JPH0867697A - 骨吸収抑制蛋白性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 骨吸収抑制作用を有する新規な蛋白性物質が
提供される。 【構成】 ニワトリ頭蓋冠のホモジナイザーより、非還
元下及び還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約
１８，５００であり優れた骨吸収抑制作用を有する蛋白
性物質が単離される。本物質は、骨粗鬆症などの骨疾患
の治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は骨吸収抑制作用を有する
ニワトリ骨細胞に由来する新規な蛋白性物質に関する。
更に詳細には、本発明は、骨粗鬆症、骨折、高カルシウ
ム血症を初めとする多くの骨疾患において破骨細胞の骨
吸収活性を抑制することにより骨代謝機能を改善する骨
疾患治療に有効な蛋白性物質に関する。特に、骨カルシ
ウムの骨からの漏出を抑制することによって骨粗鬆症の
進行を防止し、更には骨粗鬆症を治療する有効な手段と
なり得る。また、破骨細胞培養試験、臨床研究・基礎研
究における骨機能試験、本物質及び本物質の抗体・受容
体・受容体抗体を利用した臨床診断試薬・研究用試薬と
しての利用が考えられる。

【０００２】

【従来の技術】骨は加齢と共にその単位体積当りの骨量
の減少により骨粗鬆症を起こす。骨は、そのリモデリン
グ（骨改造形）即ち古い骨が吸収されそこに新しい骨が
形成されるサイクルを効率よく代謝回転して血中にカル
シウムを供給し、生体の恒常性を維持する機能（カップ
リング現象）を保有している。このバランスが崩れ骨吸
収が骨形成を上回って行われると、骨量が減少し骨粗鬆
症を起こす（Mebio ７（９）２２−２７（１９９
０）。このような代謝回転機構から骨形成を活性化する
か骨吸収を抑制することによって骨粗鬆症を治療または
予防することが出来る。骨吸収を抑制する薬剤としてカ
ルシトニン製剤が現在使用されている。しかしながら、
本薬剤は連投によるエスケープ現象（薬剤耐性化）が認
められ、さらには胃部不快感、発熱、局所痛等の多くの
副作用が高頻度で認められることが知られている（Clin
ical Calcium２ ７１６−７ ２１（１９９２））。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このようなエスケープ
現象を回避できるような、また、副作用の少ない薬剤の
開発が望まれている。本発明者らは、多くの動物の細胞
・臓器から骨吸収を抑制する物質の探索を行い、ニワト
リ頭蓋冠の骨細胞から新規の骨吸収抑制物質を取り出す
ことに成功した。従って、本発明の目的は、骨吸収抑制
作用を有する新規な生理活性物質を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため、ニワトリ頭蓋冠の骨細胞で極微量に産生
される骨吸収抑制作用を有する蛋白性因子を単離精製す
ることに成功し、本物質のＮ末端アミノ酸配列を明らか
にし本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明は、ニワトリ骨細胞に由来
し、以下の理化学的性状及び生理活性を有する蛋白性物
質である。 非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び還元下ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる推定分子量は、約１８，５００である； 骨吸収抑制作用を有する生物活性を示す； トリプシン処理により上記生物活性を失う； イオン交換樹脂、ＱセファロースにpH７．５以上で吸
着する； ０．１５ＭＮａＣｌ存在下ではヘパリンに吸着しな
い； 及び分子内Ｎ−末端に以下のアミノ酸配列を有する。

【化２】 （式中のアルファベットでＡはアラニン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｎ
はアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｔはスレオニン、Ｖは
バリンを示す。２段に表示したアルファベットは上段の
アミノ酸または下段のアミノ酸であるがどちらか特定で
きないアミノ酸を示す。）

【０００６】以下、本発明の蛋白性物質を単離精製する
工程について詳細に説明する。 (1) 本物質のニワトリ頭蓋冠からの抽出 頭蓋冠を１ｇ当たり１００ｍｌのαＭＥＭ溶液／１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄する。洗浄後上清を除去し、
細胞分離用緩衝液（０．１％コラゲナーゼ溶液）１００
ｍｌを加え、３７℃で３０分間保温する。ＰＢＳ（燐酸
緩衝液／生理食塩水）３０ｍｌで十分洗浄後、１５ｍｌ
のＰＢＳ（燐酸緩衝液／生理食塩水）を添加し試料を氷
中で冷やしながらホモゲナイザーを用いて１５krpmで１
分間攪拌する。この攪拌操作を試料を冷やしながら５回
行う。次に本溶液を遠心分離し、上清を１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（pH７．０）で透析し、その内液を抽出物質
とする。

【０００７】(2) 本物質の精製 上記抽出物質を予め１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．
０）で平衡化したＱ−セファロース・カラムに添加す
る。１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）でカラムを
洗浄し、０−１．０ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（pH７．０）で溶出する。０．１５〜０．４０ＭＮ
ａＣｌ溶出画分に骨吸収抑制活性が認められる。骨吸収
抑制活性の測定は、以後に記載する試験例の方法によっ
て行う。凍結乾燥によって濃縮し、セファデックスＧ−
５０にてゲル濾過操作を行う。分子量１０，０００〜２
０，０００の画分に骨吸収抑制活性が存在する。この画
分を凍結乾燥後少量の水に溶解し、１０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（pH７．０）で透析する。 (3) 本物質の電気泳動とＰＶＤＦ膜への転写 透析によって得られる本物質を電気泳動、即ち、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミド）によって分離す
る。ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写してクーマシー
ブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色する。 (4) 本物質のペプチド・シーケンス 予め骨吸収抑制活性と一致していることを確認してある
バンドを切り出し、プロティン・シーケンサーによって
本物質のＮ末端アミノ酸配列が決定できる。

【０００８】以上に示した工程及び以後に記述する実施
例から本発明の蛋白性物質は以下の理化学的性状及び生
理活性を有することが判る。 非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び還元下ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる推定分子量は、約１８，５００である； 骨吸収抑制作用を有する生物活性を示す； トリプシン処理により上記生物活性を失う； イオン交換樹脂、ＱセファロースにpH７．５以上で吸
着する； ０．１５ＭＮａＣｌ存在下ではヘパリンに吸着しな
い； 及び分子内Ｎ−末端に以下のアミノ酸配列を有する。

【化３】 （式中のアルファベットでＡはアラニン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｎ
はアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｔはスレオニン、Ｖは
バリンを示す。２段に表示したアルファベットは上段の
アミノ酸または下段のアミノ酸であるがどちらか特定で
きないアミノ酸を示す。）

【０００９】

【発明の効果】本発明によれば、骨吸収を抑制する新規
な蛋白性物質が提供される。本物質は骨粗鬆症・高カル
シウム血症等の骨代謝異常に基づく疾患の治療薬・予防
薬として極めて有用な手段となり得る。また、破骨細胞
培養等の基礎研究、本物質の生体内濃度を測定すること
によって骨粗鬆症機能試験等の臨床診断試薬としても有
用な手段となり得る。

【００１０】

【実施例】以下、本発明を実施例及び試験例により更に
詳細に説明する。 実施例１ 以下にニワトリ由来の骨吸収抑制物質に関する実施例を
記す。 (1) 本物質の抽出 本物質の構造を明らかにすると共に、その物理化学的性
状・生物学的性状を知るために、材料としてニワトリ
（受精１６日齢）頭蓋冠を用いた。これから蛋白を以下
の操作で抽出した。ニワトリ頭蓋冠１ｇ当り１００ｍｌ
の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液／αＭＥＭ培地（カナマイ
シン５ｍｇ／ｍｌを含む）（アーバイン社製）に浸す。
上清を除去し、細胞分離用緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ、１０ｍＭＮａＨＣＯ₃ 、１００ｍＭＮａＣｌ、３ｍ
ＭＫ₂ ＨＰＯ₄ 、１ｍＭＣａＣｌ₂ 、３０ｍＭＫＣｌ、
１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、５ｍｇ／ｍｌｇｌｃｏｓｅ、５μ
Ｍα−ＴＬＣＫ（プロテアーゼ阻害剤）で洗浄後、１ｍ
ｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含む上記細胞分離用緩衝液を
加え、３７℃で３０分間緩やかに攪拌した。ＰＢＳ（ダ
ルベッコ燐酸緩衝液）３０ｍｌで１０回洗浄した後、１
５ｍＭの１ｍｌＰＭＳＦを含む５ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮ
ａＣｌ溶液（pH７．０）を添加し、試料を氷中で冷やし
ながら、ホモゲナイザーを用いて１分間攪拌した。試料
を冷やしながらこの攪拌操作を３回行った。次に本溶液
を１０，０００×ｇで遠心し、上清を２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（pH８．０）で透析し、０．２２μｍのポアサ
イズのフィルターで濾過した。本溶液を抽出物質とし
た。かくして得られる抽出物質を２０ｍＭリン酸緩衝液
（pH７．０）／０．１５ＭＮａＣｌに溶解し、予め同溶
液にて平衡化したヘパリン−セルロファインカラムに添
加した。同溶液で洗浄し、２０ｍＭリン酸緩衝液（pH
７．０）／０．２ＭＮａＣｌで溶出したが、本物質は非
吸着画分にのみ存在し、溶出画分には存在しなかった。
骨吸収抑制活性は非吸着画分に９５％回収され、溶出画
分には回収されなかった。

【００１１】(2) 本物質の精製 上記抽出物質を予め１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．
０）で平衡化したＱ−セファロースファーストフロウ・
カラム（ファルマシア社製）に添加する。１０ｍＭトリ
ス緩衝液で未吸着物質を洗浄し、１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（pH８．０）、０Ｍから１．０ＭＮａＣｌによる直
線濃度勾配で溶出した。０．１５Ｍから０．４０ＭＮａ
Ｃｌ溶出画分に骨吸収抑制活性が認められ、Ｑ−セファ
ロース溶出画分とした。骨吸収抑制活性の測定は、以下
に示す試験例１の方法に従って実施した。このＱ−セフ
ァロース溶出画分を凍結乾燥によって濃縮し、予め０．
１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（pH
７．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−５０・
カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過操作を行った。
分子量１０，０００から２０，０００の画分に骨吸収抑
制活性が認められた。このＧ−５０ゲル濾過画分を２０
ｍＭ燐酸緩衝液（pH７．０）で４倍容量に希釈し、予め
２０ｍＭ燐酸緩衝液（pH７．０）に平衡化しておいたＭ
ｏｎｏＱ・カラム（ファルマシア社製）に添加した。２
０ｍＭ燐酸緩衝液（pH７．０）で洗浄し、未吸着物質を
得た。この未吸着画分に骨吸収抑制活性が認められた。
このＭｏｎｏＱ未吸着画分を凍結乾燥によって濃縮し、
予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ燐酸緩衝
液（pH７．０）で平衡化しておいたスーパーロース１２
・カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過操作を行っ
た。分子量１８，５００付近に、試験例１に記載するよ
うな方法に基づいて測定した結果、骨吸収抑制活性が認
められた。スーパーロース１２・カラムにて得た骨吸収
抑制物質を１μｇ／ｍｌの濃度で、１０μｇ／ｍｌのト
リブシン（シグマ社製）と５ｍＭリン酸緩衝液（pH７．
０）中で３７℃で６０分間反応させたところ、反応前に
有していた骨吸収抑制活性を消失した。

【００１２】(3) 本物質の電気泳動とＰＶＤＦ膜への転
写 スーパーロース１２ゲル濾過画分を凍結乾燥後、少量の
水に溶解し、５ｍＭ燐酸緩衝液（pH７．０）で透析し
た。透析した本物質の２−メルカプトエタノールで還元
し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳
動後、ＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド社製）に０．８ｍＡ
／ｃｍ² で２時間転写してクマシーブリリアントブルー
によって染色した。（遺伝子クローニングのためのタン
パク質構造解析ｐ４１−６２ 平野久著、１９９３年東
京化学同人社刊）。得られた結果については、図１に示
した。 (4) 本物質のペプチド・シークエンス 予め骨吸収抑制活性と一致していることを確認してある
バンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、プロティン・シーク
エンサー（アプライド・バイオ・システム社製：４７３
Ａ型）によって本物質のＮ末端アミノ酸配列を決定し
た。

【００１３】試験例１ 骨吸収抑制作用の測定 ５日齢のウサギより大腿骨及び頸骨を摘出し、少量の培
地中でハサミを用いて細切する。５％ウシ胎児血清を含
むα−ＭＥＭ（ミニマムエッセンシャルメジウム）中で
３０秒間攪拌し、３分間静置後の上清を細胞懸濁液とす
る。直径６ｍｍ、厚さ１５０μｍにスライスした象牙片
を入れた９６ｗｅｌｌプレートに、本細胞懸濁液を４×
１０⁵ ／２５０μｌ／ｗｅｌｌになるように播種する。
２時間培養後、上清を取り除き、被験物質を添加した５
％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むα−ＭＥＭを、１００
μｌ／ｗｅｌｌ加える。２４時間培養後、上清及び象牙
片上の細胞を除去し、象牙片上にできた吸収窩をアシッ
ドヘマトキシリン液で５分間染色する。染色された吸収
窩の数を顕微鏡下で計測し、被験物質無添加の対照群で
形成された吸収窩の数との比較から骨吸収抑制作用の有
無を判定する。

【００１４】実施例２ 以下に実施例１で得た本物質の生物活性について検討し
た。本物質の骨吸収抑制作用の検討 本物質を試験例１に記載の方法で測定し、１ｎｇ／ｍｌ
以上の濃度で吸収窩形成を強く抑制する作用を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】スーパーロース１２・カラム・クロマトグラフ
ィーの各画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に付した時の結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青木 真理 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 三好 敏夫 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 原 寛 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニワトリ骨細胞に由来し、以下の理化学
   的性状及び生理活性を有する蛋白性物質： 非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び還元下ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅによる推定分子量は、約１８，５００である； 骨吸収抑制作用を有する生物活性を示す； トリプシン処理により上記生物活性を失う； イオン交換樹脂、ＱセファロースにpH７．５以上で吸
   着する； ０．１５ＭＮａＣｌ存在下ではヘパリンに吸着しな
   い； 及び分子内Ｎ−末端に以下のアミノ酸配列を有する。 【化１】 （式中のアルファベットでＡはアラニン、Ｄはアスパラ
   ギン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｎ
   はアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｔはスレオニン、Ｖは
   バリンを示す。２段に表示したアルファベットは上段の
   アミノ酸または下段のアミノ酸であるどちらか特定でき
   ないアミノ酸を示す。）