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JPH09117286A - ウレアーゼ活性を有するタンパク質又は該タンパク質に対する抗体を含有する組成物 - Google Patents

ウレアーゼ活性を有するタンパク質又は該タンパク質に対する抗体を含有する組成物

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JPH09117286A
JPH09117286A JP8120532A JP12053296A JPH09117286A JP H09117286 A JPH09117286 A JP H09117286A JP 8120532 A JP8120532 A JP 8120532A JP 12053296 A JP12053296 A JP 12053296A JP H09117286 A JPH09117286 A JP H09117286A
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JP
Japan
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protein
pylori
sequence
urease
fragment
Prior art date
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JP8120532A
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Inventor
Agnes Labigne
アニエス・ラビーニユ
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Institut Pasteur filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of JPH09117286A publication Critical patent/JPH09117286A/ja
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 人体及び環境中で、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉをｉｎ
ｓｉｔｕで検出し、その病原能（該細菌は人体で活性
な胃炎に関与すると考えられる）を検査するには、この
細菌の培養が困難であるという問題がある。 【解決手段】 Ｃ．ｐｙｌｏｒｉでウレアーゼの産生に
関与する遺伝子を同定し、遺伝子内フラグメントのヌク
レオチド配列を決定することにより、同細菌の特異的同
定のための検出用プローブとして使用可能なツールを取
得した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はCampylobacter pyloriで天然に発
現されるようなウレアーゼをコードするヌクレオチド配
列、及び特に人体又は環境中におけるC.pyloriの検出の
ための、該ヌクレオチド配列の生物学的適用に係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】C.pylo
riは今日、人体の胃の腔部分の粘膜の表面、より特定的
には胃及び十二指腸潰瘍の病変部及びクレーターの周囲
のみに見いだされるグラム陰性菌である。人口の25％は
C.pyloriの保菌者であり、そのうち8 ％は潰瘍患者、9
％は非潰瘍性の消化不良患者、8 ％は無症候保菌者であ
る。
【０００３】今日単離及び報告されている全C.pyloriは
次の3 つの特性を有する。
【０００４】該細菌は高い活性を有するウレアーゼを産
生する。
【０００５】該細菌は胃の粘膜の上皮細胞に非常に強く
密着し、この特性はin vitroでヒーラー細胞に非常に強
く密着することを意味する。
【０００６】C.pyloriは、粘液を分解し、従って胃粘膜
を保護する自然障壁を弱めるタンパク分解活性を有する
酵素を産生及び放出する。
【０００７】しかしながら、人体及び環境中でC.pylori
をin situ で検出し、その病原能（該細菌は人体で活性
な胃炎に関与すると考えられる）を検査するには、この
細菌の培養が困難であるという問題がある。
【０００８】該細菌は増殖速度が非常に遅く（血液寒天
培地で 6〜7 日）、微好気性条件で増殖しなければなら
ず、空気中の酸素は有毒である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの細菌の
検出手段を研究した結果、C.pyloriでウレアーゼの産生
に関与する遺伝子を同定するに至った。
【００１０】遺伝子内フラグメントのヌクレオチド配列
を決定することにより、C.pyloriの特異的同定のための
検出用プローブとして使用可能なツールを取得するに至
った。
【００１１】従って、本発明の目的は、C.pyloriで発現
されるようなウレアーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドすることが可能な新規ヌクレオチド配列を提供するこ
とである。
【００１２】本発明の別の目的は、C.pyloriの検出用プ
ローブとして使用可能なこの配列のフラグメントを提供
することである。
【００１３】本発明の更に別の目的は、C.pyloriで発現
されるようなウレアーゼ活性を有する高純度のタンパク
質、及びこのタンパク質のフラグメントを提供すること
である。
【００１４】本発明のヌクレオチド配列は、C.pyloriで
発現されるようなウレアーゼ活性を有するタンパク質を
コードする配列の少なくとも一部を含むことを特徴とす
る。
【００１５】本発明のより特定的な目的は、Denhardt媒
質（1 ％Ficoll、1 ％ポリビニルピロリドン、1 ％ウシ
血清アルブミン）中、68℃、6 ×SSC （1 ×SSC は0.15
M のNaClと0.015Mのクエン酸ナトリウムpH7 とから構成
される）の条件下で、C.pyloriで発現されるようなウレ
アーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とハ
イブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を提供
することである。
【００１６】本発明の別の態様によるとヌクレオチド配
列は、夫々C.pyloriで発現されるようなウレアーゼ活性
を有するタンパク質又は該タンパク質のフラグメントに
対する抗体との間で免疫複合体を形成することが可能
な、ウレアーゼ活性を有するタンパク質又はそのフラグ
メントの産生に必要な情報を担持することを特徴とす
る。
【００１７】本発明の配列は更に、Eco R Ｉ（Cla Ｉ、
Bam H Ｉ）-Pst Ｉ（Hind III）制限フラグメントに対
応する約8kb のフラグメントの少なくとも一部を含むこ
とを特徴とする。
【００１８】このフラグメントの酵素制限地図を第１図
Ｂに示す。
【００１９】特に好適な配列は、第１図ＢのH2部位から
約0.55kb上流、及び第１図ＢのB2部位から約0.7kb 下流
に夫々配置された末端ヌクレオチドにより画定される約
4.2kb （±5 ％）のフラグメントの少なくとも一部を含
む。
【００２０】尚、第１図Ｂ中のB1，B2，B3は制限酵素Ba
m H Ｉによる切断部位を示すものである。
【００２１】このフラグメントにより構成される配列
は、C.pyloriで天然に発現されるようなウレアーゼ活性
を有するタンパク質の発現に必要な情報を担持する。
【００２２】これらの配列の発現は、これらの配列に担
持される情報を利用することが可能な他の全微生物、特
にウレアーゼ活性を有するタンパク質の産生をコードす
る遺伝子を元々欠失するCampylobacter 株（又はウレア
ーゼ - campylobacter 株）で生じ得る。
【００２３】更に別の態様によると、本発明は上記配列
の1 つと、場合により該配列の転写を調節することが可
能なプロモーター及び転写終結信号をコードするDNA 配
列とを組み合わせて含む組換体配列に係る。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明のヌクレオチド配列は、ヌ
クレオチド連鎖（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
【００２６】又はヌクレオチド連鎖（II）：
【００２７】
【化２】
【００２８】又はヌクレオチド連鎖（II bis）：
【００２９】
【化３】
【００３０】又は上記連鎖（Ｉ）、（II）及び（II bi
s）に夫々相補的なヌクレオチド連鎖を有する配列から
形成されたプローブとハイブリダイズすることが可能で
あることを特徴とする。
【００３１】本発明のヌクレオチド配列は、上記ヌクレ
オチド連鎖を含むか又は該連鎖の少なくとも一部により
構成されることを特徴とする。
【００３２】当然のことながら、このような配列から作
成されるプローブがC.pyloriのウレアーゼ活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子の存在を認識する能力に
関して特徴的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレ
オチド配列の塩基は遺伝子中に見いだされる順序と異な
る順序でもよく、及び／又はこれらの塩基は場合により
置換されてもよい。
【００３３】対応するRNA の酵素的逆転写又は化学的合
成により得られるような上記ヌクレオチド連鎖の配列と
ハイブリダイズ可能な全ヌクレオチド配列も本発明の範
囲に含まれる。
【００３４】本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、次の
アミノ酸配列（III ）：
【００３５】
【化４】
【００３６】の少なくとも一部に対応するヌクレオチド
配列にも係る。
【００３７】本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、（ヌ
クレオチド配列（IIbis)によりコードされる）次のアミ
ノ酸配列（IV）：
【００３８】
【化５】
【００３９】の少なくとも一部に対応するヌクレオチド
配列にも係る。
【００４０】本発明は更に、適当な宿主を形質転換する
ことが可能な発現及びクローニング用組換体ベクターに
も係り、該ベクターは上記のようなヌクレオチド配列を
発現させることが可能な調節成分の制御下で該ヌクレオ
チド配列の少なくとも一部を含む。
【００４１】好適な組換体ベクターは、上記の約4.2kb
の配列の少なくとも一部を含む。
【００４２】微生物の形質転換株も本発明の範囲に含ま
れる。これらの株は上記ヌクレオチド配列の1 つ又は上
記組換体ベクターを含む。
【００４３】1988年8 月16日付けで寄託番号I-795 でパ
リ（フランス）、パスツール研究所のCollection Natio
nale de Culture de Microorganismes（C.N.C.M.）に寄
託された大腸菌株S17-1 は、上記の約8kb の制限フラグ
メントEcoRＩ（Cla Ｉ、BamH Ｉ）-Pst Ｉ（Hind II
I）を含む約16.3kbのプラスミドpILL590 を担持する。
【００４４】本発明は更に、C.pyloriで天然に発現され
る型のウレアーゼ活性を有するタンパク質、及び該タン
パク質のペプチドフラグメントにも係る。
【００４５】本発明のタンパク質及びそのフラグメント
は、汎用遺伝暗号に従い上記ヌクレオチド配列、特に約
4.2kb の配列の少なくとも一部に対応する。
【００４６】本発明のタンパク質は更に、宿主細胞を上
記のような組換体ベクターにより形質転換し、形質転換
した宿主細胞を適当な培地で培養し、これらの細胞から
又は直接培養培地からタンパク質を回収することにより
得られるようなタンパク質であることを特徴とする。こ
の方法によるウレアーゼ又はそのフラグメントの製造も
本発明の一部を構成する。
【００４７】本発明のタンパク質及び、同様に化学的合
成により得られるそのフラグメントは、有利には高純度
を有しており、常法に従ってポリクローナル抗体を形成
するために使用される。
【００４８】上記タンパク質及びそのフラグメントを特
異的に認識することが可能なこのようなポリクローナル
抗体及びモノクローナル抗体も本発明の目的を構成す
る。
【００４９】上記ヌクレオチド配列は遺伝子工学の常法
に従い、C.pyloriでウレアーゼ活性を有するタンパク質
の合成に関与する遺伝子のクローニング及び同定により
得られる。
【００５０】本発明はヌクレオチド配列、対応するタン
パク質及びモノクローナル又はポリクローナル抗体の生
物学的適用にも係る。
【００５１】これらの適用は、遺伝子内フラグメントか
らのC.pyloriの検出用プローブの作成も含む。この作成
は特に、プローブとして使用可能な1 重鎖配列を得るた
めに2 重鎖配列を変性させる段階を含む。
【００５２】種々のCampylobacter 及び異なる属に含ま
れる微生物に場合により存在する相補配列を検出するた
めにこのようなフラグメントを用いて試験を行った処、
これらのフラグメントの高い特異性が明らかになった。
【００５３】従って、本発明は上記ヌクレオチド配列の
少なくとも一部を含むことを特徴とする検出用プローブ
にも係る。
【００５４】C.pyloriのゲノムにハイブリダイズする特
性を改変しないようなヌクレオチドを置換又は変更によ
ってのみヌクレオチド配列レベルで前記プローブから区
別される全プローブは本発明の範囲に含まれる。
【００５５】プローブとして使用されるDNA フラグメン
トは、必要な特異性及び安定なハイブリッドの形成を得
るために十分な数のヌクレオチドを含む。
【００５６】何kbにも達するフラグメントを使用するこ
とが可能であるが、より短い約25〜40ヌクレオチドのフ
ラグメントを用いても高特異性の結果が得られる。
【００５７】この型の検出に適当なプローブは、有利に
は放射性元素又は被験DNA を含む試料とハイブリダイズ
した状態で認識することが可能な他の任意の基により標
識される。
【００５８】常法に従い、プローブのヌクレオチド配列
と被験物質中に場合により含まれる相補的配列とのハイ
ブリダイゼーションが可能な条件下で、これらのプロー
ブを細菌を含む生物学的試料、又は直接これらの細菌も
しくはその核酸と接触させる。
【００５９】例えばブロットハイブリダイゼーション法
を使用することができる。この方法は、腔生検に由来す
る細菌から予め採取したDNA を変性後、このDNA のアリ
コート量をニトロセルロースメンブラン上に置く段階
と、通常条件下で各メンブランをプローブにハイブリダ
イズさせる段階と、形成されたハイブリッドを常法で検
出する段階とを含む。
【００６０】サザン法に従ってレプリカハイブリダイゼ
ーション法を使用することもできる。この方法は、DNA
を制限酵素により処理した後に形成されるDNA フラグメ
ントをアガロースゲル中で電気泳動により分画する段階
と、アルカリ変性後に適当なメンブランに移す段階と、
通常条件下でメンブランをプローブにハイブリダイズさ
せる段階とを含む。必ずしもDNA を予め発現させる必要
はない。DNA をプローブに接触できるようにすれば十分
である。
【００６１】C.pyloriの特異的同定のための検出は同様
に、DNA 増幅法（PCR ）により実施することもできる。
これらの方法は特にCetus Corporation 名義の米国特許
第4683202 及び4683195 号に記載されている。
【００６２】これらの方法を実施するためには10〜40ヌ
クレオチド、有利には約20ヌクレオチドから成る2 つの
プライマーを使用し、これらのプライマーは上記ヌクレ
オチド配列の1 つに含まれるか又は上記ヌクレオチド配
列もしくはその相補的配列の1 つの一部とハイブリダイ
ズすることが可能である。有利には、これらのプライマ
ーは増幅すべきDNA の鎖にハイブリダイズ（又は結合）
するとき、相互に約200 〜250 ヌクレオチドの間隔で配
置される。一方の配列は増幅すべきDNA フラグメントの
一方の鎖のヌクレオチド配列に結合することが可能であ
り、この配列はこのフラグメントの一方の末端（例えば
5'末端）のレベルに配置され、他方の配列は増幅すべき
DNA フラグメントの第２の鎖のヌクレオチド配列に結合
することが可能であり、この配列は上記末端と反対側の
このフラグメントの末端（提案例ではこの末端を同様に
3'末端と呼称する）のレベルに配置される。
【００６３】好適なプライマーは第１図ＢのH2〜H3制限
フラグメントのヌクレオチド配列に含まれ、相互に約 2
00〜250 ヌクレオチドの間隔で配置される。
【００６４】特に、該プライマーはこの制限配列HindII
I-Hind IIIの各末端に夫々位置するフラグメントであ
る。
【００６５】生物学的試料中に場合により存在するC.py
loriのin vitro検出方法は、該試料中に含まれ得るヌク
レオチド配列の一方の鎖の5'末端と該ヌクレオチド配列
の他方の鎖の3'末端とに夫々結合することが可能な上記
のようなプライマーに該試料を接触させ、その後、DNA
ポリメラーゼ及び4 種のヌクレオシド三リン酸dATP、dC
TP、dGTP、dTTPの存在下で遺伝子増幅し、これらのプラ
イマーハイブリダイゼーション及び遺伝子増幅操作を複
数回繰り返すことにより、該ヌクレオチド配列の量を場
合により予め増幅する段階と、本発明のヌクレオチドプ
ローブと該ヌクレオチド配列との間で形成されるハイブ
リダイゼーション複合体を産生し得る条件下で、該当生
物学的試料を該ヌクレオチドプローブと接触させる段階
と、ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階とを
含む。
【００６６】従って、本発明は培養を実施する必要なく
迅速にin situ 及び環境中で高特異性でC.pyloriを検出
することが可能なツールを提供する。
【００６７】このような検出用ツールは、これらの細菌
の天然源、感染方法、伝播方法及び汚染方法を調査する
ために特に有用である。また、生検で実施されるin vit
ro診断においてこれらのプローブを使用すると、専門機
関でなければ実施できないような技術を必要とする現状
の方法、即ち細菌学的方法又は電子顕微鏡を使用する方
法に比較して大幅な時間の利得が得られる。
【００６８】上記約8kb のフラグメントを遺伝子内プロ
ーブとして使用することにより、再現可能な結果が得ら
れた。
【００６９】これらのプローブはC.pyloriに対する特異
性を有するので、同様に非常に有利なツールを構成す
る。
【００７０】従って、感染を予防するようにC.pyloriの
病原能を調査するために、潰瘍疾病の発生においてC.py
loriが果たす役割を調査することが可能であり、また、
動物モデルで試験され得るC.pyloriの等遺伝子突然変異
体（即ち感染の病理発生に役割を果たすと思われる決定
基の各々を遺伝的に改変した細菌）をin vitroで形成で
きるように、この細菌の病原能に関与していると思われ
る遺伝的決定基を同定することが可能である。
【００７１】本発明は更に、上記ヌクレオチドプローブ
及び適当な制限酵素による、C.pyloriでウレアーゼをコ
ードする遺伝子の多形性の検出にも係る。この検出を実
施する条件は、J. of Clin. -investigations （198
6）,77, 1723-1726に所収のGusella J.F.の論文中によ
り詳細に記載されている。
【００７２】本発明は、特に特異的抗血清並びにポリク
ローナル及びモノクローナル抗体の製造のための、コー
ド化タンパク質の免疫学的適用にも係る。ポリクローナ
ル抗体は常法に従い、動物にタンパク質を注入し、抗血
清を回収した後、例えばアフィニティクロマトグラフィ
ーにより抗血清から抗体を回収することにより形成され
る。
【００７３】モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を
本発明のタンパク質により予め免疫した動物の脾細胞と
融合することにより常法通りに製造される。
【００７４】本発明は更に、C.pyloriを含有し得る生物
学的試料中に場合により存在するC.pyloriのin vitro検
出方法にも係る。該方法は、C. pylori により産生され
るウレアーゼ活性を有するタンパク質の全部又は一部と
本発明の抗体との間に形成される免疫複合体を産生し得
る条件下で、試料を該抗体と接触させる段階と、免疫複
合体を検出する段階とを含む。
【００７５】ヌクレオチドプローブの使用に基づく上記
in vitro検出方法を実施するためには、場合により少な
くとも1 対の本発明のプライマーと、所定量の本発明の
ヌクレオチドプローブと、有利な要素として検出すべき
配列とプローブとの間のハイブリダイゼーション反応の
形成に夫々適当な媒質と、有利な要素としてハイブリダ
イゼーション反応時にヌクレオチド配列とプローブとの
間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出を
可能にする試薬とを含む装置又はキットを利用すると有
利である。
【００７６】抗体の使用に基づく上記in vitro検出方法
を実施するためには、所定量の本発明の抗体と、有利な
要素として、C. pylori 株により産生されるウレアーゼ
活性を有するタンパク質の少なくとも一部と抗体との間
の免疫反応の形成に適当な媒質と、有利な要素として、
免疫反応時にウレアーゼ活性を有するタンパク質の少な
くとも一部と抗体との間に形成される免疫複合体の検出
を可能にする試薬とを含む装置又はキットを利用すると
有利である。
【００７７】上記4.2kb のフラグメントを精査した結
果、C.pyloriのウレアーゼの主要なポリペプチドサブユ
ニットをコードする構造の遺伝子を位置決定することが
できた。
【００７８】この調査は、ウレアーゼを合成することが
できない大腸菌及びC.jejuniに導入した組換体プラスミ
ドで突然変異体を構築することにより実施した（Basker
ville-A, Newell D.（1988）, Gut.29, 465-472 ）。大
腸菌のin vitro転写- 翻訳系及びミニ細胞発現系を使用
してウレアーゼのサブユニットをコードする遺伝子全体
をC.pyloriの4.2kb フラグメント中で同定及び位置決定
した。26kDa 及び61kDa の2 つの主要なタンパク質が同
定された。同時に、4.2kb のフラグメントに種々の欠失
を形成後、大腸菌からC.jejuni株への接合による伝達系
（伝達系の型については以下の詳細な説明を参照された
い）を使用して、ウレアーゼ活性の発現に不可欠な領域
を同定し、領域の欠失をポリペプチドの消失及びウレア
ーゼ活性に相関させた。この結果、ウレアーゼ活性の発
現に必要な2 つのポリペプチドをコードする遺伝子は、
第１図ＢのH3部位の下流でB2にまたがる3.35kbの中心領
域に位置することが判明した。61kDa 又は26kDa のポリ
ペプチドをコードする遺伝子の転写はEcoRＩ-PstＩ方向
に行われる。3.35kbフラグメントはC.jejuniにおけるウ
レアーゼ活性の発現に必要であるが十分ではない。大腸
菌におけるポリペプチドの発現に無関係であると思われ
る上流の0.85kbの隣接領域が、C.jejuniにおけるウレア
ーゼ活性の発現に不可欠な領域である。
【００７９】in vitro転写- 翻訳による欠失突然変異体
を分析した処、26及び61kDa の2 つのポリペプチドは隣
接する2 つのDNA フラグメントによりコードされること
が判明した。
【００８０】本発明はヌクレオチド配列（Ｖ）：
【００８１】
【化６】
【００８２】の全部又は一部に係る。
【００８３】本発明はより特定的には、汎用遺伝暗号に
従い（ヌクレオチド配列（Ｖ）によりコードされる）次
の26kDa のアミノ酸配列（VI）：
【００８４】
【化７】
【００８５】（239 アミノ酸、分子量26522 ダルトン）
の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチド配列に係
る。
【００８６】本発明は更に、ヌクレオチド配列（VII
）：
【００８７】
【化８】
【００８８】の全部又は一部に係る。
【００８９】本発明はより特定的には汎用遺伝暗号に従
い（ヌクレオチド配列（VII ）によりコードされる）次
の61kDa のアミノ酸配列（VIII）：
【００９０】
【化９】
【００９１】（569 アミノ酸、分子量61729 ダルトン）
の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチド配列に係
る。
【００９２】アミノ酸配列VIIIを特にEur. J. Biochem
175, 151-165（1588）に記載されているインゲンマメ
（タチナタマメ）ウレアーゼのアミノ酸配列と比較した
処、意外にも高いレベルのアミノ酸相同性が判明した。
このように構造が維持されることから、本発明者らは上
記配列VIIIの206 及び338 位に位置するアミノ酸により
画定されるポリペプチド配列中に完全に又は部分的に含
まれる61kDa のウレアーゼサブユニットの活性部位を推
定することができた。
【００９３】本発明は更に、配列Ｖ及び配列VII から連
続的に構成されるヌクレオチド配列IXの全部又は一部に
も係る。
【００９４】本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、配列
VI及び配列VIIIから連続的に構成される87kDa のアミノ
酸配列（Ｘ）の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチ
ド配列にも係る。
【００９５】本発明は更に、生物学的試料中に場合によ
り存在するC. pylori の検出用プローブに係り、該プロ
ーブは上記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むこ
とを特徴とする。
【００９６】自明のことながら、このような配列から作
成されるプローブがC.pyloriのウレアーゼ活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子の存在を認識する能力に
関して特徴的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレ
オチド配列の塩基は遺伝子に見いだされる順序と異なる
順序であってもよく及び／又はこれらの塩基は場合によ
り、置換されてもよい。
【００９７】対応するRNA の酵素的逆転写又は化学的合
成により得られるような上記ヌクレオチド連鎖の配列と
ハイブリダイズすることが可能な全ヌクレオチド配列も
本発明の範囲に含まれる。
【００９８】C.pyloriのゲノムにハイブリダイズする形
質を変えないようなヌクレオチド置換又は変更によって
のみヌクレオチド配列のレベルにおいて上記プローブか
ら区別される全プローブも本発明の範囲に含まれる。
【００９９】該プローブは上記生物学的試料中に場合に
より存在するC.pyloriのin vitro診断法で使用可能であ
る。
【０１００】本発明は更に、約10〜約40ヌクレオチドの
ヌクレオチドプライマーにも係り、これらのプライマー
は上記ヌクレオチド配列Ｖ又はVII の1 つ（又はこれら
の配列Ｖ及びVII から誘導される配列の1 つ）に含まれ
るか、又は（特に上記ハイブリダイゼーション条件下
で）上記ヌクレオチド配列の一部もしくはその相補的配
列にハイブリダイズすることが可能である。
【０１０１】本発明は更に、上記方法に従い生物学的試
料中に含まれ得るC.pyloriのヌクレオチドの量を予備増
幅するための、上記in vitro診断法におけるこれらのプ
ライマーの使用に係る。
【０１０２】本発明は更に、上記ヌクレオチド配列Ｖ、
VII 及びIX又はこれらの配列から誘導されるヌクレオチ
ド配列の全部又は一部を含む適当な宿主細胞を形質転換
することが可能な発現用及びクローニング用組換体ベク
ターにも係る。
【０１０３】本発明は更に、上記配列VI、VIII及びＸの
全部又は一部に対応するタンパク質の製造方法にも係
り、該方法は適当な宿主細胞（特に上記宿主細胞）を上
記ベクターにより形質転換させる段階と、こうして生成
されたタンパク質を回収する段階と、場合によりこれら
のタンパク質を精製する段階とを含むことを特徴とす
る。
【０１０４】上記タンパク質の製造方法は場合により、
生成すべきタンパク質をコードする遺伝子を予備増幅す
る段階を含み、該段階は上記方法に従い本発明のプライ
マー対を用いて実施される。
【０１０５】本発明は更に、上記ヌクレオチド配列によ
りコードされるポリペプチド（又はタンパク質）にも係
る。特に本発明は、上記87kDa のアミノ酸配列Ｘ、26kD
a の配列VI及び61kDa の配列VIII並びにそれらのフラグ
メントにも係る。
【０１０６】本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又
は一部から得られ且つ該ポリペプチドとの間で免疫複合
体を形成することが可能なポリクローナル及びモノクロ
ーナル抗体に係る。
【０１０７】本発明は特に、配列VI又は配列VIIIの少な
くとも約10〜15個のアミノ酸のペプチド配列を用いて得
られる抗体、特にモノクローナル抗体に係る。
【０１０８】本発明の好適なモノクローナル抗体は、配
列VIIIの206 及び338 位に位置するアミノ酸により画定
される配列の全部又は一部に特異的であり、より特定的
には配列VIIIの206 及び338 位に位置するアミノ酸によ
り画定される配列に由来する少なくとも約10〜15個のア
ミノ酸のペプチド配列により得られる抗体である。
【０１０９】本発明は更に、in vitro診断法を実施する
ため、及び上記のようなC.pyloriによる個体の感染のin
vitro診断用キットにおける上記抗体の使用に係る。
【０１１０】本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又
は一部、より特定的には配列VIIIの206 及び338 位に位
置するアミノ酸により画定されるポリペプチド配列の全
部又は一部を医薬上許容可能なビヒクルと組み合わせて
含む免疫学的組成物にも係る。
【０１１１】このような免疫学的組成物はC.pyloriによ
る個体の感染の予防用ワクチン組成物として使用可能で
ある。
【０１１２】本発明は更に、上記のような抗体、より特
定的には配列VIIIの206 及び338 位に位置するアミノ酸
により画定されるペプチド配列の全部又は一部との間で
免疫複合体を形成することが可能な1 又は複数の抗体
を、医薬上許容可能なビヒクルと組み合わせて含む医薬
組成物にも係る。
【０１１３】本発明のこのような医薬組成物は、C.pylo
riによる個体の感染に結び付けられる病理、特に胃炎並
びに胃及び十二指腸潰瘍の治療に使用可能である。
【０１１４】本発明の他の利点及び特徴については、C.
pyloriでウレアーゼ活性を有するタンパク質の産生に関
与する遺伝子のクローニング、ウレアーゼ活性を有する
タンパク質の発現に関連する領域の配列決定、及びC.py
loriの検出のためのヌクレオチドプローブの特異性に関
する以下の記載に報告する。
【０１１５】この記載は第１図Ａ及び第１図Ｂを参照す
るものであり、第１図ＡはC.jejuniでウレアーゼを発現
するのに必要な情報を担持する組換体コスミドIID2のPs
t Ｉ-EcoR Ｉフラグメントの制限地図、第１図ＢはpILL
590 の約8kb のフラグメントの制限地図である。
【０１１６】1) コスミドシャトルベクターにおけるゲ
ノムバンクの作成。C.pyloriでウレアーゼの産生に関与
する遺伝子のクローニング。
【０１１７】高分子量のDNA フラグメントを形成するよ
うにC.pylori株(85P）の染色体DNAを調製し、この染色
体DNA 約 300μg を制限エンドヌクレアーゼSau 3Aで制
御下に部分的消化し、ショ糖勾配に重層し、35〜45kbの
消化フラグメントを選択的に単離した。エンドヌクレア
ーゼBam H Ｉにより直鎖化し且つ脱ホスホリル化したコ
スミドシャトルベクターpILL575 に、これらのフラグメ
ント1.5μg をin vitroで連結した。pILL575 は、Labig
ne-Roussel 他によりJ. Bacteriol. 169:5320-5323, 19
87 に記載されているシャトルコスミドpILL550 から構
築し、pILL550にλファージのcos 部位を挿入（pILL550
のPvu II部位にpERG153 の1.7kb のBgl IIフラグメン
トを挿入）したものであり、従って接合により自己増殖
可能であり、大腸菌及びCampylobacter で同時に発現さ
れるカナマイシン耐性（Kmr ）をコードし、大腸菌のみ
で機能的な複製起点とCampylobacter のみで機能的な複
製起点との2 つの複製起点の存在により大腸菌及びC.je
juniで同時に複製する。この連結産物をλ粒子にin vit
roパッケージングし、その後、組換体コスミドの伝達基
をトランス配置で相補うことが可能なプラスミドIncPを
棲息させる大腸菌株に該連結産物をトランスフェクショ
ンにより導入した。感染させたカナマイシン耐性の大腸
菌コロニーをすぐに個々に−80℃に維持し、約500 個の
独立したクローンを維持することにより、Campylobacte
r pyloriのゲノムの全体を表すコスミドゲノムバンクを
大腸菌で作成した。
【０１１８】次に組換体コスミドの各々を、当然ウレア
ーゼ- であるCampylobacter jejuniC31の受容株に大腸
菌の接合により伝達した。
【０１１９】これらのカナマイシン耐性トランス接合体
の各々について、Campylobacter jejuniによりウレアー
ゼが合成されたか否かを検査した。
【０１２０】分析した106 個のコスミドから、Campylob
acter jejuni C31にウレアーゼを産生する能力を与える
遺伝子情報を担持する1 つのコスミドを単離した。組換
体コスミド（IID2）は54kbの寸法を有する。この配列上
の制限エンドヌクレアーゼPst Ｉ、BamHＩ、Sma Ｉ及び
EcoRＩによる切断部位の相対位置を第１図Ａに示す。
【０１２１】2) Campylobacter pylori でウレアーゼを
産生するために必要な遺伝子の同定。
【０１２２】8 〜15kbの部分的消化フラグメントを形成
するように、大腸菌で作成したコスミドDNA IID2からエ
ンドヌクレアーゼSau3A で部分的消化を行うことによ
り、ウレアーゼ遺伝子のサブクローニングを実施した。
大腸菌でクローニングしたハイブリッドプラスミドで、
接合による受容Campylo -bacter への伝達後にウレアー
ゼを産生する能力を与える最小のハイブリッドプラスミ
ドを調査した。
【０１２３】試験した37個のプラスミドのうち4 個のプ
ラスミド即ちpILL586 、pILL587p、ILL589及びpILL590
（第１図Ｂ）は、Campylobacter jejuniでウレアーゼを
発現するのに必要な情報を担持していた。
【０１２４】これらの4 つのハイブリッドの制限地図を
比較すると、4 つのハイブリッドに共通する4.2kb のヌ
クレオチド配列の存在が認められ、従って、この配列が
ウレアーゼの発現に必要な領域であると予想される。こ
れらの結論を立証するために、所定数の欠失を形成した
（第１図Ｂ）。
【０１２５】pILL590 からBamHＩ及びHindIII により形
成した種々の制限フラグメントが85P に存在することを
立証するために、pILL590 のEcoRＩ-PstＩフラグメント
をC.pylori85P の完全DNA とのハイブリダイゼーション
におけるプローブとして使用した。得られた結果による
と、pILL590 中に存在する8kb の配列は種々のクローニ
ング段階の間に再配置を受けていなかった。
【０１２６】3) ウレアーゼの発現に関連する領域のヌ
クレオチド配列。 H2及びH3部位の間に含まれるHindII
I フラグメントの配列は、連鎖（Ｉ）の294 ヌクレオチ
ドの配列に対応する。
【０１２７】次の連鎖（II）の610 ヌクレオチドの配列
は、H4及びB2部位（第１図Ｂ）により規定されるフラグ
メントの内側に位置する。
【０１２８】4) Campylobacter pylori の検出用ヌクレ
オチドプローブの特異性。
【０１２９】pILL590 に由来する8kb のEco R Ｉ-PstＩ
フラグメントを、ハイブリダイゼーション実験の放射性
プローブとして使用した。
【０１３０】32株のCampylobacter pyloriをコロニーハ
イブリダイゼーションで試験した処、陽性の徴候を得
た。試験した35株のCampylobacter jejuni、fetus 及び
coliのうちで、慣用緊縮ハイブリダイゼーション条件下
(50 ％ホルムアミド、37℃、3×SSC)で陽性の徴候を与
えるものは皆無であった。
【０１３１】いずれも天然にウレアーゼを産生する微生
物であるKlebsiella oxytoca（3 株）、Klebsiella pne
umoniae （3 株）、Proteus mirabilis （3 株）、Prot
eus morganii（3 株）、Proteus vulgaris（2 株）、Pr
ovidencia stuartii（3 株）、Pseudomonas picketti
（3 株）、Yersinia enterocolitica （3 株）、ウレア
ーゼ + Acinetobacter （5 株）、ウレアーゼ + Escheric
hia coli（2 株）及びウレアーゼ + Citrobacter freund
ii（3 株）を上記と同一の条件下で8kb のC.pyloriプロ
ーブで試験したが、陽性の徴候は認められなかった。
【０１３２】8kb フラグメントで擬似陽性は認められ
ず、従って、本発明のヌクレオチドプローブの特異性を
保証することができる。
【０１３３】抗体製造方法は、動物を上記ポリペプチド
により免疫感作する段階と、形成された抗体を常法に従
って回収する段階とを含む。
【０１３４】化学的経路による本発明の核酸（2 重鎖核
酸の場合、最大200 ヌクレチオド即ちpbを含む）の適当
な製造方法は、Bio-organic Chemistry 4; 274-325,198
6 に記載されているβ- シアノエチルホスホラミジト
（cyanethyl phosphoramidite）の自動化方法を使用す
ることによりDNA を合成する段階と、こうして得られた
DNA を適当なプラスミドベクターでクローニングし、適
当なプローブとハイブリダイズさせることによりDNA を
回収する段階とを含む。
【０１３５】200 ヌクレチオド即ちpb（2 重鎖核酸の場
合）を越える長さの核酸を化学的経路により製造する方
法の1 例は、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80; 7461-746
5, 1983 に記載されている原理に従って天然ポリペプチ
ドのアミノ酸連鎖と適合可能な配列を有する異なる制限
部位を末端に有する化学的に合成されたオリゴヌクレオ
チドを結合する段階と、こうして得られたDNA を適当な
プラスミドベクターでクローニングし、適当なプローブ
とハイブリダイズさせることにより所望の核酸を回収す
る段階とを含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図中、ＡはＣ．ｊｅｊｕｎｉでウレアーゼ
を発現するのに必要な情報を担持する組換体コスミドＩ
ＩＤ２のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの制限地図
であり、ＢはｐＩＬＬ５９０の約８ｋｂのフラグメント
の制限地図である。図中、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４及び
Ｈ５は、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部
位であり、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ制限酵素Ｂ
ａｍＨ１による切断部位である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 16/12 9/80 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/80 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/02 ＺＮＡ 33/569 Ｆ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＣＬ 33/573 ＡＣＭ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アニエス・ラビーニユ フランス国、91440・ビユーレ−シユール −イベツト、アブニユ・ボーセジユール・ 47

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Campylobacter pyloriによって発現され
    る様なウレアーゼ活性を有するタンパク質もしくは該タ
    ンパク質の一部またはそのペプチドフラグメントに対す
    る、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含有
    することを特徴とする組成物。
  2. 【請求項２】 配列VIIIの 206位〜338 位のアミノ酸に
    相当するアミノ酸配列又はアミノ酸配列の一部に対する
    抗体を含有することを特徴とする、請求項１に記載の組
    成物。
  3. 【請求項３】 Campylobacter pyloriによって発現され
    る様なウレアーゼ活性を有するタンパク質もしくは該タ
    ンパク質の一部又はそのペプチドフラグメントを含有す
    ることを特徴とする組成物。
  4. 【請求項４】 配列VIIIの 206位〜338 位のアミノ酸に
    相当するアミノ酸配列又はその一部を含有することを特
    徴とする、請求項３に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 ウレアーゼ活性を有するタンパク質の全
    体もしくは一部又はそのフラグメントを特異的に結合さ
    せるための、請求項１又は２に記載の組成物の使用。
  6. 【請求項６】 ウレアーゼ活性を有するタンパク質の全
    体もしくは一部又はそのペプチドフラグメントに対する
    特異的な抗体を産生することを可能とする、請求項３又
    は４に記載の組成物の使用。
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