JPH09304393A - 急性心筋梗塞診断キット - Google Patents
急性心筋梗塞診断キットInfo
- Publication number
- JPH09304393A JPH09304393A JP20736896A JP20736896A JPH09304393A JP H09304393 A JPH09304393 A JP H09304393A JP 20736896 A JP20736896 A JP 20736896A JP 20736896 A JP20736896 A JP 20736896A JP H09304393 A JPH09304393 A JP H09304393A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- myocardial infarction
- acute myocardial
- creatine kinase
- lactate dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 急性心筋梗塞の患者の血清中の複数の生化学
的標識の定量を簡単にかつ同時に行ないうる、急性心筋
梗塞診断キットおよび同診断方法を提供すること。 【解決手段】 複数の種類の抗体、複数のマイクロタイ
タープレートウェルを有し、各マイクロタイタープレー
トウェルには複数の種類の抗体のうちの多くとも１種が
固定されているマイクロタイタープレートおよび血清中
の複数の生化学的標識を測定するために用いられる複数
の種類の試薬からなる急性心筋梗塞診断キット、ならび
に急性心筋梗塞を診断する方法。
的標識の定量を簡単にかつ同時に行ないうる、急性心筋
梗塞診断キットおよび同診断方法を提供すること。 【解決手段】 複数の種類の抗体、複数のマイクロタイ
タープレートウェルを有し、各マイクロタイタープレー
トウェルには複数の種類の抗体のうちの多くとも１種が
固定されているマイクロタイタープレートおよび血清中
の複数の生化学的標識を測定するために用いられる複数
の種類の試薬からなる急性心筋梗塞診断キット、ならび
に急性心筋梗塞を診断する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、疾患の診断目的
で、酵素活性をテストするための臨床上の診断具（diag
nostics）に関する。さらに詳しくは、心筋梗塞を診断
するための臨床上のアッセイキットおよび診断方法に関
する。
で、酵素活性をテストするための臨床上の診断具（diag
nostics）に関する。さらに詳しくは、心筋梗塞を診断
するための臨床上のアッセイキットおよび診断方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】急性
心筋梗塞（以下、ＡＭＩともいう）の迅速かつ定量的な
診断がその治療の方向づけには不可欠である。
心筋梗塞（以下、ＡＭＩともいう）の迅速かつ定量的な
診断がその治療の方向づけには不可欠である。
【０００３】心電図（以下、ＥＣＧという）は、慣例的
なＡＭＩ治癒における最もポピュラーな診断法を提供す
るが、ＡＭＩ診断においてＥＣＧを適用する際には、診
断されないＥＣＧ応答が５０％も存在することがよく知
られている。血管造影的診断手術（operation）は信頼
性はあるが侵襲的であり、救急の場では一般に利用でき
ない。したがって、ＡＭＩの生化学的標識が、ＡＭＩ患
者の処置において最も効果的で特異的なインジケーショ
ン（indication）であると現在では考えられている。生
化学的標識とは、クレアチンキナーゼＭＢ（以下、ＣＫ
ＭＢともいう）、ＣＫＭＢのアイソフォーム、ＣＫＭＭ
のアイソフォーム、乳酸デヒドロゲナーゼＩ（以下、Ｌ
ＤＩともいう）、ミオグロビン（以下、ＭＧＢともい
う）、ミオシンＬ鎖（以下、ＭＬＣという）、トロポニ
ンＩ（以下、Ｔｎｐ Ｉという）、トロポニンＴ（以
下、Ｔｎｐ Ｔという）、グルタミン酸−オキザロ酢酸
トランスアミナーゼ（以下、ＧＯＴともいう）、グリコ
ーゲンホスホリラーゼＢＢ（以下、ＧＰＢＢともい
う）、エノラーゼ（以下、ＥＮＬという）および心臓の
脂肪酸結合タンパク質（以下、ｃＦＡ−ＢＰという）を
含み、これら全てが急性心筋梗塞を診断するための許容
しうる感受性または選択性のいずれかを有することが示
されている。これらのうちで、ＣＫＭＢはＡＭＩ診断の
ための「ゴールデン・マーカー」として認められ、また
ＭＧＢは心筋から最も早く放出される血清標識タンパク
質である。しかしながら、ＣＫＭＢまたはＭＧＢの単独
の測定では、ＡＭＩの存在を確認するには信頼性に欠け
る可能性がある。ＣＫＭＢはＡＭＩの発症（onset）か
ら３〜８時間内に増加し、約３６〜４８時間内に通常に
戻るので、胸痛の発症または病院での遅い管理における
患者についてＡＭＩを確認するには単独のＣＫＭＢデー
タから判断することは困難である。またＭＧＢは心臓の
細胞損傷に対して非特異的である。したがって、ＣＫＭ
Ｂ／総クレアチンキナーゼ、ＬＤＩ／総ＬＤまたはＬＤ
Ｉ／ＬＤIIの活性比率およびカルボニックアンヒドラー
ゼIII／ＭＧＢの比率が、ＡＭＩ診断のために効率性お
よび特異性を改良することが示唆される。
なＡＭＩ治癒における最もポピュラーな診断法を提供す
るが、ＡＭＩ診断においてＥＣＧを適用する際には、診
断されないＥＣＧ応答が５０％も存在することがよく知
られている。血管造影的診断手術（operation）は信頼
性はあるが侵襲的であり、救急の場では一般に利用でき
ない。したがって、ＡＭＩの生化学的標識が、ＡＭＩ患
者の処置において最も効果的で特異的なインジケーショ
ン（indication）であると現在では考えられている。生
化学的標識とは、クレアチンキナーゼＭＢ（以下、ＣＫ
ＭＢともいう）、ＣＫＭＢのアイソフォーム、ＣＫＭＭ
のアイソフォーム、乳酸デヒドロゲナーゼＩ（以下、Ｌ
ＤＩともいう）、ミオグロビン（以下、ＭＧＢともい
う）、ミオシンＬ鎖（以下、ＭＬＣという）、トロポニ
ンＩ（以下、Ｔｎｐ Ｉという）、トロポニンＴ（以
下、Ｔｎｐ Ｔという）、グルタミン酸−オキザロ酢酸
トランスアミナーゼ（以下、ＧＯＴともいう）、グリコ
ーゲンホスホリラーゼＢＢ（以下、ＧＰＢＢともい
う）、エノラーゼ（以下、ＥＮＬという）および心臓の
脂肪酸結合タンパク質（以下、ｃＦＡ−ＢＰという）を
含み、これら全てが急性心筋梗塞を診断するための許容
しうる感受性または選択性のいずれかを有することが示
されている。これらのうちで、ＣＫＭＢはＡＭＩ診断の
ための「ゴールデン・マーカー」として認められ、また
ＭＧＢは心筋から最も早く放出される血清標識タンパク
質である。しかしながら、ＣＫＭＢまたはＭＧＢの単独
の測定では、ＡＭＩの存在を確認するには信頼性に欠け
る可能性がある。ＣＫＭＢはＡＭＩの発症（onset）か
ら３〜８時間内に増加し、約３６〜４８時間内に通常に
戻るので、胸痛の発症または病院での遅い管理における
患者についてＡＭＩを確認するには単独のＣＫＭＢデー
タから判断することは困難である。またＭＧＢは心臓の
細胞損傷に対して非特異的である。したがって、ＣＫＭ
Ｂ／総クレアチンキナーゼ、ＬＤＩ／総ＬＤまたはＬＤ
Ｉ／ＬＤIIの活性比率およびカルボニックアンヒドラー
ゼIII／ＭＧＢの比率が、ＡＭＩ診断のために効率性お
よび特異性を改良することが示唆される。
【０００４】ＡＭＩの標識診断のための従来の方法を以
下に示す。
下に示す。
【０００５】（１）免疫電気泳動。これは特異的な電気
泳動ゲルにテスト血清を添加し、前記ゲルに通電し、特
異的な抗体と相互作用（interact）したゲルを染色し、
最後に酵素活性値をうるため電気泳動ゲルをスキャン
し、イソ酵素／総酵素の百分率を計算することにより行
なう。しかしながら、この方法は、長い時間がかかりま
た正確さにも欠ける。たとえ最近開発された毛管電気泳
動がアッセイ時間を短縮することができるとしても、前
記装置は高価でかつ操作のための特別な技術を要するの
で、日常のアッセイには不適当である。
泳動ゲルにテスト血清を添加し、前記ゲルに通電し、特
異的な抗体と相互作用（interact）したゲルを染色し、
最後に酵素活性値をうるため電気泳動ゲルをスキャン
し、イソ酵素／総酵素の百分率を計算することにより行
なう。しかしながら、この方法は、長い時間がかかりま
た正確さにも欠ける。たとえ最近開発された毛管電気泳
動がアッセイ時間を短縮することができるとしても、前
記装置は高価でかつ操作のための特別な技術を要するの
で、日常のアッセイには不適当である。
【０００６】（２）エンザイムイムノアッセイ（以下、
ＥＩＡともいう）、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩ
Ａともいう）、蛍光イムノアッセイ（以下、ＦＩＡとも
いう）および発光イムノアッセイ（以下、ＬＩＡともい
う）。これらのイムノアッセイの原理を、例としてエン
ザイムイムノアッセイをあげて説明し、図１（ａ）から
図１（ｃ）に示す。図１（ａ）に示すようにテスト血清
を第１の抗体１１を備えた固体担体１０に添加する。図
１（ｂ）において説明するようにテスト血清における生
化学的標識１２と第１の抗体１１が結合したのち、第２
の抗体末端１３と酵素末端１４からなる第２の抗体−酵
素結合体（conjugate）１５を添加する。つぎに図１
（ｃ）に示されるように、第２の抗体−酵素結合体１５
が生化学的標識１２と結合したのち、生化学的試薬１６
を添加し、第２の抗体−酵素結合体１５の酵素末端１４
と反応させる。最後に、テスト血清中の生化学的標識１
２の濃度を生成物１７の収量を測定することにより推定
（deduce）する。この方法は、エンザイム・リンクト・
イムノソルベント・アッセイ（enzyme linked immunoso
rbent assay、以下、ＥＬＩＳＡともいう）と呼ばれ、
広く使われている。しかしながら、この方法は、それに
かかる労力および時間消費といった性質のために、急性
心筋梗塞の検査には不適当である。同様に、ラジオイム
ノアッセイ、蛍光イムノアッセイおよび発光イムノアッ
セイもまた相当の時間がかかり、また特別の装置を要す
る。さらに、ラジオイムノアッセイの試薬およびその廃
棄物は危険性が高い。
ＥＩＡともいう）、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩ
Ａともいう）、蛍光イムノアッセイ（以下、ＦＩＡとも
いう）および発光イムノアッセイ（以下、ＬＩＡともい
う）。これらのイムノアッセイの原理を、例としてエン
ザイムイムノアッセイをあげて説明し、図１（ａ）から
図１（ｃ）に示す。図１（ａ）に示すようにテスト血清
を第１の抗体１１を備えた固体担体１０に添加する。図
１（ｂ）において説明するようにテスト血清における生
化学的標識１２と第１の抗体１１が結合したのち、第２
の抗体末端１３と酵素末端１４からなる第２の抗体−酵
素結合体（conjugate）１５を添加する。つぎに図１
（ｃ）に示されるように、第２の抗体−酵素結合体１５
が生化学的標識１２と結合したのち、生化学的試薬１６
を添加し、第２の抗体−酵素結合体１５の酵素末端１４
と反応させる。最後に、テスト血清中の生化学的標識１
２の濃度を生成物１７の収量を測定することにより推定
（deduce）する。この方法は、エンザイム・リンクト・
イムノソルベント・アッセイ（enzyme linked immunoso
rbent assay、以下、ＥＬＩＳＡともいう）と呼ばれ、
広く使われている。しかしながら、この方法は、それに
かかる労力および時間消費といった性質のために、急性
心筋梗塞の検査には不適当である。同様に、ラジオイム
ノアッセイ、蛍光イムノアッセイおよび発光イムノアッ
セイもまた相当の時間がかかり、また特別の装置を要す
る。さらに、ラジオイムノアッセイの試薬およびその廃
棄物は危険性が高い。
【０００７】（３）イソ酵素阻害もまた、血清中の生化
学的標識のためのテストに広く使われている。ここで
は、例としてクレアチンキナーゼをあげ、イソ酵素阻害
の原理を説明する。クレアチンキナーゼのＭサブユニッ
トは、抗体または試薬により阻害される。前記方法は、
特異性について充分ではなく、えられた結果は信頼性に
欠ける。
学的標識のためのテストに広く使われている。ここで
は、例としてクレアチンキナーゼをあげ、イソ酵素阻害
の原理を説明する。クレアチンキナーゼのＭサブユニッ
トは、抗体または試薬により阻害される。前記方法は、
特異性について充分ではなく、えられた結果は信頼性に
欠ける。
【０００８】（４）比濁分析（turbidimetry and nephe
lometry）。まずテスト血清をラテックス−ポリクロー
ナル抗体結合体溶液に添加し、つぎに、ポリクローナル
抗体とその抗原との結合（interaction）により、凝集
現象が導かれる。この現象をここでは生化学的標識と呼
ぶ。凝集の結果としてえられる濁りまたは屈折の変化が
生化学的標識を定量するための参考となる。自動の臨床
上の分析器の利用により、この方法は困難なく適用され
る。しかしながら、この方法は、自己免疫疾患の患者の
血液に由来するＩｇＭ、および脂肪過剰血症の患者の血
液中のキロミクロンによってもまた容易に障害される。
lometry）。まずテスト血清をラテックス−ポリクロー
ナル抗体結合体溶液に添加し、つぎに、ポリクローナル
抗体とその抗原との結合（interaction）により、凝集
現象が導かれる。この現象をここでは生化学的標識と呼
ぶ。凝集の結果としてえられる濁りまたは屈折の変化が
生化学的標識を定量するための参考となる。自動の臨床
上の分析器の利用により、この方法は困難なく適用され
る。しかしながら、この方法は、自己免疫疾患の患者の
血液に由来するＩｇＭ、および脂肪過剰血症の患者の血
液中のキロミクロンによってもまた容易に障害される。
【０００９】既存の方法は、前記欠点により障害され、
効率のよいＡＭＩ診断および治療目的の処置を深刻に妨
げる可能性がある。さらに、既存の診断方法はひとつと
しては、病院での遅い管理をうける患者にとって重要で
ある多様なＡＭＩ標識を分析することを可能としてはい
ない。
効率のよいＡＭＩ診断および治療目的の処置を深刻に妨
げる可能性がある。さらに、既存の診断方法はひとつと
しては、病院での遅い管理をうける患者にとって重要で
ある多様なＡＭＩ標識を分析することを可能としてはい
ない。
【００１０】ＡＭＩ標識の多様なパターンは、全心筋損
傷の定量、すなわち時間の推移、梗塞の大きさおよび治
療的介在の効力についての有益な参考をしばしば与えう
る。
傷の定量、すなわち時間の推移、梗塞の大きさおよび治
療的介在の効力についての有益な参考をしばしば与えう
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】既存のＡＭＩ診断の欠点
を解決するために、本発明はＡＭＩ標識自身が複数の酵
素であるという特徴を利用すること、または酵素と非酵
素標識を連結することにより開発された。本発明におけ
る診断は大多数の従来の方法よりも時間の消費をより少
なくしかつ実施の困難性をより減らすものである。
を解決するために、本発明はＡＭＩ標識自身が複数の酵
素であるという特徴を利用すること、または酵素と非酵
素標識を連結することにより開発された。本発明におけ
る診断は大多数の従来の方法よりも時間の消費をより少
なくしかつ実施の困難性をより減らすものである。
【００１２】急性心筋梗塞の初期は、クレアチンキナー
ゼＭＢおよび乳酸デヒドロゲナーゼＩの絶対的な活性に
よっては証明できないが、クレアチンキナーゼＭＢ／総
クレアチンキナーゼの百分率および乳酸デヒドロゲナー
ゼＩ／総乳酸デヒドロゲナーゼまたは乳酸デヒドロゲナ
ーゼＩ／乳酸デヒドロゲナーゼIIの百分率により立証す
ることができる。イソ酵素／総酵素の百分率（総酵素を
１００としたばあいのイソ酵素の割合）は免疫電気泳動
を利用することによりえられうる。しかしながら、前記
した免疫電気泳動の障害のために、免疫電気泳動は、緊
急の急性心筋梗塞診断法としては実用に則さない。
ゼＭＢおよび乳酸デヒドロゲナーゼＩの絶対的な活性に
よっては証明できないが、クレアチンキナーゼＭＢ／総
クレアチンキナーゼの百分率および乳酸デヒドロゲナー
ゼＩ／総乳酸デヒドロゲナーゼまたは乳酸デヒドロゲナ
ーゼＩ／乳酸デヒドロゲナーゼIIの百分率により立証す
ることができる。イソ酵素／総酵素の百分率（総酵素を
１００としたばあいのイソ酵素の割合）は免疫電気泳動
を利用することによりえられうる。しかしながら、前記
した免疫電気泳動の障害のために、免疫電気泳動は、緊
急の急性心筋梗塞診断法としては実用に則さない。
【００１３】本発明によれば急性心筋梗塞の初期を確認
するために、クレアチンキナーゼＭＢの活性、ミオグロ
ビンの質量および乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性を同時
に決定することができ、さらにグルタミン酸−オキザロ
酢酸トランスアミナーゼの活性、クレアチンキナーゼＭ
Ｂ／総クレアチンキナーゼの百分率および乳酸デヒドロ
ゲナーゼＩ／総乳酸デヒドロゲナーゼの百分率をも１つ
の実験において決定することができる。
するために、クレアチンキナーゼＭＢの活性、ミオグロ
ビンの質量および乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性を同時
に決定することができ、さらにグルタミン酸−オキザロ
酢酸トランスアミナーゼの活性、クレアチンキナーゼＭ
Ｂ／総クレアチンキナーゼの百分率および乳酸デヒドロ
ゲナーゼＩ／総乳酸デヒドロゲナーゼの百分率をも１つ
の実験において決定することができる。
【００１４】したがって、本発明の目的は、複数の種類
の抗体、複数のマクロタイタープレートウェルを有し、
各マイクロタイタープレートウェルには複数の種類の抗
体のうちの多くとも１種が固定されている、マイクロタ
イタープレートおよび血清中の複数の生化学的標識を測
定するために用いられる複数の種類の試薬からなる急性
心筋梗塞診断キットを提供することである。
の抗体、複数のマクロタイタープレートウェルを有し、
各マイクロタイタープレートウェルには複数の種類の抗
体のうちの多くとも１種が固定されている、マイクロタ
イタープレートおよび血清中の複数の生化学的標識を測
定するために用いられる複数の種類の試薬からなる急性
心筋梗塞診断キットを提供することである。
【００１５】本発明のもう１つの目的は、急性心筋梗塞
の患者の血清中の生化学的標識と結合しうる、複数の種
類の抗体を提供する工程、各固体担体には多くとも１種
の該抗体が固定されている複数の固体担体を提供する工
程、該抗体と結合しない不純物を取り除く工程、複数の
固体担体に複数の各試薬を添加する工程、および各抗体
と結合した血清中の生化学的標識の活性を測定する工程
からなる急性心筋梗塞を診断するための方法を提供する
ことである。
の患者の血清中の生化学的標識と結合しうる、複数の種
類の抗体を提供する工程、各固体担体には多くとも１種
の該抗体が固定されている複数の固体担体を提供する工
程、該抗体と結合しない不純物を取り除く工程、複数の
固体担体に複数の各試薬を添加する工程、および各抗体
と結合した血清中の生化学的標識の活性を測定する工程
からなる急性心筋梗塞を診断するための方法を提供する
ことである。
【００１６】本発明は、たとえば、１．量に関する信頼
できるデータ、２．感受性および選択性の両方を改良す
るための多様な標識パターン、３．特異性を改良するた
めの標識の比率の直接的提示、４．有効なＡＭＩ診断の
ための迅速にアクセス可能なＥＬＩＳＡリーダー（read
er）の使用、５．短い回転時間（turn-around-time）な
どの利点を提供する。これらの利点は全てＡＭＩ患者に
非常に有益である。
できるデータ、２．感受性および選択性の両方を改良す
るための多様な標識パターン、３．特異性を改良するた
めの標識の比率の直接的提示、４．有効なＡＭＩ診断の
ための迅速にアクセス可能なＥＬＩＳＡリーダー（read
er）の使用、５．短い回転時間（turn-around-time）な
どの利点を提供する。これらの利点は全てＡＭＩ患者に
非常に有益である。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるエンザイム・
リンクト・イムノアッセイ（enzyme-linkedimmunoassa
y）を図２（ａ）および図２（ｂ）により説明する。図
２（ａ）に示されるように、急性心筋梗塞の生化学的標
識に対する高力価の特異的抗体２２が選択される。前記
抗体２２は、たとえば抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体、
抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体、抗ミオグロビン抗体、
抗脂肪酸結合タンパク質抗体、抗グリコーゲンホスホリ
ラーゼＢＢ抗体、抗カルボニックアンヒドラーゼIII抗
体、抗クレアチンキナーゼＭＭ1抗体、抗クレアチンキ
ナーゼＭＭ2抗体、抗クレアチンキナーゼＭＭ3抗体、抗
クレアチンキナーゼＭＢ1抗体および抗クレアチンキナ
ーゼＭＢ2抗体でありうる。
リンクト・イムノアッセイ（enzyme-linkedimmunoassa
y）を図２（ａ）および図２（ｂ）により説明する。図
２（ａ）に示されるように、急性心筋梗塞の生化学的標
識に対する高力価の特異的抗体２２が選択される。前記
抗体２２は、たとえば抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体、
抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体、抗ミオグロビン抗体、
抗脂肪酸結合タンパク質抗体、抗グリコーゲンホスホリ
ラーゼＢＢ抗体、抗カルボニックアンヒドラーゼIII抗
体、抗クレアチンキナーゼＭＭ1抗体、抗クレアチンキ
ナーゼＭＭ2抗体、抗クレアチンキナーゼＭＭ3抗体、抗
クレアチンキナーゼＭＢ1抗体および抗クレアチンキナ
ーゼＭＢ2抗体でありうる。
【００１８】つぎに前記抗体２２は、たとえばマイクロ
タイタープレート、ラテックスまたはガラスビーズなど
の固体担体２１に固定される。続いて前記抗体２２が固
定された固体担体２１はタンパク質でブロックされる
（図２には示さず）。テスト血清を固体担体２１に添加
したのち、テスト血清中の生化学的標識２３は抗体２２
と特異的に結合する。
タイタープレート、ラテックスまたはガラスビーズなど
の固体担体２１に固定される。続いて前記抗体２２が固
定された固体担体２１はタンパク質でブロックされる
（図２には示さず）。テスト血清を固体担体２１に添加
したのち、テスト血清中の生化学的標識２３は抗体２２
と特異的に結合する。
【００１９】図２（ｂ）に示されるように、固体担体２
１中の生化学的標識２３と結合している抗体２２を洗浄
したのち、さらに試薬２４を前記固体担体２１に添加す
る。生化学的標識２３がそれ自身、たとえば、クレアチ
ンキナーゼＭＢ、乳酸デヒドロゲナーゼＩ、グリコーゲ
ンホスホリラーゼＢＢおよびカルボニックアンヒドラー
ゼIIIといった酵素であるならば、試薬２４は、前記生
化学的標識２３と反応するように設計される。生化学的
標識が酵素ではなく、単なるタンパク質、たとえばミオ
グロビンや脂肪酸結合タンパク質であれば、生化学的標
識２３は、酵素、通常は乳酸デヒドロゲナーゼと連結さ
れる。前記の連結された構造により、試薬２４もこの結
合体の酵素末端との反応に適用されうる。このばあい、
血清中へ生化学的標識−酵素結合体（濃度は既知）を添
加する競合的方法を用いる。
１中の生化学的標識２３と結合している抗体２２を洗浄
したのち、さらに試薬２４を前記固体担体２１に添加す
る。生化学的標識２３がそれ自身、たとえば、クレアチ
ンキナーゼＭＢ、乳酸デヒドロゲナーゼＩ、グリコーゲ
ンホスホリラーゼＢＢおよびカルボニックアンヒドラー
ゼIIIといった酵素であるならば、試薬２４は、前記生
化学的標識２３と反応するように設計される。生化学的
標識が酵素ではなく、単なるタンパク質、たとえばミオ
グロビンや脂肪酸結合タンパク質であれば、生化学的標
識２３は、酵素、通常は乳酸デヒドロゲナーゼと連結さ
れる。前記の連結された構造により、試薬２４もこの結
合体の酵素末端との反応に適用されうる。このばあい、
血清中へ生化学的標識−酵素結合体（濃度は既知）を添
加する競合的方法を用いる。
【００２０】つぎに、生化学的標識および生化学的標識
−酵素結合体は抗体２２と競合的に結合する。生化学的
標識２３または生化学的標識２３−酵素結合体と試薬２
４との反応から生じる生成物２５の産生量を測定するこ
とにより、生化学的標識２３の濃度を推定することがで
きる。
−酵素結合体は抗体２２と競合的に結合する。生化学的
標識２３または生化学的標識２３−酵素結合体と試薬２
４との反応から生じる生成物２５の産生量を測定するこ
とにより、生化学的標識２３の濃度を推定することがで
きる。
【００２１】より高い精度をうるには、本発明による急
性心筋梗塞診断キットを臨床的に使用する際の効率およ
び少ない労力を、また急性心筋梗塞診断キットを製造す
る際の製造時間およびコストを削減するには、好ましい
抗体の選択、抗体固定化の好ましい濃度の測定および抗
体固定化の好ましい継続時間の測定を検討すればよい。
性心筋梗塞診断キットを臨床的に使用する際の効率およ
び少ない労力を、また急性心筋梗塞診断キットを製造す
る際の製造時間およびコストを削減するには、好ましい
抗体の選択、抗体固定化の好ましい濃度の測定および抗
体固定化の好ましい継続時間の測定を検討すればよい。
【００２２】（１）抗体の選択 市販の抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体および抗乳酸デヒ
ドロゲナーゼＩ抗体は、オーイーエム、バイオデザイ
ン、ケミコン・アンド・インターナショナル・エンザイ
ム（OEM,Biodesign,Chemicon and International Enzym
e）から購入する。
ドロゲナーゼＩ抗体は、オーイーエム、バイオデザイ
ン、ケミコン・アンド・インターナショナル・エンザイ
ム（OEM,Biodesign,Chemicon and International Enzym
e）から購入する。
【００２３】つぎに、抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体ま
たは抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体のいずれかである、
抗体（１０μｇ／ｍｌ）の１００μｌを２４時間マイク
ロタイタープレートに固定する。さらに抗体を固定した
マイクロタイタープレートを１Ｍ ＫＣｌにより洗浄
し、２％ＢＳＡを含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．６）によりブロックする。そののち、一定の濃度の
クレアチンキナーゼＭＢおよび乳酸デヒドロゲナーゼＩ
を各々抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体および抗乳酸デヒ
ドロゲナーゼＩ抗体とともにマイクロタイタープレート
において１時間インキュベートした。抗体と酵素の反応
終了後、マイクロタイタープレートを洗浄し、各々に、
クレアチンキナーゼの活性を決定するための試薬Ｉおよ
び乳酸デヒドロゲナーゼの活性を決定するための試薬II
を添加する。最後に、マイクロタイタープレートにおけ
る吸光度の経時的変化（the change of absorbance wit
h respect to time）を３４０ｎｍで測定する。
たは抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体のいずれかである、
抗体（１０μｇ／ｍｌ）の１００μｌを２４時間マイク
ロタイタープレートに固定する。さらに抗体を固定した
マイクロタイタープレートを１Ｍ ＫＣｌにより洗浄
し、２％ＢＳＡを含む０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．６）によりブロックする。そののち、一定の濃度の
クレアチンキナーゼＭＢおよび乳酸デヒドロゲナーゼＩ
を各々抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体および抗乳酸デヒ
ドロゲナーゼＩ抗体とともにマイクロタイタープレート
において１時間インキュベートした。抗体と酵素の反応
終了後、マイクロタイタープレートを洗浄し、各々に、
クレアチンキナーゼの活性を決定するための試薬Ｉおよ
び乳酸デヒドロゲナーゼの活性を決定するための試薬II
を添加する。最後に、マイクロタイタープレートにおけ
る吸光度の経時的変化（the change of absorbance wit
h respect to time）を３４０ｎｍで測定する。
【００２４】試薬Ｉは、 １．イミダゾール（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．７）、
グルコース（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、酢酸マグネシウム
（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＥＤＴＡ（２ｍｍｏｌ／
Ｌ）からなる基質緩衝液および ２．ＡＤＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮＡＤＰ+（２ｍｍｏ
ｌ／Ｌ）、リン酸クレアチン（creatin phosphate）
（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−アセチルシステイン（１３
ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＨＫ（ヘキソースキナーゼ）（２５０
０Ｕ／Ｌ）およびＧ６Ｐ−ＤＨ（グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ）（１５００Ｕ／Ｌ）からなるクレ
アチンキナーゼ試薬からなる。
グルコース（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、酢酸マグネシウム
（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＥＤＴＡ（２ｍｍｏｌ／
Ｌ）からなる基質緩衝液および ２．ＡＤＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮＡＤＰ+（２ｍｍｏ
ｌ／Ｌ）、リン酸クレアチン（creatin phosphate）
（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−アセチルシステイン（１３
ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＨＫ（ヘキソースキナーゼ）（２５０
０Ｕ／Ｌ）およびＧ６Ｐ−ＤＨ（グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ）（１５００Ｕ／Ｌ）からなるクレ
アチンキナーゼ試薬からなる。
【００２５】クレアチンキナーゼ（ＣＫ）と試薬Ｉとの
反応を以下に示す。
反応を以下に示す。
【００２６】
【数１】
【００２７】
【数２】
【００２８】
【数３】
【００２９】試薬IIは、 １．リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．６）、
ピルビン酸ナトリウム（０．６３ｍｍｏｌ／Ｌ）および
安定剤からなる基質緩衝液および ２．ＮＡＤＨ（０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ）からなるＮＡＤ
Ｈ試薬からなる。
ピルビン酸ナトリウム（０．６３ｍｍｏｌ／Ｌ）および
安定剤からなる基質緩衝液および ２．ＮＡＤＨ（０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ）からなるＮＡＤ
Ｈ試薬からなる。
【００３０】試薬IIと乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
の反応を以下に示す。
の反応を以下に示す。
【００３１】
【数４】
【００３２】前記の方法により抗体を選択すると、前記
のバイオデザイン社より入手可能な抗クレアチンキナー
ゼＭＢ抗体が他の製造者より入手可能なものよりも、よ
りよいパフォーマンス（performance）を実施でき、前
記のバイオデザイン社より入手可能な抗乳酸デヒドロゲ
ナーゼＩでは最もよいパフォーマンスを実施できる。
のバイオデザイン社より入手可能な抗クレアチンキナー
ゼＭＢ抗体が他の製造者より入手可能なものよりも、よ
りよいパフォーマンス（performance）を実施でき、前
記のバイオデザイン社より入手可能な抗乳酸デヒドロゲ
ナーゼＩでは最もよいパフォーマンスを実施できる。
【００３３】（２）抗体固定化の好ましい濃度の決定 抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体および抗乳酸デヒドロゲ
ナーゼＩ抗体を数種の濃度に希釈する。つぎに、異なる
濃度のこれらの抗体を固体担体に固定する。これに続く
方法は前記の抗体の選択における方法と同様である。
ナーゼＩ抗体を数種の濃度に希釈する。つぎに、異なる
濃度のこれらの抗体を固体担体に固定する。これに続く
方法は前記の抗体の選択における方法と同様である。
【００３４】図５に示されるように、１０μｇ／ｍｌの
抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体をマイクロタイタープレ
ートに固定し、抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体について
実施することが好ましい。たとえ１０μｇ／ｍｌよりも
高い濃度でよりよいパフォーマンスをうることができた
としても、製造コストに関して魅力的ではないので、本
発明による急性心筋梗塞診断キットの製造には１０μｇ
／ｍｌの濃度を用いる。
抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体をマイクロタイタープレ
ートに固定し、抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体について
実施することが好ましい。たとえ１０μｇ／ｍｌよりも
高い濃度でよりよいパフォーマンスをうることができた
としても、製造コストに関して魅力的ではないので、本
発明による急性心筋梗塞診断キットの製造には１０μｇ
／ｍｌの濃度を用いる。
【００３５】つぎに、図６に示されるように、抗乳酸デ
ヒドロゲナーゼＩ抗体の濃度が高くなるほど、活性のパ
フォーマンスはよりよいことがわかる。しかしながら、
活性のパフォーマンスが減少することのない濃度につい
てコストを考慮すると、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体
の固定化の好ましい濃度として１０μｇ／ｍｌが選択さ
れる。
ヒドロゲナーゼＩ抗体の濃度が高くなるほど、活性のパ
フォーマンスはよりよいことがわかる。しかしながら、
活性のパフォーマンスが減少することのない濃度につい
てコストを考慮すると、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体
の固定化の好ましい濃度として１０μｇ／ｍｌが選択さ
れる。
【００３６】（３）好ましい抗体固定化時間の決定 １０μｇ／ｍｌの抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体および
１０μｇ／ｍｌの抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体を一定
期間固体担体に固定する。これ以後の方法は、前記の抗
体の選択における方法と同様である。
１０μｇ／ｍｌの抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体を一定
期間固体担体に固定する。これ以後の方法は、前記の抗
体の選択における方法と同様である。
【００３７】図７に示されるように、抗クレアチンキナ
ーゼＭＢ抗体の固定化時間が長くなるほど、マイクロタ
イタープレートに固定される抗体の量が多くなることが
わかる。とくに、マイクロタイタープレートに固定され
た抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体の量は９６時間の固定
化ののち、急激に増加する。したがって、９６時間が、
抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体固定化の好ましい時間で
あるとわかる。
ーゼＭＢ抗体の固定化時間が長くなるほど、マイクロタ
イタープレートに固定される抗体の量が多くなることが
わかる。とくに、マイクロタイタープレートに固定され
た抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体の量は９６時間の固定
化ののち、急激に増加する。したがって、９６時間が、
抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体固定化の好ましい時間で
あるとわかる。
【００３８】つぎに、図８を参照すると、抗乳酸デヒド
ロゲナーゼＩ抗体の固定化時間が長くなるほど、マイク
ロタイタープレートに固定される抗体の量が多くなるこ
とがわかる。とくに、マイクロタイタープレートに固定
された抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体の量は７２時間の
固定化ののち、急激に増加する。したがって、７２時間
が、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体固定化の好ましい時
間であるとわかる。
ロゲナーゼＩ抗体の固定化時間が長くなるほど、マイク
ロタイタープレートに固定される抗体の量が多くなるこ
とがわかる。とくに、マイクロタイタープレートに固定
された抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体の量は７２時間の
固定化ののち、急激に増加する。したがって、７２時間
が、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体固定化の好ましい時
間であるとわかる。
【００３９】さらに、テスト血清のインキュベーション
のための好ましい時間を考察する。まず、抗クレアチン
キナーゼＭＢ抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６時間
マイクロタイタープレートに固定する。洗浄ののち、抗
クレアチンキナーゼＭＢ抗体を固定したマイクロタイタ
ープレートをＢＳＡでブロックする。つぎに、一定の濃
度の数種のテスト血清を異なる時間インキュベートし、
ついで洗浄する。続いて、試薬Ｉをマイクロタイタープ
レートに添加し、マイクロタイタープレートにおける吸
光度の経時変化を３４０ｎｍで測定する。
のための好ましい時間を考察する。まず、抗クレアチン
キナーゼＭＢ抗体を１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６時間
マイクロタイタープレートに固定する。洗浄ののち、抗
クレアチンキナーゼＭＢ抗体を固定したマイクロタイタ
ープレートをＢＳＡでブロックする。つぎに、一定の濃
度の数種のテスト血清を異なる時間インキュベートし、
ついで洗浄する。続いて、試薬Ｉをマイクロタイタープ
レートに添加し、マイクロタイタープレートにおける吸
光度の経時変化を３４０ｎｍで測定する。
【００４０】図９に示されるように、テスト血清中のク
レアチンキナーゼＭＢをテストするためには、テスト血
清のインキュベーションのための好ましい時間は３０分
よりやや長い。図１１にしたがえば、前記の方法により
えられるクレアチンキナーゼＭＢの標準曲線により、テ
ストの限界が約５〜１５０Ｕ／Ｌであることが示され
る。
レアチンキナーゼＭＢをテストするためには、テスト血
清のインキュベーションのための好ましい時間は３０分
よりやや長い。図１１にしたがえば、前記の方法により
えられるクレアチンキナーゼＭＢの標準曲線により、テ
ストの限界が約５〜１５０Ｕ／Ｌであることが示され
る。
【００４１】同様に、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体を
８０μｇ／ｍｌに希釈し、７２時間マイクロタイタープ
レートに固定した。洗浄ののち、抗乳酸デヒドロゲナー
ゼＩ抗体を固定したマイクロタイタープレートをＢＳＡ
でブロックした。つぎに、一定の濃度の数種のテスト血
清を異なる時間インキュベートし、ついで洗浄する。続
いて、試薬IIをマイクロタイタープレートに添加し、マ
イクロタイタープレートにおけるＯ．Ｄ．値の経時的変
化を３４０ｎｍで測定する。
８０μｇ／ｍｌに希釈し、７２時間マイクロタイタープ
レートに固定した。洗浄ののち、抗乳酸デヒドロゲナー
ゼＩ抗体を固定したマイクロタイタープレートをＢＳＡ
でブロックした。つぎに、一定の濃度の数種のテスト血
清を異なる時間インキュベートし、ついで洗浄する。続
いて、試薬IIをマイクロタイタープレートに添加し、マ
イクロタイタープレートにおけるＯ．Ｄ．値の経時的変
化を３４０ｎｍで測定する。
【００４２】図１０に示されるように、テスト血清中の
乳酸デヒドロゲナーゼＩをテストするためには、テスト
血清のインキュベーションのための好ましい時間は約１
５分よりいく分長い。図１２にしたがえば、前記の方法
によりえられる乳酸デヒドロゲナーゼＩの標準曲線によ
り、テストの限界が約５〜１５０Ｕ／Ｌであることが示
される。
乳酸デヒドロゲナーゼＩをテストするためには、テスト
血清のインキュベーションのための好ましい時間は約１
５分よりいく分長い。図１２にしたがえば、前記の方法
によりえられる乳酸デヒドロゲナーゼＩの標準曲線によ
り、テストの限界が約５〜１５０Ｕ／Ｌであることが示
される。
【００４３】実際においての、本発明による急性心筋梗
塞診断キットの操作原理およびプロセスのフローを以下
に説明する。
塞診断キットの操作原理およびプロセスのフローを以下
に説明する。
【００４４】図１３に示されるように、テスト血清を６
つの部分に分割し、これをテスト血清Ｉ、テスト血清I
I、テスト血清III、テスト血清IV、テスト血清Ｖおよび
テスト血清VIとする。つぎに、テスト血清Ｉを抗クレア
チンキナーゼＭＢ抗体を固定したマイクロタイタープレ
ートウェルＩに添加し、テスト血清IIを抗乳酸デヒドロ
ゲナーゼＩ抗体を固定したマイクロタイタープレートウ
ェルIIに添加する。つぎに、一定量のミオグロビン−乳
酸デヒドロゲナーゼ結合体をテスト血清IIIと混合し、
ミオグロビン−乳酸デヒドロゲナーゼ結合体およびテス
ト血清IIIを含むこの混合物を抗ミオグロビン抗体を固
定したマイクロタイタープレートウェルIIIに添加す
る。テスト血清IV、テスト血清Ｖおよびテスト血清VIを
いずれの抗体も含まないブランクのマイクロタイタープ
レートウェルIV、ブランクのマイクロタイタープレート
ウェルＶおよびブランクのマイクロタイタープレートウ
ェルVIに各々添加する。さらに、マイクロタイタープレ
ートウェルＩ、マイクロタイタープレートウェルIIおよ
びマイクロタイタープレートウェルIIIを３０分間イン
キュベートし、そののち洗浄する。つぎに、試薬Ｉをマ
イクロタイタープレートウェルＩおよびマイクロタイタ
ープレートウェルIVに添加する。試薬IIをマイクロタイ
タープレートウェルII、マイクロタイタープレートウェ
ルIIIおよびマイクロタイタープレートウェルＶに添加
する。グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
をテストするための試薬IIIをマイクロタイタープレー
トウェルVIに添加する。
つの部分に分割し、これをテスト血清Ｉ、テスト血清I
I、テスト血清III、テスト血清IV、テスト血清Ｖおよび
テスト血清VIとする。つぎに、テスト血清Ｉを抗クレア
チンキナーゼＭＢ抗体を固定したマイクロタイタープレ
ートウェルＩに添加し、テスト血清IIを抗乳酸デヒドロ
ゲナーゼＩ抗体を固定したマイクロタイタープレートウ
ェルIIに添加する。つぎに、一定量のミオグロビン−乳
酸デヒドロゲナーゼ結合体をテスト血清IIIと混合し、
ミオグロビン−乳酸デヒドロゲナーゼ結合体およびテス
ト血清IIIを含むこの混合物を抗ミオグロビン抗体を固
定したマイクロタイタープレートウェルIIIに添加す
る。テスト血清IV、テスト血清Ｖおよびテスト血清VIを
いずれの抗体も含まないブランクのマイクロタイタープ
レートウェルIV、ブランクのマイクロタイタープレート
ウェルＶおよびブランクのマイクロタイタープレートウ
ェルVIに各々添加する。さらに、マイクロタイタープレ
ートウェルＩ、マイクロタイタープレートウェルIIおよ
びマイクロタイタープレートウェルIIIを３０分間イン
キュベートし、そののち洗浄する。つぎに、試薬Ｉをマ
イクロタイタープレートウェルＩおよびマイクロタイタ
ープレートウェルIVに添加する。試薬IIをマイクロタイ
タープレートウェルII、マイクロタイタープレートウェ
ルIIIおよびマイクロタイタープレートウェルＶに添加
する。グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
をテストするための試薬IIIをマイクロタイタープレー
トウェルVIに添加する。
【００４５】試薬IIIは、 １．アスパラギン酸塩（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）およびα
−ケトグルタル酸塩（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる緩
衝溶液および ２．乳酸デヒドロゲナーゼ（１５００Ｕ／Ｌより高い濃
度）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（１２００Ｕ／Ｌより
高い濃度）およびＮＡＤＨからなるＧＯＴ試薬からな
る。
−ケトグルタル酸塩（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）からなる緩
衝溶液および ２．乳酸デヒドロゲナーゼ（１５００Ｕ／Ｌより高い濃
度）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（１２００Ｕ／Ｌより
高い濃度）およびＮＡＤＨからなるＧＯＴ試薬からな
る。
【００４６】グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ）と試薬IIIとの反応を以下に示す。
ナーゼ（ＧＯＴ）と試薬IIIとの反応を以下に示す。
【００４７】
【数５】
【００４８】
【数６】
【００４９】最後に、マイクロタイタープレートウェル
Ｉ〜VIにおけるＯ．Ｄ．値の経時的変化を３４０ｎｍで
測定し、活性を推定する。総クレアチンキナーゼおよび
総乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、各々マイクロタイタ
ープレートウェルIVおよびＶにおいて、Ｏ．Ｄ．値の経
時的変化により推定する。クレアチンキナーゼＭＢおよ
び乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性は、各々マイクロタイ
タープレートウェルＩおよびIIにおいて、Ｏ．Ｄ．値の
経時的変化により推定する。前記でえられる結果によ
り、クレアチンキナーゼＭＢ／総クレアチンキナーゼの
百分率および乳酸デヒドロゲナーゼＩ／総乳酸デヒドロ
ゲナーゼの百分率を計算する。同様に、グルタミン酸−
オキザロ酢酸トランスアミナーゼの活性もまた３４０ｎ
ｍでマイクロタイタープレートウェルVIの吸光度の値の
減少率により推断（infer）する。さらに、マイクロタ
イタープレートウェルIIIにおいてミオグロビンおよび
ミオグロビン−乳酸デヒドロゲナーゼ結合体と抗ミオグ
ロビン抗体は競合的に反応する。反応終了後、マイクロ
タイタープレートウェルを洗浄する。さらに、試薬IIを
マイクロタイタープレートウェルIIIに添加する。その
のち、乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性を３４０ｎｍでの
マイクロタイタープレートウェルIIIにおける吸光度の
減少率により推断する。最後に、ミオグロビンの量を推
定する。
Ｉ〜VIにおけるＯ．Ｄ．値の経時的変化を３４０ｎｍで
測定し、活性を推定する。総クレアチンキナーゼおよび
総乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、各々マイクロタイタ
ープレートウェルIVおよびＶにおいて、Ｏ．Ｄ．値の経
時的変化により推定する。クレアチンキナーゼＭＢおよ
び乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性は、各々マイクロタイ
タープレートウェルＩおよびIIにおいて、Ｏ．Ｄ．値の
経時的変化により推定する。前記でえられる結果によ
り、クレアチンキナーゼＭＢ／総クレアチンキナーゼの
百分率および乳酸デヒドロゲナーゼＩ／総乳酸デヒドロ
ゲナーゼの百分率を計算する。同様に、グルタミン酸−
オキザロ酢酸トランスアミナーゼの活性もまた３４０ｎ
ｍでマイクロタイタープレートウェルVIの吸光度の値の
減少率により推断（infer）する。さらに、マイクロタ
イタープレートウェルIIIにおいてミオグロビンおよび
ミオグロビン−乳酸デヒドロゲナーゼ結合体と抗ミオグ
ロビン抗体は競合的に反応する。反応終了後、マイクロ
タイタープレートウェルを洗浄する。さらに、試薬IIを
マイクロタイタープレートウェルIIIに添加する。その
のち、乳酸デヒドロゲナーゼＩの活性を３４０ｎｍでの
マイクロタイタープレートウェルIIIにおける吸光度の
減少率により推断する。最後に、ミオグロビンの量を推
定する。
【００５０】本発明による急性心筋梗塞診断キットの特
徴を以下に示す。
徴を以下に示す。
【００５１】１．本発明による急性心筋梗塞診断キット
は、たとえば、クレアチンキナーゼＭＢおよびミオグロ
ビンなどの急性心筋梗塞の早期の標識と、たとえば乳酸
デヒドロゲナーゼＩといった後期の標識との同時測定を
提供する。したがって、誤診が避けられうる。
は、たとえば、クレアチンキナーゼＭＢおよびミオグロ
ビンなどの急性心筋梗塞の早期の標識と、たとえば乳酸
デヒドロゲナーゼＩといった後期の標識との同時測定を
提供する。したがって、誤診が避けられうる。
【００５２】２．イソ酵素および総酵素の同時測定は、
本発明による急性心筋梗塞診断キットにより提供されう
る。したがって、急性心筋梗塞の発症を再確認できる。
本発明による急性心筋梗塞診断キットにより提供されう
る。したがって、急性心筋梗塞の発症を再確認できる。
【００５３】３．ミオグロビンの量は、本発明による急
性心筋梗塞キットによりわかりうる。ミオグロビンの量
は灌流治療が効果であるかどうかの指標となりうるの
で、侵襲的な診断は、必要時のみ実施されうる。
性心筋梗塞キットによりわかりうる。ミオグロビンの量
は灌流治療が効果であるかどうかの指標となりうるの
で、侵襲的な診断は、必要時のみ実施されうる。
【００５４】４．同じ試薬、手段および分光光度計の測
定波長により、イソ酵素および総酵素の両方の活性がわ
かりうる。結果として、イソ酵素／総酵素の百分率は信
頼性がある。
定波長により、イソ酵素および総酵素の両方の活性がわ
かりうる。結果として、イソ酵素／総酵素の百分率は信
頼性がある。
【００５５】５．本発明による急性心筋梗塞診断キット
によれば、６０分以内に、同波長で、全ての相対値を読
み出すことができる。
によれば、６０分以内に、同波長で、全ての相対値を読
み出すことができる。
【００５６】６．本発明による急性心筋梗塞診断キット
は、広く入手可能なＥＬＩＳＡ装置と協同して使用でき
る。結果として、緊急の・さし迫ったテストに適してい
る。
は、広く入手可能なＥＬＩＳＡ装置と協同して使用でき
る。結果として、緊急の・さし迫ったテストに適してい
る。
【００５７】本発明は何が現在最も実用的で好ましい実
施態様であるかという見地から記載したが、本発明は開
示した実施態様に限定されるものではない。たとえば、
グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／グリコーゲンホスホ
リラーゼの百分率、ミオグロビン／カルボニックアンヒ
ドラーゼIIIの百分率および脂肪酸結合タンパク質／カ
ルボニックアンヒドラーゼIIIの百分率もまた本発明の
精神の範囲においてえられうる。
施態様であるかという見地から記載したが、本発明は開
示した実施態様に限定されるものではない。たとえば、
グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／グリコーゲンホスホ
リラーゼの百分率、ミオグロビン／カルボニックアンヒ
ドラーゼIIIの百分率および脂肪酸結合タンパク質／カ
ルボニックアンヒドラーゼIIIの百分率もまた本発明の
精神の範囲においてえられうる。
【００５８】さらに、本発明は、添付した請求項の真意
および範囲内に含まれる様々な変更および類似のアレン
ジメントを包含することを意図し、その範囲は全てのそ
のような変更および類似の構造を包含するような最も広
い解釈にしたがうべきである。
および範囲内に含まれる様々な変更および類似のアレン
ジメントを包含することを意図し、その範囲は全てのそ
のような変更および類似の構造を包含するような最も広
い解釈にしたがうべきである。
【００５９】
【発明の効果】急性心筋梗塞の患者の血清中の複数の生
化学的標識の定量を簡単にかつ同時に行ないうる、急性
心筋梗塞診断キットおよび同診断方法を提供することが
できる。
化学的標識の定量を簡単にかつ同時に行ないうる、急性
心筋梗塞診断キットおよび同診断方法を提供することが
できる。
本発明は、本願に不可欠な部分を形成する以下の記述お
よび添付書類を参照することによりより完全に理解しう
る。
よび添付書類を参照することによりより完全に理解しう
る。
【図１】（ａ）から（ｃ）は、エンザイム・リンクト・
イムノソルベント・アッセイの従来の方法を説明するた
めの断面説明図である。
イムノソルベント・アッセイの従来の方法を説明するた
めの断面説明図である。
【図２】（ａ）から（ｂ）は、本発明によるエンザイム
イムノアッセイの方法の好ましい実施態様を説明するた
めの断面説明図である。
イムノアッセイの方法の好ましい実施態様を説明するた
めの断面説明図である。
【図３】クレアチンキナーゼＭＢと試薬Ｉとの反応時の
時間（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度をプ
ロットしたグラフである。
時間（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度をプ
ロットしたグラフである。
【図４】乳酸デヒドロゲナーゼＩおよび試薬IIの反応時
の時間（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度を
プロットしたグラフである。
の時間（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度を
プロットしたグラフである。
【図５】抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体の好ましい固定
化濃度を決定するための濃度（μｇ／ｍｌ）に対する３
４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプ
ロットしたグラフである。
化濃度を決定するための濃度（μｇ／ｍｌ）に対する３
４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプ
ロットしたグラフである。
【図６】抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体の好ましい固定
化濃度を決定するための濃度（μｇ／ｍｌ）に対する３
４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプ
ロットしたグラフである。
化濃度を決定するための濃度（μｇ／ｍｌ）に対する３
４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプ
ロットしたグラフである。
【図７】抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体の好ましい固定
化時間を決定するための時間（ｈｒ）に対する３４０ｎ
ｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプロット
したグラフである。
化時間を決定するための時間（ｈｒ）に対する３４０ｎ
ｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプロット
したグラフである。
【図８】抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体の好ましい固定
化時間を決定するための時間（ｈｒ）に対する３４０ｎ
ｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプロット
したグラフである。
化時間を決定するための時間（ｈｒ）に対する３４０ｎ
ｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の変化をプロット
したグラフである。
【図９】抗クレアチンキナーゼＭＢ抗体を固定したマイ
クロタイタープレートウェルにおけるテスト血清の好ま
しいインキュベーション時間を決定するための時間（ｍ
ｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍ
ｉｎ）の変化をプロットしたグラフである。
クロタイタープレートウェルにおけるテスト血清の好ま
しいインキュベーション時間を決定するための時間（ｍ
ｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍ
ｉｎ）の変化をプロットしたグラフである。
【図１０】抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体を固定したマ
イクロタイタープレートウェルにおけるテスト血清の好
ましいインキュベーション時間を決定するための時間
（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ
／ｍｉｎ）の変化をプロットしたグラフである。
イクロタイタープレートウェルにおけるテスト血清の好
ましいインキュベーション時間を決定するための時間
（ｍｉｎ）に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ
／ｍｉｎ）の変化をプロットしたグラフである。
【図１１】クレアチンキナーゼＭＢの濃度（Ｕ／Ｌ）に
対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の
変化に関する標準曲線を示すグラフである。
対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）の
変化に関する標準曲線を示すグラフである。
【図１２】乳酸デヒドロゲナーゼＩの濃度（ｌｏｇ（Ｕ
／Ｌ））に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／
ｍｉｎ）の変化に関する標準曲線を示すグラフである。
／Ｌ））に対する３４０ｎｍにおける吸光度（ｍＯＤ／
ｍｉｎ）の変化に関する標準曲線を示すグラフである。
【図１３】本発明による急性心筋梗塞診断キットを用い
る方法のためのフローチャートである。
る方法のためのフローチャートである。
【図１４】急性心筋梗塞患者の発症以降に本発明による
急性心筋梗塞診断キットを用いることによってえた時間
（ｈｒ）に対する数種の酵素の活性（Ｕ／Ｌ）およびイ
ソ酵素／総酵素の百分率（％）をプロットしたグラフで
ある。
急性心筋梗塞診断キットを用いることによってえた時間
（ｈｒ）に対する数種の酵素の活性（Ｕ／Ｌ）およびイ
ソ酵素／総酵素の百分率（％）をプロットしたグラフで
ある。
１０、２１ 固体担体 １１ 第１の抗体 １２、２３ 生化学的標識 １３ 第２の抗体 １４ 酵素末端 １５ 抗体−酵素結合体 １６ 生化学的試薬 １７、２５ 生成物 ２２ 抗体 ２４ 試薬
Claims (25)
- 【請求項１】 複数の種類の抗体、複数のマイクロタイ
タープレートウェルを有し、各マイクロタイタープレー
トウェルには複数の種類の抗体のうちの多くとも１種が
固定されているマイクロタイタープレートおよび血清中
の複数の生化学的標識を測定するために用いられる複数
の種類の試薬からなる急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項２】 さらにミオグロビン−乳酸デヒドロゲナ
ーゼ結合体からなる請求項１記載の急性心筋梗塞診断キ
ット。 - 【請求項３】 抗体が、抗クレアチンキナーゼＭＢ抗
体、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体、抗ミオグロビン抗
体、抗脂肪酸結合タンパク質抗体、抗グリコーゲンホス
ホリラーゼＢＢ抗体、抗カルボニックアンヒドラーゼII
I抗体、抗クレアチンキナーゼＭＢ1抗体、抗クレアチン
キナーゼＭＢ2抗体、抗クレアチンキナーゼＭＭ1抗体、
抗クレアチンキナーゼＭＭ2抗体および抗クレアチンキ
ナーゼＭＭ3抗体からなる群より選ばれる請求項１記載
の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項４】 血清中の複数の生化学的標識が、クレア
チンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリコーゲンホ
スホリラーゼＢＢおよびカルボニックアンヒドラーゼII
Iからなる群より選ばれる請求項１記載の急性心筋梗塞
診断キット。 - 【請求項５】 複数の種類の試薬が分光光度計の同じ測
定波長を有する請求項１記載の急性心筋梗塞診断キッ
ト。 - 【請求項６】 複数の種類の試薬が、クレアチンキナー
ゼおよびクレアチンキナーゼのイソ酵素を検出するため
に用いられる第１の試薬、乳酸デヒドロゲナーゼおよび
乳酸デヒドロゲナーゼのイソ酵素を検出するために用い
られる第２の試薬およびグルタミン酸−オキザロ酢酸ト
ランスアミナーゼを検出するために用いられる第３の試
薬からなる請求項３記載の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項７】 第１の試薬が、リン酸クレアチン、ＡＤ
Ｐ、グルコース、ヘキソースキナーゼ、ＮＡＤＰ+およ
びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる請
求項６記載の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項８】 第２の試薬が、ピルビン酸ナトリウムお
よびＮＡＤＨからなる請求項６記載の急性心筋梗塞診断
キット。 - 【請求項９】 第３の試薬が、アスパラギン酸塩、α−
ケトグルタル酸塩、ＮＡＤＨおよびリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼからなる請求項６記載の急性心筋梗塞診断キッ
ト。 - 【請求項１０】 抗体が固定されているマイクロタイタ
ープレートウェルがタンパク質でブロックされる請求項
１記載の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項１１】 マイクロタイタープレートウェルに抗
クレアチンキナーゼＭＢ抗体が１０μｌ／ｍｌ程度の濃
度、約１００μｌの体積および９６時間程度の時間で固
定される請求項３記載の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項１２】 マイクロタイタープレートウェルに抗
乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体が１０μｌ／ｍｌ程度の濃
度、約１００μｌの体積および７２時間程度の時間で固
定される請求項３記載の急性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項１３】 マイクロタイタープレートウェルに抗
クレアチンキナーゼ抗体を固定するためのインキュベー
ション時間が３０分間程度である請求項３記載の急性心
筋梗塞診断キット。 - 【請求項１４】 マイクロタイタープレートウェルに抗
乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体を固定するためのインキュ
ベーション時間が１５分間程度である請求項３記載の急
性心筋梗塞診断キット。 - 【請求項１５】 急性心筋梗塞の患者の血清中の生化学
的標識と結合しうる複数の種類の抗体を提供する工程、
各固体担体には多くとも１種の該抗体が固定されている
複数の固体担体を提供する工程、該抗体と結合しない不
純物を取り除く工程、複数の固体担体に複数の各試薬を
添加する工程、および各抗体と結合した血清中の生化学
的標識の活性を測定する工程からなる急性心筋梗塞を診
断するための方法。 - 【請求項１６】 抗体が、抗クレアチンキナーゼＭＢ抗
体、抗乳酸デヒドロゲナーゼＩ抗体、抗ミオグロビン抗
体、抗脂肪酸結合タンパク質抗体、抗グリコーゲンホス
ホリラーゼＢＢ抗体、抗カルボニックアンヒドラーゼII
I抗体、抗クレアチンキナーゼＭＢ1抗体、抗クレアチン
キナーゼＭＢ2抗体、抗クレアチンキナーゼＭＭ1抗体、
抗クレアチンキナーゼＭＭ2抗体および抗クレアチンキ
ナーゼＭＭ3抗体からなる群より選ばれる請求項１５記
載の急性心筋梗塞を診断するための方法。 - 【請求項１７】 複数の固体担体がマイクロタイタープ
レートである請求項１５記載の急性心筋梗塞を診断する
ための方法。 - 【請求項１８】 さらにタンパク質で複数の固体担体を
ブロックする工程からなる請求項１５記載の急性心筋梗
塞を診断するための方法。 - 【請求項１９】 さらに血清の複数の部分のうちの１つ
の部分へミオグロビン−乳酸デヒドロゲナーゼを添加す
る工程からなる請求項１５記載の急性心筋梗塞を診断す
るための方法。 - 【請求項２０】 複数の種類の試薬が、クレアチンキナ
ーゼおよびクレアチンキナーゼのイソ酵素を検出するた
めに用いられる第１の試薬、乳酸デヒドロゲナーゼおよ
び乳酸デヒドロゲナーゼのイソ酵素を検出するために用
いられる第２の試薬およびグルタミン酸−オキザロ酢酸
トランスアミナーゼを検出するために用いられる第３の
試薬からなる請求項１５記載の急性心筋梗塞を診断する
ための方法。 - 【請求項２１】 複数の種類の試薬が分光光度計の同じ
測定波長を有する請求項１５記載の急性心筋梗塞を診断
するための方法。 - 【請求項２２】 第１の試薬が、リン酸クレアチン、Ａ
ＤＰ、グルコース、ヘキソースキナーゼ、ＮＡＤＰ+お
よびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる
請求項２０記載の急性心筋梗塞を診断するための方法。 - 【請求項２３】 第２の試薬が、ピルビン酸ナトリウム
およびＮＡＤＨからなる請求項２０記載の急性心筋梗塞
を診断するための方法。 - 【請求項２４】 第３の試薬が、アスパラギン酸塩、α
−ケトグルタル酸塩、ＮＡＤＨおよびリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼからなる請求項２０記載の急性心筋梗塞を診断
するための方法。 - 【請求項２５】 血清中の生化学的標識の活性を吸光度
の経時変化により推定する請求項１５記載の急性心筋梗
塞を診断するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW85105768 | 1996-05-15 | ||
| TW85105768 | 1996-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09304393A true JPH09304393A (ja) | 1997-11-28 |
Family
ID=21625244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20736896A Pending JPH09304393A (ja) | 1996-05-15 | 1996-08-06 | 急性心筋梗塞診断キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09304393A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010532484A (ja) * | 2007-06-29 | 2010-10-07 | コレロジック システムズ，インコーポレイテッド | 卵巣癌のための予測マーカー |
| JP2013508682A (ja) * | 2009-10-15 | 2013-03-07 | ロベルト・ボッシュ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | マルチサイト式バイオセンサーおよびそれに関する方法 |
| JP2019514009A (ja) * | 2016-04-13 | 2019-05-30 | ノヴァメド リミテッド | １ステップ心臓検査デバイス |
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-
1996
- 1996-08-06 JP JP20736896A patent/JPH09304393A/ja active Pending
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| US9927435B2 (en) | 2009-10-15 | 2018-03-27 | Robert Bosch Gmbh | Multisite biosensor and associated method |
| JP2019514009A (ja) * | 2016-04-13 | 2019-05-30 | ノヴァメド リミテッド | １ステップ心臓検査デバイス |
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