被測定物質が存在する
（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から見ると図３
のＢに示した凝集像と同様の像が観察される。この特開
平２−１２４４６４号公報に記載の測定方法は、磁性粒
子を磁石により測定容器底面に引き寄せて磁性粒子の沈
降速度を増大させることにより、測定容器底面の凝集像
の形成を短時間で行わせ、判定に要する時間を短縮する
ことができると記載されている。

【００１１】しかしながら、上記の間接凝集反応測定
法、特開平２−１２４４６４号公報に記載の測定方法、
及び標識物質を検出する放射免疫測定法（ＲＩＡ法）並
びに酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）等のいずれの免疫学的
測定方法においても、測定反応系中の被検物質に対する
特異的結合物質（抗体又は抗原）に対して試料中の被検
物質（抗原又は抗体）が過剰に存在する場合には、あた
かも試料中に被検物質が存在しないか、又は実際に存在
する量よりも少なく測定されてしまうことがある。（地
帯現象、プロゾーン現象 、ポストゾーン現象又はフッ
ク現象）この地帯現象では、試料中に被検物質が存在す
る（陽性）のに被検物質が存在しない（陰性）と判定し
てしまったり、実際に存在する量よりも少なく定量して
しまい、誤った結果が得られてしまう。なお、特開昭６
４−６９９５４号公報に記載の測定方法は、地帯現象を
抑制できるものの、試料中の被検物質が余りに大過剰な
場合には影響を受けてしまうこともあるものであった。
このように陽性の試料を陰性と誤って判定する可能性が
あるということは、特に臨床検査による疾病の診断にお
いては重大な問題となっていた。

【００１２】「ジャーナル オブ オートマティック
ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｍａｔ
ｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２巻，１４９〜１５２
頁，１９８０年」にリーク（Ｌｅｅｋ）らは、試料中の
ヒト胎盤ラクトーゲン（ｈＰＬ）を、抗ヒト胎盤ラクト
ーゲン（ｈＰＬ）抗体を結合させたラテックス粒子と反
応させ、生成する凝集粒子及び非凝集粒子を血球計数装
置で計数することにより測定を行う粒子計数免疫検定法
（ＰＡＣＩＡ）において、反応系に遊離の抗ヒト胎盤ラ
クトーゲン（ｈＰＬ）抗体を添加することにより反応感
度を下げて、試料の希釈倍数が１０倍であっても地帯現
象の影響を受けずに測定が行えたことを記載している。
しかしながら、この粒子計数免疫検定法（ＰＡＣＩＡ）
は、高価である血球計数装置を使用する特殊な測定方法
であって、限られた施設でしか実施することができない
ものである。

【００１３】特開昭５９−４６８５６号公報には、液体
試料中の抗原を、抗体（抗原と結合して凝集を起こさせ
る試薬）を担持した微細粒子と混合し、これより生ずる
粒子の凝集の程度を測定して、液体試料中の抗原の存在
量を定量する粒子凝集検定法において、反応混合物中に
更に、抗原に対する１価の抗体〔Ｆ（ａｂ）断片〕（抗
原と等価であって抗原と結合してその結合した抗原が粒
子を凝集し得ないようにする能力のある物質）を溶解含
有させることにより、地帯現象を抑制することができる
ことが記載されている。しかし、ここで示された測定方
法は粒子計数免疫検定法（ＰＡＣＩＡ）であるので、や
はり限られた施設でしか実施することができないもので
ある。

【００１４】特開平６−３２４０４３号公報には、サン
プル液中の分析対象物を、粒子状キャリヤー物質に固定
した分析対象物に対する抗体（分析対象物に特異的に結
合することができるレセプターＲ₁ ）に結合させ、サン
プル液中の分析対象物を測定する方法において、分析対
象物へ２つの結合部位を有する抗体（分析対象物への少
なくとも２つの結合部位を有するレセプターＲ₂ ）を含
有させることにより、フック作用（地帯現象）による妨
害を回避、防止できることが記載されている。しかしな
がら、ここで示された測定方法は、サンプル液中の分析
対象物と粒子状キャリヤー物質に固定した分析対象物に
対する抗体の結合を、結合により生じた濁度を機器を用
いて測定するものであるので、濁度を測定することがで
きる装置の使用が必須なものである。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記し
た従来の測定方法及び測定試薬が有する問題点を解決す
べく鋭意検討を重ねた結果、試料中に被検物質が過剰に
存在しても地帯現象を防ぐことができ、よって陽性の試
料を陰性と誤って判定することを防止でき、そして特別
な装置を使用することなく、簡便かつ正確に試料中の被
検物質の測定を行うことができる測定方法及び測定試薬
を完成するに至った。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の被検
物質に対する特異的結合物質が固定された面を有する担
体の該面に試料を接触させる工程、及び被検物質に対す
る特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的
結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された
粒子を前記面に接触させる工程を含む、前記面における
前記粒子の分布状態から試料中の被検物質の存在の測定
を行う測定方法において、前記担体に固定された特異的
結合物質又は前記粒子に固定された特異的結合物質とは
別に被検物質に対する特異的結合物質を前記工程の一方
又は両方において存在させることを特徴とする、試料中
の被検物質の測定方法である。また、本発明は、少なく
とも、試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定
された面を有する担体、被検物質に対する特異的結合物
質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一
又は異なる特異的結合物質が固定された粒子、及び遊離
の被検物質に対する特異的結合物質より構成される、試
料中の被検物質の測定試薬である。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明において測定を行う被検物
質としては、タンパク質、糖質、脂質、核酸のような有
機物質、無機物質等の生体関連物質であればいずれのも
のでもよい。具体的には、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、
ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗
ＨＤＶ抗体、抗ＨＥＶ抗体、抗ＨＧＶ抗体等のウイルス
関連の抗原又は抗体；大腸菌Ｏ１５７抗原、抗トレポネ
ーマ・パリダム（ＴＰ）抗体、抗マイコプラズマ抗体、
抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）、抗クラミジア抗
体等の細菌関連の抗原又は抗体；免疫グロブリンＧ(Ig
G）、免疫グロブリンＡ(IgA) 、免疫グロブリンＭ(IgM)
、若しくは免疫グロブリンＥ(IgE) 等の免疫グロブリ
ン；Ｃ反応性タンパク質（CRP)、α1-酸性糖タンパク
質、ハプトグロビン、補体Ｃ3 、補体Ｃ4 、リウマトイ
ド因子等の炎症マーカー；α−フェトプロテイン、ＣＥ
Ａ、ＣＡ19-9等の腫瘍マーカー；ヒト胎盤絨毛性ゴナド
トロピン等のホルモン；アレルゲン、アレルゲン特異Ig
E 抗体等のアレルギー関連の抗原又は抗体；抗トロンビ
ンＩＩＩ(ATIII) 等の血液凝固系関連物質；フィブリン
体分解物(FDP) 、Ｄダイマー等の線溶系関連物質；ＡＢ
Ｏ式血液型抗体、不規則抗体等の血液型関連の抗原又は
抗体；ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡ；細菌のＤＮＡ又は
ＲＮＡ；ヒト等の動物若しくは植物のＤＮＡ又はＲＮ
Ａ；リポタンパク質(a) 等の他の疾病に関連した物質又
は薬物等を例示することができる。特に、被検物質とし
て抗ＨＢｃ抗体（抗Ｂ型肝炎ウイルス・コア抗体）は好
適である。

【００１８】本発明において、試料とは、前記の被検物
質が存在する可能性があり、かつその被検物質の存在の
有無の確認又は場合によっては定量を行おうとする液状
のものをいう。例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、鼻汁
等の体液；ヒト又は動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、
爪、筋肉、神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の
抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽
出液等が挙げられる。

【００１９】本発明において、被検物質に対する特異的
結合物質（以下、単に特異的結合物質と言うことがあ
る）とは被検物質に対し親和性を有する物質を言い、被
検物質との特異的な相互作用により該被検物質に非共有
結合的に安定に結合する物質をいう。例えば、特異的結
合物質は、被検物質が抗原の場合にはその抗体であり、
被検物質が抗体の場合にはその抗原又はその抗体に対す
る抗体であり、被検物質がヌクレオチド鎖の場合にはそ
れと相補的なヌクレオチド鎖である。また、被検物質が
リガンドの場合にはそのレセプターである。粒子に固定
される特異的結合物質と、担体に固定される特異的結合
物質は、被検物質を介しての結合が可能であれば、それ
ぞれ同一でも異なってもよい。そして、「試料中の被検
物質に対する特異的結合物質が固定された面を有する担
体の該面に試料を接触させる工程」（以下、第１の工程
と言うことがある）及び「被検物質に対する特異的結合
物質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同
一又は異なる特異的結合物質が固定された粒子を前記面
に接触させる工程」（以下、第２の工程と言うことがあ
る）の一方又は両方において存在させる被検物質に対す
る特異的結合物質は、担体に固定された被検物質に対す
る特異的結合物質、及び／又は、粒子に固定された被検
物質に対する特異的結合物質と、同一でも異なってもよ
い。遊離の被検物質に対する特異的結合物質も、担体に
固定された被検物質に対する特異的結合物質、及び／又
は、粒子に固定された被検物質に対する特異的結合物質
と、同一でも異なってもよい。第１の工程及び第２の工
程の一方又は両方において存在させる被検物質に対する
特異的結合物質、及び遊離の被検物質に対する特異的結
合物質は、被検物質に対する特異的結合部位を１箇所又
は２箇所以上持つものである。

【００２０】本発明に用いられる粒子としては、一般に
間接凝集反応測定法に用いられる粒子でよい。例えば、
リポソ−ム、ラテックス粒子、ゼラチン粒子、ポリアク
リルアミド粒子、ポリスチレン粒子、マイクロカプセ
ル、エマルジョン等の有機高分子粒子、ガラスビ−ズ、
シリカビ−ズ、ベントナイト等の無機高分子粒子、他の
人工粒子、及び赤血球等を挙げることができる。

【００２１】また、粒子として磁性粒子を用いることも
できる。この磁性粒子は、少なくとも外部から磁石を作
用させている間は磁化する粒子であればよい。この磁性
粒子としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の強
磁性金属、これらの強磁性金属を含む合金、非磁性体中
に強磁性金属又は強磁性金属を含む合金を含有するも
の、強磁性金属中又は強磁性金属を含む合金中に非磁性
体を含有するもの等の強磁性体を単独で粒子状に成形し
た粒子、強磁性体を核としてその表面をポリスチレン、
シリカゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の高分子
物質で被覆した粒子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラ
チン、アクリルアミド等の高分子物質の粒子を核として
強磁性体を被覆した粒子、赤血球、リポソーム又はマイ
クロカプセル等の閉じた袋状の物質に強磁性体を封入し
た粒子等を挙げることができる。なお、この磁性粒子
は、外部から磁石を作用させている間は磁化し、外部か
らの磁石の遮断により速やかに減磁する性質を持つもの
であることが特に好ましく、そのような磁性粒子として
は、例えば、強磁性体である酸化鉄(III) (Fe2O3)を粒
子内に分散させた磁性粒子である「Dynabeads M-450 un
coated（商品名）〔ダイナル社製〕」が挙げられる。

【００２２】更に、粒子としては、色素を被覆するか又
は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着
色したものを使用してもよい。

【００２３】粒子の粒子径は、好ましくは0.01〜100 μ
ｍであり、特に好ましくは 0.5〜10μｍである。また、
粒子の比重は、分散媒中で沈降する比重であれば良く、
例えば比重１〜１０のものが好ましい。

【００２４】本発明においては、被検物質に対する特異
的結合物質が固定された粒子を用いるが、特異的結合物
質を粒子に固定するには、特異的結合物質を前記の粒子
の表面に疎水結合、親水吸着等の物理的吸着法、共有結
合等の化学的結合法又はこれらの方法の併用などにより
行うことができる。

【００２５】特異的結合物質の粒子への固定を物理的吸
着法により行う場合は、公知の方法に従って、該特異的
結合物質と粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させ
ることにより行うことができる。例えば、特異的結合物
質と粒子を緩衝液等の溶液中で混合し撹拌することによ
り接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜約１日間吸着反
応を行わせた後、得られた粒子を緩衝液等で洗浄すれば
よい。

【００２６】また、特異的結合物質の粒子への固定を架
橋試薬による化学的結合法によって行う場合は、日本臨
床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号 臨床検査
のためのイムノアッセイ−技術と応用−」, 臨床病理刊
行会, 1983年、日本生化学会編「新生化学実験講座１
タンパク質IV」, 東京化学同人, 1991年等に記載の公知
の方法に従い、特異的結合物質と粒子をグルタルアルデ
ヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド、
トリニトロメタン等の二価性の架橋試薬と混合、接触さ
せ、特異的結合物質と粒子のそれぞれのアミノ基、カル
ボキシル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等の官
能基を架橋試薬と反応させることにより固定することが
できる。例えば、粒子を含む緩衝液等にグルタルアルデ
ヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド、
トリニトロメタン等の二価性の架橋試薬を加え、撹拌し
反応させる。次にこれに特異的結合物質を加え、撹拌し
て反応させる。場合によっては、その後これに透析、ゲ
ルろ過などの処理により架橋試薬を除くか若しくは架橋
反応の反応停止剤を添加すること等により反応を停止さ
せる。そして、得られた粒子を緩衝液等で洗浄すればよ
い。

【００２７】また、特異的結合物質の粒子への固定量を
変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高低に
応じて容易に感度を変更することができる。例えば、粒
子に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特異的結
合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高めること
ができる。

【００２８】必要があれば非特異的反応を抑制するた
め、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイ
ン又はその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳等を特異
的結合物質を固定した粒子に接触させること等の公知の
方法により、該粒子をマスキングしてもよい。例えば、
マスキングは特異的結合物質を固定した粒子をウシ血清
アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩
などの各種タンパク質などを含む緩衝液等に加え静置
し、該粒子の表面を各種タンパク質等でコーティングす
ることにより行うことができる。

【００２９】本発明において、担体としては、被検物質
に対して特異的結合物質が固定された面を有する担体を
使用する。担体としては特異的結合物質を固定させる面
を有しており、該面に試料等の溶液（液体）を接触させ
ることができる限りいずれの形状、構造でもよく、例え
ば、測定容器や、板状体などが挙げられる。本発明にお
いて、担体としては、試料等の溶液（液体）を保持する
ことができるもので有ればその形状、大きさ、材質等は
特に問わない。例えば、間接凝集反応測定法において使
用される担体であれば特に制限無く用いることができ
る。この担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロ
ン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン又
はポリメタクリレートなどから成る試験管、Ｕ型、Ｖ
型、若しくはＵＶ型などのマイクロプレート又はトレイ
等の測定容器あるいは板状体等を用いることができる。

【００３０】特異的結合物質の担体の面への固定化は、
物理的吸着法又は架橋試薬による化学的結合法によって
行うことができる。物理的吸着法による場合は、公知の
方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質と担体
の面とを接触させることにより行うことができる。例え
ば、担体が測定容器の場合、緩衝液等に溶解した特異的
結合物質を該測定容器の凹部に入れて静置することによ
り接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜約１日間吸着反
応を行わせた後、凹部の液を吸引除去し、緩衝液等で洗
浄すればよい。

【００３１】また、架橋試薬による化学的結合法により
行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特
集第53号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応
用−」, 臨床病理刊行会, 1983年、日本生化学会編「新
生化学実験講座１ タンパク質IV」, 東京化学同人, 19
91年等に記載の公知の方法に従い、被検物質に対する特
異的結合物質と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイ
ミド、イミドエステル、マレイミド、トリニトロメタン
等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特異的結合物
質と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオ
ール基、アルデヒド基、水酸基等と反応させることによ
り固定させることができる。例えば、担体が測定容器の
場合、該測定容器の凹部にグルタルアルデヒド、カルボ
ジイミド、イミドエステル、マレイミド、トリニトロメ
タン等の二価性の架橋試薬を加え、静置して反応させ
る。次いでこれに特異的結合物質を加えて静置すること
により反応させる。場合によっては、その後これに架橋
反応の反応停止剤を添加すること等により反応を停止さ
せる。そして、緩衝液等で洗浄を行う。

【００３２】更に、必要があれば非特異的反応を抑制す
るため、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オ
ボアルブミン、カゼイン、フィッシュ・プロテイン、ゼ
ラチン若しくはその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳
等を特異的結合物質を固定した担体に接触させること等
の公知の方法により、特異的結合物質を固定した担体を
マスキングしてもよい。例えば、担体が測定容器である
場合には、特異的結合物質を固定した該測定容器の凹部
にウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オボアル
ブミン、カゼイン、フィッシュ・プロテイン、ゼラチン
又はその塩などの各種タンパク質などを含む緩衝液等を
加えて静置し、特異的結合物質を固定した測定容器の凹
部の表面を各種タンパク質等でコーティングした後、凹
部の液を吸引除去することにより行うことができる。

【００３３】本発明の試料中の被検物質の測定方法にお
いては、まず、上記のように被検物質に対する特異的結
合物質が固定された面を有する担体の該面に被検物質の
存在が疑われる試料を接触させる。（第１の工程）

【００３４】担体が例えば上記したような測定容器の場
合には、該測定容器の凹部に試料を添加することにより
測定容器の内壁面と試料とを接触させることができる。

【００３５】試料は、例えば希釈液により希釈して担体
に接触させることができる。この試料の希釈液として
は、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣ
ＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥ
Ｓ、ＴＥＳ若しくはＢＥＳなどよりなるグッド（Ｇｏｏ
ｄ）の緩衝液、クエン酸、クエン酸二ナトリウム、コハ
ク酸水素ナトリウム、マレイン酸水素ナトリウム、フタ
ル酸水素カリウム若しくはグリシンなどよりなる有機系
緩衝液、ホウ酸、リン酸若しくはイミダゾールなどより
なる無機系緩衝液又はリン酸緩衝生理食塩水等の各種緩
衝液、あるいは生理食塩水等を用いることができる。な
お、この緩衝液のpHについては、pH４〜12の範囲内にあ
ることが好ましい。

【００３６】また、試料の希釈液には、ウシ血清アルブ
ミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、又はその塩など
の各種タンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各
種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血
清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤、非イオン性界
面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性
剤などの各種界面活性剤等の添加剤を適宜加えて用いる
ことができる。

【００３７】そして、これらの添加剤を加える際の濃度
は特に限定されるものではないが、0.001 〜10％(w/v)
が好ましく、特に0.01〜５％(w/v) が好ましい。

【００３８】また、界面活性剤としては、ソルビタン脂
肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセ
リン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エ
ステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
フィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチ
レンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒ
マシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリン等
の非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面
活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩
若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩な
どの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

【００３９】上記の特異的結合物質が固定された担体の
面に試料を接触させる工程（第１の工程）と同時に又は
その後に、被検物質に対する特異的結合物質であって前
記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特
異的結合物質が固定された粒子をこの担体の面に接触さ
せる。（第２の工程） なお、第２の工程の後に第１の工程を行っても構わな
い。

【００４０】そして、粒子は、例えば適当な分散媒に分
散して担体の面に接触させることができる。この試料の
分散媒としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、
ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ若しくはＢＥＳなどよりなるグ
ッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液、クエン酸、クエン酸二ナト
リウム、コハク酸水素ナトリウム、マレイン酸水素ナト
リウム、フタル酸水素カリウム若しくはグリシンなどよ
りなる有機系緩衝液、ホウ酸、リン酸若しくはイミダゾ
ールなどよりなる無機系緩衝液又はリン酸緩衝生理食塩
水等の各種緩衝液、あるいは生理食塩水等を用いること
ができる。なお、この緩衝液のpHについては、pH４〜12
の範囲内にあることが好ましい。

【００４１】また、この粒子の分散媒には、上記の希釈
液の項で記載した添加剤をそれぞれ適宜加えて用いるこ
とができる。そして、これらの添加剤を加える際の濃度
は特に限定されるものではないが、0.001 〜10％(w/v)
が好ましく、特に0.01〜５％(w/v) が好ましい。

【００４２】本発明においては、上記の特異的結合物質
が固定された担体の面に試料を接触させる工程（第１の
工程）及び特異的結合物質が固定された粒子をこの担体
の面に接触させる工程（第２の工程）の一方又は両方に
おいて、担体に固定された特異的結合物質又は粒子に固
定された特異的結合物質とは別に被検物質に対する特異
的結合物質を存在させる。これは、担体又は粒子のいず
れにも固定されていない遊離の「被検物質に対する特異
的結合物質」を含有させた、試料の希釈液及び／又は粒
子の分散媒を用いて、上記第１の工程及び第２の工程を
行うことにより実施することができる。また、上記第１
の工程及び第２の工程の前に、遊離の「被検物質に対す
る特異的結合物質」を含有させた溶液を担体の面に接触
させることにより実施することができる。この被検物質
に対する特異的結合物質を試料の希釈液及び／又は粒子
の分散媒等の溶液に含有させる濃度は、特に限定される
ものではないが、０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好まし
く、特に０．１〜１０μｇ／ｍＬが好ましい。

【００４３】上記のように、担体の面に試料を接触させ
る工程（第１の工程）及び粒子をこの担体の面に接触さ
せる工程（第２の工程）を行った後、この担体の面にお
ける粒子の分布状態から試料中の被検物質の存在の測定
を行う。この担体の面上の粒子の分布状態、即ち像は、
目視により、又は吸光度測定やパターン認識によるマイ
クロプレートリーダー等の光学的読み取り装置により確
認することができる。

【００４４】本発明の作用について従来の方法と比較し
ながら以下説明を行う。まず、従来の方法について説明
する。試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定
された面を有する担体の該面に試料を接触させると、試
料中の被検物質は担体の面に固定されている被検物質に
対する特異的結合物質に結合し、「担体−特異的結合物
質−被検物質」の結合を生じる。この担体の面に、被検
物質に対する特異的結合物質であって前記担体に固定さ
れた特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が
固定された粒子を接触させると、この特異的結合物質が
固定された粒子は担体に結合した被検物質に結合して、
「担体−特異的結合物質−被検物質−特異的結合物質−
粒子」の結合を生成する。この結合の生成を担体の面上
の粒子の分布状態により確認することによって、試料中
の被検物質の存在の測定を行うことができる。

【００４５】また、担体の面に試料を接触させる工程と
粒子をこの担体の面に接触させる工程を同時に行う場合
には、試料中の被検物質は粒子に固定された特異的結合
物質に結合して「被検物質−特異的結合物質−粒子」の
結合を生じ、更にこれは担体に固定された特異的結合物
質に結合して、「担体−特異的結合物質−被検物質−特
異的結合物質−粒子」の結合を生成する。この場合も、
この結合の生成を担体の面上の粒子の分布状態により確
認することによって、試料中の被検物質の存在の測定を
行うことができる。担体の面上の粒子の分布状態による
「担体−特異的結合物質−被検物質−特異的結合物質−
粒子」の結合の生成の確認であるが、試料中に被検物質
が存在せず（陰性）この結合が生成しない場合には粒子
は収束し、図３のＡに示した凝集像と同様の像を確認す
ることができる。また、試料中に被検物質が存在して
（陽性）この結合が生成する場合には粒子は面上に広が
り、図３のＢに示した凝集像と同様の像を確認すること
ができる。

【００４６】しかしながら、試料中に被検物質が過剰に
存在する場合には、担体に固定された特異的結合物質及
び粒子に固定された特異的結合物質それぞれにこの過剰
の被検物質が結合して、「担体−特異的結合物質−被検
物質」及び「被検物質−特異的結合物質−粒子」の結合
が生成してしまい、「担体−特異的結合物質−被検物質
−特異的結合物質−粒子」の結合が生成できない。よっ
て、試料中に被検物質が存在する（陽性）にもかかわら
ず、図３のＢに示した凝集像と同様の像を得ることがで
きず図３のＡに示した凝集像と同様の像が得られてしま
うので、試料中には被検物質が存在しない（陰性）と誤
って判定してしまうことになる。（地帯現象） この従来の方法の作用の模式図を図４に示した。

【００４７】

【図４】

【００４８】次に、本発明について説明する。本発明に
おいても、特異的結合物質が固定された面を有する担体
の該面に試料を接触させると、試料中の被検物質は担体
の面に固定されている特異的結合物質に結合し、「担体
−特異的結合物質−被検物質」の結合を生じる。この
時、試料中の被検物質が過剰に存在すると、担体の面に
固定されている特異的結合物質に結合できない遊離状態
の被検物質が出てくるが、この場合に遊離の「被検物質
に対する特異的結合物質」が存在すると、遊離状態の被
検物質は遊離の特異的結合物質に捕捉されて「被検物質
−特異的結合物質」の結合を生じる。この担体の面に、
前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる
特異的結合物質が固定された粒子を接触させると、この
特異的結合物質が固定された粒子は担体に結合した被検
物質に結合して、「担体−特異的結合物質−被検物質−
特異的結合物質−粒子」の結合を生成する。しかし、遊
離状態であった被検物質は遊離の特異的結合物質に捕捉
されていて、もう粒子に固定された特異的結合物質とは
結合できないので、「担体−特異的結合物質−被検物
質」及び「被検物質−特異的結合物質−粒子」の結合が
生成することはなく、「担体−特異的結合物質−被検物
質−特異的結合物質−粒子」の結合だけが生成する。つ
まり、地帯現象は生じない。そして、この結合の生成を
担体の面上の粒子の分布状態により確認することによっ
て、試料中の被検物質の存在の測定を行うことができ
る。

【００４９】また、担体の面に試料を接触させる工程と
粒子をこの担体の面に接触させる工程を同時に行う場合
には、試料中の被検物質は粒子に固定された特異的結合
物質に結合して「被検物質−特異的結合物質−粒子」の
結合を生じるが、試料中の被検物質が過剰に存在する時
には、やはり、粒子に固定されている特異的結合物質に
結合できない遊離状態の被検物質が出てくる。この場合
に遊離の「被検物質に対する特異的結合物質」が存在す
ると、遊離状態の被検物質は遊離の特異的結合物質に捕
捉されて「被検物質−特異的結合物質」の結合を生じ
る。そして、粒子に固定された特異的結合物質に結合し
た被検物質は更に担体に固定された特異的結合物質に結
合して、「担体−特異的結合物質−被検物質−特異的結
合物質−粒子」の結合を生成する。しかし、この場合
も、遊離状態であった被検物質は遊離の特異的結合物質
に捕捉されていて、もう担体の面に固定された特異的結
合物質とは結合できないので、「担体−特異的結合物質
−被検物質」及び「被検物質−特異的結合物質−粒子」
の結合が生成することはなく、「担体−特異的結合物質
−被検物質−特異的結合物質−粒子」の結合だけが生成
する。つまり、地帯現象は生じない。そして、この結合
の生成を担体の面上の粒子の分布状態により確認するこ
とによって、試料中の被検物質の存在の測定を行うこと
ができる。この本発明における作用の模式図を図１に示
した。

【００５０】

【図１】

【００５１】本発明においては、段階的に希釈した試料
のそれぞれを本発明の測定方法により測定した時の、粒
子による凝集像が得られる最大の希釈倍数である凝集価
を求めることにより、試料中に含まれる被検物質の量を
確かめることができる。この凝集価の測定は、間接凝集
反応測定法の常法に準じて行えばよく、例えば、特異的
結合物質が固定された担体の凹部に試料を入れ、これを
試料の希釈液で段階的に希釈してその希釈列を作り、次
に各凹部に特異的結合物質が固定された粒子を加え、混
合攪拌した後静置して、粒子の面上での分布状態である
凝集の有無を確認し、凝集像が得られた最大の希釈倍数
を凝集価として採用し、求めることができる。

【００５２】また、予め規定した希釈倍数で希釈した試
料を本発明の測定方法により測定し、この時の凝集の有
無から試料中における被検物質の存在の有無を定性的に
測定することもできる。

【００５３】なお、本発明による試料中の被検物質の測
定方法においては、試料、特異的結合物質が固定された
粒子、及び遊離の特異的結合物質を予め混合接触し、次
いでこれを特異的結合物質が固定された担体に接触させ
ることにより測定を行ったり、又は予め特異的結合物質
が固定された粒子を加えておいた特異的結合物質が固定
された担体に、試料、そして遊離の特異的結合物質を接
触させて測定を行うこともできる。

【００５４】そして、本発明による試料中の被検物質の
測定方法においては、特異的結合物質が固定された粒子
の粒子として磁性粒子を用い、この特異的結合物質が固
定された粒子に磁力を作用させることにより短時間で凝
集像を生じさせることができる、特開平４−２１６４６
６号公報及び特開平４−２４２１６７号公報に記載され
ているような測定方法を適用することもできる。

【００５５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に詳述す
るが、本発明はこの実施例によって何ら限定されるもの
ではない。

【００５６】〔実施例〕 （血清試料中の抗ＨＢｃ抗体の測定）本発明により血清
試料中の抗ＨＢｃ抗体（抗Ｂ型肝炎ウイルス・コア抗
体）の測定を行った。

【００５７】（１）ＨＢｃ抗原の調製 （ｉ）形質転換及び培養 まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＨＢｃ抗原の全遺
伝子配列を含む発現ベクターｐＧＨＢｃにて「Ｄ．Ｈａ
ｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６巻，５５
７頁，１９８３年」に記載された方法により形質転換し
た。この形質転換された大腸菌（形質転換体）をＬＢ培
地中にて３７℃で一晩培養した後、遠心分離して菌体を
回収した。

【００５８】（ｉｉ）超音波破砕 これを１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＰＭＳＦを含有
する５０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、「Ｐｏｗｅｒ
Ｓｏｎｉｃ Ｍｏｄｅｌ１５０」ソニケーター（ヤマト
科学社製）にて超音波破砕し、遠心分離後上清を回収し
てＨＢｃ抗原を含有する物質を得た。

【００５９】（ｉｉｉ）硫安分別 更に、このＨＢｃ抗原を含有する物質にＤＮａｓｅＩ及
び塩化マグネシウムを加え、４℃にて３０分間放置した
後、硫安（硫酸アンモニウム）を３０％飽和になるよう
に添加し、４℃にて一晩撹拌し、その後遠心分離を行い
沈殿物を回収した。

【００６０】（ｉｖ）加熱処理 このＨＢｃ抗原を含有する物質である沈殿物を、２０ｍ
Ｍ ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．２）に懸濁し、この
緩衝液中のＨＢｃ抗原を含有する物質を６５℃で３０分
間加熱した。次にこれを遠心分離して沈殿を分離し除去
し、上清を宿主（大腸菌）由来の夾雑物質が除去された
ＨＢｃ抗原含有溶液として得た。

【００６１】（ｖ）ハイドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィー処理 このＨＢｃ抗原含有溶液をイオン強度１０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）にて透析し、これを同緩衝液にて
予め平衡化しておいたセラミックハイドロキシアパタイ
ト（バイオラッド社製）を充填したカラム（直径６ｃ
ｍ、長さ６ｃｍ）にかけ、同緩衝液を流速２．０ｍＬ／
分で流し、そして溶出される液を４ｍＬずつ分取し、素
通りした画分（画分番号４〜１０）を分取して更に純度
が高いＨＢｃ抗原（Ｂ型肝炎ウイルス・コア抗原）を得
た。

【００６２】（２）ＨＢｃ抗原固定化担体の調製 上記（１）で得たＨＢｃ抗原を１μｇ／ｍＬになるよう
にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、これを９
６穴マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに５０
μＬずつ分注し、３７℃にて一晩放置した後除去した。
次いで、０．５％カゼイン（メルク社製）を含む５０ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、
３７℃にて１日放置した後除去して、ＨＢｃ抗原固定化
担体を調製した。

【００６３】（３）ＨＢｃ抗原固定化粒子の調製 粒子（Dynabeads M-450 uncoated、ダイナル社製、粒
径：４．５μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、比重１．
５、濃度３％（W/V））をリン酸緩衝生理食塩水にて濃
度が１％になるように希釈し、これに上記（１）で得た
ＨＢｃ抗原を３μｇ／ｍＬになるように溶解し計５００
μＬとし、３７℃で１時間振とうした。次いで、この粒
子を０．５％カゼイン（メルク社製）を含む１００ｍＭ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、粒子の分
散媒として０．５％カゼイン（メルク社製）を含む１０
０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を５ｍＬ加えて、
３７℃にて３日間放置してＨＢｃ抗原固定化粒子を調製
した。

【００６４】（４）遊離ＨＢｃ抗原を含むＨＢｃ抗原固
定化粒子液の調製 上記（３）で調製したＨＢｃ抗原固定化粒子の２．５ｍ
Ｌに上記（１）で調製したＨＢｃ抗原を１μｇ／ｍＬに
なるように加えて、遊離ＨＢｃ抗原を含むＨＢｃ抗原固
定化粒子液を調製した。

【００６５】（５）血清試料中の抗ＨＢｃ抗体の測定 抗ＨＢｃ抗体を含むことが分かっている３種類の血清試
料（血清試料１、血清試料２及び血清試料３）につい
て、抗ＨＢｃ抗体を測定した。 （ｉ）試料希釈液の添加 上記（２）で調製したＨＢｃ抗原固定化担体の第１列、
第２列、第３列、第４列、第５列及び第６列の各ウェル
（穴）に、試料の希釈液として０．５％カゼイン（メル
ク社製）を含む１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．
０）を２５μＬずつ加えた。

【００６６】（ｉｉ）試料の段階希釈 次に、血清試料１の２５μＬをこの担体の第１列及び第
２列の第１ウェルに加え、血清試料２の２５μＬを第３
列及び第４列の第１ウェルに加え、そして血清試料３の
２５μＬを第５列及び第６列の第１ウェルに加え、この
後これらの各々の列の第１ウェル中の液の２５μＬを第
２ウェルに移し、これを第１２ウェルについてまで繰り
返して行い、試料の段階希釈を行った。

【００６７】（ｉｉｉ）粒子の添加 この担体の第１列、第３列及び第５列の各ウェルに遊離
ＨＢｃ抗原を含まない上記（３）で調製したＨＢｃ抗原
固定化粒子を２５μＬずつ加え、また第２列、第４列及
び第６列の各ウェルに上記（４）で調製した遊離ＨＢｃ
抗原を含むＨＢｃ抗原固定化粒子液を２５μＬずつ加え
て、この担体を１０秒間攪拌した。

【００６８】（ｉｖ）ウェルの粒子の分布状態の確認 その後１時間静置した後、この担体の第１列から第６列
の第２ウェルから第１２ウェルまでの各ウェルの粒子の
分布状態を目視により確認した。なお、ウェルの底部に
粒子が収束し図３のＡに示した凝集像と同様の像を示す
場合には、試料中に抗ＨＢｃ抗体が存在しない（陰性）
と判定し、ウェル内に一様に粒子が広がり図３のＢに示
した凝集像と同様の像を示す場合には、試料中に抗ＨＢ
ｃ抗体が存在する（陽性）と判定した。

【００６９】（ｖ）測定結果 測定結果を表１に示した。

【００７０】

【表１】

【００７１】また、担体の第１列から第６列の第２ウェ
ルから第１２ウェルまでの各ウェルの粒子の分布状態の
像を図２に示した。

【００７２】

【図２】

【００７３】遊離のＨＢｃ抗原を存在させていない第１
列、第３列及び第５列の測定では、いずれの試料におい
ても抗ＨＢｃ抗体濃度が高い低希釈時には（第２ウェル
〜第４ウェル又は第５ウェル）、本来陽性であるものが
陰性となってしまっている。 （地帯現象）しかし、遊離のＨＢｃ抗原を存在させてい
る第２列、第４列及び第６列の測定では、いずれの試料
においても本来陽性のものが陰性となるような地帯現象
は見られない。これより、本発明による測定では、被検
物質が過剰に存在する試料であっても、地帯現象を防い
で正確に測定が行えることが確かめられた。

【００７４】〔参考例〕 （本発明の作用の検証）本発明の作用が、過剰に存在す
る被検物質を遊離の特異的結合物質により捕捉するもの
であることを確かめる検証を行った。下記の３種類の測
定系（測定系Ａ、測定系Ｂ及び測定系Ｃ）により抗ＨＢ
ｃ抗体が過剰に存在する２種類の血清試料（血清試料１
及び血清試料２）を測定した。 測定系Ａ：遊離ＨＢｃ抗原非存在・過剰抗ＨＢｃ抗体除
去処理無し 測定系Ｂ：遊離ＨＢｃ抗原非存在・過剰抗ＨＢｃ抗体除
去処理有り 測定系Ｃ：遊離ＨＢｃ抗原存在 ・過剰抗ＨＢｃ抗体除
去処理無し （１）測定系Ａにおける測定 （ｉ）試料希釈液の添加 上記実施例の（２）で調製したＨＢｃ抗原固定化担体の
第１列及び第４列の各ウェル（穴）に、試料の希釈液と
して０．５％カゼイン（メルク社製）を含む１００ｍＭ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を２５μＬずつ加えた。

【００７５】（ｉｉ）試料の段階希釈 次に、抗ＨＢｃ抗体を過剰に含む血清試料１の２５μＬ
をこの担体の第１列の第１ウェルに加え、また抗ＨＢｃ
抗体を過剰に含む血清試料２の２５μＬをこの担体の第
４列の第１ウェルに加え、そしてこの各々の列の第１ウ
ェル中の液の２５μＬを第２ウェルに移し、これを第８
ウェルについてまで繰り返して行い、試料の段階希釈を
行った。

【００７６】（ｉｉｉ）粒子の添加 この担体の第１列及び第４列の各ウェルに上記実施例の
（３）で調製したＨＢｃ抗原固定化粒子を２５μＬずつ
加えて、この担体を１０秒間攪拌した。

【００７７】（ｉｖ）ウェルの粒子の分布状態の確認 その後１時間静置した後、この担体の第１列及び第４列
の各ウェルの粒子の分布状態を目視により確認した。な
お、ウェルの底部に粒子が収束し図３のＡに示した凝集
像と同様の像を示す場合には、試料中に抗ＨＢｃ抗体が
存在しない（陰性）と判定し、ウェル内に一様に粒子が
広がり図３のＢに示した凝集像と同様の像を示す場合に
は、試料中に抗ＨＢｃ抗体が存在する（陽性）と判定し
た。 （２）測定系Ｂにおける測定 （ｉ）試料希釈液の添加 上記実施例の（２）で調製したＨＢｃ抗原固定化担体の
第２列及び第５列の各ウェル（穴）に、試料の希釈液と
して０．５％カゼイン（メルク社製）を含む１００ｍＭ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を２５μＬずつ加えた。

【００７８】（ｉｉ）試料の段階希釈 次に、抗ＨＢｃ抗体を過剰に含む血清試料１の２５μＬ
をこの担体の第２列の第１ウェルに加え、そして抗ＨＢ
ｃ抗体を過剰に含む血清試料２の２５μＬをこの担体の
第５列の第１ウェルに加え、そしてこの各々の列の第１
ウェル中の液の２５μＬを第２ウェルに移し、これを第
８ウェルについてまで繰り返して行い、試料の段階希釈
を行った。

【００７９】（ｉｉｉ）過剰の抗ＨＢｃ抗体の除去 この担体の第２列及び第５列の各ウェル中にある試料及
び試料希釈液をピペットで吸引して、過剰の抗ＨＢｃ抗
体を除去した。そして、これらの各ウェルを０．５％カ
ゼイン（メルク社製）を含む１００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ９．０）で３回洗浄した。

【００８０】（ｉｖ）粒子の添加 この担体の第２列及び第５列の各ウェルに上記実施例の
（３）で調製したＨＢｃ抗原固定化粒子を２５μＬずつ
加えて、この担体を１０秒間攪拌した。

【００８１】（ｖ）ウェルの粒子の分布状態の確認 その後１時間静置した後、この担体の第２列及び第５列
の各ウェルの粒子の分布状態を目視により確認した。な
お、この分布状態の像の判定は上記（１）の（ｉｖ）の
測定系Ａの場合と同様にして行った。 （３）測定系Ｃにおける測定 （ｉ）試料希釈液の添加 上記実施例の（２）で調製したＨＢｃ抗原固定化担体の
第３列及び第６列の各ウェル（穴）に、試料の希釈液と
して０．５％カゼイン（メルク社製）を含む１００ｍＭ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を２５μＬずつ加えた。

【００８２】（ｉｉ）試料の段階希釈 次に、抗ＨＢｃ抗体を過剰に含む血清試料１の２５μＬ
をこの担体の第３列の第１ウェルに加え、そして抗ＨＢ
ｃ抗体を過剰に含む血清試料２の２５μＬをこの担体の
第６列の第１ウェルに加え、そしてこの各々の列の第１
ウェル中の液の２５μＬを第２ウェルに移し、これを第
８ウェルについてまで繰り返して行い、試料の段階希釈
を行った。

【００８３】（ｉｉｉ）遊離ＨＢｃ抗原の添加 上記実施例の（１）で調製したＨＢｃ抗原を１μｇ／ｍ
Ｌになるように０．５％カゼイン（メルク社製）を含む
１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解して遊
離ＨＢｃ抗原液を調製した。そして、この遊離ＨＢｃ抗
原液を上記（ｉｉ）の担体の第３列及び第６列の各ウェ
ルに２５μＬずつ加えて、この担体を１０秒間攪拌し
た。

【００８４】（ｉｖ）粒子の添加 この担体の第３列及び第６列の各ウェルに上記実施例の
（３）で調製したＨＢｃ抗原固定化粒子を２５μＬずつ
加えて、この担体を１０秒間攪拌した。

【００８５】（ｖ）ウェルの粒子の分布状態の確認 その後１時間静置した後、この担体の第３列及び第６列
の各ウェルの粒子の分布状態を目視により確認した。な
お、この分布状態の像の判定は上記（１）の（ｉｖ）の
測定系Ａの場合と同様にして行った。

【００８６】（４）測定結果 上記（１）、（２）及び（３）の各測定系における測定
結果を表２に示した。

【００８７】

【表２】

【００８８】測定系Ａ（第１列及び第４列）では、遊離
のＨＢｃ抗原を存在させておらず、かつ過剰の抗ＨＢｃ
抗体の除去も行っていないので、抗ＨＢｃ抗体濃度が高
い低希釈時には（第１ウェル〜第６ウェル又は第７ウェ
ル）、本来陽性であるものが陰性となってしまい、地帯
現象が生じてしまっている。しかし、測定系Ｂ（第２列
及び第５列）では、遊離のＨＢｃ抗原は存在させていな
いものの、過剰の抗ＨＢｃ抗体は除去してしまっている
ので、本来陽性のものが陰性となるような地帯現象は見
られない。また、測定系Ｃ（第３列及び第６列）では、
過剰の抗ＨＢｃ抗体の除去は行っていないが、遊離のＨ
Ｂｃ抗原を存在させているので、地帯現象は見られてい
ない。測定系Ｃは本発明の測定方法によるものである
が、ここで測定系に加えた遊離のＨＢｃ抗原は、担体に
固定されたＨＢｃ抗原に結合した試料よりの抗ＨＢｃ抗
体には結合していないと考えられる。なぜなら、もし加
えた遊離のＨＢｃ抗原がこの抗ＨＢｃ抗体に結合してい
るなら、後で加えたＨＢｃ抗原が固定された粒子はこの
担体にはもう結合できないはずであるが、実際は結合し
て陽性像を示している。従って本発明の測定方法におい
ては、加えた遊離のＨＢｃ抗原は固定されたＨＢｃ抗原
を介して担体に結合した抗ＨＢｃ抗体に結合しているの
ではなく、つまり担体と粒子を架橋する役目を果たして
いるものではなく、測定系中に遊離状態で存在して過剰
の抗ＨＢｃ抗体を捕捉し、これにより地帯現象が生じる
のを防いでいるものである。

【００８９】

【発明の効果】本発明の試料中の被検物質の測定方法及
び測定試薬によれば、試料中に被検物質が過剰に存在し
ても地帯現象を防ぐことができ、よって陽性の試料を陰
性と誤って判定することを防止でき、そして特別な装置
を使用することなく、簡便かつ正確に試料中の被検物質
の測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における作用を示した模式図である。

【図２】本発明による血清試料中の抗ＨＢｃ抗体測定時
の担体の各ウェルの粒子の分布状態の像を示した写真で
ある。

【図３】試料中の被検物質の存在の有無を粒子の分布状
態により測定する測定方法における粒子の分布状態の像
を示した図である。

【図４】従来の方法における作用を示した模式図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小池 克郎 東京都豊島区上池袋一丁目37番１号 財団 法人癌研究会癌研究所内

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中の被検物質に対する特異的結合物質
   が固定された面を有する担体の該面に試料を接触させる
   工程、及び被検物質に対する特異的結合物質であって前
   記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特
   異的結合物質が固定された粒子を前記面に接触させる工
   程を含む、前記面における前記粒子の分布状態から試料
   中の被検物質の存在の測定を行う測定方法において、前
   記担体に固定された特異的結合物質又は前記粒子に固定
   された特異的結合物質とは別に被検物質に対する特異的
   結合物質を前記工程の一方又は両方において存在させる
   ことを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。
2. 【請求項２】試料中の被検物質に対する特異的結合物質
   が固定された面を有する担体の該面に試料を接触させる
   工程の後に、被検物質に対する特異的結合物質であって
   前記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる
   特異的結合物質が固定された粒子を前記面に接触させる
   工程を行う、請求項１に記載の試料中の被検物質の測定
   方法。
3. 【請求項３】試料中の被検物質に対する特異的結合物質
   が固定された面を有する担体の該面に試料を接触させる
   工程と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記
   担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異
   的結合物質が固定された粒子を前記面に接触させる工程
   を同時に行う、請求項１に記載の試料中の被検物質の測
   定方法。
4. 【請求項４】前記工程の一方又は両方において存在させ
   る被検物質に対する特異的結合物質が、担体に固定され
   た被検物質に対する特異的結合物質と同一である、請求
   項１〜３のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測
   定方法。
5. 【請求項５】前記工程の一方又は両方において存在させ
   る被検物質に対する特異的結合物質が、粒子に固定され
   た被検物質に対する特異的結合物質と同一である、請求
   項１〜４のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測
   定方法。
6. 【請求項６】前記工程の一方又は両方において存在させ
   る被検物質に対する特異的結合物質が、担体に固定され
   た被検物質に対する特異的結合物質及び粒子に固定され
   た被検物質に対する特異的結合物質のいずれとも異な
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料中の被検
   物質の測定方法。
7. 【請求項７】担体が測定容器である、請求項１〜６のい
   ずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定方法。
8. 【請求項８】被検物質が抗原であり、被検物質に対する
   特異的結合物質が前記抗原に対する抗体である、請求項
   １〜７のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定
   方法。
9. 【請求項９】被検物質が抗体であり、被検物質に対する
   特異的結合物質が前記抗体に対する抗原又は抗体であ
   る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の試料中の被検
   物質の測定方法。
10. 【請求項１０】被検物質が抗Ｂ型肝炎ウイルス・コア抗
    体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の試料中
    の被検物質の測定方法。
11. 【請求項１１】少なくとも、試料中の被検物質に対する
    特異的結合物質が固定された面を有する担体、被検物質
    に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された
    特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定
    された粒子、及び遊離の被検物質に対する特異的結合物
    質より構成される、試料中の被検物質の測定試薬。
12. 【請求項１２】遊離の被検物質に対する特異的結合物質
    が、担体に固定された被検物質に対する特異的結合物質
    と同一である、請求項１１に記載の試料中の被検物質の
    測定試薬。
13. 【請求項１３】遊離の被検物質に対する特異的結合物質
    が、粒子に固定された被検物質に対する特異的結合物質
    と同一である、請求項１１又は１２に記載の試料中の被
    検物質の測定試薬。
14. 【請求項１４】遊離の被検物質に対する特異的結合物質
    が、担体に固定された被検物質に対する特異的結合物質
    及び粒子に固定された被検物質に対する特異的結合物質
    のいずれとも異なる、請求項１１に記載の試料中の被検
    物質の測定試薬。
15. 【請求項１５】担体が測定容器である、請求項１１〜１
    ４のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定試
    薬。
16. 【請求項１６】被検物質が抗原であり、被検物質に対す
    る特異的結合物質が前記抗原に対する抗体である、請求
    項１１〜１５のいずれか１項に記載の試料中の被検物質
    の測定試薬。
17. 【請求項１７】被検物質が抗体であり、被検物質に対す
    る特異的結合物質が前記抗体に対する抗原又は抗体であ
    る、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の試料中の
    被検物質の測定試薬。
18. 【請求項１８】被検物質が抗Ｂ型肝炎ウイルス・コア抗
    体である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の試
    料中の被検物質の測定試薬。