JPH09501936A

JPH09501936A - 生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組成物および装置

Info

Publication number: JPH09501936A
Application number: JP7507766A
Authority: JP
Inventors: デニスエイ．カーソン; イーヤルラズ; メレディスエル．ハウエル
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 1997-02-25
Also published as: CA2169635A1; EP0714308A4; CA2169635C; MX9406552A; WO1995005853A1; AU705889B2; JP2004331668A; AU7639194A; EP0714308A1

Abstract

(57)【要約】本発明には、生物活性ペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドを投与することによって、（特に治療用ペプチドを予防接種するかまたは一過的に発現させるため）宿主中に生物活性ペプチドを導入する方法が含まれている。大部分の実施態様において、上記ポリヌクレオチドは、リポソームのようなコロイド製剤と複合しておらずまたゲノム組込みベクターと結合もしていないという意味で、裸である。一実施態様では、裸のポリヌクレオチドが、宿主の他の組織と比べて高濃度の抗原提示細胞を有する宿主の組織に投与される。そのポリヌクレオチドは、取り込まれて、局所的に、全身的に、および／または宿主の侵入点から離れた位置で発現される。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、哺乳類の高齢関連の疾病および疾患耐性の損失を遅らせ、治療しおよび予防するのに効果的なペプチドを発現する。この実施態様では、治療量以下のレベルのペプチドが宿主の発育の適当な段階で発現される。本発明の方法に使用する装置と組成物も述べられている。

Description

【発明の詳細な説明】生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組成物および装置関連米国特許願本願は、１９９３年８月２６日付けで米国特許商標庁に出願された米国特許願第０８／１１２，４４０号の一部継続出願である。米国政府の権利についての陳述本発明は、米国国立衛生研究所が付与した認可番号ＡＲ０７５６７およびＡＲ２５４４３に基づいて政府援助によってなされたともいえる。米国政府は本発明に何らかの権利を持っている可能性がある。発明の背景１．発明の分野本発明は、生物活性ペプチドを作動的に（operatively）コードする１種以上のポリヌクレオチドを、好ましくは無侵襲的手段で哺乳類の宿主に導入することによって、生物活性ペプチドを哺乳類宿主に投与する方法に関する。また本発明は、前記ポリヌクレオチドを投与して、哺乳類の老化に付随する疾病と免疫機能の喪失を予防し治療する方法に関する。２．関連技術の説明生物活性を有するペプチドまたはタンパク質を患者の細胞に直接導入することは治療の面で大きな価値がある。しかし、この手法にはいくつかの欠点がある。重要な問題には、特に、ペプチドに対して生体応答を生じるのに充分な投与量において潜在的な毒性がある恐れのあることである。実際面でも、これらペプチドを単離・精製するかまたは合成するのに伴う費用の問題がある。さらに、これらペプチドの臨床効果も、その生体内での半減期が比較的短いこと（これは標的組織中に存在するプロテアーゼ類によってこれらペプチドが分解されることが通常原因である）によって限定される。これらの理由から、タンパク質を発現する遺伝子を患者／宿主に送達することによって患者にタンパク質を導入する方法は、タンパク質を投与する方法に代わる興味深い方法である。しかし、今までのところ、異種遺伝物質を宿主に導入する主な手段は、例えば宿主の細胞をウイルスベクターで形質転換することによって、遺伝子を宿主のゲノムに組み込む方法である。ウイスルエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム内に封入されたＤＮＡを含有する、リポソーム中に封入されたＤＮＡを用いて、生後の動物に遺伝子を直接生体内に輸送する方法も報告されている。１９８４年に、リス肝炎の裸のクローン化プラスミドＤＮＡをリスの肝臓内に注射したところ、リスにウイルス感染と抗ウイルス抗体の生成が起こったことを示した米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）での研究が報告された（Ｓｅｅｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、５８４９〜５８５２頁、１９８４年）。数年後、Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、骨格筋の組織に注射された裸のポリヌクレオチド（すなわち、リポソームまたはウイルスの発現ベクターと結合していないＤＮＡまたはＲＮＡ）からタンパク質が発現されたと報告した（Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７巻、１４６５頁、１９９０年、さらにＰＣＴ出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照）。Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、筋肉組織が、多核細胞、筋小胞体、および筋肉細胞中に深く延びるＴ管（横断細管）システムを含んでなり、独特の構造を有しているので、筋肉細胞はポリヌクレオチドを効率的に取り込んで発現すると予想した。他の組織の細胞も裸のポリヌクレオチドを取り込むことができると考えられているが、他の組織内での発現は、今まで、発現される遺伝子の送達が、送達系、例えば細胞のリポソーム形質転換による場合しか確認されていない。実際に、他の研究者達は、骨格筋以外の組織内では裸のポリヌクレオチドの取込みと発現が検出可能なレベルまたは生物活性レベルでは起こらないと示唆している（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻１１２７７〜１１２８１頁、１９９２年［遺伝子をエアゾルで送達した場合、発現はリポソーム送達系を使用すれば起こったが、ＤＮＡだけを導入したときは発現が起こらなかった］、およびＴａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２〜１５４頁、１９９２年［コロイド金のビーズに結合させたｈＧＨプラスミドをワクチン「ガン」でマウスの皮膚に注射したとき免疫応答を誘発しなかった］を参照）。長期療法で筋肉組織中にＤＮＡまたはＲＮＡを注射することは、筋肉細胞内で遺伝子を発現させるのに一般に有効であるが、遺伝子の劣化が原因で失われる発現を補うため繰り返し注射する必要がある。この手法は、時間がかかり高価であるだけでなく、注射部位とその近傍に炎症が起こるので実用的でないといえる。このような炎症によって、ヌクレオチドが導入される筋肉などの体細胞がそれ自体が免疫応答の標的になり（例えば、実施例Ｉを参照）、重篤な筋壊死をもたらすことがある。さらに、ＤＮＡの筋肉内注射は、筋肉組織を損傷する危険があるだけでなく、治療の効力も明らかに低下させる。例えば、オタワ大学に勤務する研究者達は、最近、「横紋筋は、プラスミドＤＮＡの形態で伝達されるリポーター遺伝子を吸収し発現できることを見出された唯一の組織である…しかし、我々の知見によれば、上記注射法で損傷した繊維はプラスミドＤＮＡを取り込んで発現することをしない。」ということを観察した（Ｄａｖｉｓ他、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、４巻、１５１〜１５９頁、１９９３年）。さらに、筋肉注射を使うことは、筋肉組織自体の疾患に対する治療の場合、少なくとも短期間は有効であるとはいえ、患者の身体の他の場所で発現されたペプチドに対する、組織に特異的な免疫応答または他の生体応答を刺激するのには余り有効でないようである。その結果、筋肉内注射は、多くの感染症の主な侵入点すなわち皮膚および粘膜においてペプチドを発現させるのに特に実用的な方法ではない。さらに、ポリヌクレオチドを筋肉内に注射すると、標的筋肉細胞にるコード化タンパク質の放出のため、組織中に抗体と細胞傷害性Ｔ細胞の両者の生成をもたらすようである。これとは対照的に、タンパク質の注射は（例えば予防接種方式の場合）、外因性タンパク質はクラスＩプロセシング経路には効率よく入らないので、細胞障害性Ｔ細胞の生成は通常誘発しない。ＰＣＴ特許出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号（先に考察した）で、発明者らは、骨格筋や他の体組織中に裸ＤＮＡを注射すると注射された細胞の細胞質中に遺伝子が発現されるようになると提唱した。さらに発明者達は、コードされたタンパク質が次にクラスＩプロセシング経路に入り、細胞障害性Ｔ細胞の生成を誘発する（樹立されたウイルス感染症と癌を制御するのに必要）と考えている。しかしながら、先に考察したように、代わりに、抗原を発現する体細胞はいずれも、クラスＩ拘束細胞障害性Ｔ細胞応答が抗原に対し誘導される前に、まず抗原提示細胞による取込みに用いられる細胞外空間に抗原を放出しなければならないようである。この結論は、抗原提示に関する最近の研究によって裏付けられており、「非造血細胞中に独占的に発現される…クラスＩ拘束抗原に対する免疫応答をプライムすると、その抗原を提示する前に、その抗原を宿主の骨髄由来細胞に伝達する」という観察がなされている（Ｈｕａｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４巻、９６１〜９６５頁、１９９４年）。したがって、ＰＣＴ出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号のタンパク質を発現させるため筋肉細胞に遺伝物質を導入する方法が基づいている少なくとも一つの前提は、正確ではない。しかしながら、筋肉内注射を使うと、注射された遺伝子が劣化する前に全身的に比較的高いレベルのタンパク質が発現される。このような応答は、タンパク質置換を目的とする療法の場合、望ましいとはいえ、比較的速いクリアランスまたは比較的低いレベルの発現が最適である免疫化プロトコルでは、意図していない毒性がもたらされることがある。その結果、規則的に脱落もしくは再生する組織（例えば、皮膚）におよび／または生体内で摩耗速度が比較的高い細胞（例えば、抗原提示細胞）に遺伝子を導入することは、遺伝子免疫化のための一層有用な経路であろう。遺伝子の送達系について、遺伝子を宿主のゲノムに導入するウイルスベクターのような手段には、宿主細胞内の遺伝物質の損傷を伴う潜在的な健康面の危険性がある。遺伝子を生体内で送達するのにカチオンリポソームまたはバイオリスティックデバイス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｄｅｖｉｃｅ）（すなわち、ビーズに結合されたポリヌクレオチドを組織に「発射する」ワクチン「ガン」）を使用することは準備集中的であり、かつ標的細胞に伝達するのに適切な粒子の大きさを選択するいくつかの実験を行う必要がある。さらに、ヌクレオチドを導入する侵襲的な手段（例えば、注射）には、（特に長期治療の場合）組織外傷の問題があり、例えば臓器のような特定の標的組織に対するアクセスが制限される。イオン導入法その他の経皮伝達方法のようなペプチドの医薬製剤を無侵襲的に送達する手段には、少なくとも組織の外傷を最小にする利点がある。しかし、経皮もしくは粘膜による伝達がなされるペプチドの生物学的利用率は、これらの組織中のプロテアーゼの濃度が比較的高いので限定される、と信じられている。さらにあいにくなことに、ペプチドをコードする遺伝子を経皮または粘膜で伝達することによってペプチドを送達する高信頼性の手段は、まだ入手できない。裸遺伝子を生体内で発現することによるペプチドの成功裡の投与における利点は、サイトカインタンパク質類（例えば、インターロイキン−２、以後「ＩＬ− ２」と呼称する）を患者に投与して老化に伴う疾患を治療または予防する免疫療法の現状と比較することによって、説明することができる。哺乳類の種は、生活様式と寿命が異なるにもかかわらず、ほとんどすべての哺乳類の種に、老化過程の一部としてある種の疾患が起こる。これらの疾患としては、癌、高血圧症、血管障害および糖尿病になることがあるインスリン抵抗性がある。これら疾患の発症のタイミングは環境因子だけが原因であると考えられることはできないので、その発症は遺伝的にプログラムされていると考えられている。しかし、実際に老化過程および年齢に関連する疾病の発生を制御するプロセスは知られていない。一般に、老化には、外因性抗原に対し免疫応答を行う能力の低下、機能の余力およびストレスに対する応答の低下、ならびに線維症への傾向の増大が付随している。これらの状態はすべて、循環サイトカイン類が関与しているかまたはこれらサイトカイン類によって生体内で一部制御されている。例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）タンパク質は、グルコース恒常性に影響し、インスリン耐性のＣ５７ＢＬ／ＫｓｄｂマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｇｏｂ／ｏｂマウスに対して血糖降下薬として作用することができる（ＤｅｌＲｅｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、５９４３頁、１９８９年）。成人発症型糖尿病のこれら動物モデルの場合、ヒト組換えＩＬ−１を１回注射すると、グルコース血中濃度が数時間正常になる。またＩＬ −１は、食欲に影響する視床下部下垂体軸およびストレスに対する応答に対して作用することも知られている。したがって、ＩＬ−１の産生または応答性が異常であると、老化に伴うインスリン非依存性糖尿病と肥満の両方が起こる基になる。それ故、ＩＬ−１遺伝子療法（ＩＬ−２について記載されているのと正確に同じに投与して）によって、マウスとヒトにおける糖尿病の発症が防止される。高血圧症は、糖尿病とともに起こることが多い老化の別の随伴症である。最近の研究によって、血圧を主に調節するのは内皮性弛緩因子の酸化窒素であることが分かった。酸化窒素の産生は、ＩＬ−１によって調節される。したがって、老化とともに起こる血圧の上昇も、ＩＬ−１遺伝子療法によって予防することができる。ＩＬ−１タンパク質は、動物に急激に投与すると、発熱させショックを起こすこともある。しかし、身体遺伝子療法によって低濃度のＩＬ−１を続けて産生すると、これらの副作用は回避される。医薬投与量のサイトカインタンパク質類の投与による生物学的効果に関する研究が最近研究者達によってなされており、免疫系を刺激してある種の病原体に対するその応答を増大しそして例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者などのような免疫不全の患者の免疫機能を維持しようとの探索が進んでいる。具体的に述べると、免疫系疾患の治療薬としてＩＬ−２を投与する試みが最近次のようにいくつも報告されている。すなわち、Ｔｅｐｐｌｅｒ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻、４８３〜４９２頁、１９９３年（組換えＩＬ−２タンパク質とポリエチレングリコールの接合体のＨＩＶ感染患者に対する投与）、Ｃａｌｉｇｕｉｒｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻、１２３〜１３２頁、１９９３年（進行癌の患者に対する組換えＩＬ−２タンパク質の長期注入）、およびＫａｐｌａｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１５７〜１６２頁、１９９２年（マラバーらい（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）またはＨＩＶに感染した患者に対するＩＬ−２の投与）がある。これら研究の中心は、ＩＬ−２タンパク質を、その毒性を最小にする方法で投与する手段を開発することである。ＩＬ−２タンパク質の毒性は、その有効な治療薬としての使用に対する主な障害になっている。ＩＬ−２療法は、効果的であるためには、一般に、投与されたタンパク質が、高アフィニティーのＩＬ−２受容体を飽和しかつ循環ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を著しく膨張されるのに充分な量で血清中に存在している必要がある。しかし、高投与量のＩＬ−２は、重篤な低血圧症、肺水腫、腎不全、心臓不整脈および神経機能障害などの致命的な毒性をもたらす。この問題を克服するために上記研究者達が採用した方法は、感染および／または疾患が発症した後、比較的少ない投与量でＩＬ−２タンパク質を長期間投与して実験する方法であった。しかし、この方法は、矛盾のない予測可能なＩＬ−２療法に対して効果的なパラメータを定義しなければならない。特に、サイトカイン類の導入によってもたらされる循環タンパク質の濃度は、プロテアーゼで分解されるためもあって、時間が経過するにつれて相当に変化する。したがって、繰り返し注射する必要があり、その結果、患者が利用できるタンパク質の量に「山と谷」が生じる。さらに、ＩＬ−２による研究は、類似の方法が、相当の臨床実験を行った後でも、年齢に関連する疾病を含む各種の病状で役割を果たす他のサイトカイン類を使用する場合確実に有効なのかどうかを示していない。したがって、タンパク質（サイトカイン類と抗原類が含まれるがこれらに限定されない）の毒性を最小にする方法でタンパク質を宿主に導入する効果的な手段が要求されている。さらに具体的に述べると、確実にしかし治療量以下の濃度のタンパク質を長期間発現させるような方法で宿主にタンパク質を導入する手段も要求されている。後者の場合、特に年齢関連疾病と予防・治療するためサイトカイン類を投与する手段が要求されている。さらに広げて述べると、上記考察は、皮膚と粘膜に局所免疫を誘発して例えば性的感染症と呼吸器疾患に対して宿主に予防接種できるペプチドを生体内で発現する裸ヌクレオチドを導入する有効な手段に対する要求も示している。また、組織に著しく外傷を与えることなく組織特異的な方法で、生物活性ペプチドをコードする遺伝子を、宿主に導入する手段に対する要求も示唆されている。本発明はこれらの全ての要求に取り組むものである。発明の概要本発明の好ましい実施態様の詳細を、添付図面と以下の説明で述べる。本発明の詳細を一旦知ると、当該技術分野の当業者にとって多くの追加的な革新および変更が自明であろう。１．定義以下の定義は、本発明の考察を簡単に行えるように提供するものである。しかし、当該技術分野の当業者は、これらの定義は、本発明の適法の範囲および精神から逸脱することなく、均等物を含むよう拡大できることが分かるであろう。この理由により、これらの定義は、本発明を限定すると解釈すべきでない。ａ．「裸のポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、かつ本発明によって実施される治療法の目的に対し適当なセンスストランドとアンチセンスストランドを含む。この場合のポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが含まれる場合もある。この文脈における「裸の」は、コロイド物質（リポソーム製剤を含む）と複合したり、ポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に取り込ませるベクター中に含有さたりしていないポリヌクレオチドを意味する。ｂ．「作動的にコードしている」（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｅｎｃｏｄｉｎｇ）は、所望の翻訳産物例えばペプチドまたはタンパク質の発現、および所望の場合、分泌を行うのに必要なプロモーターなどの配列を含有するよう修飾されたポリヌクレオチドを意味する。本発明の実施態様はすべて公知のプラスミド発現ベクターを使用して実施することができる。好ましくは、これらのベクターは、所望の翻訳産物をコードするｃＤＮＡを含有している。したがって、特にことわらない限り、「ポリヌクレオチド」または「裸のポリヌクレオチド」は、適切なプラスミド発現ベクターに含有されている作動的なコーディング配列を意味する。ｃ．「ポリヌクレオチドの混合物」は、同じプロモーターの制御下にある２種以上２００種までのポリヌクレオチドの種を意味するものとする。ｄ．「合成」は、ポリヌクレオチドの配列を合成する公知の手法を意味し、未変性ポリヌクレオチドの単離と精製を含む。ｅ．「ペプチド」は、生体内で所望の生体作用を有する、小ペプチド類、ポリヌクレオチド類、オリゴペプチド類およびタンパク質を意味する。ｆ．「イオン導入法」は、ペプチド類を宿主に連続的に送達するのに現在使用されている公知の経皮透過手法を意味する。さらに具体的に述べると、その手法は、生理的に許容される電流を加えることによってイオン種の輸送を容易に行えるようにするプロセスである。このプロセスおよび他の経皮透過手法は、Ｃｈｉｅｎ他、ＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ、「ＮｏｖｅｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ」、７章、Ｃ項（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，１９９２年）に記載されており、その関連する開示事項は、医薬送達の技術に関する当該技術分野の知識の状態を示す目的で本明細書に援用するものである。ｇ．「界面活性剤／吸収促進剤」は、特定の小分子およびペプチド類の吸収と移入を容易にする、当該技術分野で現在公知の化学薬剤を意味する。ｈ．「抗原提示細胞」すなわち「ＡＰＣ」には、ランゲルハンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、樹状細胞、およびリンパ系臓器の指状突起細胞などの公知のＡＰＣが含まれる。また、この定義には、（１）この発明のポリヌクレオチドを皮膚に吸収し発現するリンパ球とマクロファージ、および（２）本明細書に含まれている組織写真に示す単核細胞などのような単核細胞も含まれている。これらの細胞は、組織細胞ではないが、抗原提示細胞と考えられる。本発明にとってこれらの細胞の中で最も重要なものは、表皮、ならびに頬粘膜、腟、子宮頚および食道の偏平粘膜上皮（ＡＰＣの濃度が「比較的高い」領域）を含む、上皮およびリンパ組織の胸腺依存性領域中に多数存在していることが知られているＡＰＣである。したがって、本明細書で使用する「皮膚」と「粘膜」という用語は、下記のそれらの定義に加えてＡＰＣが集合している部位を特に意味している。ｉ．「宿主」は、本発明によって実施される療法の受容者を意味する。宿主は、任意の脊椎動物でもよいが、好ましくは哺乳類である。宿主は、哺乳類の場合、ヒトが好ましいが、家畜もしくはペットの動物でもよい。ｊ．「標的組織」は、裸のポリヌクレオチドの発現が求められている宿主の組織を意味する。ｋ．「皮膚」は、本明細書では、宿主の表皮、真皮および皮下の組織を意味する。ｌ．「粘膜」は、身体内に位置している宿主の粘膜組織を意味し、限定されないが、呼吸流路（気管支流路、肺上皮および鼻腔上皮を含む）、生殖器流路（腟、陰茎および肛門の粘膜を含む）、尿流路（例えば尿道、膀胱など）、口、眼、ならびに声帯を含む。ｍ．「侵入点」は、すぐ隣接している組織をんで、裸ポリヌクレオチドを宿主に導入する部位、を意味する。ｎ．「代理終点（ＳｕｒｒｏｇａｔｅＥｎｄＰｏｉｎｔ）」は、疾患が発症する直前に起こる宿主の生物学的状態を意味する。その例としては、糖耐性の損失（糖尿病）、コレステロール濃度の増大（心臓病）および血液中および尿中に遊離ラジカルのアミノ酸が存在すること（これは中枢神経系において遊離ラジカルを解毒する酵素が損失していることを意味する）が挙げられる。ｏ．「生物学的欠陥」は、哺乳類の老化に伴う、免疫機能または良好な健康状態の損失（疾患および宿主の疾患に対する抵抗性の欠陥を含む）を意味する。ｐ．「治療量以下の濃度」および「治療量以下の投与量」は、裸のポリヌクレオチドを宿主に一回非累積的に投与することによって発現されたペプチドに対して宿主が急性の検出可能な応答を起こすのに不充分な量で、裸ポリヌクレオチドが宿主内で行うペプチドの発現を意味する。ｑ．「真皮」および「表皮への投与」は、裸ポリヌクレオチドを皮膚にまたは皮膚を通じて与える投与経路を示す。真皮経路としては、真皮内と皮下の注射および経皮透過がある。表皮経路としては、刺激体に対して免疫応答を誘発するのに充分に皮膚の最外層を刺激する手段がある。その刺激体としては、機械的または化学的（好ましくは局所用の）物剤がある。ｒ．「上皮投与」は、化学的刺激剤が粘膜の上皮に塗布されることを除いて、化学薬剤の表皮投与とほとんど同じ方法である。ｓ．「ＩＬ」は、インターロイキンを意味する。ｔ．「ＴＨＩ応答」は、ある種のＡＰＣすなわちマクロファージ類ゃや樹状細胞類に結合してそれらを活性化する抗原によって優先的に誘発される体液免疫応答を意味する。ｕ．「生物活性ペプチド」は、宿主に投与した場合、宿主内で治療利点を発揮するかまたは免疫応答を誘発するペプチドを意味する。２．考察一面において、本発明は、抗原またはペプチドを作動的にコードする（を作らせるための遺伝子コードを持っている）裸のポリヌクレオチドを宿主の細胞に送達することによって、抗原に対する局所免疫または治療用のペプチドもしくはポリヌクレオチドに対する全身応答を誘発する方法で構成されている。さらに詳しく述べると、裸ポリヌクレオチドは、身体の他の組織と比べて比較的高濃度の抗原提示細胞を含有している組織に送達することが好ましい。本発明は、関与する発現メカニズムについて特定の原理によって完全には限定されないが、ポリヌクレオチドが単核細胞、恐らく宿主の抗原提示細胞によって発現されるので、裸のポリヌクレオチドの投与によるこれら組織内での生物学的応答が達成されると考えられる。また、該単核細胞は、裸ポリヌクレオチドの導入に対する炎症性免疫応答に関与していると考えられる。組織学的研究によると、裸のポリヌクレオチドは、有意な量で、線維芽細胞などの組織細胞によって直接には吸収されないようである（実施例９と図１５を参照）。この結論は、（１）微量の裸ポリヌクレオチドをマウスに真皮内投与してさえも顕著なＴＨ１応答を誘発したこと（マクロファージと樹状細胞による抗原提示を示唆、実施例１７と図２４〜２５を参照）、（２）裸ポリヌクレオチドをマウスに真皮内投与を行うと、検出可能な濃度の抗体の産生を刺激することなく、細胞障害性Ｔ細胞の生成を誘発したこと（実施例１５と図２１を参照）、および（３）抗原としてのポリヌクレオチドに対して長期の免疫記憶が誘発されること（実施例１６と図２２〜２３）を示す研究結果によって裏付けられている。本発明のこの方法において炎症が明確な役割を演じているとすれば、炎症に伴い標的組織の細胞膜の透過性が増大して裸ポリヌクレオチドの取り込み（特に皮膚と粘膜などのようなバリヤーを越えての取り込み）が促進されることは、当該技術分野の当業者にとって十分に評価されることであろう。標的組織として理想的なのは、皮膚または粘膜である。これらの組織は、局在した治療または免疫の応答を誘発することが望ましい感染症または疾患に対して治療が行われる場合、特に好ましい。例えば、粘膜経路の投与は、感染組織における抗原に対する免疫応答を追加刺激するために治療を行う性的感染症の治療に好ましい。鼻腔内経路の投与（吸入または吹入による）も、呼吸器疾患とその関連疾患を治療する療法に対し特に有用である。さらに、粘膜または真皮の経路は、アレルゲンに対する免疫化を行うのに有用である。また、これらの組織は、再生する性能があるため、導入された物質が侵入点に留まっている期間が制限されるので好ましい。標的組織中に存在している抗原提示細胞が裸ポリヌクレオチドの発現を仲介する働きをもっているので、本発明の方法は、局在応答を誘発するのに有用であるほどに発現されたペプチドに対する全身応答を誘発するのには有用ではない。しかし、投与量が充分な場合は、一過性全身効果を誘発することができる。したがって、発現されたペプチドに対する全身応答を誘導する本発明のこの面での有用な用途は、他の全身治療のアジュパントとしての用途であろう。本発明の別の面としては、ＡＰＣは伝達体として働き、裸のポリヌクレオチドをリンパ系臓器および侵入点以外の粘膜組織に送達する。この実施態様を、以下の仮定にを参照しながら説明するが、記載されているメカニズムは、本発明を限定するように解釈すべきではない。この実施態様においては、ＡＰＣは、裸ポリヌクレオチドを侵入点またはその近傍で吸収し、次いでリンパ循環系に送る。ＡＰＣは、リンパ節に到達すると、発現されたタンパク質を抗原として提示して、免疫応答を刺激する。そこから、例えば粘膜から、「ホーミング」受容体を保有するこれらＡＰＣは、リンパ循環系に再び入り、侵入点の組織以外の標的細胞に定着するまで循環していく。所望により、ホーミング受容体（標的細胞リガンドに結合する特異的膜タンパク質）の配列が決定され、裸ポリヌクレオチドに組み込まれる。リンパ系での発現について、この実施態様は、サイトカイン類を送達することによって、宿主の応答性を高めて、宿主中に存在する特異的サイトカイン類の濃度を増大させる手法も提供する。特に、リンパ系臓器において、循環サイトカイン類（抗原投与とともにまたはそれから短時間後に投与された）の宿主濃度が増大すると、病原体抗原に対する宿主の免疫応答を追加増大させることができ、そして（１）ワクチンのアジュバントとして働き、（２）自己免疫疾患における自己抗原に対する免疫応答を減少させ、または（３）アロ抗原（例えば、組織または臓器の移植の後で産生される）に対する免疫応答を減少させる。対象の遺伝子を保有するＡＰＣがリンパ節から移動して、ＡＰＣがホーミング受容体を持っている組織まで循環する場合、その遺伝子は、接近可能な侵入点に投与し、不便で接近しにくい部位で発現させることができる。例えば、鼻腔内に送達された裸ポリヌクレオチドは、適当な条件下で、生殖器の粘膜で発現される。本発明の他の用途は、抗原に対するアレルギー反応を和らげる用途である。この点では、鼻の投与経路が特に有用である。例えば、ＩＬ−２、γインターフェロンおよび／または形質転換成長因子（ＴＧＦβ）の遺伝子を投与して、ＩｇＥ分子の産生を抑制することができる。最近の臨床試験で、ＩＬ−２とγインターフェロンは、ＩｇＥの産生を妨害するのに充分な投与量で毒性であることが確認されたので、上記方法は特に興味深い。そのうえ、ＩｇＥ分子は、皮膚と粘膜中に支配的に存在しているので、本発明の侵入点としてこれらの経路を使用すると、これらの組織でのアレルギー反応を和らげるのに特に効果的であると期待できる。皮膚または粘膜で局在応答を誘発することが有用な場合の実施例が現存する。特に、粘膜経路の投与は、性的感染症を治療する場合に好ましい。この療法は、ＨＩＶ、ヒト乳頭腫ウイルス（生殖器のいぼの生成に関与しているウイルスなど）などの感染因子または皮膚ウイルス感染症に対する局所免疫応答を調節するのに用いることができる。また、免疫抑制が治療面で価値がある場合、免疫抑制因子（例えばＴＧＦβ）を有効にコードする遺伝子も本発明の方法によって供給することができる。この方法が有用な場合の実施例は、炎症性腸疾患を治療する場合である。本発明の特に有用な局面は、老化に伴う疾病の発症に関連するサイトカイン類及び生化学物質を、治療量以下の濃度で長期間、宿主に供給するための本発明の利用である。この局面では、裸のポリヌクレオチドは、サイトカインまたは関連成長因子のようなタンパク質を作動的にコードし、これらのタンパク質が哺乳類の循環系中に存在するかしないかで老化に伴う疾病の発生を容易にしたり遅延させたりするという具合に、免疫系を刺激する。このような疾病は、その血清中濃度が通常年齢とともに減少するペプチド類、例えばサイトカイン類、成長ホルモン類および酵素類（例えば、ヒトのα−Ｌフコシダーゼ、これは抗原に対する炎症性応答を仲介する）の濃度を増大させることによって抑制することができる。本発明のその外の特別な利点は、比較的少ない投与量の抗原を投与することである。さらに具体的に述べると、抗原を作動的にコードするであろうポリヌクレオチドが抗原自体の代わりに投与されるので、宿主に導入される異物質の量が比較的少ない。さらに、裸ポリヌクレオチドの皮膚または粘膜を通じての投与経路は、同じ強さの免疫応答を起こすのに必要なＤＮＡの濃度が筋肉内投与経路の場合より低い（例えば、約１／１０〜１／５０である。例えば、実施例１６と図２２〜２３を参照）。その結果、本発明は、例えば多価ワクチンとして用いるため、数百種もの異なる抗原をコードする裸ポリヌクレオチドを投与するのに役立つ。本発明の他の特別な利点は、アンチセンス療法での使用である。簡潔にいうと、特定の障害が特定の変異した核酸配列の発現と関連している場合、その変異遺伝子が転写もしくは翻訳の段階で特異的な発現を行うのを妨害するヌクレオチド配列を使用することができる。この手法は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはリボザイムを利用し、特異的な変異ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクするかまたは該ｍＲＮＡをリボザイムで切断することによって、該ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断する。アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、２６２巻、４０頁、１９９０年）。現在までに、いくつかの遺伝子や癌遺伝子がサプレッションまたはダウンレギュレーションのために標的になっており、以下のものがある。すなわち、限定されないが、ｐ５３（Ｖ．Ｓ．Ｐｒａｓｏｌｏｖ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（モスクワ）、２２巻、１１０５〜１１１２頁、１９８８年）、ｒａｓ（Ｓ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６巻、９８５〜９９１頁、１９８９年、Ｄ．Ｂｒｏｗｎ他、ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅｓ．、４巻、２４３〜２４９頁、１９８９年）、ｆｏｓ（Ｂ．Ｌｅｖｉ他、Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖｌ、２５巻（Ｓｕｐｐｌ）、９５〜１０２頁、１９８８年、Ｄ．Ｍｅｒｃｏｌａ他、Ｇｅｎｅ、７２巻、２５３〜２６５頁、１９８８年）、およびｍｙｃ（Ｓ．Ｏ．Ｆｒｅｙｔａｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８巻、１６１４〜１６２４頁、１９８８年、Ｅ．Ｖ．Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８巻、３６８３〜３６９５頁、１９８８年、Ｓ．Ｌ．Ｌｏｋｅ他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１巻、２８２〜２８８頁、１９８８年）である。それは、全ての症例において、標的の変異遺伝子の産生を遮断するのに充分ではない。Ｌｅｖｉｎｅ他が報告しているように（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｉｓｉｃａＡｃｔａ、１０３２巻、１１９〜１３６頁、１９９０年）、腫瘍表現型に寄与する突然変異には少なくとも５種類ある。したがって、多重突然変異遺伝子の障害の各突然変異を標的にすることにより、アンチセンス療法の利点を最適化しなければならない。本発明の方法は、ポリヌクレオチドの混合物を送達するのに特に適しているので、多重突然変異のアンチセンス療法に特に有用である。また、アンチセンス療法は、例えばIII型、IV型およびＬｅｖｉｎｅらの前掲文献に記載されているIII型に似ているＶ型の変異で新生物細胞を産生する確率を増大するよう直接作用する変異タンパク質の産生を遮断するのにも使用できる。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、突然変異が顕著でない場合、例えば適正なタンパク質をコードする非突然変異対立遺伝子が残っている場合、治療上効果的である。しかし、突然変異がＩ型突然変異の場合のように顕著なとき、およびある種のIII型突然変異の場合のような両方の対立遺伝子が欠失しているかまたは一方が欠失して他方が突然変異体であるとき、アンチセンス療法に続いて置換療法を行うことが好ましい。置換療法では、変異遺伝子またはガン原遺伝子を持っていると確認された標的細胞に、その確認された変異遺伝子に関連する障害または異常増殖が起こるのを未然に防止するのに必要な野生型タンパク質を産生する野生型遺伝子が導入される。腫瘍サプレッサー遺伝子の場合、サプレッサー遺伝子を培養細胞中に導入すると、細胞死が起こるかまたは識別できる変化が全く起こらないが、これらの細胞は動物内でもはや腫瘍形成性でなはいことが知られている。したがって、リボザイムおよび／またはアンチセンスの療法を遺伝子置換療法とともに行う場合、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的である変異遺伝子を含有する細胞集団が、治療中の患者内での異常増殖の発生にもはや寄与しなくなる機会が増大する。また、本発明は、癌状態すなわち特定の遺伝子の欠失または特定の遺伝子内の多形性によって仲介される細胞増殖障害を治療する遺伝子療法を提供するものである。この療法は、変異遺伝子によって起こる増殖障害をもっていると本発明の方法で確認された細胞に、特異的なアンチセンスポリヌクレオチドおよび／または置換野生型遺伝子を導入することによって、その効果を達成する。その細胞が、多形性を有する遺伝子の複製を防止するために、アンチセンス療法のみならず野生型遺伝子の置換も必要なのかどうかは、事例ごとに決定されねばならず、そしてその変異が顕著な効果をもっているのかどうか、すなわち、その野生型遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊されてその遺伝子が全く存在しないことが細胞増殖効果をもっているのかどうか、によって決まる。皮膚にまたは皮膚の近傍に局所免疫を誘発する好ましい投与経路は、経皮透過、真皮内注射、または表皮細胞の最外層の表面のひっかきもしくは刺激（すなわち表皮投与）による経路であるが、皮下注射もある種の用途に用いられ得る。呼吸道に局所免疫を誘発するのに好ましい投与経路は、吸入または吹入による経路であるが、他の粘膜組織への投与経路はその所在によって変わる。裸のポリヌクレオチドを皮膚または粘膜に導入すべき場合、界面活性剤、吸収促進剤、化学的刺激剤（例えば、角質溶解剤）または機械的刺激体を用いることにより、注射の必要なしに、ポリヌクレオチドを容易に送達できることが好ましい。遺伝子以外の小分子の取り込みを容易にする界面活性剤および吸収促進剤は、当該技術分野で公知であり、過度の試験を行うことなく遺伝子の取り込みを容易にするため使用するのに適応させることができる。裸のポリヌクレオチドを導入するその他の実質上非侵襲の手法は、ペプチドの経皮透過に用いて成功している経皮透過による方法（好ましくはイオン導入法）である。循環するサイトカイン類および関連ペプチドの産生を刺激する本発明の実施態様の場合、非経口の投与経路を用いることができるが、宿主の組織にほとんど侵襲しないか全く侵襲しない経路を用いることが非常に好ましい。しかし、裸のポリヌクレオチドは繰り返し投与する必要があるので、筋肉内注射は好ましくない。代わりに、裸のポリヌクレオチドを、皮膚および粘膜のような再生する身体の領域に導入することは、これらの領域が、各投与に伴う外傷によって直接冒される細胞を置換する性能をもっているので、好ましい。本発明のこれらの実施態様で発現させるタンパク質を確実に分泌させるため、当該技術分野の当業者にとって公知の分泌を制御する配列を、このような配列が全長の遺伝子中にまだ存在していない場合、投与される裸のポリヌクレオチド中に含有させる。さらに、ポリヌクレオチドは、治療量以下の濃度でペプチドを送達する本発明の実施態様で用いる場合、リポソームに接合されるか、または生体外でそのポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞で送達されてもよいことに留意すべきである。しかしながら、先に考察した理由から、これらの実施態様では、裸のポリヌクレオチドと粘膜または真皮の投与経路を用いることがやはり好ましい。特に、リポソームを使用すると発現レベルが低下するようである。この現象は、リポソームを抗原物質として認識するＡＰＣの性能が低いことが原因のようである。図面の簡単な説明図１は、ｐＲＥＶｋ３およびｐＲＳＶＩＬ−２を筋肉内注射した後の慢性炎症（パネルＡ）と筋壊死（パネルＢ）を示す筋肉組織の断面を示す。パネルＣはｐＲＥＶＫ３またはｐＲＳＶＩＬ−２を皮下注射した後の類似の筋肉組織の断面を示す。図２Ａは、裸のｐＣＭＶＲＮＰを真皮内注射した後の血清中抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示し、図２Ｂは、裸のｐＣＭＶＲＮＰを筋肉内注射した後の血清中抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図３は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に導入する前の抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図４は、麻痺されていない群のＢａｌｂ／ｃマウスの抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図５は、麻酔された群のＢａｌｂ／ｃマウスの抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図６は、ｐＲＳＶＩＬ−２とｐＲＳＶＩＬ−４（パネルＡ）およびｐＲＳＶＴＧＦβ１（パネルＢ）を筋肉内注射されたマウスの血清中の抗ＫＬＨの濃度のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図７は、ｐＲＳＶＩＬ−２（パネルＡ）、ｐＲＳＶＴＧＦβ１（パネルＢ）およびｐＲＳＶＴＧＦβ（パネルＣ）を筋肉内注射した後のマウスの血清中の抗トランスフェリンの濃度のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図８は、（ｐＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＴＧＦβを注射されたマウスにおける）抗原投与（ａｎｔｉｇｅｎｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後の足蹠腫検定の結果を示す。図９は、ｐＲＳＶＩＬ−２およびｐＲＳＶＴＧＦβを注射されたＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの抗クロマチン血清中濃度のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図１０は、個々のＡＫＲ／Ｊマウスが時間の経過につれて示すＩＬ−２発現量のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図１１は、図１０に記載されているマウスの長命データを示す。図１２は、治療量以下の濃度でＩＬ−２遺伝子の発現を起こすのに充分な投与量で裸のポリヌクレオチドを導入した後の、ＡＫＲ／Ｊマウス（マウスリンパ腫のモデル）のＮＫ細胞の細胞溶解活性の⁵¹Ｃｒ放出検定試験の結果を示す。図１３（ａ）−（ｂ）は、若いＢａｌｂ／ｃマウスと老年のＢａｌｂ／ｃマウスに裸ｐＲＳＶＩＬ−２を異なる投与量で投与した後のＩＬ−２発現のレベルを示す。図１４は、異なる侵入点でｐＲＳＶＩＬ−２を投与した後、血清中に検出されたＩＬ−２発現のレベルを示す。図１５は、Ｂａｌｂ／ｃにおけるｐＣＭＶＲＮＰの侵入点での皮膚の組織学的試験の結果を示す写真であり、単核細胞（ＡＰＣ）によるプラスミドの取り込みを示している。ＡＰＣは矢印で示し、組織細胞（プラスミドを含有していない）は傾斜線（ｓｌａｓｈｅｄｌｉｎｅ）で示してある。図１６は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに機械的に表皮に投与した後の抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図１７は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに化学的に表皮に投与した後の抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図１８は、ＩＬ−２をコードする裸のポリヌクレオチドを投与した後、時間の経過につれて血清中に検出されたＩＬ−２発現の安定性を示す。図１９は、裸のｐＣＭＶＲＮＰを真皮内に注射されたＢａｌｂ／ｃマウスにウイルス投与がなされた後に生存した期間を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示す。図２０は、ＣＭＶまたはＲＳＶのプロモーター配列を含有する裸のプラスミドを別個に真皮内に注射した後のＮＰ遺伝子の発現をグラフで比較して示す。図２１は、各種の裸プラスミドを真皮内に注射した後、マウス内に検出された細胞障害性Ｔ細胞のレベルを示す。図２２は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを筋肉内もしくは真皮内に注射して投与した後、および（２）β−ガラクトシダーゼを真皮内に注射して投与した後の、抗β−ガラクトシダーゼ抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２３は、抗原のブースター注射を行った後の図２２に示すマウス由来の血清中抗β−ガラクトシダーゼ抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図２４は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを真皮内または筋肉内に注射したマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射したマウスの血清中ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２５は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを真皮内または筋肉内に注射したマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射したマウスの血清中ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２６は、抗原のブースター注射を行った後の図２５に記載のマウスの血清中ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２７は、抗原のブースター注射を行った後の図２４に記載のマウスの血清中ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２８は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドでコートされたとがった先端で皮膚をひっかくことによって導入されたマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射されたマウスの血清中ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。図２９は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドでコートされたとがった先端で皮膚をひっかくことによって導入されたマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射されたマウスの血清中ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。発明の詳細な説明この説明を通じて示される実施態様および実施例は、代表例とみなすべきであり、本発明を限定するものではない。Ｉ．相当な濃度の抗原提示細胞を有する標的組織への裸のポリヌクレオチドの導入Ａ．裸のポリヌクレオチドの製造本発明に使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよいが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列が好ましい。本発明で用いられるポリヌクレオチド配列は、（ａ）発現可能であり、かつ（ｂ）非複製性（ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）であるかまたは宿主ゲノム中に複製されないように当該技術分野で公知の手段で処理しなければならない。本発明に使用するのに適切なポリヌクレオチドの製造について以下に説明し、次いで特定のポリヌクレオチドの組成物の製造法を示す具体的な実施例を以下に提供する。しかし、非複製性ポリヌクレオチドの他の公知の製造法も適切なものであることは当該技術分野の当業者にとって明らかなことである。本発明に使用するポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知のハイブリッド形成法を用いて得ることができる。また、ＤＮＡとＲＮＡは、当該技術分野で公知の自動核酸合成装置を用いて合成することもできる。ポリヌクレオチドの混合物を生成させるのに、公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが特に好ましい。ゲノム核酸類は、Ａｕｓｕｂｅｌ他、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２章と４章（ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年）に記載されているプロトコルなどの当該技術分野で公知の方法で製造することができる。ＣＤＮＡは、当該技術分野で公知の方法で製造することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ）米国ニューヨーク、１９８２年）を参照）。また、対象のポリヌクレオチドを含有するｃＤＮＡ発現ライブラリーも当該技術分野で公知の方法によって選別することができる。参考のため、上記の方法の実施例を以下の考察によって説明する。特定の用途に用いる好ましいポリヌクレオチドは、先に述べた発明の概要の項で提案されている。例えば、本発明の裸のポリヌクレオチドは治療用ペプチドを作動的にコードできるが、抗原として作用して体液応答および／または細胞応答を刺激することができる免疫原性ペプチドをコードする方が好ましい。また、裸のポリヌクレオチドは抗体を作動的にコードすることができる。この点について、「抗体」という用語には、あらゆるクラスの全免疫グロブリン、キメラ抗体類、二重もしくは多重の抗原特異性を有するハイブリッド抗体類、およびハイブリッドフラグメントを含有するフラグメントが含まれる。また、「抗体」の意味の中には、そのようなフラグメントの接合体、および例えば米国特許第４，７０４，６９２号に記載されているようないわゆる抗原結合タンパク質類（一本鎖の抗体類）も含まれる。代わりに、そのコードされる抗体は、例えば米国特許第４，６９９，８８０号に記載されているような抗イディオタイプ抗体（他の抗体を捕捉する抗体）であってもよい。しかし、当該技術分野の当業者は、本発明の方法は、対象の治療用および／または免疫原性のペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドまたはその混合物を投与するのに用いるよう構成されていることが分かるであろう。したがって、本発明は、特定のポリヌクレオチドを使用することに限定されない。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、別個のフラグメントの形態またはより大きな構造体の成分としてのデオキシリボヌクレオチド類またはリボヌクレオチド類を意味する。本発明の治療用および／または免疫原性のペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡフラグメントから、または組換え転写単位に発現されうる合成遺伝子を提供するオリゴヌクレオチド類から組み立てることができる。本発明のポリヌクレオチドの配列としては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの配列がある。ポリヌクレオチドの配列は、遺伝コードから推定できるが、その遺伝コードの縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチド類には、その遺伝コードの結果として縮重している配列が含まれているが、その配列は当該技術分野の当業者であれば容易に決定できる。所望の治療用および／または免疫原性のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、真核生物または原核生物中に発現させることができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物を挙げることができる。真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物中で発現する方法は、当該技術分野で公知である。宿主中で発現し複製することができる生物学的に機能を有するウイルスおよびプラスミドのＤＮＡベクターも当該技術分野で公知である。このようなベクターは、本発明のＤＮＡを組み込むのに用いられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、対象の治療用および／または免疫原性のペプチドを作動的にコードする公知のポリヌクレオチドの機能誘導体がある。「機能誘導体」という用語は、ある分子の「フラグメント類」、「変異体類」、「類似体類」または「化学的誘導体類」を意味する。本発明のＤＮＡ配列のいずれかのような一つの分子の「フラグメント」には、その分子の任意のヌクレオチドサブセットが含まれる。このような分子の「変異体」とは、その全分子またはそのフラグメントに実質的に類似している天然に存在する分子を意味する。ある分子の「類似体」とは、その全分子またはそのフラグメントに実質的に類似している非天然の分子を意味する。本明細書で用いる場合、分子は、通常その分子の一部分ではない追加の化学部分を他の分子が含有している場合、その他の分子の「化学誘導体」であるといわれる。このような部分によって、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、これらの部分は、その分子の毒性を低下させ、分子の望ましくない副作用などを除くかまたは減少させることができる。このような効果を仲介できる当該技術分野で公知の部分は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、米国ペンシルベニア州、イーストン（１９８０年）に開示されている。したがって、「ポリヌクレオチド」という用語には、本明細書で用いる場合、本明細書に記載されているポリヌクレオチドに実質的に類似しかつ類似の活性を有する、機能誘導体、フラグメント類、変異体類、類似体類および化学誘導体類が含まれる。また、本発明の治療用および／または免疫原性のペプチドを製造するのに使用するＤＮＡ配列は、いくつもの方法で得ることができる。例えば、そのＤＮＡは、当該技術分野で公知のハイブリッド形成法を用いて単離することができる。これらの方法には、限定されないが、１）ゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーとプローブのハイブリッドを形成させて共有されているヌクレオチド配列を検出する方法、２）発現ライブラリーを抗体で選別して共有されている構造の特徴を検出する方法、および３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成がある。また、そのフラグメントをコードする特異的ＤＮＡ配列は、１）二本鎖ＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡから単離する、２）ＤＮＡ配列を化学的に製造して対象のポリペプチドに必要なコドンを提供する、および３）ドナーの真核細胞から単離されたｍＲＮＡを逆転写することによって二本鎖ＤＮＡ配列を生体外で合成する、ことによって得ることができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれる、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡの補体が最終的に形成される。ハイブリッド形成法は、各プローブが潜在的に、変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合物を含有するハイブリッド形成試料中の特異的ＤＮＡ配列の完全補体である場合、標識を付けた混合合成オリゴヌクレオチドのプローブを用いて組換えクローンを選別するのに有用である。このような選別を行う場合、ハイブリッド形成は、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡについて実施することが好ましい。ハイブリッド形成法は、対象のポリペプチドに関連するｍＲＮＡの存在量が極端に少ない場合、起源由来のｃＤＮＡクローンを検出するのに特に有用である。換言すれば、非特異的結合を避けるのを目的とする緊縮ハイブリッド形成条件を用いることによって、例えば、標的ＤＮＡを混合物中の単一プローブとハイブリッドを形成させることによって特異的ｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可視化することができる。対象のポリヌクレオチドを含有していると考えられるｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡ由来の各種ｍＲＮＡを卵母細胞中に注入し、ｃＤＮＡ遺伝子産物が発現するのに充分な時間を与え、次いで例えば対象のポリヌクレオチドがコードするペプチドに対して特異的な抗体を用いるかまたは繰り返しモチーフに対するプローブおよび対象のポリヌクレオチドがコードするペプチドの特徴的な組織発現パターンを利用することによって、所望のｃＤＮＡの発現産物の存在について試験して選別することができる。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも一つのエピトープをもっている治療用および／または免疫原性のペプチドの発現について、そのペプチドに対し特異的な抗体を用いて間接的に選別することができる。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として誘導され、対象のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。適当なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリッド形成法に依存する選別法によって、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することができる。問題のタンパク質をコードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。そのためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが分かっていなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、その遺伝コードから推定できるが、そのコードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重している場合、混合付加反応を実施することができる。これには変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合物が含まれる。このような選別を行う場合、ハイブリッド形成は、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡについて実施することが好ましい。本発明の裸のポリヌクレオチドは、これらポリペプチドの発現を制御する調節タンパク質を作動的にコードする他のポリヌクレオチドに接合するかもしくはそのような他のポリヌクレオチドと組み合わせて使用してもよく、または認識、プロモータおよび分泌の配列を含有していてもよい。当該技術分野の当業者は、過度の試験を行わずに、調節ポリヌクレオチドを選択し、それを本発明の裸のポリヌクレオチド中に組み込む（該調節ポリヌクレオチドがまだ存在していない場合）ことができる。例えば、マウスまたはヒトの系に用いる適切なプロモーターとその使用については、前掲のＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙの第１章に記載されている。本発明に用いる特に好ましい形態の裸のポリヌクレオチドは、プラスミドベクターに組み込まれた形態のものである。プラスミドベクター、特にレプリケーターを含有するプラスミドベクター、を使用すると、標的組織中での遺伝子の発現が延長される。また、ある種のプラスミドベクターは、ペプチドをコードする遺伝子がこのベクターに組み込まれると、高レベルの発現が達成されるので、免疫原性ペプチドに対する免疫応答の優れたメディエイタである。適切なプラスミドベクターは、当該技術分野では公知であり、前掲のＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙの第１章に記載のベクター類が挙げられる。特に好ましい２種のプラスミドベクターは、ｐＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）とｐＣＭＶ（サイトメガロウイルス）のプロモーターベクターである。これらプロモーターのうち、ＣＭＶは、筋肉以外の組織に導入されるポリヌクレオチドに対して好ましい。この好ましさは、ＣＭＶプロモーターを利用すると、ここでいう文脈において、高レベルの発現が達成される、という観察結果に基づいている。ＲＳＶプロモーターを単離する適切なプロトコルおよびプラスミドベクターを構築する際の該プロモーターの使用法については、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７９巻、６７７７頁（１９８２年）に記載されている。他の好ましいプラスミドベクターは、ｐＲＥＰ７とｐＲＥＶであり、これらは米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されている。ポリヌクレオチドをクローン化する場合、ｍＲＮＡを製造するのに特に適切なプラスミドは、Ｋｒｅｉｇ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１２巻、７０５７〜７０７０頁（１９８４年）に記載されているｐＳＰ６４Ｔクローニングベクターである。開始コドンを含有する任意のｃＤＮＡは、このプラスミドに導入することが可能であり、ｍＲＮＡは発現されたＤＮＡ鋳型から通常の技術を用いて製造される。本発明に利用できる各種のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスがある。このレトロウイルスのベクターとしては、マウスまたは鳥類のレトロウイルスのベクターの誘導体が好ましい。単一の異種遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例としては、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）がある。多くのさらに別のレトロウイルスベクターが多重遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターは、全て、選択マーカーの遺伝子を運ぶかまたは組み込むことができるので、形質導入された細胞を同定して生成させることができる。ウイルスベクターに、例えば、特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする他の遺伝子とともに、対象の配列を１種以上挿入することによって、そのベクターは標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にすることができる。好ましいターゲティングは、抗体を用いてレトロウイルスベクターを標的とすることによって達成される。当該技術分野の当業者は、レトロウイルスのゲノムに挿入して対象のポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を行うことができる特異的ポリヌクレオチド配列を知っているか、または過度の実験を行うことなく容易に確認できるであろう。必要な場合、別のベクターを用いて置換遺伝子を細胞に標的送達することができる。アンチセンス療法の場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多形性を有する標的遺伝子に対してのみ特異的であるから、アンチセンスオリゴヌクレオチドと置換遺伝子も同じベクターで送達することができる。組換えレトロウイルス類は欠陥があるので、感染性ベクター粒子を製造するには補助が必要である。この補助は、例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることによって提供される。これらのプラスミドは、パッケージング機構が、包膜（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）を行うためのＲＮＡ転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞系としては、限定されないが、例えば Ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２がある。これらの細胞系は、ゲノムがパッケージされていないので、中空ビリオンを産生する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルが無傷であるようなヘルパー細胞内に導入され、しかし構造遺伝子は対象の他の遺伝子で置換されていると、そのベクターはパッケージされてベクタービリオンを産生することができる。発現を監視するため、これらのベクターは修飾して公知のレポーター遺伝子を含有させてもよい。例えば、Ｎｏｒｔｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻、２８１頁（１９８５年）に記載されているｐＲＳＶｌａｃ−ＺＤＮＡベクターは、タンパク質発現によってβ−ガラクトシダーゼを産生することができる。ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」、ｐＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの構築に関するＧｏｒｍａｎ他の前掲の文献を参照）も使用できる。簡便なプラスミドの増殖は、大腸菌内で行うことができる（例えば、前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌを参照）。トレライジングワクチン（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇｖａｃｃｉｎｅ）として使用する場合、ポリヌクレオチド類の混合物またはポリヌクレオチド類の別個に同時に投与される群が、免疫抑制サイトカイン（例えばＴＧＦβ）のために作動的にコードしている遺伝子および関連する組織互換性タンパク質について作動的にコードしている別の遺伝子を含有していてもよい。このやり方は、異種抗原（アロ抗原を含む）および自己抗原に対する耐性を誘発させる際に用いるよう適応している。アンチセンス療法に用いる場合、合成のアンチセンスオリゴヌクレオチド類は、一般に１５〜２５個の塩基の長さである。ヒトゲノムがランダムな組織であるとすれば、統計学的に、１７量体がヒトＤＮＡの細胞ｍＲＮＡ中の非反復配列を形成し、１５量体が細胞ｍＲＮＡの成分中の非反復配列を形成していることが示唆される。したがって、選択された遺伝標的に対する実質上の特異性が本発明の合成オリゴマーを用いて容易に得ることができる。細胞内で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリッドを形成して二本鎖分子を生成する。その細胞は二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害する。約１５個のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴマーは、容易に合成され、かつ標的のヌクレオチド変異体産生細胞中に導入されたとき、大きな分子より問題を起こすことが少ないようであるので、好ましい。遺伝子の生体外翻訳を阻害するのにアンチセンス法を使用することは、当該技術分野で公知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７２巻、２８９頁、１９８８年）。あまり一般的ではないが、ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子も用いることができる。リボザイム類は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の方式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する性能を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を修飾することによって、ＲＮＡ分子内に変異癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子が生成することに関連する特異的ヌクレオチド配列を認識しそれを切断する分子を作製することができる（Ｃｅｃｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．、２６０巻、３０３０頁、１９８８年）。この手方の主な利点は、リボザイムが配列特異的であるので、特定の変異配列を有する標的ｍＲＮＡのみが不活性化されることである。リボザイムには２種の基本的な型がある。すなわち、テトラヒメナ型（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ−ｔｙｐｅ）（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻、５８５頁、１９８８年）と「ハンマーヘッド」型（”ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ”−ｔｙｐｅ）である。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは１１〜１８塩基の長さの配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡの種の中に排他的に出現する可能性が大きくなる。したがって、特異的なｍＲＮＡの種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、そして１８塩基の認識配列の方が短い認識配列より好ましい。未修飾のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、血清および細胞ヌクレアーゼ類によって容易に分解される。したがって、当該技術分野でよく知られているように、リン酸骨格に特定の修飾を行って、アンチセンスＤＮＡに対してヌクレアーゼ耐性を付与した。例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびα −アノマー糖ホスフェートなど、骨格修飾オリゴマー類は、血清および細胞ヌクレアーゼ類に対する耐性が増大した。そのうえ、メチルホスホネートは、非イオン性であり、親油性が増大して、細胞膜を通じての取込みが改善される。アンチセンス剤として修飾オリゴヌクレオチドを使用する場合、わずかに長いかまたは短い配列が必要であろう。というのは、分子構造の化学変化がハイブリッド形成に影響するからである（Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ他、ＢｉｏＰｈａｒｍ、４巻、３６〜４２頁、１９９１年）。これらの骨格を修飾したオリゴは、標的配列に結合し、その細胞の翻訳機構が特異的ＲＮＡに結合するのを遮断するかまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）構造を形成してリボヌクレアーゼＨ活性を誘発することによって、その阻害作用を発揮する。Ｂ．裸ポリヌクレオチド類の医薬製剤裸のポリヌクレオチドの組成物およびポリヌクレオチドの混合物は、医薬として許容される懸濁液、溶液または乳濁液中に入れてもよい。適切な媒体としては食塩水があるが、ポリヌクレオチドを標的組織へ送達するのに抗原提示細胞に依存しないそれら実施態様の場合は、リポソーム製剤でもよい。さらに具体的に述べると、医薬として許容される担体としては、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水の溶液、乳濁液または懸濁液があり、食塩水と緩衝媒体が含まれる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、ラクテイテッドリンゲル液（ｌａｃｔａｔｅｄＲｉｎｇｅｒ’ｓ）または不揮発性油がある。静脈内媒体としては、流体と栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づいたもの）などがある。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌薬、酸化防止薬、キレート薬および不活性ガスなども存在していてもよい。さらに、裸ポリヌクレオチドの組成物は、本発明による後程の再構成および使用に備えて、当該技術分野で公知の手段を用いて凍結乾燥してもよい。裸ポリヌクレオチドの抗原としてのＡＰＣ認識に依存しない本発明の態様の場合、先に考察した標的ベクター送達系に加えて、標的送達のためにコロイド分散系を使用することもできると思われる。しかし、裸のヌクレオチドを投与するために本発明の方法を用いること、およびこれらヌクレオチドを比較的高い濃度の抗原提示細胞を有する組織に投与することの利点があるが、ポリヌクレオチドを送達するのにコロイド分散系を使用するのはあまり好ましい方法ではないであろうということが当該技術分野の当業者にとって理解されるであろう。したがって、このような系についての以下の考察は、本発明の好ましい方法でも特定の適応症に対する用途には利用できないと判断するのに主として参考にしてもらうために、提供するものである。コロイド分散系としては、巨大分子複合体類、ナノカプセル類、マイクロスフェア類、ビーズ類、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル類、混合ミセル類およびリポソーム類を含む脂質ベースの系がある。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソーム類は、生体外および生体内で送達媒体として有用な人工の膜小胞である。大きさが０．２〜４．０μｍの範囲内の大型一重膜小胞（ＬＵＶ）が、大型の巨大分子を含有する水性緩衝液をかなりのパーセントで被包できることが分かっている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンは、水性の内容物中に入れて被包し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙ他、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６巻、７７頁、１９８１年）。リポソームは、哺乳類の細胞に加えて、植物、酵母および細菌の細胞にポリヌクレオチドを送達するのに用いられてきている。リポソームが効率的な遺伝子輸送媒体であるためには、下記の特性をもっていなければならない。すなわち、（１）アンチセンスポリヌクレオチドをその生物活性を低下させることなく高効率にコードする遺伝子を被包すること、（２）非標的細胞に比べて標的細胞の方に優先的にかつ実質的に結合すること、（３）小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に高効率に送達すること、および（４）遺伝情報を正確かつ効果的に発現すること、である（Ｍａｎｎｉｎｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻、６８２頁、１９８８年）。リポソームの組成は、通常、リン脂質類特に相転移温度が高いリン脂質類の組合せ体であり、通常ステロイド類特にコレステロールと組み合わせたものである。他のリン脂質類または他の脂質類も使用することができる。リポソーム類の物理特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存している。リポソームを製造するのに有用な脂質類の例としては、ホスファチジル化合物類、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質類、セレブロシド類およびガングリオシド類がある。特に有用なのは、ジアシルホスファチジルグリセロール類であり、これらは、その脂質部分が１４〜１８個の炭素原子を含有し特に１６〜１８個の炭素原子を含有し、かつ飽和している。リン脂質の実例としては、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンである。リポソーム類のターゲティングは、解剖学的因子と機械論的因子に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、例えば、臓器特異的、細胞特異的および細胞小器官特異的の選択性のレベルに基づいている。機械論的ターゲティングは、受動的であるかまたは能動的であるかに基づいて区別することができる。受動ターゲティングは、洞様毛細血管を有する臓器中の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中にリポソームが分布するという自然の傾向を利用している。一方、能動ターゲティングでは、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質のような特異的リガンドにカップリングさせるか、または天然に存在する局在部位以外の臓器と細胞型へのターゲティングを達成するためリポソームの組成もしくは大きさを変えることによって、リポソームが改変される。標的送達系の表面は、種々の方法で修飾することができる。リポソームの標的送達系の場合、脂質群は、リポソームの脂質二重層中に組み込まれて、ターゲティングリガンドはリポソーム二重層との安定した結合が維持される。脂質の連鎖をターゲティングリガンドに結合するのに各種の連結基を用いることができる。ＡＰＣの発現に依存している本発明のこれら実施態様の場合、リポソーム製剤は、裸ポリヌクレオチドの生体内での取込みをかなり制限するので、使用すべきではない。このような実施態様では、代わりに、等張緩衝溶液が、裸ポリヌクレオチドの取込みを最大にするのに好ましい媒体である。さらに、吸収促進剤、界面活性剤、化学的刺激剤または機械的刺激手段も、裸ポリヌクレオチド組成物が侵入点を通じて透過するのを促進するのに好ましい。有機医薬またはペプチドがベースの医薬の粘膜送達に使用して成功している促進剤と界面活性剤に関する一般原理については、Ｃｈｉｅｎ、ＮｏｖｅｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、第４章（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、１９９２年）を参照されたい。医薬の鼻腔内送達の公知の手段と原理に関する具体的な情報は、Ｃｈｉｅｎの前掲文献の第５章に記載されている。適切な鼻腔内吸収促進剤の例が第５章の表２と３に記載されているが、一層おだやかな薬剤が好ましい。さらに、医薬の経皮送達の公知の手段と原理も、Ｃｈｉｅｎの前掲文献の第７章で考察されている。また、粘膜／鼻腔内送達を行う本発明の方法に用いる適切な薬剤が、Ｃｈａｎｇ他、ＮａｓａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ、「ＴｒｅａｔｉｓｅｏｎＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｔｙ」の第９章と表３−４Ｂ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，１９９２年）に記載されている。皮膚を通じて医薬を吸収するのを促進することが知られている適切な薬剤が、Ｓｌｏａｎ著のＵｓｅｏｆＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙＰａｒａｍｅｔｅｒｓｆｒｏｍＲｅｇｕｌａｒＳｏｌｕｔｉｏｎＴｈｅｏｒｙｔｏＤｅｓｃｒｉｂｅＰａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ−ＤｒｉｖｅｎＰｒｏｃｅｓｓｅｓ、第５章、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ＴｏｐｉｃａｌａｎｄＯｃｕｌａｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ」（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、１９９２年）およびそのテキストの他の部分に開示されている。これらの方法（および医薬送達を容易にするため便利に使用される他の方法）は、当該技術分野の当業者が過度に試験を行うことなく、本発明の方法に用いる裸のポリヌクレオチドを製造するのに適応させることができると考えられる。特に、前記パラグラフで考察した方法は、本発明の発明者の知見によれば、ポリヌクレオチドの送達に従来用いられたことはないが、この目的に使用するのに適していると考えられる。その理由のため、上記引用文献類は、本発明の方法に必須なものではないが、本明細書に援用するものである。この適合性を説明する具体的な実施例を以下に述べる。Ｃ．裸のポリヌクレオチドを投与する手段と経路皮膚投与経路の場合、導入手段は、表皮投与、皮下注射または真皮内注射による方法である。これらの手段のうち、表皮投与は、真皮内組織中に高濃度でＡＰＣが存在していると考えられる場合好ましい。しかし皮膚投与経路に用いる導入手段で最も好ましいのは、侵襲性が最も少ない手段である。これらの手段の中で好ましいのは、経皮透過法と表皮投与法である。経皮透過法の場合、イオン導入法が適切な方法である。イオン導入法の透過は市販されている「パッチ」を用いて実施できるが、このパッチは、その生成物を、無傷の皮膚を通じて数日間以上にわたって連続して送達する。この方法を使用すると、比較的濃度が高い医薬組成物の透過を制御することができ、組合せ医薬の注入を行うことができ、そして吸収促進剤を同時に使用できる。この方法に用いる代表的なパッチ製品は、米国カリフォルニア州ロスアンゼルス所在のＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ社の登録商標製品ＬＥＣＴＲＯＰＡＴＣＨである。この製品は、電子制御により貯留電極（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を中性ｐＨに維持して、いろいろな濃度の投与を行い、かつ連続的におよび／または周期的に投与するよう適応させることができる。そのパッチの調製と使用は、ＬＥＣＴＲＯＰＡＴＣＨ製品に添付されているメーカー印刷の指示書に従って実施しなければならない。なお、その指示書は、本明細書に援用するものである。表皮投与法は、基本的に、刺激体に対する免疫応答を引き起こすのに充分に表皮の最外層を機械的にまたは化学的に刺激する。具体的に述べると、その刺激は、ＡＰＣを刺激部位に引き付けるのに充分な刺激でなければならない。さきに考察したように、次にＡＰＣは、投与された裸ポリヌクレオチドを取り込みそして発現すると考えられる。代表的な機械的刺激方法では、直径が非常に小さくかつ短い多数の尖叉が使用され、その尖叉を使用して、皮膚を刺激しＡＰＣを刺激部位に引きつけ、その尖叉の末端から転移した裸ポリヌクレオチドを取り込ませる。例えば、フランス国リヨン所在のＰａｓｔｕｅｒＭｅｒｉｅｕｘ社が製造したＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ旧ツベルクリン試験には、裸のポリヌクレオチドを導入するのに適した装置が含まれている。その装置（米国では、ペンシルベニア州スイフトウォーター所在のＣｏｎｎａｕｇｈｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社が販売している）は、一方の末端にシリンジプランジャーを備え他方の末端に尖叉ディスク（ｔｙｎｅｄｉｓｋ）と備えたプラスチック製コンテナーで構成されている。その尖叉デスクは、表皮細胞の最外層をひっかく長さの小直径の尖叉を多数保有している。ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣのキットの尖叉には、各々旧ツベルクリンがコートされているが、本発明の場合、各ニードルは、裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の医薬組成物でコートされている。この装置は、この装置の製品に含まれている、メーカーが記載した説明書にしたがって使用される。使用と投与に関するこれらの説明書は、この装置の通常の使用方法を説明するため本明細書に援用するものである。この実施態様でも使用できる類似の装置は、アレルギー試験を実施するのに現在使用されている装置である。裸のポリヌクレオチドを表皮投与するのに適切な他の方法は、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学薬剤を使用し、充分な免疫応答を誘発してＡＰＣをその領域に引き付ける方法である。一つの例は角質溶解剤であり、例えば、ＮｏｘｅｍａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社が登録商標ＮＡＩＲで販売している市販の局所脱毛クリーム中に使用されているサリチル酸がある。このやり方は、粘膜の上皮への投与を行うのにも利用できる。この化学刺激剤は、機械的刺激体とともに適用してもよい（例えば、ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ型尖叉が化学刺激剤でコートもされていると、こうなるが）。裸のポリヌクレオチドは、化学刺激剤も含有している担体中に懸濁されているか、または該刺激剤と同時に投与されてもよい。粘膜投与の場合、導入手法は、侵入点の場所によって変わる。特に、呼吸器感染症に対する免疫化と治療を行う場合は、鼻腔内投与法が最も好ましい。これらの方法としては、裸ポリヌクレオチドまたはその混合物のエアロゾル懸濁液の吸入または裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の吹入がある。坐剤および局所製剤も、生殖器および眼の細胞の部位のような特定の粘膜に導入するのに適している。裸ポリヌクレオチドの腟送達について特に興味深いのは、腟サンドイッチ型リングとペッサリーである。これら装置の例とその使用方法については、Ｃｈｉｅｎの前掲の文献第９章に記載されている。本発明の方法を用いて供給される各裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の投与量は、宿主が所望する応答および使用されるポリヌクレオチドによってかわる。一般的に、一回の投与で１００〜２００μｇまでのＤＮＡを投与できるが、皮膚または粘膜を通じて約０．３μｇという少量のＤＮＡを投与して長期間続く免疫応答を誘発することができると考えられる。しかし、本発明の目的を達成するには、裸のポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドがコードしている生物学的に活性のペプチドを発現させるのに充分な投与量で供給されれば充分である。特別の状態（例えば治療量以下の投与量のサイトカインを供給する場合）に適した投与量は、以下の考察と実施例で説明する。これらの投与量は、治療レベル、治療量以下のレベルまたは免疫原性レベルの発現を達成するために改変してもよい。発現されたペプチドの存在と量を確認する方法は、当該技術分野の当業者にとって公知のことなので、詳細には述べない。これらの方法のある種の物を下記の実施例で述べるが、これらの方法としては、一般に、免疫検定法（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法）、ＰＣＲ法、および当該技術分野で公知の方法に従って実施される免疫組織学的分析方法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓ）がある。投与されるポリヌクレオチドの投与量は、これらの検定法と定量法ならびに当該臨床技術分野の当業者にとって公知の生体内臨床微候によって提供される情報に基づいて、所望の発現レベルを達成するために、調節することができる。ＩＩ．年齢に関連する疫病の発症の場合に重要なサイトカイン類および他のタンパク質を治療量以下のレベルで発現させるための、裸ポリヌクレオチドの導入裸のポリヌクレオチドを製造し導入する上記の方法は、本発明のこの実施態様に用いるのに適している。この実施態様においては、ここに述べる方法が治療量以下のレベルの循環サイトカイン類と類縁タンパク質を産生するのに採用される。上記で分かるように、治療量以下のレベルの発現タンパク質を産生するのに必要な裸ポリヌクレオチドの量は、熟練した臨床家であれば、容易に決定し必要に応じて調節することができる。本発明のこの局面は、所望のタンパク質のために作動的にコードしているポリヌクレオチドまたはその組換え混合物を、好ましくは老化に伴う生物学的欠陥が発生する前に、哺乳類に投与することによって実施される。例えば、免疫系が弱くなったことに伴う疫病が発生する危険性が高い患者に、例えば、疾患に対する代理終点の観察によって決定される疾患の発症の前に、連続レベルでタンパク質発現を行うよう、治療量以下のレベルの免疫刺激性インターロイキン（例えばＩＬ−２）を投与する。疾患の危険度が高い患者の場合、この治療は患者の寿命全体を通じて続けられる。患者にこの長期コースの治療を受け入れさせるためには、ポリヌクレオチドの個々の投与量（および得られるタンパク質発現のレベル）は低く（すなわち治療量以下で）なければならない。しかし、ポリヌクレオチドは、タンパク質よりもはるかにゆっくりと分解する（すなわち、数箇月の差）と考えられるので、あまり頻繁に投与しなくてもよく、したがって、患者に対する毒性と外傷の危険が最小になる。さらに具体的に述べると、老化に伴う疾患状態、またはＨＩＶ−１感染症の過程でのＣＤ４Ｔ細胞の損失のような免疫系の弱体化が原因の他の生物学的事象が発生する前または発生と同時に、所望のポリヌクレオチドの投与を開始する。疾患状態または免疫機能の損失が発生する。疾患状態または免疫機能の損失が発生する前に長期の連続した治療を開始することが好ましい。治療は、対象の遺伝子、特にサイトカイン類（例えば、インターロイキン類とリンフォトキシン類）のためのコードを有する遺伝子の治療量以下のレベルでの発現により達成されている。最も好ましくは、対象の遺伝子の少なくとも一つが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトメジン類（例えば、インスリン様成長因子［ＩＧＦ −１］）および／またはＴＧＦβのためのコードを有する遺伝子であるのがよい。これらのタンパク質は、免疫応答の大きさ（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＧＨおよびＩＧＦ−１）、ストレスもしくは損失に対する全身応答（例えば、ＩＬ −１）、組織の細胞充実性（ＧＨとＩＧＦ−１）および細胞外マトリックスタンパク質と結合組織の沈着（ＴＧＦβ）を制御するか、またはこれらに影響し得る。そして後者は、ＩＬ−１とＩＬ−２の活性が減少するにつれて、一層大きな生物学的作用を発揮する。本発明のこの特定の方法は、一部において、前記セクションＩに記載されている方法のサブセットである。しかし、当該技術分野の当業者は、本発明のこの実施態様が、「裸」でないポリヌクレオチドすなわちコロイド分散系に結合されているポリヌクレオチドを用いて実施できることが分かるであろう。しかし、上記セクションＩで開示した方法は優れたものであるが、その実践法（すなわち、比較的高比率のＡＰＣを含有する組織中に導入された「裸」のポリヌクレオチドを用いての）がはるかに好ましいのである。ＩＩＩ．裸ポリヌクレオチド反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）の投与本発明の他の局面は、単一プロモーターの制御下で、例えば、２００個までのポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構造体を発現させることを通して、ペプチド反応混液（すなわち、ポリヌクレオチドの混合物）を投与することである。この実施態様は、類似の症状を起こす異なる種の物質による感染症を治療するのに特に有用である。例えば、類似の臨床症状を有する呼吸器疾病を起こすライノウィル類の公知の種は、１００種を超えて存在している。特定の感染中の種を同定を行う（労力を要しかつしばしば正確でないプロセス）よりも、本発明の方法に従ってカクテルワクチンを投与することができ、それにより多数の異なるライノウィルスに対する免疫応答を刺激することができる。また、このやり方によって、異なる患者由来のエンベロープ遺伝子（この遺伝子は、必要な場合、増幅してもよい）のプールされた単離物を用いて、ＨＩＶの各種の株に対するワクチンを構築することができる。ポリヌクレオチドの混合物を投与は、２種以上の生物活性を有するペプチドを送達するのにも役立つ。例えば、免疫原性ペプチドのために作動的にコードする裸ポリヌクレオチドを、抗体を作動的にコードする裸ポリヌクレオチドと連結するかまたは一緒に投与して、ペプチドと抗体の両者が発現されるようにすることができる。実例を示すと、ＩＬ−２と抗ｇｐ７１を連帯して発現する遺伝子類を投与により（ＩＬ−２タンパク質で得られた結果に基づいて）、マウス内のマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に応答して発生した腫瘍組織内に抗体が局在する結果が得られた（ＩＬ−２／抗ｇｐ７１ｍＡｂの同時投与によって得られた結果について、Ｓｃｈｕｌｚ他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５０巻、５４２１〜５４２５頁、１９９０年を参照）。本発明の各実施態様の局面を示す例を以下に示す。これら例は、例示しているとみなすべきであり、本発明を限定しているとみなすべきではない。例裸ポリヌクレオチドの筋肉内注射を行った後、マウスに局在した遅延型過敏症が起こる裸のプラスミドｃＤＮＡを筋肉内に注射すると、そのポリヌクレオチドがコードしているペプチドが発現する（先に報告した結果と矛盾しない）が、筋肉組織内に該遺伝子に対する免疫応答が誘発される（先に報告した結果とは逆である）。２種のプラスミドを同時に注射すると、この炎症反応が慢性になり、筋壊死が現われる。両者の応答は、遺伝子の侵入点すなわち筋肉組織における、該遺伝子に対する局在した遅延型過敏症の応答の診断と一致している。先の予想とは逆に、筋肉細胞による取込みというよりむしろこの炎症性応答が、その筋肉注射に次いで裸ポリヌクレオチドが発現したことの（唯一の原因ではないにしても）原因でもあるようである。裸のｃＤＮＡの筋肉内注射によって起こる免疫応答を説明するため、ｐＲＥＶｋ３とｐＲＳＶＩＬ２を次のように調整した。プラスミド類の製造慢性リンパ性白血病のヒト患者由来の転位カッパライト遺伝子（rearranged kappa light gene）を単離した。この遺伝子は、Ｈｕｍｋｖ３２５を含有し、このＨｕｍｋｖ３２５は、ＩｇＭ自己抗体と慢性リンパ性白血病細胞によって共通して発現される１７．１０９交差反応性イディオタイプをコードしている。この遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｒｔｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻、９８３頁（１９９２年）に記載されている。なお、この文献は、本明細書に援用するものである。この遺伝子のＶ−Ｊ領域を含有する１０４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを切取り、哺乳類発現ベクターｐＲＥＰ７（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のポリクローニング部位中に、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）の下流に挿入して、ベクターを製造しｐＲＥＶｋ３と命名した。再構成（rearranged）ＪＫ１セグメントの下流には、翻訳を終結する自然終止コドンがある。ｐＲＳＶＩＬ−２という名称のＩＬ−２発現ベクターを製造するため、ベクターｐＲＳＶＬ（Ｗｏｌｆｆ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、１４６５頁、１９９０年）中のルシフェラーゼｃＤＮＡを、Ｃｕｌｌｅｎ、Ｃｅｌｌ、４６巻、９３７頁（１９８６年）に教示されている方法に従って、ｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＩＬ −２（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏ．６７６１８）の６８０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントで置き換えた。このＷｏｌｆｆ他およびＣｕｌｌｅｎの文献は、これら発現ベクターの構築に関する当該技術分野の知識を示すために本明細書に援用するものである。マウスへのプラスミドｃＤＮＡの筋肉内注射８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをメトキシフルランで麻酔した。プラスミドｃＤＮＡ（１００μｇ／注射）を１００ μｌの食塩水に懸渇させ、次いで２８ゲージの注射針を用いて四頭筋に一週間間隔で４回注射した。６頭のマウスの一群は、１００μｇのｐＲＥＶｋ３を注射された。別の一群の６頭のマウスは、各１００μｇのｐＲＥＶｋ３とｐＲＳＶＩＬ −２を注射され、第三群のマウスは、１００μｇの食塩水だけを注射された。これらの注射を行う直前に、血液試料を内側前頭脳底動脈から集めた。プラスミド類による生体内遺伝子発現を確認するためのＥＬＩＳＡ法Ｈｕｍｋｖ３２５産物に対する抗体をＥＬＩＳＡ法（酵素結合イムノソルベント検定法）で測定した。ＩｇＭリウマチ因子ＧｌｏがＨｕｍｋｖ３２５遺伝子によってコードされ、１７．１０９イディオタイプの正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）カッパ軽鎖を持っている。その精製タンパク質を、０．１Ｍホウ酸塩、０．２ＭＮａｃｌを含有しているｐＨ８．２の緩衝ホウ酸食塩水すなわちＢＢＳ中に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、次いでその１００μｌずつをプラスチック製の微量滴定プレートのウェルに添加した。４℃で一夜インキュベートした後、これらプレートを、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＢＢＳ（ＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄し、次に１％ウシ血清アルブミンを補充したＢＢＳ（ＢＢＳ／ＢＳＡ）を用いて室温で４時間クエンチした。ＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後、ＢＢＳ／ＢＳＡで連続希釈を行った試料を二つずつウェルに分配した。室温で３時間インキュベートした後、プレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次に、ＢＢＳ／ＢＳＡで１：２０００に希釈したビオチニル化痛風抗マウスＩｇＧ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社）とともにインキュベートした。１時間後、これらプレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いで２５μｌのＴＭＢペルオキシダーゼの基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社）とともにインキュベートした。３０分後に、４５０ｎｍ波長光の吸光度をマイクロプレートリーダー（米国カリフォルニア州メロンパーク所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）で測定した。その免疫血清中の抗体含量を推定するため、試験結果を、モノクロナール抗体１７．１０９で作成した標準曲線と比較した（例えば、Ｃａｒｓｏｎ他、（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻、１０８１〜１０８７頁におけるこのｍＡｂの説明を参照）。これらの検定結果は、対象の抗体の産生が増大したことを示し、それによりプラスミドによる遺伝子の発現を裏付けている。組織学的評価筋肉内注射を行ったマウスを４９日目に殺した。遺伝子が注射された筋肉を１０％ホルマリンで固定し、組織学的評価のために処理した。ｐＲＥＶｋ３とｐＲＳＶＩＬ２を同時に注射されてあった筋肉の部分は、慢性炎症と筋壊死を実証し、これは局在遅延型過敏症の応答と一致した（図１Ａおよび１Ｂ）。これと対照的に、ｐＲＥＶｋ３またはｐＲＳＶＩＬ２を単独で注射された筋肉は、皮下注射の部位にリンパ様浸潤物が局在していた（図１Ｃ）。例ＩＩ裸ポリヌクレオチドを真皮内注射した後の遺伝子発現裸ポリヌクレオチドの筋肉内注射に代わるものを探究するため、マウスに裸ｃＤＮＡプラスミドの真皮内注射を行った。遺伝子の発現が観察されたので、測定を行った。インフルエンザのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のための遺伝子を、上記のｐＣＭＶプラスミド中にサブクローン化した。インフルエンザの多数の株から由来のＲＮＰ遺伝子は、当該技術分野で公知であり、各種の株内の配列中に高度に保存されている（例えば、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６５巻、３７０４頁、１９９１年を参照）。４頭の８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに、１００μｌのＨＢＳＳ中に懸渇させたｐＣＭＶ−ＰＮＰの１５μｇを３回注射した。尾の基部に２週間間隔で真皮内注射を行った。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩのＭＨＣ分子が提示する抗原を認識して、ウィルスに感染した細胞を除くのに重要な役割を果たす。ｃＤＮＡ発現ベクターによる筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化は、抗原をクラスＩのＭＨＣ分子に導入してＣＴＬ応答を刺激するのに効果的な方法とみなされた。この研究では、インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）抗原遺伝子を含有するプラスミドの真皮内（ｉ．ｄ．）注射を行ったところ、ＮＰ特異的ＣＴＬおよび高力価の抗ＮＰ抗体の両者が該発された。これらの抗体は、局所炎症なしで、注射してから６週間後に最高量に到達し、少なくとも２８週間変化しなかった。プラスミドＤＮＡは、臭化エチジウムの存在下におけるＣｓＣｌ染色法（ｂａｎｄｉｎｇ）で精製し、凍結して１０ｍＭのトリスーＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の中に貯蔵した。注射を行う前に、そのプラスミドをエタノールで沈殿させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する正常食塩水に溶解した。Ｖｉｅｒａ他、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｌ．、２巻、４８７頁、（１９９０年）に記載されているのと実質的に同様に、ＥＬＩＳＡ法で血清中の抗ＮＰＩｇＧの存在量を測定した。この検定の試験結果を図２Ａに示す。それら動物の全てが高力価の抗ＮＰ抗体を発生し、２０週間以上保持された。図２Ｂに示すように、真皮内注射は、等価量のプラスミドの筋肉内注射（例Ｉに記載したように行った）と比べ、抗体価が約４倍高くなるようであった。図２の座標軸は、それぞれ、時間に対するＥＬＳＡ法力価（平均、１オンス）を示す。すべてのグラフ点に対する血清希釈度は、２５６０である。例ＩＩＩ裸のポリヌクレオチドを鼻腔内に誘導した後の遺伝子発現例ＩＩで記載したのと同じＨＢＢＳ懸渇液中の同じプラスミド（ｐＣＭＶ−ＲＮＰ）を用いて、インフルエンザリボ核タンパク質をコードする裸ポリヌクレオチドを、６頭ずつの３群のＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に導入した。血清による種々の希釈度のプラスミドを導入する前後の抹消血液中の抗ＮＰＩｇＧの濃度を、例ＩＩに記載したようにしてＥＬＩＳＡ法で測定した。血液は、鼻腔内に導入して６週間後に各々マウスから採取した。図３は、プラスミドを鼻腔内に導入する前後に行ったＥＬＩＳＡ法検定の結果をグラフで示す。グラフには血清希釈度に対してＥＬＩＳＡ力価をプロットしてある。図３において、数値は、各群の個々のマウスについての値（＃１−３）および各群の全マウスについての平均値（＃Ｇ１−Ｇ３）を示す。麻酔なしで、３×７．５μｇのプラスミドを注射された第二群のマウスは、バックグランド（図３）と比べて抗体の高い力価を示した。これらのデータを図４に示す。第三群のマウスは、麻酔をかけて同重量のプラスミドを注射された。これらのマウス中の抗ＮＰＩｇＧの力価が示すＲＮＰの発現は、麻酔をかけなかったマウスで達成された発現と実質的に類似していた。麻酔をかけたマウスについてのデータを図５に示す。発現は、吸収促進剤を追加使用することによって高めることができ、かつ時効性促進剤で期間を延長することができる。なお、時効性促進剤の特性と使用法は、Ｃｈｉｅｎの前揚文献の第５章に示唆されているように、当該技術分野で公知である。例ＩＶＩＬ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−４の裸遺伝子を投与した後の、治療量以下のレベルのサイトカイン類の発現およびそのサイトカイン類に対する全身応答ＩＬ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−４のための発現ベクターの構築ヒト（ｈ）ＩＬ−２（ＡＴＣＣ６７６１８）、ＴＧＦ−β１（ＡＴＣＣ５９９５４）およびマウスＩＬ−４（ＡＴＣＣ３７５６１）のためのｃＤＮＡを、ベクターｐＢＳＩＩＳＫ（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手）の中にサブクローン化して、５’−ＨｉｎｄＩＩＩと３’−Ｓｍａ１の部位を生成させた。これらの部位を使用して、例Ｉに記載した発現ベクターｐＲＳＶＬ中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ１ルシフェラーゼｃＤＮＡフラグメントを置換した。得られた発現ベクター類（ｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶＴＧＦβｌおよびｐＲＳＶＩＬ４）は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有している。プラスミドＤＮＡは、米国カリフォルニア州チャッツワース所在のＱｉａｇｅｎ社から入手したＱＩＡＧＥＮキットを用いて形質転換ＤＨ５α大腸菌から精製した。これら３種のベクターの振る舞いは、Ｌｏｔｚ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７巻、１２５３頁、（１９８８年）に記載されているようにして、マウスＣ₂ Ｃ₁₂筋芽細胞（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection、米国メリーランド州ロックフォード所在）ＣＲＬ１７７２〕の一過性リポフェクション（tran sient lipofection）によって確認した。なお、上記Ｌｏｔｚ他の文献は、本明細書に援用するものである。各々の場合、リポフェクションを行ってから４８時間後に得た上澄み液は、適当な特異的中和抗体（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）の存在下または非存在下でマウスのＣ３Ｈ／ＨｅＦ胸腺細胞を用いてリンパ球活性化因子（ＬＡＦ）検定法によって測定したところ、生物活性サイトカインを含有していた。実験要綱５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー所在）から購入した。６週齢の時点（ゼロ日目）で動物を４頭ずつのマウスからなる４群に分割した。ゼロ日目、７日目および１４日目に、第二群〜第四群に、右大腿部の異なる５箇所に、１００μｌの正常食塩水に溶解した合計１００μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＲＳＶＩＬ２、ＰＲＳＶＴＧＦβ１またはｐＲＳＶＩＬ４）を２８ゲージの針で筋肉内（ｉ．ｍ．）に注射した。３日目、１０日目および１７日目（サイトカイン遺伝子を注射してから３日後）に、１００μｌのＩＭＪＥＣＴＡＬＵＭ（水酸化アルミニウム、米国イリノイ州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ社）に分散させた１００μｇのキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社）を同じ大腿部に筋肉内注射して全動物を免疫化した。第二組の実験は、類似のプロトコルで行った。８頭ずつのマウスからなる５群の各マウスの右大腿部に、１００μｇのプラスミドＤＮＡ（第二〜第四の群にそれぞれｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶＴＧＦβ１またはｐＲＳＶＩＬ４）を注射した。第一群には正常食塩水を注射したが、第五群には、１００μｇのｐＲＳＶＩＬ２と１００μｇのｐＲＳＶＴＧＦβを注射した。第一の実験と異なり、抗原（ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社））を、同じ条件下で左肩の筋肉内に注射した。５６日目または６３日目に、５０μｌの正常食塩水中に懸渇させた５０μｇの抗原（それぞれ、ＫＬＨまたはトランスフェリン）を皮下にブースト注射した。全動物は、眼窩後神経叢から血液を１週間ごとに採集して抗体のレベルを測定した。６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１０マウス／群）に、同じ方法で１００μｇのｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶＴＧＦβ１またはｐＲＳＶｎｕｌｌ（すなわち、導入遺伝子なし）を４週間間隔で３回注射した。マウスは、１６週時点すなわち最後の注射をしてから２週間後に採血して、抗クロマチン抗体のレベルを測定した。トランスフェリンの実験では、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群の３頭のマウス、対照群の１頭のマウスおよびｐＲＳＶＩＬ２群の１頭のマウスが、採血中または麻酔中に死んだ。ｃＤＮＡプラスミドによるサイトカイン類の発現によって起こった、抗原応答に対する効果を確認する抗体検定微量滴定プレートのウエル（Ｃｏｓｔａｒ＃３５９０、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）をヒトトランスフェリンでコートし（１００μｌ／ウエル、ホウ酸緩衝食塩水（ＢＢＳ）ｐＨ８．０中に１０μ ｇ／ｍｌ、一夜）、そして同じ緩衝液で洗浄し、次いで１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＢＢＳ溶液でクエンチした。ＢＢＳの０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１：１０００に希釈した血清試料を添加して、ウエルを倍にした。４℃で一夜インキュベートした後、プレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次にＢＢＳで１：８０００に希釈したビオチニル化抗マウスＩｇＧと抗マウスＩｇＭ（米国ペンシルベニア州ウエスト・グローブ所在のＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とともにインキュベートした。１％ＢＳＡを含有するＢＢＳで１：２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプタビジン（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社）とともに１時間インキュベートした後、プレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いでＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社）とともにインキュベートした。３０分後に、４５０ｎｍ波長光の吸光度を、ＴＩＴＥＲＴＥＫＭＵＬＴＩＳＣＡＮＭＥＴＥＲ（米国メリーランド州、ロックビル所在のＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で測定した。各検定には、１：５０００で出発して連続して希釈した標準のマウス抗ＫＬＨまたは抗トランスフェリン抗血清を含めた。トランスフェリンの実験では、吸光度の値は相対抗体濃度に変換した。以下の試験結果の記載事項の中で、１は標準の抗血清の１：５０００希釈液中における抗体のレベルと定義する。全ＩｇＧと全ＩｇＧ１の濃度は、トランスフェリンの実験では、メーカーの説明にしたがって、放射状免疫拡散法のキット（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ社）を用いて測定した。クロマチンに対する抗体を、上記の各例に記載されているようにして、ＥＬＩＳＡ法で測定した。そのＥＬＩＳＡ表のＯＤ値は、強い陽性の基準血清（ｓｔｒｏｎｇｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｒｕｍ）について作成した標準曲線を参照して、得た。得られた試験結果は、試験血清と同じＯＤ× １０⁶を与え、存在する抗体の量の尺度単位を表すように示した、標準曲線の希釈度である。絶対単位は任意であり、図６と７に等価の希釈率（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）で表してある。ＴＧＦ−β１タンパク質の循環濃度の測定遺伝子を投与することによって循環サイトカインの濃度の増大が持続されるようになるかどうかを測定するため、マウスから６週目すなわち第１回の遺伝子注射をしてから４週間後に採血し、その血漿試料のＴＧＦ−β１活性を、ＣＣＬ６４ミンク肺細胞増殖検定法を用いて検定した。なお、この検定法は、Ｌａｔｚ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻、４１８９頁に記載されているものを若干改変した方法である。また、この文献は本明細書に援用するものである。ＴＧＦ−β１を特異的に中和するがＴＧＦ−β ２またはＴＧＦ−β３を中和しないウサギ抗体は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社（米国ミネソタ州ミネアポリス所在）から購入した。遅延型過敏症応答の測定サイトカイン遺伝子の注射によって細胞性免疫が調整されるかどうかを測定するため、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を、抗原投与を行ってから４８時間後の足蹠腫脹によって試験した。７０日目に、１００μｌの正常食塩水中の１００μｇのトランスフェリンを右後足の足蹠に注射した。足蹠の厚みを、注射前と注射してから４８時間後にキャリパーで測定し、これら測定値の差を計算した。試験結果異種抗原に対する抗体応答に及ぼすサイトカイン遺伝子注射の効果第一組の実験で、異種抗原すなわちキーホールドリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、これはプラスミドと同じ部位に注射したが、に対する抗体応答に及ぼすサイトカイン遺伝子の筋肉内注射の効果を測定した。ＫＬＨに対する抗体は、ｐＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＩＬ４の群の方が対照群よりも高いレベルに到達した（図６、パネルＡ）。これと対照的に、抗ＫＬＨ抗体は、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群の方が対照群よりも低かった（図６、パネルＢ）。サイトカイン遺伝子が、その効果を所属リンパ節だけでなく全身にわたって発揮したかどうかを測定するため、抗原（トランスフェリン）とサイトカインベクターを二つの異なる部位に注射する第二組の実験を行った。トランスフェリンに対する抗体は、ｐＲＳＶＩＬ２群で最高であり（図７、パネルＡ）、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群では最低であった（図７、パネルＢ）。これらの試験結果は、上記２種のプラスミドの注射が抗体応答と刺激するかまたは阻害することができることを示した。いくつかの生体外の系で、ＴＧＦβは、ＩＬ−２の作用を打ち消す。ＴＧＦβ が生体内で同じ活性をもっているかどうかは分かっていない。したがって、ＩＬ −２またはＴＧＦ−β１をコードするプラスミドを同時に注射する実験を実施した。ｐＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＴＧＦβ １の両者を注射した群の抗トランスフェリン抗体のレベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ 群と区別できなかった（図１０）パネルＣ）。すなわち、ＴＧＦ−β１の発現がＩＬ−２の作用を完全に中和したことを実証している。ｐＲＳＶＩＬ４群の抗トランスフェリン抗体の平均レベルは、対照群より高かったが、有意差はなかった（１１週目で２．３±０．４対１．７±０．３６ｍｇ／Ｌ）。全ＩｇＧおよびＩｇＧ１のレベルトランスフェリンを注射したマウス由来の血清中の全ＩｇＧのレベルを測定した。最高のＩｇＧレベルは、ｐＲＳＶＩＬ２群とｐＲＳＶＩＬ４群において１０週間後と１１週間後に観察された。一方最低のレベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群に見られた（表Ｉ）。ＴＧＦ−β１プラスミドを注射すると、ＩＬ−２による増加を完全に阻害した。ｐＲＳＶＩＬ２／ｐＲＳＶＴＧＦβ１群の全ＩｇＧのレベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群と類似していた。ｐＲＳＶＩＬ４を注射されたマウスは、ＩｇＧ１の濃度が他の群より有意に高かった。遅延型過敏症（ＤＴＨ）サイトカイン遺伝子の注射によって細胞性免疫を調整できるかどうかを決定するため、抗原投与後に足蹠腫脹検定法を行って試験した。図８に示すように、対照群と比べて、ｐＲＳＶＩＬ２注射マウスに、高度に有意な足蹠腫脹の増大があった。ｐＲＳＶＴＧＦβ１を同時に注射すると、ＩＬ− ２の効果を完全に阻害した。循環ＴＧＦ−β１のレベル６週目すなわち最後のｐＲＳＶＴＧＦβ１の注射をしてから４週間後のＴＧＦβ１の平均血漿中濃度は、ｐＲＳＶＩＬ２を注射したかまたは未処置の動物の場合僅かに０．３２ｎｇ／ｍｌであったのに比べて、２．６ｎｇ／ｍｌであり、これは８倍の差を示している。そのＴＧＦ−βの活性は、ＴＧＦ−β１に対する特異的抗体によって中和された（表ＩＩ）。最後のプラスミドを注射してから４週間後に、ｐＲＳＶＴＧＦ−β１かｐＲＳＶＩＬ−２のいずれかを注射されたマウスから血漿の試料を集めた。これらの試料は、１：１０に希釈し、ｐＨ４まで酸性にし、中和し、次いでＣＣＬ６４検定法でＴＧＦ−β活性について３回ずつ試験した。また、これら試料の一部を、ＣＣＬ６４検定法に付する前に、ＴＧＦ−β１に対して特異的なウサギ中和抗体（１０ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。免疫前ウサギのＩｇＧは、ＴＧＦβの活性のレベルを変えなかった。ＴＧＦβのレベルは、組換えＴＧＦ−β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）を含む標準曲線と比べて求め、ｎｇ／ｍｌの単位で表し、１群当たり３個の試料の平均値±ＳＥで示した。抗クロマチン抗体トランスフェリンの試験から得た試験結果は、プラスミドＤＮＡの注射によって、異種抗原に対する細胞性または体液性の免疫応答中に３種のサイトカインに特徴的な生物学的効果が誘発されたことを示した。この方法が、進行中の病的免疫応答を調整するのにも効果的であるかどうかを決定するため、ＩＬ−２とＴＧＦ−β１のプラスミドを筋肉注射でＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに導入した。なお、このマウスは、高力価の自己抗体を産生し、全身性エリテマトーデスのモデルとして使用されている。ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス中のクロマチンに対する自己抗体の力価は、ｐＲＳＶＩＬ２群で有意に増大した。ｐＲＳＶＴＧＦβ１群に最低の力価がみとめられた。これら２群間の平均値の差はほぼ７倍であった（図９）。プラスミドｃＤＮＡの注射後の筋肉組織内での遺伝子発現は、リポーター遺伝子構造体を用いる実験で、前掲のＷｏｌｆｆ他、Ｎａｔｕｒｅの文献により以前に実証されている。しかし、本明細書のここで提供した試験結果は、ｃＤＮＡ発現ベクターを筋肉内に直接注射すれば、全身性の効果を有する生物活性タンパク質の産生を誘発できるということを初めて実証している。サイトカインの遺伝子と抗原は、異なる時間に異なる部位で、実験動物に注射した。さらに、これらサイトカイン遺伝子の免疫作用は、投与後、幾週間も持続した。これらの試験結果は、これらサイトカイン遺伝子の効果が全身的に発揮されたことを示している。例Ｖマウスリンパ腫モデルにおける裸のポリヌクレオチドの治療量以下の発現による予防ＩＬ−２遺伝子免疫療法（発現されたタンパク質が疾病の発症を予防もしくは遅延させることができるかどうかの試験）実験計画とマウスへの注射６月齢のＡＫＲ／Ｊ退役繁殖（retired breeder）雌マウス、１６月齢の退役繁殖雌ＩＣＲ異種交配マウス、１６月齢のＢＡＬＢ／ｃの老退役繁殖雌マウスおよび６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー所在）から購入した。ＡＫＲ雌マウスは、９月齢までに９０％がリンパ腫を発症する。実験を行う前に、ＡＫＲ／Ｊマウスは、血液塗抹スライドの分析によって循環リンパ芽細胞の存在について予め選別した。リンパ腫のない動物を、ＤＮＡを注射するための２３頭のマウスの２群に分割した。ＡＫＲとＩＣＲのマウスは、１週間ごとに３回ＤＮＡを注射され、引き続き実験中２週に１回注射された。ＩＬ−２の遺伝子は、上記の例に記載されているようにして、適当な発現ベクター中にサブクローン化した。前記の諸実験例に記載されているように、ｐＲＳＶＩＬ−２と呼ばれているベクターは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復プロモーターの配列とＳＶ４０ポリアデニル化配列との間にはさまれた、ＩＬ−２をコードする配列（ＡＴＣＣＣＲＬ＃６７６１８、米国メリーランド州ロックビル）を含有している。対照のベクターのｐＲＳＶは、ＩＬ−２をコードする配列を持っていない。プラスミドＤＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａＭＥＧＡＰＲＥＰキット（米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて大量に精製した。精製されたプラスミドＤＮＡ（２５μｇ／注射）を０．９％ＮａＣｌ溶液（１００μｌ／注射）中に懸濁させ、次に２８ゲージの注射針を用いて各マウスの右の四頭筋に直接注射した。タンパク質の発現と検出血清試料を、ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）から入手したＩＬ −２ＥＬＩＳＡキットを使用してヒトＩＬ−２について検定した。各試料は２回ずつ検定し、組換えヒトＩＬ−２の血清中濃度を用いる標準曲線と比較した。この検定法の検出の最低限界は、７５ｐｇ／ｍｌである。マウスＩＬ−２との交差反応性は、極微小観察された。これらの試験結果を図１０に報告する（個々のマウスの発現の時間経過）。動物の長命に関する効果動物の生存状況を出生時から殺した時点まで測定した。動物を殺したのは、ａ）著しく体重が減少したとき（すなわち、２週間で３０％以上）、ｂ）胸腺肥大のためハンチング（hunching）または呼吸障害が出現したとき、またはｃ）末梢血液中に多数のリンパ芽細胞がみられた時である。一般に、末梢リンパ芽細胞は、突然（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）出現し、老化の身体的兆候が死亡する前７〜１０日間に検出可能になった。生存曲線データの統計的解析は、当該技術分野で公知のカプラン−マイヤー生存曲線推定量を用いて実施した。群の間の有意性は、当該技術分野で公知のマンテル−ヘンツェル検定法（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｔｚｅｌｔｅｓｔ）を用いて求めた。この実験に用いた動物の長命に関するデータは、図１１に要約してある。対照群の動物の１／２がリンパ腫で７箇月２０日で死亡し、全体が９箇月で死亡した。これに対して、裸のｐＲＳＶＩＬ−２を投与された６頭の動物のうち、４頭が９カ月後に生存していた。若いＡＫＲ／Ｊマウスにおける、リンパ芽細胞に対する細胞溶解活性に及ぼすＩＬ−２遺伝子発現の影響を測定するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団の分析注射されたマウスのナチュラルキラー細胞溶解活性を、当該技術分野で公知の標準⁵¹Ｃｒ放出検定法を使って測定した。ＹＡＣ−１（ＮＫ感受性マロニーマウス白血病ウイルス誘導マウスリンパ腫細胞系）およびＰ８１５（ＮＫ耐性マウス肥満細胞腫細胞系）をＡＴＣＣ（米国メリーランド州ロックビル所在）から入手し、標的細胞として使用した。⁵¹Ｃｒ標識標的細胞を、丸底９６ウエル微量滴定プレートのウエルに添加し、次いで各種のエフェクター対標的比（Ｅ／Ｔ比）が得られるように、エフェクター細胞を３回ずつプレートした。非付着性マウスＰＢＬ（エフェクター細胞）を、リンパ球Ｍ（カナダ、オンタリオ州、ホーンビー所在のＣｅｄａｒｌａｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．社）の勾配遠心分離によって単離し、次いで培養皿内で一夜インキュベートすることによって、単核細胞を消耗させた。エフェクター細胞と標的細胞を４時間、同時にインキュベートした。上澄み液を収穫し、ガンマカウンターで計数して同位元素の放出量を測定した。試験結果を、次の式：１００×［（平均ｃｐｍ実験量−平均ｃｐｍ自発的放出量）／（平均ｃｐｍ全放出量−平均ｃｐｍ自然放出量）］から計算した百分率比⁵¹ Ｃｒ放出量として図１２に示す。示した数値は、指定のＥ／Ｔ比および表示の時点における全ての試料の場合の平均値＋ＳＥＭである。自然放出量は、２％ＳＤＳを添加した後に測定した。この検定の試験結果によって、プラスミドを注射されたＡＫＲ／Ｊマウスのリンパ芽細胞に対するナチュラルキラー活性が確認されている。この活性は、通常なら、これらのマウスには実質的に存在しないであろう。例ＶＩ若いマウスと老年のマウスに裸ＩＬ−２遺伝子を導入する際の投与レベルの変化に対する応答Ｂａｌｂ／ｃマウスと例Ｖに記載のプラスミド類を用いて、０．９％食塩水中のｐＲＳＶＩＬ２を、別々のマウスに１週間に１度それぞれ０（すなわちｐＲＳＶのみ）、５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／注射の投与量で注射した。各投与量について、３頭の若いマウス（約１６週齢）と３頭の老年マウス（１６月齢以上）の右後足の筋肉内に注射した。ＩＬ−２の発現を、例Ｖに記載したようにしてマウスの各群について検定した。これらのデータを図１３の（ａ）−（ｂ）に示す。動物の体重と身体の外観も毒性の徴候として監視した。５０μｇと１００μｇの試験投与レベルで、幾分かの毒性が現れた。これらのマウスで最高の結果が得られたのは、０．９％食塩水１００ｍｌ中１２．５〜２５μｇの場合である。発現は、１箇月時点では老年マウスの方が僅かに大きかったが、２週時点では若いマウスの方が僅かに大きかった。例ＶＩＩ各種の侵入点を通して裸のポリヌクレオチドを導入した後の全身発現若いＢａｌｂ／ｃマウスの群に、１週間間隔で、裸のｐＲＳＶＩＬ２を、（１）皮下（背部）、（２）筋肉内（右後足）、（３）真皮内（尾の基部）、または（４）鼻腔内に注射した。使用したプラスミドは、例Ｖに記載したものと同じであった。これらの各ルートを介して裸のｐＲＳＶＩＬ２を投与して得られた全身発現のレベルに関するデータを、図１４に示す。例ＶＩＩＩＩＣＲマウス中のヒトＩＬ−２または発現と、マウスナチュラルキラー細胞集団の特異的刺激および膨張との相関関係ＡＫＲ癌モデルにおいて、ＩＬ−２を注射されたマウス中のナチュラルキラー細胞集団の特異的膨張と刺激は、腫瘍細胞の免疫サーベイランスについてこの群に有利な効果を与える因子である。したがって、例Ｖでは、ＩＬ−２のレベル（ＥＬＩＳＡ法で測定）は、ナチュラルキラー活性と相関関係があった。両者の値は、対照を注射された群の値に比べて有意に増大した。そして、その増大は、同じ時間間隔（注射の０〜３箇月）中に経験された。同じ時点で、末梢のリンパ球または顆粒球のレベルの変化は、処置を受けた動物の血液塗抹スライドの分析によって検出されなかった。この知見は、注射後に炎症が全く起こらなかったこと、およびＮＫ細胞集団以外の免疫系のサブセットが注射後のＩＬ−２発現のレベルに影響されなかったこと、を示しているので、重要である。同じ情報を老年の動物について以下のようにして求めた。動物の各群は、１０頭の老年のＩＣＲマウス（固有の病状がない異系交配マウス系）で構成されていた。前記例のＡＫＲ動物と同じプロトコルを用いて、動物に、ｐＲＳＶまたはｐＲＳＶ−ＩＬ−２を注射した。これらの動物（注射してから０〜４箇月後）の相対白血球数を測定した。その結果を以下の表ＩＩに示す。ＮＫ細胞活性を、例Ｖに記載されているようにして、⁵¹Ｃｒ放出検定法で測定した。標的細胞は、ｐ８１５（ＮＫ耐性マウス肥満細胞腫）またはＹＡＣ−１（ＮＫ感受性マウスリンパ腫）であった。エフェクター細胞は、リンパ球Ｍ遠心分離法で単離した。ＮＫ細胞活性を測定するのに用いた式は、以下のとおりである。これらのデータを下記表ＩＶに示す。例ＩＸ皮膚の侵入点における、単核細胞による裸ポリヌクレオチドの細胞取り込みを示す組織学的試験裸ｐＣＭＶｌａｃｚをＢａｌｂ／ｃマウスの尾の真皮内に注射してから３日後に、マウスを殺した。プラスミドの侵入点の組織培養物を得て、大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性を求めるため染色した。これら培養物の組織学的試験で得たスライドの写真（４０倍）を図１５に示す。図１５に示すように、プラスミドは単核細胞によって取り込まれていることがわかる（青色）。組織試料中の線維芽細胞は染色されていないので、プラスミドはこれらの細胞には取り込まれなかったことを示している。プラスミドをまさに取り込んだ丸みのある単核細胞は、マクロファージおよび／または他の抗原提示細胞のようである。このことは、プラスミドの取込みが捕食作用によるものであることを示しているといえる。例Ｘ機械的刺激体を用いて免疫応答を誘発する裸ポリヌクレオチドの表皮投与図１６は、機械的手段によってｐＣＭＶＲＮＰの表皮投与を行った後の抗ＮＰＩｇＧの血清中濃度について、例Ｉに記載したのと同様にして、ＥＬＩＳＡ法で分析した結果を示す。プラスミドを、先に記載したようにして、前記の未コートのＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ装置の尖叉にコートした（あるいは、長期間にわたって安定に貯蔵するため、該装置の尖叉上に裸のポリヌクレオチドを凍結乾燥させることもできることに留意すべきである）。該装置の尖叉全体上の全プラスミド濃度は、等張正常食塩水担体中約５０μｇであった（約１５０μｇプラスミド／ｍｌ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスの背部の毛をそり落とし、次いでそのそった皮膚を上記尖叉装置でゆるやかにひっかいた。図１６に示すように、抗ＮＰＩｇＧが続いて血清中に検出された（例えば、４２日目にこのマウスの血清は１：１０２４０の力価の抗体を含有していた）。例ＸＩ化学薬剤を用いて免疫応答を誘発する裸ポリヌクレオチドの表皮投与化学薬剤を塗布するとともにｐＣＭＶＲＮＰを表皮投与した後の抗ＮＰＩｇＧの血清中濃度について、例Ｉに記載したのと同様にして、ＥＬＩＳＡ法で分析した結果を図１７に示す。プラスミドを４０μｇの等張正常食塩水に懸濁させて、１ｍｌ当たり約１５０ μｇのプラスミドを含有させた。この溶液をＢＡＮＤ−ＡＩＤブランドの包帯の非接着性パッド（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社）に吸収させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスの毛を例Ｘに記載されているのと同様にしてそり落とし、市販の角質溶解剤（すなわち、先に述べた、商品名ＮＡＩＲで販売されている脱毛クリーム）をそのそり落とした皮膚に塗布した。数分後に、その角質溶解剤を皮膚から洗い落とし次いでプラスミドを含有する包帯をその皮膚に貼付した。図１７に示すように、処置した動物は、１：６４０の力価で血清抗ＮＰＩｇＧを発生した。例ＸＩＩ裸ｐＲＳＶ−ＩＬ−２を投与した後のＩＬ−２発現の安定性ＩＬ−２発現の安定性を、例ＶＩＩついて述べたマウスで、測定した。ｐＲＳＶ−ＩＬ−２を１週間間隔で２回注射した後、ＩＬ−２の血清中濃度を、例Ｖに記載したようにして、測定した。老年マウスの場合、ＩＬ−２の血清中濃度は、若いマウスよりゆっくり減少した。これらのデータを図１８に示すが、ＡＰＣの濃度が特に筋肉組織に比べて相対的に高い組織に裸のポリヌクレオチドを導入することによって、比較的安定な遺伝子発現が達成できる、ことを示している。例ＸＩＩＩ裸ｐＣＭＶＲＮＰを真皮内に注射されたマウスによる、ウイルスの攻撃に対する免疫応答適当な裸ポリヌクレオチドによる予防接種で発生した免疫が、致命的なウイルスの攻撃から動物を保護できるかどうかを試験するため、インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１株（Ａ／ＰＲ／８／３４、米国のＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｏｃｅｎｔＮ．Ｍｂａｗｖｉｋｅ博士から提供された）由来のＮＰ遺伝子を含有するｐＣＭＶＲＮＰプラスミド１５μｇを３回１０頭のＢａｌｂ／ｃマウスからなる群に真皮内注射を行った。対照群には、注射されない動物と関連のないプラスミド（ｐｎＢＬ３）を注射された動物が含まれている。最初にプラスミドを注射してから６週間後、ＬＤ₉₀投与量のＨ３Ｎ２インフルエンザ株（Ａ／ＨＫ／６８、この株もＭｂａｗｕｉｋｅ博士から提供された）を動物に投与した。真皮内に予防接種されたマウスは、予防接種されていない対照マウスと比べて、上記攻撃に対して有意に保護された（ｐ＜０．０１）。図１９（カプラン−マイヤー生存曲線）を参照。例ＸＩＶ裸のサイトメガロウイルスもしくはラウス肉腫ウイルスのプロモーターを含有する裸プラスミドを真皮内注射した後の遺伝子発現の相対レベル発現ベクター中に用いたプロモーター領域の可能な効果を、例ＩＩに述べたＲＮＰ遺伝子を含有する２種のプラスミドを試験することによって、評価した。一方のプラスミドｐＣＭＶＲＮＰは、サイトメガロウイルスの即時初期プロモーター（immediate early promoter）、エンハンサーおよびイントロン領域をもっていた。他方のプラスミドは、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ領域由来のプロモーターを有していた（ｐＲＳＶＲＮＰ）。図２０に示すように、これらプラスミドによって発現されたＮＰタンパク質に対する抗体応答は、真皮注射した後、ＣＭＶプロモーターの方が一貫して高かった。なお、このことは、ＮＰ遺伝子を筋肉内注射した後にみられる応答とは異なっているが、２種のプラスミドによって産生される抗体のレベルの方はほとんど等価である（データは示していない）。例ＸＶ裸ポリヌクレオチドを真皮内投与した後の細胞障害性Ｔリンパ球応答の選択誘発Ｃ５７／Ｂ６系のマウスの尾に、ＣＤＭ８ｏｖａプラスミド（詳細は、Ｓｈａｓｔｒｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻、２７２４〜２７３６頁、１９９３年に報告されている）から精製した裸ＤＮＡ１００μｇを、２週間の間隔で真皮内注射を行った。このＣＤＭ８ｏｖａプラスミドは、オボアルブミンに対する全長（１．８ｋｂ）のｃＤＮＡを含有している。第２回の遺伝子投与を行ってから２週間後、マウスの脾臓を取り出し、次に、合成のオバルブミンペプチドで予めパルスされてあってそれに致命的に放射線（３０００ラド）を照射された共通遺伝子の脾細胞とともに生体外で培養した。このペプチドは、マウス中の細胞障害性Ｔ細胞に対するクラスＩ拘束標的であり、Ｓｈａｓｔｒｉ他に記載されている組織適合性ハプロタイプＫ^bを有している。５日間培養した後、これら細胞を二つのタイプの標的とともにインキュベートして、オバルブミンをコードする遺伝子を導入されたマウスによる細胞障害性Ｔ細胞の生成について試験した。これらの標的は、合成オバルブミンペプチドでパルスされたマウスＥＬ−４リンパ球またはオボアルブミンのｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＥＬ−４細胞であった（図２１を参照。オバルブミンのｃＤＮＡは、図中で「ＥＧ７」と示してある）。これら２種の標的の溶解百分率を異なるエフェクター対標的比（図２１ではＥ：Ｔ比として示してある）の場合について測定した。図２１に示すように、裸ＣＤＭ８ｏｖａプラスミドを導入された動物は、オバルブミン標的（すなわち、オバルブミンペプチドを有するＥＬ −４およびＥＧ７）に対して特異的であるが、対照のＥＬ−４細胞（すなわち、オバルブミンペプチドを含有していないＥＬ−４細胞）に対しては特異的でない細胞障害性Ｔ細胞を産生した。ＣＤＭ８ｏｖａプラスミドを真皮内に予防接種されたＣ５７／Ｂ６マウスも、オバルブミンに対する抗体について選別された。ＣＤＭ８ｏｖａプラスミドを投与してから６週間後に集めた血清は、検出可能なレベルの抗体を含有していなかった（オバルブミンをコートした微量滴定プレートについて、酵素結合イムノソルベント検定法を用いて測定した）。総合的に、これらのデータは、本発明の裸ポリヌクレオチドの投与法が、抗体産生を誘発することなしに、ＭＨＣクラスＩ拘束細胞障害性Ｔ細胞（この場合オバルブミンに対するＴ細胞である）を誘発することを示している。例ＸＶＩＴ細胞に対する抗原による刺激によって誘発される、裸ポリヌクレオチドの真皮内投与後の延長された免疫記憶ＣＭＶプロモーターの制御下で大腸菌酵素β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド型の裸ポリヌクレオチド（「ｐＣＭＶＬａｃ−Ｚ」）（０．５〜５ｎｇ／１ｍｇのＤＮＡ内毒素含量）の０．１、１、１０および１００μｇを、４頭ずつのマウスからなる群に、筋肉内（「ＩＭ」）または真皮内（「ＩＤ」）の投与経路で投与した。比較のために、４頭のマウスからなる別の群に１００μｇのβ−ガラクトシダーゼタンパク質（「ＰＲ」）を真皮内に投与した。注射は、すべて担体として５０μｌの正常食塩水を用いて行った。ＩＭおよびＩＤの注射は、０．５ｍｌのシリンジと２８．５ゲージの針で実施した。その後、２週間の間隔をおいて、酵素結合イムノソルベント検定法で抗体を測定した。要約すると、全抗体は、固相抗原としてβ−ガラクトシダーゼ（米国カリフォルニア州所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて測定した。微量滴定プレート（Ｃｏｓｔａｒ）米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、９０ｍＭホウ酸塩（ｐＨ８．３）＋８９ｍＭのＮａＣｌ（すなわちホウ酸緩衝食塩水：ＢＢＳ）に溶解した抗原５μｇで、一夜室温にてコートし、次いで１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有するＢＢＳで一夜ブロックした。血清試料は、最初の８週間は１：４０の希釈度で出発して、その後は１：３２０の希釈度でＢＢＳで連続的に希釈した。これらの試料をプレートに添加し一夜室温で貯蔵した。これらプレートをＢＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、次にアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ所在のＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎａｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ．社）の１：２０００希釈液と室温で１時間反応させるか、または同じ条件下で、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国アラバマ州のＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏ−ｔｅｃｈ社）の１：２０００希釈液と反応させるか、またはアルカリ性ホスファターゼ標識ラット抗マウスＩｇＧ２Ａ抗体（米国カリフォルニア州のＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の１：５００希釈液と反応させた。プレートを再度洗浄し、次いで、１ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有する０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）中に１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェノールホスフェート（米国インディアナ州インディアナポリス所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含有する溶液を添加した。基質をプレートに添加してから１時間後に、４０５ｎｍの波長光の吸光度を読み取った。図２２に示すように、ｐＣＭＶＬａｃ−ＺプラスミドをＩＤ注射で投与された動物とＰＲを投与された動物には、等価の大きさの抗体応答が誘発されたが、一方ｐＣＭＶＬａｃ−ＺプラスミドをＩＭ注射で投与された動物には、それより小さい抗体応答が測定された。Ｔ細胞の記憶を評価するため、動物に、別の部位にＩＤ注射で０．５μｇのＰＲをブースト（追加投与）した。もし、これらの動物が記憶Ｔ細胞を発生してβ−ガラクトシダーゼに対する抗体の産生を制御していたのであったならば、これら動物は、可溶性タンパク質の抗原を追加投与した後に、初回抗原投与に対する応答で示されたよりもはるかに激しい免疫応答になると考えられる。図２３に示すように、ｐＣＭＶＬａｃ−ＺプラスミドをＩＤ注射によって投与された動物は、プラスミドまたはＰＲをＩＭ注射で投与された動物よりも相当に優れた免疫記憶を発生していたことは明らかである。さらに、ＩＤ注射を受けた動物が発生した記憶は、最低約１２週間持続した。例ＸＶＩＩ裸ポリヌクレオチドを真皮内投与した後のＴＨ１応答の選択的誘発マウスにおいて、ＩｇＧ２Ａ抗体は、ＴＨ１型免疫応答に対する血清マーカーであり、一方ＩｇＧ１抗体は、ＴＨ２型免疫応答を示唆している。ＴＨ２応答は、アレルギー随伴ＩｇＥ抗体クラスを含み、可溶性タンパク質抗原が比較的強いＴＨ２応答を刺激する傾向がある。これに対して、ＴＨ１応答は、マクロファージおよび樹状細胞に結合する抗原によって誘発される。ＴＨ１応答は、アレルギー症とＡＩＤＳを治療するのに特に重要である。応答があるとすれば、どの応答が本発明の裸ポリヌクレオチドを投与されたマウスによって起こされるのであろうかを決定するために、マウスに、ｐＣＭＶＬａｃ−Ｚまたは前記の例に記載のタンパク質を予防接種した。２週間隔で、β −ガラクトシダーゼに対するＩｇＧ２ａとＩｇＧ１が少しでも存在すれば、該酵素をコートした微量滴定プレート上で、酵素結合イムノソルベント検定法（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａのサブクラスに対し特異的な抗体を使用して）によって、その存在を測定した。図２４に示すように、プラスミドをＩＤ注射で投与されたマウスのみが高力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した。図２５に示すように、該酵素自体でマウスを免疫化すると（「ＰＲ」）、比較的高い力価のＩｇＧ１抗体の産生が誘発された。ＩＭで注射されたマウスの場合は、ＩｇＧ２ＡおよびＩｇＧ１の抗体の両者が低力価で、明らかな選択性なしで産生された。これらの図に示すデータは、４頭ずつのマウスからなる各群から得た数値の平均値で構成されている。時間の経過に対する抗体応答の安定性を測定するため、同じ群の動物に、０．５μｇの酵素を真皮内に注射して追加投与を行った。図２６と２７に示すように、予めＩＤ注射された動物に酵素を追加投与すると、ＩｇＧ２Ａ抗体応答に１０倍近くの上昇を誘発した（すなわち、抗体力価が１：６４０から１：５１２０まで上昇した）が、ＩｇＧ１応答は刺激しなかった。これらのデータは、裸ポリヌクレオチドのＩＤ投与によって誘発される選択的ＴＨ１応答が、続いての抗原へに暴露にも拘わらず、宿主内に維持されていることを示している。例ＸＶＩＩＩ機械的刺激体による裸ポリヌクレオチドの投与後のマウス内のＴＨ１応答例ＸＶＩＩで述べた実験を、次に挙げる相違点を除いて、別の群のマウスにおいて繰り返した。すなわち、その相違点は、（１）初回抗原投与だけを試験した、および（２）ｐＣＭＶＬａｃ−Ｚプラスミドを、４頭のマウスからなる１群に例Ｘで述べた尖叉装置を用いて投与し、一方β−ガラクトシダーゼタンパク質（１０μｇ）を、４頭のマウスからなる他の群に真皮内（ＩＤ）注射で投与した、ことである。図２８に示すように、プラスミドを投与されたマウスは、タンパク質を投与されたマウスと比べて、比較的低い力価のＩｇＧ１抗体を産生した。これに対して、図２９に示すように、プラスミドを投与されたマウスは、タンパク質を投与されたマウスに比べて、十分に高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した。これらの試験結果は、例ＸＶＩＩで得た結果に類似しているが、興味深いことに、次のような違いがある。すなわち、尖叉装置で皮膚をひっかくことによってプラスミドを投与されたマウスは、同じプラスミドをＩＤ注射で投与されたマウスよりも一層高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した（これら両群とも、ＩＭ注射でプラスミドを投与されたマウスよりも高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した）。これらの試験結果は、皮膚を尖叉装置でひっかくと、裸のポリヌクレオチドのための「損傷を受けた」侵入点に多数のＡＰＣが引きつけられることを示し、かつ、ＡＰＣが、筋肉や他の体細胞よりも、遺伝子の投与と発現を行うのに一層効果的な標的である、という学説と一致している。これらの図に示したデータは、４頭のマウスからなる各群から得た数値の平均値で構成されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/00 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/00 ＡＡ６１Ｎ 1/30 8825−4ＣＡ６１Ｎ 1/30 // Ｃ１２Ｎ 5/10 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラズイーヤルアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴカミノフエルタ 7965 (72)発明者ハウエルメレディスエル. アメリカ合衆国オレゴン州 97331 コーバリスノースウェストグラントプレイス 3009

Claims

【特許請求の範囲】１．生物活性ペプチドを宿主に導入する方法であって、宿主の他の組織に比べて高濃度の抗原提示細胞を含有する宿主の組織に、医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを投与することからなり、前記裸ポリヌクレオチドは、生物活性ペプチドを作動的にコードしており、そして前記抗原提示細胞が裸ポリヌクレオチドを発現し、次いで前記生物活性ペプチドが少なくとも一つの標的組織中に分泌されることを特徴とする方法。２．請求の範囲１に記載の方法であって、前記裸ポリヌクレオチドが投与される組織が皮膚または粘膜であることを特徴とする方法。３．請求の範囲１に記載の方法であって、前記生物活性ペプチドが免疫原性抗原であることを特徴とする方法。４．請求の範囲２に記載の方法であって、前記医薬として許容される担体が吸収促進剤を含有していることを特徴とする方法。５．請求の範囲２に記載の方法であって、投与経路が経皮透過を包含することを特徴とする方法。６．請求の範囲２に記載の方法であって、投与経路が、医薬として許容される局所組成物中の裸ポリヌクレオチドを宿主の表皮または粘膜上皮に塗布すること、および裸ポリヌクレオチドの侵入点において自己に対する免疫応答を誘発できる化学刺激剤を実質的に同時に投与することを包含することを特徴とする方法。７．請求の範囲２に記載の方法であって、裸ポリヌクレオチドが、刺激に対する免疫応答を誘発するのに充分に、宿主の表皮または粘膜上皮を機械的に刺激する手段を用いて投与され、該手段がさらに前記裸ポリヌクレオチドを、刺激部位の表皮に転移させることを特徴とする方法。８．請求の範囲１に記載の方法であって、投与経路が真皮内注射または皮下注射を包含することを特徴とする方法。９．請求の範囲５に記載の方法であって、前記透過がイオン導入法のパッチを用いて達成されることを特徴とする方法。１０．請求の範囲１に記載の方法であって、投与経路が医薬として許容されるエーロゾル組成物の吸入を包含し、前記組成物が裸ポリヌクレオチドを含有していることを特徴とする方法。１１．請求の範囲１に記載の方法であって、生物活性ペプチドが宿主に対し治療効果を有すると期待されることを特徴とする方法。１２．請求の範囲１に記載の方法であって、２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与されることを特徴とする方法。１３．請求の範囲１２に記載の方法であって、前記混合物中のポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる生物活性ペプチドを別個にかつ作動的にコードしていることを特徴とする方法。１４．請求の範囲１に記載の方法であって、前記裸ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡからなる分子の群から選択されることを特徴とする方法。１５．請求の範囲１４に記載の方法であって、前記裸ポリヌクレオチドがＤＮＡのアンチセンス鎖であることを特徴とする方法。１６．請求の範囲１４に記載の方法であって、前記裸ポリヌクレオチドがＤＮＡのセンス鎖であることを特徴とする方法。１７．請求の範囲１９に記載の方法であって、前記生物活性ペプチドが、免疫原性抗原、抗体、酵素、サイトカインおよびホルモンからなる群から選択されることを特徴とする方法。１８．（ａ）抗原提示細胞による認識が可能で、かつ生物活性ペプチドを作動的にコードしている少なくとも一つの裸ヌクレオチドと、（ｂ）前記裸ポリヌクレオチドを含有する医薬として許容される担体と、そして（ｃ）皮膚または粘膜による組成物の吸収を容易にする吸収促進剤とを含有してなる組成物。１９．（ａ）抗原提示細胞による認識が可能で、かつ生物活性ペプチドを作動的にコードしている少なくとも一つの裸ヌクレオチドと、（ｂ）前記裸ポリヌクレオチドを含有する医薬として許容される担体と、そして（ｃ）哺乳類の表皮または粘膜上皮を刺激しかつ自己に対する免疫応答を誘発することができる化学薬剤とを含有してなる組成物。２０．老化に伴う宿主の生物学的欠陥を遅らせるかまたは予防する方法であって、医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを哺乳類に投与することを包含し、前記裸ポリヌクレオチドが、老化に伴う宿主の生物学的欠陥を遅らせるかまたは予防するのに充分な生物活性を有するペプチドを作動的にコードしており、前記生物活性ペプチドが治療量以下のレベルで宿主内で発現され、前記裸ポリヌクレオチドの投与が、生物的欠陥の代理終点が発生する前、実質的に同時に、または後に始まることを特徴とする方法。２１．請求の範囲２０に記載の方法であって、前記投与の経路が非経口の経路であることを特徴とする方法。２２．請求の範囲２０に記載の方法であって、前記生物活性ペプチドが免疫原性抗原、抗体、酵素、サイトカインおよびホルモンからなる群から選択されることを特徴とする方法。２３．請求の範囲２０に記載の方法であって、前記裸ポリヌクレオチドの宿主への侵入点が、宿主の他の組織に比べて高い濃度の抗原提示細胞を含有する組織であることを特徴とする方法。２４．請求の範囲２０に記載の方法であって、２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与されることを特徴とする方法。２５．請求の範囲２４に記載の方法であって、前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる生物活性ペプチドを別個にかつ作動的にコードしていることを特徴とする方法。２６．宿主に予防接種を行う方法であって、医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを、皮膚または粘膜を通じて宿主に投与することからなり、その裸ポリヌクレオチドが免疫原性抗原を作動的にコードしており、前記抗原が皮膚または粘膜中の抗原提示細胞によって発現されて、皮膚または粘膜内で免疫原性抗原による攻撃に対する宿主の免疫応答を誘発または強化することを特徴とする方法。２７．請求の範囲２６に記載の方法であって、２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与されることを特徴とする方法。２８．請求の範囲２７に記載の方法であって、前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる免疫原性抗原を別個にかつ作動的にコードしていることを特徴とする方法。２９．アレルゲンに対する宿主の免疫応答を和らげる方法であって、医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを、宿主の皮膚または粘膜を通して宿主に投与することを包含し、前記裸ポリヌクレオチドが、皮膚または粘膜でアレルゲンによる抗原投与に対して応答して宿主がＩｇＥを産生するのを抑制する生物活性ペプチドを作動的にコードしていることを特徴とする方法。３０．請求の範囲２９に記載の方法であって、２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与されることを特徴とする方法。３１．請求の範囲３０に記載の方法であって、前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる免疫原性抗原を別個にかつ作動的にコードしていることを特徴とする方法。３２．請求の範囲２９に記載の方法であって、前記生物活性ペプチドが、インターロイキン−２、γインターフェロンまたは形質転換成長因子βからなる群から選択されることを特徴とする方法。３３．裸ポリヌクレオチドを経皮透過させる装置であって、医薬として許容される担体中含ませた効果的量の裸ポリヌクレオチドを含有するイオン導入法のパッチを具備していることを特徴とする装置。３４．請求の範囲３３に記載の装置であって、前記パッチがさらに吸収促進剤を含有していることを特徴とする装置。３５．裸ポリヌクレオチドを宿主に導入する装置であって、宿主の表皮の最外層の予想される厚みと同等の長さの多数の針が取り付けられたハンドル手段を具備し、各針が裸ポリヌクレオチドを含有する医薬として許容される担体でコートされ、各裸ポリヌクレオチドが生物活性ペプチドを作動的にコードしていることを特徴とする装置。３６．請求の範囲３５に記載の装置であって、前記担体がさらに吸収促進剤を含有することを特徴とする装置。３７．請求の範囲３５に記載の装置であって、前記担体がさらに化学刺激剤を含有し、その量が化学刺激剤に対する宿主の免疫応答を誘発するのに充分な量であることを特徴とする装置。３８．治療薬剤に対する宿主の応答を高める方法であって、治療薬剤を宿主に投与することと、治療薬剤に対して生体内アジュバントとして作用するペプチドを作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドを宿主に実質的に同時に投与することを包含し、前記裸ポリヌクレオチドが請求の範囲１に記載の方法にしたがって宿主に投与されることを特徴とする方法。３９．宿主内で治療用ペプチドに対する一過性の全身応答を誘発する方法であって、医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを宿主にその皮膚または粘膜を通して投与することを包含し、前記裸ポリヌクレオチドが治療用ペプチドを作動的にコードしており、前記裸ポリヌクレオチドが該ペプチドを分泌させる調節配列の制御下にあり、そして前記治療用ペプチドが皮膚または粘膜内で抗原提示細胞によって取り込まれて発現され、次いで宿主の循環系中に分泌されることを特徴とする方法。４０．請求の範囲６に記載の方法であって、前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなることを特徴とする方法。４１．請求の範囲１９に記載の方法であって、前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなることを特徴とする方法。４２．請求の範囲３７に記載の方法であって、前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなることを特徴とする方法。