JPH0854393A - 特異的結合方法および試験キット - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 １種以上の特異的結合リガンドを、各標的リ
ガンドについてのリガンドとリポーター酵素との水溶性
コンジュゲートを利用する競合イムノアッセイで検出す
ることを目的とする。 【構成】 標的リガンドは、第１レセプターに関してコ
ンジュゲートと競争する。次いで未複合化コンジュゲー
トを固定化第２レセプターと接触させて、検出可能な信
号を発生するのに使用できる反応生成物を生成する。こ
のアッセイでは、発生した信号が１種以上の標的リガン
ドに対して正比例する。
ガンドについてのリガンドとリポーター酵素との水溶性
コンジュゲートを利用する競合イムノアッセイで検出す
ることを目的とする。 【構成】 標的リガンドは、第１レセプターに関してコ
ンジュゲートと競争する。次いで未複合化コンジュゲー
トを固定化第２レセプターと接触させて、検出可能な信
号を発生するのに使用できる反応生成物を生成する。こ
のアッセイでは、発生した信号が１種以上の標的リガン
ドに対して正比例する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、競合的結合アッセイ・
フォーマットを用いる標的リガンドの迅速な特異的結合
アッセイに関する。また、本発明は、前記アッセイを実
施する際に有用な試験キットに関する。本発明は、疾病
の指標でありうる種々の特異的結合リガンドを検出して
診断するのに有用である。
フォーマットを用いる標的リガンドの迅速な特異的結合
アッセイに関する。また、本発明は、前記アッセイを実
施する際に有用な試験キットに関する。本発明は、疾病
の指標でありうる種々の特異的結合リガンドを検出して
診断するのに有用である。
【０００２】
【従来の技術】医学的研究および調査、ならびに分析お
よび診断方法において、種々の流体、例えば、生物学的
流体に存在する化学的および生物学的物質の迅速かつ正
確な測定が必要とされ続けている。例えば、治療薬、麻
薬、ホルモン、タンパク質、毒素、微生物、ウイルス、
ステロイドもしくは核酸の存在は、種々疾病もしくは状
態の有効な調査、診断または治療のために迅速かつ正確
に検出されねばならない。プロスタグランジンＥ2 （Ｐ
ＧＥ2 ）は、身体における炎症の有力な生化学的メディ
エイタである。歯肉溝流体中の高レベルのＰＧＥ2 は、
歯周疾患の指標となることが示されている。歯周疾患の
周期性により、疾患活性の正確な測定は、疾患増悪の期
間を測定するのに有用であり、かつ好ましい疾患の治療
を助けるのに有用であるだろう。ＰＧＥ2 が非常に低濃
度（ 100ナノモル濃度以下）で検出できれば、歯周疾患
の指標としてのＰＧＥ2 の臨床的有用性は最高となる。
よび診断方法において、種々の流体、例えば、生物学的
流体に存在する化学的および生物学的物質の迅速かつ正
確な測定が必要とされ続けている。例えば、治療薬、麻
薬、ホルモン、タンパク質、毒素、微生物、ウイルス、
ステロイドもしくは核酸の存在は、種々疾病もしくは状
態の有効な調査、診断または治療のために迅速かつ正確
に検出されねばならない。プロスタグランジンＥ2 （Ｐ
ＧＥ2 ）は、身体における炎症の有力な生化学的メディ
エイタである。歯肉溝流体中の高レベルのＰＧＥ2 は、
歯周疾患の指標となることが示されている。歯周疾患の
周期性により、疾患活性の正確な測定は、疾患増悪の期
間を測定するのに有用であり、かつ好ましい疾患の治療
を助けるのに有用であるだろう。ＰＧＥ2 が非常に低濃
度（ 100ナノモル濃度以下）で検出できれば、歯周疾患
の指標としてのＰＧＥ2 の臨床的有用性は最高となる。
【０００３】化学的および生物学的物質を検出するため
の多種多様な分析方法がこの10年間で開発されてきた。
そのような方法のほとんどが、「特異的結合」反応とし
て当該技術分野で既知であるものに頼っている。そのよ
うな反応では、検出しようとする未知物質（「特異的結
合リガンド」として既知である）は、対応する「レセプ
ター」分子と特異的かつ優先的に反応する。最もよく知
られている特異的結合反応は、免疫反応体、例えば、抗
体と抗原（免疫応答を生じる外因物質）の間で起こる
が、しかしまた別の特異的結合反応（例えば、アビジン
とビオチン、または糖とレクチン）も知られている。
の多種多様な分析方法がこの10年間で開発されてきた。
そのような方法のほとんどが、「特異的結合」反応とし
て当該技術分野で既知であるものに頼っている。そのよ
うな反応では、検出しようとする未知物質（「特異的結
合リガンド」として既知である）は、対応する「レセプ
ター」分子と特異的かつ優先的に反応する。最もよく知
られている特異的結合反応は、免疫反応体、例えば、抗
体と抗原（免疫応答を生じる外因物質）の間で起こる
が、しかしまた別の特異的結合反応（例えば、アビジン
とビオチン、または糖とレクチン）も知られている。
【０００４】当該技術分野で既知のアッセイ・フォーマ
ットの多くは、固定化されていない反応体が固定化され
た反応体から分離されるように、１つ以上の反応体を固
形基体に固定化することを要求する。「サンドイッチ」
および「直接結合アッセイ」は、分離段階を要する、当
該技術分野で用いられてきたアッセイ・フォーマットの
範疇に入る。しかしながら、低分子量標的特異的結合リ
ガンド、例えば、ＰＧＥ2 の検出に標準免疫学的技法を
成功裏に使用することはかなり困難である。低分子量
（１ナノモル濃度以下）のそのようなリガンドを検出す
ることが特に望まれるが、しかし標準免疫学的技法はこ
の目的に関して常に頼りになるわけではない。
ットの多くは、固定化されていない反応体が固定化され
た反応体から分離されるように、１つ以上の反応体を固
形基体に固定化することを要求する。「サンドイッチ」
および「直接結合アッセイ」は、分離段階を要する、当
該技術分野で用いられてきたアッセイ・フォーマットの
範疇に入る。しかしながら、低分子量標的特異的結合リ
ガンド、例えば、ＰＧＥ2 の検出に標準免疫学的技法を
成功裏に使用することはかなり困難である。低分子量
（１ナノモル濃度以下）のそのようなリガンドを検出す
ることが特に望まれるが、しかし標準免疫学的技法はこ
の目的に関して常に頼りになるわけではない。
【０００５】一般的には、低分子量の標的特異的結合リ
ガンドの定量は、標識していないリガンド（試験試料
中）と標識化リガンドとの間の、リガンドのレセプター
の結合部位についての競争を伴う。これは、典型的な競
合的特異的結合アッセイである。試験試料中のリガンド
は、レセプターから標識化リガンドを置換し、そして種
々方法により置換量が定量される。結合標識化リガンド
を測定すると、試料中のリガンドの量と発生した信号と
は反対に相関する。結合していない標識化リガンドを測
定すると、正の相関が得られるだろう。一般的には、結
合標識由来の信号は容易に測定されるが、しかし（例え
ば、医院で）高度の診断訓練および装置を欠く医療業者
がその信号を解釈することはより困難である。
ガンドの定量は、標識していないリガンド（試験試料
中）と標識化リガンドとの間の、リガンドのレセプター
の結合部位についての競争を伴う。これは、典型的な競
合的特異的結合アッセイである。試験試料中のリガンド
は、レセプターから標識化リガンドを置換し、そして種
々方法により置換量が定量される。結合標識化リガンド
を測定すると、試料中のリガンドの量と発生した信号と
は反対に相関する。結合していない標識化リガンドを測
定すると、正の相関が得られるだろう。一般的には、結
合標識由来の信号は容易に測定されるが、しかし（例え
ば、医院で）高度の診断訓練および装置を欠く医療業者
がその信号を解釈することはより困難である。
【０００６】標準競合的特異的結合アッセイに伴う別の
問題は、遊離もしくは結合標識化リガンドの測定が、遊
離および結合分子の分離効率により制限されることであ
る。遊離標識化リガンドが結合標識化リガンドから十分
に分離されないとき、アッセイの感度および特異性は悪
影響を受けるだろう。従って、低濃度の種々の標的特異
的結合リガンド（特に低分子量のもの）を迅速かつ容易
に検出するために、遊離標識化リガンドが効率よく分離
および測定される、高感度な競合的結合アッセイが必要
とされる。
問題は、遊離もしくは結合標識化リガンドの測定が、遊
離および結合分子の分離効率により制限されることであ
る。遊離標識化リガンドが結合標識化リガンドから十分
に分離されないとき、アッセイの感度および特異性は悪
影響を受けるだろう。従って、低濃度の種々の標的特異
的結合リガンド（特に低分子量のもの）を迅速かつ容易
に検出するために、遊離標識化リガンドが効率よく分離
および測定される、高感度な競合的結合アッセイが必要
とされる。
【０００７】同時係属かつ通常譲渡された米国特許出願
番号第 08/250,980 号明細書，題名「酵素阻害および抗
阻害抗体を用いる特異的結合アッセイならびに試験キッ
ト（Specific Binding Assay and Test Kit Using Enzy
me Inhibitor and Anti-Inhibitor Antibodies）」，Co
ntestable, Snyder, Corona-HowardおよびGroganにより
1994年 5月31日出願，は、前記課題を解決するそのよう
なアッセイを提供する。しかしながら、この出願のアッ
セイは、信号を発生させるために用いられるリポーター
酵素に特異的である数種の精巧な抗体の使用を必要とす
る。これらの抗体は、アッセイを有利にする別の重要な
性質を有する。そのような試薬は、所定の複数のアッセ
イについて一貫して開発または製造するのが難しいこと
がある。従って、一般的なアッセイ・フォーマットによ
り提供される著しい利点を保持しながら、可能であれば
それらの使用を回避することが望まれるだろう。このよ
うに、あまり精巧ではない試薬を使用し、かつ製造およ
び使用がより簡単である別のアッセイが望まれる。
番号第 08/250,980 号明細書，題名「酵素阻害および抗
阻害抗体を用いる特異的結合アッセイならびに試験キッ
ト（Specific Binding Assay and Test Kit Using Enzy
me Inhibitor and Anti-Inhibitor Antibodies）」，Co
ntestable, Snyder, Corona-HowardおよびGroganにより
1994年 5月31日出願，は、前記課題を解決するそのよう
なアッセイを提供する。しかしながら、この出願のアッ
セイは、信号を発生させるために用いられるリポーター
酵素に特異的である数種の精巧な抗体の使用を必要とす
る。これらの抗体は、アッセイを有利にする別の重要な
性質を有する。そのような試薬は、所定の複数のアッセ
イについて一貫して開発または製造するのが難しいこと
がある。従って、一般的なアッセイ・フォーマットによ
り提供される著しい利点を保持しながら、可能であれば
それらの使用を回避することが望まれるだろう。このよ
うに、あまり精巧ではない試薬を使用し、かつ製造およ
び使用がより簡単である別のアッセイが望まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】米国特許第 4,859,583
号明細書（Heller他）は、複数の部屋を有するデバイス
を用いる低分子量抗原の化学ルミネセンス・イムノアッ
セイを記載している。前記アッセイでは、試料の抗原が
抗体に結合した標識化抗原と置換する。標識化抗原は、
光信号を発生させる第２室に拡散される。このアプロー
チには幾つかの問題が伴うが、しかし主要な問題は、膜
の反対側まで拡散させなければならないので、アッセイ
をゆっくり行わなくてはならないことである。さらに、
デバイスは複雑になり、そして各所定の分析物（抗原）
に適する膜を必要とする。低分子量分析物の速くて簡単
なアッセイを得ることは望ましいだろう。
号明細書（Heller他）は、複数の部屋を有するデバイス
を用いる低分子量抗原の化学ルミネセンス・イムノアッ
セイを記載している。前記アッセイでは、試料の抗原が
抗体に結合した標識化抗原と置換する。標識化抗原は、
光信号を発生させる第２室に拡散される。このアプロー
チには幾つかの問題が伴うが、しかし主要な問題は、膜
の反対側まで拡散させなければならないので、アッセイ
をゆっくり行わなくてはならないことである。さらに、
デバイスは複雑になり、そして各所定の分析物（抗原）
に適する膜を必要とする。低分子量分析物の速くて簡単
なアッセイを得ることは望ましいだろう。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記課題は、下記段階： Ａ）任意の順序で、 １）標的特異的結合リガンドを含むことが予測される流
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの第１レセプター、お
よび ３）前記標的特異的結合リガンドとリポーター酵素との
水溶性コンジュゲート、を合わせて、前記第１レセプタ
ーと、前記標的特異的結合リガンドまたは前記水溶性コ
ンジュゲートのいずれかとの複合体を含有する混合物を
生成せしめること、 Ｂ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記混合
物の試料および固定化第２レセプターを合わせて（但
し、前記第２レセプターは、前記リポーター酵素または
前記標的特異的結合リガンドのいずれかに特異的であ
る）、前記固定化第２レセプターと未複合化水溶性コン
ジュゲートとの水不溶性反応生成物を生成せしめるこ
と、（但し、前記第１レセプターが水溶性であるとき、
前記固定化第２レセプターが前記標的特異的結合リガン
ドに特異的であることを条件とする） Ｃ）前記段階Ｂ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｄ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記分離した水不溶性反応生成物により発生
した信号を検出すること、を含む、標的特異的結合リガ
ンドを検出するための特異的結合方法を用いて解決され
る。
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの第１レセプター、お
よび ３）前記標的特異的結合リガンドとリポーター酵素との
水溶性コンジュゲート、を合わせて、前記第１レセプタ
ーと、前記標的特異的結合リガンドまたは前記水溶性コ
ンジュゲートのいずれかとの複合体を含有する混合物を
生成せしめること、 Ｂ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記混合
物の試料および固定化第２レセプターを合わせて（但
し、前記第２レセプターは、前記リポーター酵素または
前記標的特異的結合リガンドのいずれかに特異的であ
る）、前記固定化第２レセプターと未複合化水溶性コン
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と、（但し、前記第１レセプターが水溶性であるとき、
前記固定化第２レセプターが前記標的特異的結合リガン
ドに特異的であることを条件とする） Ｃ）前記段階Ｂ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｄ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記分離した水不溶性反応生成物により発生
した信号を検出すること、を含む、標的特異的結合リガ
ンドを検出するための特異的結合方法を用いて解決され
る。
【００１０】また、本発明は、個々のパックに、標的特
異的結合リガンドとリポーター酵素との水溶性コンジュ
ゲート、前記標的特異的結合リガンドの第１レセプタ
ー、および固定化第２レセプター（但し、前記第２レセ
プターは、前記リポーター酵素または前記標的特異的結
合リガンドのいずれかに特異的であり、前記第１レセプ
ターが水溶性であるときには、前記固定化第２レセプタ
ーが前記標的特異的結合リガンドに特異的であることを
条件とする）、を含む、標的特異的結合リガンドの検出
に有用な試験キットも提供する。本発明は、リポーター
酵素の活性由来の信号がアッセイ系中の標的特異的結合
リガンドの量に正比例する、特異的結合アッセイであ
る。それは、低濃度の標的特異的結合リガンド、特に低
分子量リガンド、例えば、ＰＧＥ2 の迅速かつ容易な検
出のために提供される。従って、本アッセイは、歯周疾
患の診断または治療に都合良く使用できる。
異的結合リガンドとリポーター酵素との水溶性コンジュ
ゲート、前記標的特異的結合リガンドの第１レセプタ
ー、および固定化第２レセプター（但し、前記第２レセ
プターは、前記リポーター酵素または前記標的特異的結
合リガンドのいずれかに特異的であり、前記第１レセプ
ターが水溶性であるときには、前記固定化第２レセプタ
ーが前記標的特異的結合リガンドに特異的であることを
条件とする）、を含む、標的特異的結合リガンドの検出
に有用な試験キットも提供する。本発明は、リポーター
酵素の活性由来の信号がアッセイ系中の標的特異的結合
リガンドの量に正比例する、特異的結合アッセイであ
る。それは、低濃度の標的特異的結合リガンド、特に低
分子量リガンド、例えば、ＰＧＥ2 の迅速かつ容易な検
出のために提供される。従って、本アッセイは、歯周疾
患の診断または治療に都合良く使用できる。
【００１１】ある態様では、本発明のアッセイが、固定
化第１レセプターを用いた遊離および結合リポーター酵
素標識化リガンドの急速な競合分離を使用している。次
いで遊離標識化リガンドが、リガンドまたはリポーター
酵素のいずれかに特異的な固定化第２レセプター分子と
複合化し、そして典型的には、得られた反応生成物が信
号発生および検出の容易な使い捨て試験デバイスに捕捉
される。好ましい態様では、異なる固定化レセプターお
よび各標識リガンドの水溶性コンジュゲートを用いて、
単一の試験デバイスで複数の標的リガンドを検出および
区別できる。別の態様では、第１レセプターが水溶性
（非固定化）であり、かつ固定化第２レセプターが、試
料中のリガンドの存在を検出するためにリポーター酵素
に結合させたリガンドと反応する。
化第１レセプターを用いた遊離および結合リポーター酵
素標識化リガンドの急速な競合分離を使用している。次
いで遊離標識化リガンドが、リガンドまたはリポーター
酵素のいずれかに特異的な固定化第２レセプター分子と
複合化し、そして典型的には、得られた反応生成物が信
号発生および検出の容易な使い捨て試験デバイスに捕捉
される。好ましい態様では、異なる固定化レセプターお
よび各標識リガンドの水溶性コンジュゲートを用いて、
単一の試験デバイスで複数の標的リガンドを検出および
区別できる。別の態様では、第１レセプターが水溶性
（非固定化）であり、かつ固定化第２レセプターが、試
料中のリガンドの存在を検出するためにリポーター酵素
に結合させたリガンドと反応する。
【００１２】
【具体的な態様】本発明は、リガンドについてのレセプ
ター分子が入手可能であるかまたは製造可能であるよう
な、１つ以上の多種多様な標的特異的結合リガンド（以
下本明細書ではリガンドと示される）のいずれかを定性
的、定量的または半定量的に検出するのに使用できる。
リガンド−レセプター複合体の具体例（すなわち、リガ
ンドと対応するレセプターとの反応生成物）は、限定さ
れるものではないが、抗体−抗原、抗体−ハプテン、ア
ビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロ
ネクチンおよびプロテインＡ−ＩｇＧの複合体を含む。
本発明のために、また相補的核酸（すなわち、相補鎖の
ハイブリッド生成物）がリガンド−レセプター複合体と
して考えられる。そのような相補的核酸は、塩基対毎に
相補的である必要はない。一方の鎖がもう一方の鎖より
も長くてもよいし、または一方の鎖が複数のより短い相
補鎖を有していてもよい。リガンドは、限定されるもの
ではないが、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質
類（酵素類、抗体類、抗原性タンパク質類、糖タンパク
質類、リポタンパク質類およびアビジンを包含する）、
ホルモン類（例えば、サイロキシン、トリヨードサイロ
キシン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エストロゲン、Ａ
ＣＴＨおよびサブスタンスＰ）、免疫系モジュレーター
類（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン
−６および腫瘍壊死因子α）、ビタミン類、ステロイド
類、炭水化物類（例えば、多糖類）、糖脂質類、薬物類
（例えば、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタ
ール、モルフィネ、カルバマゼピンおよびテオフィリ
ン）、抗生物質類（例えば、ゲンタマイシン）、細菌細
胞およびウイルスの成分（例えば、レンサ球菌種、ヘル
ペスウイルス類、淋菌種、クラミジア種、レトロウイル
ス類、インフルエンザウイルス類、プレボテラ種、ポル
フィロモナス種、アクチノバチルス種およびマイコバク
テリウム種）、核酸類（一本鎖および二本鎖オリゴヌク
レオチドを包含する）、医薬品製剤類、ハプテン類、レ
クチン類、ビオチン、ならびに当業者に容易に明らかで
ある別の物質を含む。好ましい態様では、リガンドが抗
原性物質（例えば、前記薬物）または抗体（抗抗体を包
含する）である。
ター分子が入手可能であるかまたは製造可能であるよう
な、１つ以上の多種多様な標的特異的結合リガンド（以
下本明細書ではリガンドと示される）のいずれかを定性
的、定量的または半定量的に検出するのに使用できる。
リガンド−レセプター複合体の具体例（すなわち、リガ
ンドと対応するレセプターとの反応生成物）は、限定さ
れるものではないが、抗体−抗原、抗体−ハプテン、ア
ビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロ
ネクチンおよびプロテインＡ−ＩｇＧの複合体を含む。
本発明のために、また相補的核酸（すなわち、相補鎖の
ハイブリッド生成物）がリガンド−レセプター複合体と
して考えられる。そのような相補的核酸は、塩基対毎に
相補的である必要はない。一方の鎖がもう一方の鎖より
も長くてもよいし、または一方の鎖が複数のより短い相
補鎖を有していてもよい。リガンドは、限定されるもの
ではないが、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質
類（酵素類、抗体類、抗原性タンパク質類、糖タンパク
質類、リポタンパク質類およびアビジンを包含する）、
ホルモン類（例えば、サイロキシン、トリヨードサイロ
キシン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エストロゲン、Ａ
ＣＴＨおよびサブスタンスＰ）、免疫系モジュレーター
類（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン
−６および腫瘍壊死因子α）、ビタミン類、ステロイド
類、炭水化物類（例えば、多糖類）、糖脂質類、薬物類
（例えば、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタ
ール、モルフィネ、カルバマゼピンおよびテオフィリ
ン）、抗生物質類（例えば、ゲンタマイシン）、細菌細
胞およびウイルスの成分（例えば、レンサ球菌種、ヘル
ペスウイルス類、淋菌種、クラミジア種、レトロウイル
ス類、インフルエンザウイルス類、プレボテラ種、ポル
フィロモナス種、アクチノバチルス種およびマイコバク
テリウム種）、核酸類（一本鎖および二本鎖オリゴヌク
レオチドを包含する）、医薬品製剤類、ハプテン類、レ
クチン類、ビオチン、ならびに当業者に容易に明らかで
ある別の物質を含む。好ましい態様では、リガンドが抗
原性物質（例えば、前記薬物）または抗体（抗抗体を包
含する）である。
【００１３】本発明は、低分子量標的特異的結合リガン
ドの検出に特に有用である。「低分子量標的特異的結合
リガンド」とは、 500ダルトン未満の分子量を有し、か
つ（単一エピトープ結合部位のみにより、または立体障
害により）単一対応レセプター分子のみと複合化できる
化合物を意味する。そのようなリガンドは、限定される
ものではないが、ＰＧＥ2 および別のアラキドン酸中間
代謝物、ジゴキシン、ジフェニルヒダントイン、カルバ
マゼピン、フェノバルビタールおよび当該技術分野で容
易に明らかである別のものを含む。最も好ましい態様で
は、本発明はＰＧＥ2 の効率のよい迅速な検出に有用で
ある。
ドの検出に特に有用である。「低分子量標的特異的結合
リガンド」とは、 500ダルトン未満の分子量を有し、か
つ（単一エピトープ結合部位のみにより、または立体障
害により）単一対応レセプター分子のみと複合化できる
化合物を意味する。そのようなリガンドは、限定される
ものではないが、ＰＧＥ2 および別のアラキドン酸中間
代謝物、ジゴキシン、ジフェニルヒダントイン、カルバ
マゼピン、フェノバルビタールおよび当該技術分野で容
易に明らかである別のものを含む。最も好ましい態様で
は、本発明はＰＧＥ2 の効率のよい迅速な検出に有用で
ある。
【００１４】本明細書中で用いられている「抗体」なる
語は（特に断らない限り）、当該技術分野で一般的であ
るように、単一の特異性を有する完全な免疫グロブリン
分子を包含する。加えて、この語は、そのような分子の
化学的に調製された断片〔例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ）′、Ｆ（ａｂ）2 、断片〕および遺伝学的に調製さ
れたそれらの等価体（例えば、「一本鎖抗体断片」もし
くはＳｃＦｖ断片）を包含することを意味する。本明細
書中に記載される各型の抗体は、モノクローナルもしく
はポリクローナルでありうる。モノクローナル抗体は、
従来のハイブリドーマ技術を用いて通常調製されるそれ
らの分子を含むが、しかしそれらは電気融合、ウイルス
性形質転換および当該技術分野で既知である別の方法に
より調製することもできる。一般的には、本発明の実施
に際して用いられるモノクローナル抗体は、Kohler他，
Nature 256, 495 (1975)に記載される従来の方法に従っ
て、適当な動物（例えば、マウスもしくはラット）を対
応する抗原、例えば、リポーター酵素（もしくはタンパ
ク質担体に結合させた抗原）で免疫することにより調製
される。
語は（特に断らない限り）、当該技術分野で一般的であ
るように、単一の特異性を有する完全な免疫グロブリン
分子を包含する。加えて、この語は、そのような分子の
化学的に調製された断片〔例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ）′、Ｆ（ａｂ）2 、断片〕および遺伝学的に調製さ
れたそれらの等価体（例えば、「一本鎖抗体断片」もし
くはＳｃＦｖ断片）を包含することを意味する。本明細
書中に記載される各型の抗体は、モノクローナルもしく
はポリクローナルでありうる。モノクローナル抗体は、
従来のハイブリドーマ技術を用いて通常調製されるそれ
らの分子を含むが、しかしそれらは電気融合、ウイルス
性形質転換および当該技術分野で既知である別の方法に
より調製することもできる。一般的には、本発明の実施
に際して用いられるモノクローナル抗体は、Kohler他，
Nature 256, 495 (1975)に記載される従来の方法に従っ
て、適当な動物（例えば、マウスもしくはラット）を対
応する抗原、例えば、リポーター酵素（もしくはタンパ
ク質担体に結合させた抗原）で免疫することにより調製
される。
【００１５】免疫した動物の脾細胞の集団は、Lane「J.
Immunol. Methods 81, 223-228 ページ（1985）〕の教
示に従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ1450）も
しくは別の融合剤（fusogen ）の存在下で、適当なハイ
ブリドーマ・セルラインと融合できる。得られたハイブ
リッド細胞を選択培地で希釈し、マイクロタイタープレ
ートに分配し、そして７〜21日間培養した後、スクリー
ニングして抗体がどのような型の性質を有するのか調べ
る。特に有用な抗体の特別な調製方法を以下に具体的に
示す。哺乳動物の脾細胞とハイブリッドするための種々
の骨髄腫（ミエローマ）セルラインは市販されている。
そのようなセルラインの供給源は、American Type Cult
ure Collection (ATCC), Rockville, Marylandを含む。
特に有用な骨髄腫セルラインは、Sp2/0-Ag14およびP3x6
3Ag8骨髄腫細胞を含み、それらは両方ともATCCより入手
可能である。最初のセルラインが好ましい。
Immunol. Methods 81, 223-228 ページ（1985）〕の教
示に従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ1450）も
しくは別の融合剤（fusogen ）の存在下で、適当なハイ
ブリドーマ・セルラインと融合できる。得られたハイブ
リッド細胞を選択培地で希釈し、マイクロタイタープレ
ートに分配し、そして７〜21日間培養した後、スクリー
ニングして抗体がどのような型の性質を有するのか調べ
る。特に有用な抗体の特別な調製方法を以下に具体的に
示す。哺乳動物の脾細胞とハイブリッドするための種々
の骨髄腫（ミエローマ）セルラインは市販されている。
そのようなセルラインの供給源は、American Type Cult
ure Collection (ATCC), Rockville, Marylandを含む。
特に有用な骨髄腫セルラインは、Sp2/0-Ag14およびP3x6
3Ag8骨髄腫細胞を含み、それらは両方ともATCCより入手
可能である。最初のセルラインが好ましい。
【００１６】本発明で用いられるモノクローナル抗体の
調製では、選択されたハイブリドーマを、軟寒天でクロ
ーン化し、そして個々のクローンを引き抜いて、従来の
方法を用いて培養し、そして前記方法を用いてスクリー
ニングした。モノクローナル抗体は、振盪フラスコ中で
成長させ、そして固定化プロテインＡもしくはプロテイ
ンＧのいずれかの従来のアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて抗体を収集および精製することができる。
所望により、別の従来の精製方法を用いることもでき
る。
調製では、選択されたハイブリドーマを、軟寒天でクロ
ーン化し、そして個々のクローンを引き抜いて、従来の
方法を用いて培養し、そして前記方法を用いてスクリー
ニングした。モノクローナル抗体は、振盪フラスコ中で
成長させ、そして固定化プロテインＡもしくはプロテイ
ンＧのいずれかの従来のアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて抗体を収集および精製することができる。
所望により、別の従来の精製方法を用いることもでき
る。
【００１７】アッセイ・プロトコール：一般的には、本
発明のアッセイ・プロトコールは、任意の順序で以下の
試薬： １）ある種の型の流体試料中のリガンド（例えば、抗原
性物質）、 ２）流体試料中の前記リガンドに特異的でありかつそれ
と反応性である（リポーター酵素に結合されていてもよ
く、または遊離型であってもよい）、第１レセプター
（例えば、抗体）、および ３）前記標的リガンドとリポーター酵素との水溶性コン
ジュゲート、を合わせることを含む。一度これらの試薬
が合わされると、適当な反応が生じる。詳細には、標的
リガンドおよび水溶性コンジュゲートは、第１レセプタ
ー上の利用可能な部位について競争し、それによって特
異的結合複合体が生成する。
発明のアッセイ・プロトコールは、任意の順序で以下の
試薬： １）ある種の型の流体試料中のリガンド（例えば、抗原
性物質）、 ２）流体試料中の前記リガンドに特異的でありかつそれ
と反応性である（リポーター酵素に結合されていてもよ
く、または遊離型であってもよい）、第１レセプター
（例えば、抗体）、および ３）前記標的リガンドとリポーター酵素との水溶性コン
ジュゲート、を合わせることを含む。一度これらの試薬
が合わされると、適当な反応が生じる。詳細には、標的
リガンドおよび水溶性コンジュゲートは、第１レセプタ
ー上の利用可能な部位について競争し、それによって特
異的結合複合体が生成する。
【００１８】第１レセプターが何らかの形で固定化され
ている場合、次いでこのように生成された水不溶性特異
的結合複合体は、得られた上清中の未複合化水溶性コン
ジュゲートから分離される。分離手段は以下により詳細
に記載する。一度分離が達成されると、未複合化水溶性
コンジュゲートを含む上清の試料は固定化第２レセプタ
ーと合わせられる。この第２レセプターは、コンジュゲ
ートのリポーター酵素またはコンジュゲートのリガンド
部分のいずれかに特異的である。この接触の結果、コン
ジュゲートと固定化第２レセプターとの水不溶性反応生
成物が生成する。次いでこの反応生成物は、残留する未
反応水溶性コンジュゲートから分離される。信号は、固
定化反応生成物中の活性リポーター酵素の存在により、
適当な信号発生性試薬（下記）を用いて、流体試料中の
リガンドの量に正比例して発生する。
ている場合、次いでこのように生成された水不溶性特異
的結合複合体は、得られた上清中の未複合化水溶性コン
ジュゲートから分離される。分離手段は以下により詳細
に記載する。一度分離が達成されると、未複合化水溶性
コンジュゲートを含む上清の試料は固定化第２レセプタ
ーと合わせられる。この第２レセプターは、コンジュゲ
ートのリポーター酵素またはコンジュゲートのリガンド
部分のいずれかに特異的である。この接触の結果、コン
ジュゲートと固定化第２レセプターとの水不溶性反応生
成物が生成する。次いでこの反応生成物は、残留する未
反応水溶性コンジュゲートから分離される。信号は、固
定化反応生成物中の活性リポーター酵素の存在により、
適当な信号発生性試薬（下記）を用いて、流体試料中の
リガンドの量に正比例して発生する。
【００１９】従って、もとの流体試料中にリガンドが全
く存在しないとき、第１分離段階の後に上清中に存在す
る水溶性コンジュゲートはないだろう。上清中に水溶性
コンジュゲートが全く存在しないとき、固定化第２レセ
プターと反応するコンジュゲートはなく、そして信号も
発生しない。流体試料中にリガンドが存在するとき、水
溶性コンジュゲートが上清中に存在するだろう。このコ
ンジュゲートは固定化第２レセプターと複合化し、それ
によって流体試料中のリガンドの量に正比例して検出可
能な固定化反応生成物を提供する。第１レセプターが水
溶性であるとき（固定化されていないとき）、複合化ま
たは未複合化物質の混合物を含有する反応溶液は、標的
特異的結合リガンドのみに特異的である固定化第２レセ
プターと直接接触せしめられる。リガンドとリポーター
酵素とのコンジュゲートと第１レセプターとの複合体
は、それらが固定化第２レセプターと反応できないよう
に洗い流される。従って、第１レセプターを用いて複合
化または未複合化物質を予め分離することが要求され
る。信号発生および検出は、前記と同様に達成される。
く存在しないとき、第１分離段階の後に上清中に存在す
る水溶性コンジュゲートはないだろう。上清中に水溶性
コンジュゲートが全く存在しないとき、固定化第２レセ
プターと反応するコンジュゲートはなく、そして信号も
発生しない。流体試料中にリガンドが存在するとき、水
溶性コンジュゲートが上清中に存在するだろう。このコ
ンジュゲートは固定化第２レセプターと複合化し、それ
によって流体試料中のリガンドの量に正比例して検出可
能な固定化反応生成物を提供する。第１レセプターが水
溶性であるとき（固定化されていないとき）、複合化ま
たは未複合化物質の混合物を含有する反応溶液は、標的
特異的結合リガンドのみに特異的である固定化第２レセ
プターと直接接触せしめられる。リガンドとリポーター
酵素とのコンジュゲートと第１レセプターとの複合体
は、それらが固定化第２レセプターと反応できないよう
に洗い流される。従って、第１レセプターを用いて複合
化または未複合化物質を予め分離することが要求され
る。信号発生および検出は、前記と同様に達成される。
【００２０】前記の種々の段階では、前記試薬は、適当
な温度で合わせることができるが、一般的には約10〜約
35℃の範囲で、そして好ましくは室温で合わせることが
できる。混合する時間は数秒間〜 120分間に変えること
ができるとはいえ、典型的には混合段階は約５分間未満
の時間を必要とする。また、方法全体が約20分間以内に
実施されることが好ましい。検出しようとするリガンド
は、限定されるものではないが、全血、血清、血漿、リ
ンパ液、胆汁、尿、脊髄液、涙液、綿棒で集めた被検
体、便検体、精液、膣分泌物、唾液、歯肉溝液および当
業者に容易に明らかな別のものを包含する、動物もしく
はヒトの体液、組織または老廃物の多種多様な流体試料
（もしくは水性溶液）中に存在するであろう。流体試料
の量は当該技術分野で知られているように広範に変える
ことができるが、典型的には少なくとも約１〜10μＬで
ある。
な温度で合わせることができるが、一般的には約10〜約
35℃の範囲で、そして好ましくは室温で合わせることが
できる。混合する時間は数秒間〜 120分間に変えること
ができるとはいえ、典型的には混合段階は約５分間未満
の時間を必要とする。また、方法全体が約20分間以内に
実施されることが好ましい。検出しようとするリガンド
は、限定されるものではないが、全血、血清、血漿、リ
ンパ液、胆汁、尿、脊髄液、涙液、綿棒で集めた被検
体、便検体、精液、膣分泌物、唾液、歯肉溝液および当
業者に容易に明らかな別のものを包含する、動物もしく
はヒトの体液、組織または老廃物の多種多様な流体試料
（もしくは水性溶液）中に存在するであろう。流体試料
の量は当該技術分野で知られているように広範に変える
ことができるが、典型的には少なくとも約１〜10μＬで
ある。
【００２１】第１および第２レセプター分子は、リガン
ド、またはリガンドに付着させたリポーター酵素標識と
の反応に応じる。一般的には、そのようなレセプター
は、リガンドにまたはリポーター酵素（下記）に特異的
な抗体である。ある態様では、第１および第２レセプタ
ーの両レセプターが、同一もしくは異なる水不溶性支持
体上に固定された形で提供される。適当な支持体は、限
定されるものではないが、ポリマー、磁気もしくはガラ
スの粒子、ポリマーもしくはガラスの濾過膜、セルロー
ス系濾紙、ポリマーフィルム、ガラススライド、試験
管、磁性鉄流体、試験デバイスもしくはマイクロタイタ
ープレートの試験ウェル、または当業者に容易に明らか
な別のものを含む。好ましくは、レセプターが、この目
的で設計された同一もしくは異なるポリマー粒子上に固
定される。このような粒子は当該技術分野で周知であ
る。粒子表面上の反応性基は、限定されるものではない
が、カルボキシ、２−置換エチルスルホニル、ビニルス
ルホニル、エポキシ、アルデヒド、活性ハロ原子類、ア
ミノ、ヒドラジンおよび活性エステル類、例えば、スク
シンイミドオキシカルボニルを含む。
ド、またはリガンドに付着させたリポーター酵素標識と
の反応に応じる。一般的には、そのようなレセプター
は、リガンドにまたはリポーター酵素（下記）に特異的
な抗体である。ある態様では、第１および第２レセプタ
ーの両レセプターが、同一もしくは異なる水不溶性支持
体上に固定された形で提供される。適当な支持体は、限
定されるものではないが、ポリマー、磁気もしくはガラ
スの粒子、ポリマーもしくはガラスの濾過膜、セルロー
ス系濾紙、ポリマーフィルム、ガラススライド、試験
管、磁性鉄流体、試験デバイスもしくはマイクロタイタ
ープレートの試験ウェル、または当業者に容易に明らか
な別のものを含む。好ましくは、レセプターが、この目
的で設計された同一もしくは異なるポリマー粒子上に固
定される。このような粒子は当該技術分野で周知であ
る。粒子表面上の反応性基は、限定されるものではない
が、カルボキシ、２−置換エチルスルホニル、ビニルス
ルホニル、エポキシ、アルデヒド、活性ハロ原子類、ア
ミノ、ヒドラジンおよび活性エステル類、例えば、スク
シンイミドオキシカルボニルを含む。
【００２２】特に有用な粒状支持体は、例えば、ヨーロ
ッパ特許第 0 323 692号明細書（1989年 7月12日刊行）
および米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他，引用
することにより本明細書中に組み入れられる）に記載さ
れており、それらは、活性ハロ原子類、活性化２−置換
エチルスルホニルもしくはビニルスルホニル基を有する
１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーより調製さ
れる。有用なカルボキシ含有ポリマー粒子は、米国特許
第 5,262,297号明細書（Sutton他）に記載されている。
この文献は、引用することにより本明細書中に組み入れ
られる。別のカルボキシ含有ポリマー粒子が従来技術文
献に記載されており、そして多くのものが市販されてい
る。
ッパ特許第 0 323 692号明細書（1989年 7月12日刊行）
および米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他，引用
することにより本明細書中に組み入れられる）に記載さ
れており、それらは、活性ハロ原子類、活性化２−置換
エチルスルホニルもしくはビニルスルホニル基を有する
１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーより調製さ
れる。有用なカルボキシ含有ポリマー粒子は、米国特許
第 5,262,297号明細書（Sutton他）に記載されている。
この文献は、引用することにより本明細書中に組み入れ
られる。別のカルボキシ含有ポリマー粒子が従来技術文
献に記載されており、そして多くのものが市販されてい
る。
【００２３】支持体へのレセプターの付着は、種々の従
来の方法のいずれかを用いて、例えば、レセプター分子
を塗布して吸着させることで、またはインキュベートし
て支持体上の反応性基と共有結合反応させることで達成
できる。そのような方法は、例えば、米国特許第 5,25
2,457号明細書（Snodgrass 他）および米国特許第 5,26
2,297号明細書（Sutton他）（これらは、両方とも引用
することにより本明細書中に組み入れられる）に記載さ
れている。あるいは、レセプターは、支持体、例えば、
ポリマー粒子、に付着した連結基を有するその支持体に
結合させることもできる。そのような連結基は、支持体
から伸びている化学的部分であってもよく、または生物
学的連結部分、例えば、レセプターが複合することがで
きるペプチドもしくは抗体であってもよい。
来の方法のいずれかを用いて、例えば、レセプター分子
を塗布して吸着させることで、またはインキュベートし
て支持体上の反応性基と共有結合反応させることで達成
できる。そのような方法は、例えば、米国特許第 5,25
2,457号明細書（Snodgrass 他）および米国特許第 5,26
2,297号明細書（Sutton他）（これらは、両方とも引用
することにより本明細書中に組み入れられる）に記載さ
れている。あるいは、レセプターは、支持体、例えば、
ポリマー粒子、に付着した連結基を有するその支持体に
結合させることもできる。そのような連結基は、支持体
から伸びている化学的部分であってもよく、または生物
学的連結部分、例えば、レセプターが複合することがで
きるペプチドもしくは抗体であってもよい。
【００２４】本発明方法に用いられる第１レセプターの
量は、一般的には約10-11 〜約10-7モル濃度であり、約
10-9〜約10-8モル濃度の量が好ましい。本発明の実施に
際して用いられるリガンドとリポーター酵素との水溶性
コンジュゲートは、タンパク質、ホルモン、薬物、また
は必要な反応性基を有する別の化学的もしくは生物学的
化合物を共有結合させるための当該技術分野の従来の技
法のいずれかを用いて調製できる。従って、リガンドお
よびリポーター酵素の種々の反応性基は、コンジュゲー
トを作成するための手段を選択する際に考慮できる。そ
のような基は、限定されるものではないが、カルボキシ
基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基およびイミダ
ゾール基を含む。有用な結合方法は、限定されるもので
はないが、ペプチド結合、過ヨウ素酸酸化、グルタルア
ルデヒド、ジカチオンエーテル、カルバモイルオニウム
塩、カルボジイミドもしくはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドの使用、および当業者に容易に明らかな別のものを
含む。これらおよび別の方法の各々の詳細は、Williams
他，Method in Immunology and Immunochemistry, Acad
emic Press, New York, 1976，およびYoshitake 他，Eu
r. J. Biochem. 101, 395 (1979)を包含する多数の文献
に見出される。
量は、一般的には約10-11 〜約10-7モル濃度であり、約
10-9〜約10-8モル濃度の量が好ましい。本発明の実施に
際して用いられるリガンドとリポーター酵素との水溶性
コンジュゲートは、タンパク質、ホルモン、薬物、また
は必要な反応性基を有する別の化学的もしくは生物学的
化合物を共有結合させるための当該技術分野の従来の技
法のいずれかを用いて調製できる。従って、リガンドお
よびリポーター酵素の種々の反応性基は、コンジュゲー
トを作成するための手段を選択する際に考慮できる。そ
のような基は、限定されるものではないが、カルボキシ
基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基およびイミダ
ゾール基を含む。有用な結合方法は、限定されるもので
はないが、ペプチド結合、過ヨウ素酸酸化、グルタルア
ルデヒド、ジカチオンエーテル、カルバモイルオニウム
塩、カルボジイミドもしくはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドの使用、および当業者に容易に明らかな別のものを
含む。これらおよび別の方法の各々の詳細は、Williams
他，Method in Immunology and Immunochemistry, Acad
emic Press, New York, 1976，およびYoshitake 他，Eu
r. J. Biochem. 101, 395 (1979)を包含する多数の文献
に見出される。
【００２５】本方法の第１段階で用いられる水溶性コン
ジュゲートの量は、バックグラウンドが無視できて複合
体生成の速度が受け入れられるように、一般的には、少
なくとも約10-11 モル濃度のリポーター酵素を提供する
のに十分な量である。加えて、信号を生成するための酵
素基質があまり迅速に反応しないように、一般的にはそ
の量は約３×10-8モル濃度以下である。水溶性コンジュ
ゲートの一部分として本発明に有用なリポーター酵素
は、典型的には診断方法における標識として用いられ
る。それらは、限定されるものではないが、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチ
ンキナーゼ、ウリカーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼおよび当業者に容易に明らかな別の
ものを含む。ペルオキシダーゼ（種々の供給源のいずれ
か由来）が好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最
も好ましい。
ジュゲートの量は、バックグラウンドが無視できて複合
体生成の速度が受け入れられるように、一般的には、少
なくとも約10-11 モル濃度のリポーター酵素を提供する
のに十分な量である。加えて、信号を生成するための酵
素基質があまり迅速に反応しないように、一般的にはそ
の量は約３×10-8モル濃度以下である。水溶性コンジュ
ゲートの一部分として本発明に有用なリポーター酵素
は、典型的には診断方法における標識として用いられ
る。それらは、限定されるものではないが、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチ
ンキナーゼ、ウリカーゼ、グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼおよび当業者に容易に明らかな別の
ものを含む。ペルオキシダーゼ（種々の供給源のいずれ
か由来）が好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最
も好ましい。
【００２６】本発明の実施に際して段階Ｂ）で用いられ
る第２レセプターは、前記方法の段階Ａ）で用いられる
第１レセプターと同じであってもまたは異なっていても
よい。すなわち、それはリガンドのレセプター、例え
ば、抗体でありうる。種々のリガンドの抗体は、市販品
を購入することにより、またはポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体の既知調製方法を用いて調製される
ことが当該技術分野で周知である。複数のリガンドが同
時に検出される下記態様では、検出しようとするリガン
ドに特異的である第２レセプターが用いられる。あるい
は、第２レセプターは、水溶性コンジュゲートのリポー
ター酵素に特異的な抗体であって、酵素活性を著しく阻
害しない抗体でありうる。すなわち、前記抗体は、酵素
活性を20％以下（そして好ましくは６％以下）しか阻害
しない。そのような抗体は、前記従来の方法を用いて調
製し、続いてスクリーニング処理により所望の性質を有
する抗体を見出すことにより入手できる。それらは、本
明細書では「バインダー（binder）」抗体として示され
る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的なバ
インダー抗体についてのスクリーニングは、以下に、ど
のようにして所定のリポーター酵素についてそのような
スクリーニング処理が実施されたのか具体的に記載する
が、しかし本発明はこのリポーター酵素のみの使用に限
定されると解釈されるものではない。別のリポーター酵
素の抗体が本明細書で提供された教示を用いて同様に調
製および同定できると信じる。リポーター酵素に対する
特異性についてのスクリーニングは、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ・コンジュゲートを吸着させて含むポリスチ
レン・マイクロタイタープレート中で従来のエンザイム
・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（Enzyme Lin
ked Immunosorbent Assay ）（ＥＬＩＳＡ）を用いて容
易に達成できる。
る第２レセプターは、前記方法の段階Ａ）で用いられる
第１レセプターと同じであってもまたは異なっていても
よい。すなわち、それはリガンドのレセプター、例え
ば、抗体でありうる。種々のリガンドの抗体は、市販品
を購入することにより、またはポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体の既知調製方法を用いて調製される
ことが当該技術分野で周知である。複数のリガンドが同
時に検出される下記態様では、検出しようとするリガン
ドに特異的である第２レセプターが用いられる。あるい
は、第２レセプターは、水溶性コンジュゲートのリポー
ター酵素に特異的な抗体であって、酵素活性を著しく阻
害しない抗体でありうる。すなわち、前記抗体は、酵素
活性を20％以下（そして好ましくは６％以下）しか阻害
しない。そのような抗体は、前記従来の方法を用いて調
製し、続いてスクリーニング処理により所望の性質を有
する抗体を見出すことにより入手できる。それらは、本
明細書では「バインダー（binder）」抗体として示され
る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的なバ
インダー抗体についてのスクリーニングは、以下に、ど
のようにして所定のリポーター酵素についてそのような
スクリーニング処理が実施されたのか具体的に記載する
が、しかし本発明はこのリポーター酵素のみの使用に限
定されると解釈されるものではない。別のリポーター酵
素の抗体が本明細書で提供された教示を用いて同様に調
製および同定できると信じる。リポーター酵素に対する
特異性についてのスクリーニングは、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ・コンジュゲートを吸着させて含むポリスチ
レン・マイクロタイタープレート中で従来のエンザイム
・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（Enzyme Lin
ked Immunosorbent Assay ）（ＥＬＩＳＡ）を用いて容
易に達成できる。
【００２７】西洋ワサビペルオキシダーゼについての特
異性：西洋ワサビペルオキシダーゼと、例えば、Jackso
n Immunoresearchから得られる不適当な抗体（該系にお
て反応性ではない抗体）とのコンジュゲートを被覆した
マイクロタイター・ウェルに、各ハイブリドーマ培養液
上清の試料（50μＬ／プレートウェル）を入れる。30〜
60分間インキュベーションした後、プレートを適当な非
イオン界面活性剤の緩衝液で洗浄し、そしてマウスもし
くはラット西洋ワサビペルオキシダーゼ特異的モノクロ
ーナル抗体の存在を、抗マウスＩｇＧもしくは抗ラット
ＩｇＧとアルカリ性ホスファターゼとのコンジュゲート
（抗マウスＦｃとのコンジュゲートは、例えば、Jackso
n Immunoresearchから入手することができる）を用いて
検出する。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（ 1.5モル濃度，pH８）中の基質ｏ−ニトロフェニ
ルリン酸二ナトリウム塩（４mg/mL ）を添加することに
より、色素信号を発生できる。別の信号生成性試薬もし
くは酵素標識が同様に使用できる。約30分後にバックグ
ラウンド信号の少なくとも２倍の濃度の色素信号を提供
する抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的であ
ると見なされる。色素信号は、従来の分光光度計を用い
て測定できる。西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な
バインダー抗体は、以下のようにして阻害機能について
スクリーニングできる。前記の通り、バインダー抗体が
酵素活性の阻害をほとんどまたは全く示さないことが望
ましい。
異性：西洋ワサビペルオキシダーゼと、例えば、Jackso
n Immunoresearchから得られる不適当な抗体（該系にお
て反応性ではない抗体）とのコンジュゲートを被覆した
マイクロタイター・ウェルに、各ハイブリドーマ培養液
上清の試料（50μＬ／プレートウェル）を入れる。30〜
60分間インキュベーションした後、プレートを適当な非
イオン界面活性剤の緩衝液で洗浄し、そしてマウスもし
くはラット西洋ワサビペルオキシダーゼ特異的モノクロ
ーナル抗体の存在を、抗マウスＩｇＧもしくは抗ラット
ＩｇＧとアルカリ性ホスファターゼとのコンジュゲート
（抗マウスＦｃとのコンジュゲートは、例えば、Jackso
n Immunoresearchから入手することができる）を用いて
検出する。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（ 1.5モル濃度，pH８）中の基質ｏ−ニトロフェニ
ルリン酸二ナトリウム塩（４mg/mL ）を添加することに
より、色素信号を発生できる。別の信号生成性試薬もし
くは酵素標識が同様に使用できる。約30分後にバックグ
ラウンド信号の少なくとも２倍の濃度の色素信号を提供
する抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的であ
ると見なされる。色素信号は、従来の分光光度計を用い
て測定できる。西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な
バインダー抗体は、以下のようにして阻害機能について
スクリーニングできる。前記の通り、バインダー抗体が
酵素活性の阻害をほとんどまたは全く示さないことが望
ましい。
【００２８】酵素阻害についてのアッセイ：マイクロタ
イタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50μ
Ｌ）を入れ、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン（
0.8％）を含む溶液（50μＬ）を添加し、そして得られ
た混合物を10分間室温で放置する。次いで、クエン酸／
リン酸緩衝液（50ミリモル濃度，pH 5.5，混合比 1:1）
中に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、ｏ−フェニレン
ジアミン（１mg/mL ）を含むもの 100μＬを添加するこ
とにより残留酵素活性を測定し、そして色素信号の量を
450nmで従来の分光光度計（速度 100mOD/分）を用いて
測定する。別の基質もしくは色素提供性試薬が同様に使
用できる。これらの西洋ワサビペルオキシダーゼを（モ
ノクローナル抗体が存在しない対照と比較して）約20％
未満しか阻害しない培養液上清は、バインダー抗体とし
ての使用が考えられる。好ましくはこれらの抗体が、リ
ポーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）
の活性を６％以下しか減少させない。
イタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50μ
Ｌ）を入れ、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン（
0.8％）を含む溶液（50μＬ）を添加し、そして得られ
た混合物を10分間室温で放置する。次いで、クエン酸／
リン酸緩衝液（50ミリモル濃度，pH 5.5，混合比 1:1）
中に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、ｏ−フェニレン
ジアミン（１mg/mL ）を含むもの 100μＬを添加するこ
とにより残留酵素活性を測定し、そして色素信号の量を
450nmで従来の分光光度計（速度 100mOD/分）を用いて
測定する。別の基質もしくは色素提供性試薬が同様に使
用できる。これらの西洋ワサビペルオキシダーゼを（モ
ノクローナル抗体が存在しない対照と比較して）約20％
未満しか阻害しない培養液上清は、バインダー抗体とし
ての使用が考えられる。好ましくはこれらの抗体が、リ
ポーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）
の活性を６％以下しか減少させない。
【００２９】バインダー抗体の解離定数（Ｋd ）は、一
般的には50ナノモル濃度以下であり、好ましくは25ナノ
モル濃度以下であり、そしてより好ましくは約５ナノモ
ル濃度以下である。本明細書に記載されたＫd 値が抗体
の相対尺度であること、そしてそのパラメーターを測定
するための種々の従来の方法がわずかに低いまたは高い
値を与えるかもしれないことは、理解されるべきであ
る。下記第Ｉ表に報告したＫd のほとんどは（「B5-10
」を除く）、前記スクリーニング試験により酵素活性
の約99％を阻害するように決定された、10ナノモル濃度
の「4-22.2」と示されるモノクローナル抗体による、
0.1ナノモル濃度のリポーター酵素（例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ）の阻害を50％妨害するのに要する
バインダー抗体の濃度を測定することにより決定した。
モノクローナル抗体4-22.2を、ATCCに寄託されたハイブ
リドーマ・セルラインHB11603 を用いて調製した。従来
の競合アッセイにより西洋ワサビペルオキシダーゼの存
在下で結合および未結合抗体の量を測定することによ
り、バインダー抗体B5-10 のＫd を測定した。下記第Ｉ
表に、本発明の実施に際して有用な西洋ワサビペルオキ
シダーゼに特異的な有用なバインダー・モノクローナル
抗体の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ阻害を列挙する。
般的には50ナノモル濃度以下であり、好ましくは25ナノ
モル濃度以下であり、そしてより好ましくは約５ナノモ
ル濃度以下である。本明細書に記載されたＫd 値が抗体
の相対尺度であること、そしてそのパラメーターを測定
するための種々の従来の方法がわずかに低いまたは高い
値を与えるかもしれないことは、理解されるべきであ
る。下記第Ｉ表に報告したＫd のほとんどは（「B5-10
」を除く）、前記スクリーニング試験により酵素活性
の約99％を阻害するように決定された、10ナノモル濃度
の「4-22.2」と示されるモノクローナル抗体による、
0.1ナノモル濃度のリポーター酵素（例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ）の阻害を50％妨害するのに要する
バインダー抗体の濃度を測定することにより決定した。
モノクローナル抗体4-22.2を、ATCCに寄託されたハイブ
リドーマ・セルラインHB11603 を用いて調製した。従来
の競合アッセイにより西洋ワサビペルオキシダーゼの存
在下で結合および未結合抗体の量を測定することによ
り、バインダー抗体B5-10 のＫd を測定した。下記第Ｉ
表に、本発明の実施に際して有用な西洋ワサビペルオキ
シダーゼに特異的な有用なバインダー・モノクローナル
抗体の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ阻害を列挙する。
【００３０】
【表１】
【００３１】モノクローナル抗体6-89.1および7-32.2
は、代表的な西洋ワサビペルオキシダーゼのバインダー
抗体である。それらは、ATCCに寄託されたそれぞれHB11
635 およびHB11604 と本明細書に明記された新規ハイブ
リドーマ・セルラインを用いて調製した。本発明のアッ
セイの過程でリポーター酵素により発生させる信号は、
信号を発生させるのに用いられる特定のリポーター酵素
および対応する試薬（例えば、基質）に依存して、化学
ルミネセンス、電気化学もしくは比色信号でありうる。
は、代表的な西洋ワサビペルオキシダーゼのバインダー
抗体である。それらは、ATCCに寄託されたそれぞれHB11
635 およびHB11604 と本明細書に明記された新規ハイブ
リドーマ・セルラインを用いて調製した。本発明のアッ
セイの過程でリポーター酵素により発生させる信号は、
信号を発生させるのに用いられる特定のリポーター酵素
および対応する試薬（例えば、基質）に依存して、化学
ルミネセンス、電気化学もしくは比色信号でありうる。
【００３２】化学ルミネセンス信号は、リポーター酵素
に応じて多種多様な方法で発生させることができる。ほ
とんどの化学ルミネセンス系では、リポーター酵素がペ
ルオキシダーゼであり、そして酸化体、例えば、過酸化
水素が存在するかまたは何らかの形でそれを発生させて
いる（例えば、オキシダーゼとその基質との反応）。有
用な化学ルミネセンス信号は、例えば、アクリジニウム
塩類、ジオキセタン類、テトラキス（ジメチルアミノ）
エチレン、ルシフェリン、ルシゲニン、塩化オキザリ
ル、所定のオキシダーゼ（例えば、キサンチンオキシダ
ーゼ）および２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
オン類（例えば、ルミノールおよびイソルミノール）を
用いて発生させられる。そのような化合物およびそれら
の用途の多数の具体例が、従来技術文献、例えば、米国
特許第 4,383,031号明細書（Boguslaski他）、米国特許
第 4,598,044号明細書（Kricka他）、米国特許第 4,72
9,950号明細書（Kricka他）、米国特許第 5,108,893号
明細書（Baret ）およびChemiluminescence in Organic
Chemistry (Gundermann他，Springer-Verlag, Berlin,
1987, 204-207ページ）で知られている。化学ルミネセ
ンス信号を発生させる場合、好ましくはペルオキシダー
ゼがリポーター酵素として用いられ、そしてルミノール
もしくは同様の化合物が信号発生性試薬として用いられ
る。
に応じて多種多様な方法で発生させることができる。ほ
とんどの化学ルミネセンス系では、リポーター酵素がペ
ルオキシダーゼであり、そして酸化体、例えば、過酸化
水素が存在するかまたは何らかの形でそれを発生させて
いる（例えば、オキシダーゼとその基質との反応）。有
用な化学ルミネセンス信号は、例えば、アクリジニウム
塩類、ジオキセタン類、テトラキス（ジメチルアミノ）
エチレン、ルシフェリン、ルシゲニン、塩化オキザリ
ル、所定のオキシダーゼ（例えば、キサンチンオキシダ
ーゼ）および２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
オン類（例えば、ルミノールおよびイソルミノール）を
用いて発生させられる。そのような化合物およびそれら
の用途の多数の具体例が、従来技術文献、例えば、米国
特許第 4,383,031号明細書（Boguslaski他）、米国特許
第 4,598,044号明細書（Kricka他）、米国特許第 4,72
9,950号明細書（Kricka他）、米国特許第 5,108,893号
明細書（Baret ）およびChemiluminescence in Organic
Chemistry (Gundermann他，Springer-Verlag, Berlin,
1987, 204-207ページ）で知られている。化学ルミネセ
ンス信号を発生させる場合、好ましくはペルオキシダー
ゼがリポーター酵素として用いられ、そしてルミノール
もしくは同様の化合物が信号発生性試薬として用いられ
る。
【００３３】好ましくは、比色信号が本発明方法で発生
させられる。そのような信号は、当該技術分野で周知で
あるような、多種多様なリポーター酵素および試薬を用
いて達成できる。リポーター酵素がペルオキシダーゼで
ある場合（これは好ましい）、有用な色素提供性試薬
は、限定されるものではないが、テトラメチルベンジジ
ンおよびその誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、トリア
リールメタン類、ならびにイミダゾールロイコ色素類、
例えば、米国特許第 4,087,747号明細書（Bruschi ）お
よび米国特許第 5,024,935号明細書（McClune ）（両方
とも引用することにより本明細書に組み入れられる）に
記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素を含む。種
々のリポーター酵素の基質溶液は、洗浄溶液に含めてま
たはアッセイの最後に提供される。ある有用なトリアリ
ールイミダゾールロイコ色素の基質溶液は、過酸化水素
および電子移動剤、例えば、４′−ヒドロキシアセトア
ニリドもしくは３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセト
アニリドを適当な緩衝液中に含む。
させられる。そのような信号は、当該技術分野で周知で
あるような、多種多様なリポーター酵素および試薬を用
いて達成できる。リポーター酵素がペルオキシダーゼで
ある場合（これは好ましい）、有用な色素提供性試薬
は、限定されるものではないが、テトラメチルベンジジ
ンおよびその誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、トリア
リールメタン類、ならびにイミダゾールロイコ色素類、
例えば、米国特許第 4,087,747号明細書（Bruschi ）お
よび米国特許第 5,024,935号明細書（McClune ）（両方
とも引用することにより本明細書に組み入れられる）に
記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素を含む。種
々のリポーター酵素の基質溶液は、洗浄溶液に含めてま
たはアッセイの最後に提供される。ある有用なトリアリ
ールイミダゾールロイコ色素の基質溶液は、過酸化水素
および電子移動剤、例えば、４′−ヒドロキシアセトア
ニリドもしくは３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセト
アニリドを適当な緩衝液中に含む。
【００３４】所望の信号を生成するのに必要とされる種
々試薬の量は、種々の信号生成性系について入手可能な
多数の文献を参照することにより、当業者に容易に明ら
かであるだろう。好ましい比色系を得るための特定の手
段を、以下の実施例に示す。また、アッセイで発生する
所望の信号を検出するのに必要とされる装置は、当業者
に容易に明らかであるだろう。いくらかの比色信号は、
使用者の目視的観察により容易に評価できるが、より一
般的には、信号が比色、蛍光もしくは化学ルミネセンス
信号を受けて評価するための適当な装置を用いて評価さ
れる。
々試薬の量は、種々の信号生成性系について入手可能な
多数の文献を参照することにより、当業者に容易に明ら
かであるだろう。好ましい比色系を得るための特定の手
段を、以下の実施例に示す。また、アッセイで発生する
所望の信号を検出するのに必要とされる装置は、当業者
に容易に明らかであるだろう。いくらかの比色信号は、
使用者の目視的観察により容易に評価できるが、より一
般的には、信号が比色、蛍光もしくは化学ルミネセンス
信号を受けて評価するための適当な装置を用いて評価さ
れる。
【００３５】第１レセプターが固定化されている場合、
段階Ａ）とＢ）の間に中間分離段階が実施される。固定
化第１レセプターと、リガンドまたは水溶性コンジュゲ
ートとで生成された水不溶性複合体は、いずれかの適す
る装置および方法を用いて未複合化物質（未複合化水溶
性コンジュゲートを包含する）から分離される。例え
ば、段階Ａ）由来の反応混合物は、水不溶性複合体を保
持しながら上清（水溶性物質を含有する）を通過させる
種々濾過材料のいずれかを用いて濾過できる。あるい
は、マイクロタイタープレート、試験管もしくは別のデ
バイス容器に付着されうる水不溶性複合体から、上清を
デカンテーションできる。好ましくは、水不溶性複合体
が適当な物質（例えば、前記ポリマー粒子）に付着さ
れ、そしてそのような粒子は容易に濾過または遠心分離
される。
段階Ａ）とＢ）の間に中間分離段階が実施される。固定
化第１レセプターと、リガンドまたは水溶性コンジュゲ
ートとで生成された水不溶性複合体は、いずれかの適す
る装置および方法を用いて未複合化物質（未複合化水溶
性コンジュゲートを包含する）から分離される。例え
ば、段階Ａ）由来の反応混合物は、水不溶性複合体を保
持しながら上清（水溶性物質を含有する）を通過させる
種々濾過材料のいずれかを用いて濾過できる。あるい
は、マイクロタイタープレート、試験管もしくは別のデ
バイス容器に付着されうる水不溶性複合体から、上清を
デカンテーションできる。好ましくは、水不溶性複合体
が適当な物質（例えば、前記ポリマー粒子）に付着さ
れ、そしてそのような粒子は容易に濾過または遠心分離
される。
【００３６】有用な濾過デバイスは、当業者に容易に明
らかであるだろう。好ましい濾過デバイスが、米国特許
第 4,948,561号明細書（Hinckley他，図１）に記載され
ている。最も好ましい濾過デバイスは、平均孔径約 0.5
〜約10μｍを有する微孔質濾過膜を含む。そのような膜
は、Pall Corp からロプロジン（LOPRODYNE,商標）膜と
して市販されている。
らかであるだろう。好ましい濾過デバイスが、米国特許
第 4,948,561号明細書（Hinckley他，図１）に記載され
ている。最も好ましい濾過デバイスは、平均孔径約 0.5
〜約10μｍを有する微孔質濾過膜を含む。そのような膜
は、Pall Corp からロプロジン（LOPRODYNE,商標）膜と
して市販されている。
【００３７】段階Ｂ）および本発明方法の次段階は、固
定化第２レセプターおよび初期反応溶液が適当に混合さ
れうる適当な容器で実施できる。例えば、この混合処理
は、マイクロタイタープレート、試験管、微小管および
当業者に容易に明らかな別のもので実施できる。好まし
くは本方法が、第２レセプターが適当な形で固定化され
た使い捨て試験デバイスで実施される。そのような試験
デバイスは当業者に容易に明らかであり、そして米国特
許第 3,825,410号明細書（Bagshawe）、米国特許第 3,8
88,629号明細書（Bagshawe）、米国特許第 3,970,429号
明細書（Updike）、米国特許第 4,446,232号明細書（Li
otta）、米国特許第 4,833,087号明細書（Hinckley）、
米国特許第 4,877,586号明細書（Devaney, Jr.他）、米
国特許第4,921,677（Hinckley他）、米国特許第 4,923,
680号明細書（Nelson）、米国特許第 4,948,561号明細
書（Hinckley他）、米国特許第 4,988,627号明細書（Sm
ith-Lewis ）および米国特許第 5,132,085号明細書（Pe
lanek ）に記載されているようなデバイスを含む。最も
好ましい試験デバイスは、微孔質濾過膜（例えば、Pall
Corp 市販のロプロジン（LOPRODYNE,商標）もしくはバ
イオダイン（BIODYNE,商標）膜）を含む複数の試験ウェ
ルを含む。そのようなデバイスは、EastmanKodak Compa
ny よりスレセル（SURECELL, 商標）もしくはエバルサ
イト（EVALUSITE,商標）試験キットとして入手可能であ
る。所望により、固定化第２レセプターを、本発明方法
で使用する前に膜上に配置できる。
定化第２レセプターおよび初期反応溶液が適当に混合さ
れうる適当な容器で実施できる。例えば、この混合処理
は、マイクロタイタープレート、試験管、微小管および
当業者に容易に明らかな別のもので実施できる。好まし
くは本方法が、第２レセプターが適当な形で固定化され
た使い捨て試験デバイスで実施される。そのような試験
デバイスは当業者に容易に明らかであり、そして米国特
許第 3,825,410号明細書（Bagshawe）、米国特許第 3,8
88,629号明細書（Bagshawe）、米国特許第 3,970,429号
明細書（Updike）、米国特許第 4,446,232号明細書（Li
otta）、米国特許第 4,833,087号明細書（Hinckley）、
米国特許第 4,877,586号明細書（Devaney, Jr.他）、米
国特許第4,921,677（Hinckley他）、米国特許第 4,923,
680号明細書（Nelson）、米国特許第 4,948,561号明細
書（Hinckley他）、米国特許第 4,988,627号明細書（Sm
ith-Lewis ）および米国特許第 5,132,085号明細書（Pe
lanek ）に記載されているようなデバイスを含む。最も
好ましい試験デバイスは、微孔質濾過膜（例えば、Pall
Corp 市販のロプロジン（LOPRODYNE,商標）もしくはバ
イオダイン（BIODYNE,商標）膜）を含む複数の試験ウェ
ルを含む。そのようなデバイスは、EastmanKodak Compa
ny よりスレセル（SURECELL, 商標）もしくはエバルサ
イト（EVALUSITE,商標）試験キットとして入手可能であ
る。所望により、固定化第２レセプターを、本発明方法
で使用する前に膜上に配置できる。
【００３８】特許請求した方法の分離段階Ｃ）は、いず
れか所望の形で実施できる。中間分離段階について先に
記載方法および装置を段階Ｃ）に使用することができ
る。好ましくは、水溶性反応生成物が前記と同じ使い捨
て試験デバイス中の未反応水溶性コンジュゲートから分
離される。また、分離した反応生成物から発生した信号
を、そのような場合、使い捨て試験デバイス中で検出す
ることもできる。ある好ましい態様では、同じ濾過およ
び試験デバイスを用いて２種以上の異なるリガンドを同
時に検出することができる。そのような２種以上の標的
特異的結合リガンドを検出するための特異的結合方法
は、下記段階： Ａ）任意の順序で、 １）２種以上の標的特異的結合リガンドを含むことが予
測される流体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの各々の固定化第１レ
セプター、ならびに ３）各標的特異的結合リガンドおよび同一のリポーター
酵素から生成されたコンジュゲートである、２種以上の
水溶性コンジュゲート、を合わせて、前記固定化第１レ
セプターと、対応する標的特異的結合リガンドまたは水
溶性コンジュゲートのいずれかとの２種以上の異なる水
不溶性複合体を生成せしめること、 Ｂ）前記段階Ａ）で生成された水不溶性複合体を、未複
合化水溶性コンジュゲートを含有する上清から分離する
こと、 Ｃ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記上清
の試料、および前記標的特異的結合リガンドの各々の固
定化第２レセプターを合わせて（但し、前記固定化第２
レセプターは、水不溶性支持体の異なる領域に配置され
ている）、前記水不溶性支持体上のそれぞれ異なる領域
で、前記固定化第２レセプターと未複合化水溶性コンジ
ュゲートとの水不溶性反応生成物を生成せしめること、 Ｄ）前記段階Ｃ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｅ）前記流体試料中の前記２種以上の標的特異的結合リ
ガンドの測定として、前記水不溶性支持体上の異なる領
域の前記分離した水不溶性反応生成物により発生した信
号を検出すること、を含む。
れか所望の形で実施できる。中間分離段階について先に
記載方法および装置を段階Ｃ）に使用することができ
る。好ましくは、水溶性反応生成物が前記と同じ使い捨
て試験デバイス中の未反応水溶性コンジュゲートから分
離される。また、分離した反応生成物から発生した信号
を、そのような場合、使い捨て試験デバイス中で検出す
ることもできる。ある好ましい態様では、同じ濾過およ
び試験デバイスを用いて２種以上の異なるリガンドを同
時に検出することができる。そのような２種以上の標的
特異的結合リガンドを検出するための特異的結合方法
は、下記段階： Ａ）任意の順序で、 １）２種以上の標的特異的結合リガンドを含むことが予
測される流体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの各々の固定化第１レ
セプター、ならびに ３）各標的特異的結合リガンドおよび同一のリポーター
酵素から生成されたコンジュゲートである、２種以上の
水溶性コンジュゲート、を合わせて、前記固定化第１レ
セプターと、対応する標的特異的結合リガンドまたは水
溶性コンジュゲートのいずれかとの２種以上の異なる水
不溶性複合体を生成せしめること、 Ｂ）前記段階Ａ）で生成された水不溶性複合体を、未複
合化水溶性コンジュゲートを含有する上清から分離する
こと、 Ｃ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記上清
の試料、および前記標的特異的結合リガンドの各々の固
定化第２レセプターを合わせて（但し、前記固定化第２
レセプターは、水不溶性支持体の異なる領域に配置され
ている）、前記水不溶性支持体上のそれぞれ異なる領域
で、前記固定化第２レセプターと未複合化水溶性コンジ
ュゲートとの水不溶性反応生成物を生成せしめること、 Ｄ）前記段階Ｃ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｅ）前記流体試料中の前記２種以上の標的特異的結合リ
ガンドの測定として、前記水不溶性支持体上の異なる領
域の前記分離した水不溶性反応生成物により発生した信
号を検出すること、を含む。
【００３９】前記方法で複数のリガンドを検出するのに
有用な水不溶性支持体は、フィルム、紙、膜、もしくは
アッセイの試薬に対して不活性でありかつ異なる固定化
第２レセプター付着物を配置できるいずれか別の水不溶
性物質でありうる。そのような付着物は、ドット、スト
リップおよびシンボルを包含するいずれか所望の配置を
取ることができる（例えば、米国特許第 5,132,085号明
細書およびヨーロッパ特許第 0,439,210号明細書を参照
されたい）。好ましくは、固定化第２レセプターの付着
物は、単一試験デバイスの微孔質膜上の異なる粒状ドッ
トとして配置される。
有用な水不溶性支持体は、フィルム、紙、膜、もしくは
アッセイの試薬に対して不活性でありかつ異なる固定化
第２レセプター付着物を配置できるいずれか別の水不溶
性物質でありうる。そのような付着物は、ドット、スト
リップおよびシンボルを包含するいずれか所望の配置を
取ることができる（例えば、米国特許第 5,132,085号明
細書およびヨーロッパ特許第 0,439,210号明細書を参照
されたい）。好ましくは、固定化第２レセプターの付着
物は、単一試験デバイスの微孔質膜上の異なる粒状ドッ
トとして配置される。
【００４０】本明細書に記載されかつ本発明方法の実施
に際して用いられる試薬およびデバイスは、試験キット
の個別に包装された成分として供給することができる。
そのようなキットは、標的特異的結合リガンドとリポー
ター酵素との水溶性コンジュゲート、前記第１レセプタ
ー（固定化されているかまたは固定化されていない）お
よび前記固定化第２レセプターを含む。ほとんどの態様
では、試験キットは、これらの試薬すべて、ならびにリ
ポーター酵素に応じて比色、蛍光もしくは化学ルミネセ
ンス信号を提供するのに適する試薬、洗浄溶液、使い捨
て試験デバイス、濾過デバイス、そして本発明方法を実
施するための使用説明書を含む。また、キットは、２種
以上の標的特異的結合リガンドを検出するのに必要とさ
れる個々の成分、すなわち、複数の第１レセプター、第
２レセプターおよび当業者に理解されるであろう別の試
薬を含むこともできる。以下の実施例は、本発明を具体
的に説明するものであり、限定することを意図するもの
ではない。すべてのパーセンテージは、特に断らない限
り重量パーセントである。
に際して用いられる試薬およびデバイスは、試験キット
の個別に包装された成分として供給することができる。
そのようなキットは、標的特異的結合リガンドとリポー
ター酵素との水溶性コンジュゲート、前記第１レセプタ
ー（固定化されているかまたは固定化されていない）お
よび前記固定化第２レセプターを含む。ほとんどの態様
では、試験キットは、これらの試薬すべて、ならびにリ
ポーター酵素に応じて比色、蛍光もしくは化学ルミネセ
ンス信号を提供するのに適する試薬、洗浄溶液、使い捨
て試験デバイス、濾過デバイス、そして本発明方法を実
施するための使用説明書を含む。また、キットは、２種
以上の標的特異的結合リガンドを検出するのに必要とさ
れる個々の成分、すなわち、複数の第１レセプター、第
２レセプターおよび当業者に理解されるであろう別の試
薬を含むこともできる。以下の実施例は、本発明を具体
的に説明するものであり、限定することを意図するもの
ではない。すべてのパーセンテージは、特に断らない限
り重量パーセントである。
【００４１】実施例の材料および方法： 西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的なモノクローナル
抗体（レセプター）の調製： 前記第Ｉ表で6-89.1と示さ
れた代表的なモノクローナル・バインダー抗体を以下の
ように調製した。スプレーグ・ドーリーネズミに、市販
TDM/MPL アジュバント乳剤（RIBI Corporation）に西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ 400μｇ）を含む溶液を、４
週間おきに４回注射した。５回目の注射は、リン酸緩衝
溶液中西洋ワサビペルオキシダーゼ（ 400μｇ）を用い
て行った。３日後、免疫したラットの脾細胞を、従来の
方法を用いてSp2/0-Ag14骨髄腫セルライン由来の細胞と
融合させた。
抗体（レセプター）の調製： 前記第Ｉ表で6-89.1と示さ
れた代表的なモノクローナル・バインダー抗体を以下の
ように調製した。スプレーグ・ドーリーネズミに、市販
TDM/MPL アジュバント乳剤（RIBI Corporation）に西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ 400μｇ）を含む溶液を、４
週間おきに４回注射した。５回目の注射は、リン酸緩衝
溶液中西洋ワサビペルオキシダーゼ（ 400μｇ）を用い
て行った。３日後、免疫したラットの脾細胞を、従来の
方法を用いてSp2/0-Ag14骨髄腫セルライン由来の細胞と
融合させた。
【００４２】前記のように、西洋ワサビペルオキシダー
ゼと、抗マウス抗体とのコンジュゲートを被覆したマイ
クロタイタープレートのウェルに50μＬの培養液上清を
添加することにより、得られた西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに特異的な抗体のスクリーニングを実施した。ヤギ
抗マウスＩｇＧ Ｆｃとアルカリ性ホスファターゼとの
コンジュゲート（Jackson Immunoresearch）を添加し、
続いてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（ 1.5モル濃度，pH８）中にアルカリ性ホスファターゼ
の基質としてｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
（Sigma Chemical）を含むもの（４mg/mL ）を用いて信
号を発生させることにより、結合した抗体を検出した。
30分後に、従来の分光光度計を用いて色素信号を評価し
た。
ゼと、抗マウス抗体とのコンジュゲートを被覆したマイ
クロタイタープレートのウェルに50μＬの培養液上清を
添加することにより、得られた西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに特異的な抗体のスクリーニングを実施した。ヤギ
抗マウスＩｇＧ Ｆｃとアルカリ性ホスファターゼとの
コンジュゲート（Jackson Immunoresearch）を添加し、
続いてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（ 1.5モル濃度，pH８）中にアルカリ性ホスファターゼ
の基質としてｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
（Sigma Chemical）を含むもの（４mg/mL ）を用いて信
号を発生させることにより、結合した抗体を検出した。
30分後に、従来の分光光度計を用いて色素信号を評価し
た。
【００４３】西洋ワサビペルオキシダーゼ阻害機能につ
いてのスクリーニングを以下のように実施した。マイク
ロタイタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50
μＬ）を添加し、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン
（ 0.8％）を含むものを添加し、そして得られた混合物
を10分間室温でインキュベートした。クエン酸／リン酸
緩衝液（50μＬ，50ミリモル濃度，pH 5.5）中にｏ−フ
ェニレンジアミン（１mg/mL ）を含む溶液（ 100μＬ）
を添加し、そして色素信号の量を 450nmで従来の分光光
度計（ 100mOD/分）を用いて測定することにより、残留
西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を測定した。得られた
抗体6-89.1は、酵素活性を６％までしか減少させないこ
とが測定された。
いてのスクリーニングを以下のように実施した。マイク
ロタイタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50
μＬ）を添加し、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン
（ 0.8％）を含むものを添加し、そして得られた混合物
を10分間室温でインキュベートした。クエン酸／リン酸
緩衝液（50μＬ，50ミリモル濃度，pH 5.5）中にｏ−フ
ェニレンジアミン（１mg/mL ）を含む溶液（ 100μＬ）
を添加し、そして色素信号の量を 450nmで従来の分光光
度計（ 100mOD/分）を用いて測定することにより、残留
西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を測定した。得られた
抗体6-89.1は、酵素活性を６％までしか減少させないこ
とが測定された。
【００４４】先に「B5-10 」と明記されたモノクローナ
ル・バインダー抗体を同様に調製した。以下の実施例で
用いられる特定のバインダー抗体は、本発明に決定的な
ものではない。前記のようないずれかの適当なバインダ
ー抗体が同様に使用できる。バインダー抗体は、アッセ
イで使用する前に、リン酸緩衝溶液１mL当たり抗体約１
mgおよび0.02％メルチオレート保存剤を含む別個の保存
溶液として４℃で保存した。
ル・バインダー抗体を同様に調製した。以下の実施例で
用いられる特定のバインダー抗体は、本発明に決定的な
ものではない。前記のようないずれかの適当なバインダ
ー抗体が同様に使用できる。バインダー抗体は、アッセ
イで使用する前に、リン酸緩衝溶液１mL当たり抗体約１
mgおよび0.02％メルチオレート保存剤を含む別個の保存
溶液として４℃で保存した。
【００４５】ジフェニルヒダントインと西洋ワサビペル
オキシダーゼとのコンジュゲートの調製：ジフェニルヒ
ダントイン・ハプテンとアミン富化西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの水溶性コンジュゲートを以下のように調製
した。この調製法は単に代表的なものであり、本発明に
有用なコンジュゲートの調製に必須であるわけではな
い。別の調製方法も存在する。ハプテン、５，５−ジフ
ェニル−３−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシ
カルボニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニ
ル〕ブチル｝−２，４−イミダゾリジンジオンを、ヨー
ロッパ特許第 0 517 327号明細書（1993年５月５日発
行）に記載される方法により調製した。それは、その刊
行物では「HD-2」と明記されている。米国特許第 5,16
2,219号明細書（引用することにより本明細書に組み入
れられる）の実施例１の一般法を用いてアミン富化西洋
ワサビペルオキシダーゼを調製した。
オキシダーゼとのコンジュゲートの調製：ジフェニルヒ
ダントイン・ハプテンとアミン富化西洋ワサビペルオキ
シダーゼとの水溶性コンジュゲートを以下のように調製
した。この調製法は単に代表的なものであり、本発明に
有用なコンジュゲートの調製に必須であるわけではな
い。別の調製方法も存在する。ハプテン、５，５−ジフ
ェニル−３−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシ
カルボニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニ
ル〕ブチル｝−２，４−イミダゾリジンジオンを、ヨー
ロッパ特許第 0 517 327号明細書（1993年５月５日発
行）に記載される方法により調製した。それは、その刊
行物では「HD-2」と明記されている。米国特許第 5,16
2,219号明細書（引用することにより本明細書に組み入
れられる）の実施例１の一般法を用いてアミン富化西洋
ワサビペルオキシダーゼを調製した。
【００４６】４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリ
モル濃度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムア
ミド（ 1.031mL）に「HD-2」（15.5mg）を溶解すること
により、ハプテンをアミン富化西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合させた。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン−Ｎ′−（３−プロパンスルホン酸）緩衝液（pH
８， 0.1モル濃度）中にアミン富化西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（１mL，10mg/mL ）を含む溶液を、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）を含有する乾
燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ 500μＬ）と渦巻
混合しながら合わせ、次いで42℃の水浴に入れた。「HD
-2」溶液（ 500μＬ）を酵素溶液に渦巻混合しながら滴
下して、モル比を50:1にした。反応混合物を穏やかに攪
拌しながら42℃で１時間インキュベートした。
モル濃度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムア
ミド（ 1.031mL）に「HD-2」（15.5mg）を溶解すること
により、ハプテンをアミン富化西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合させた。Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン−Ｎ′−（３−プロパンスルホン酸）緩衝液（pH
８， 0.1モル濃度）中にアミン富化西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（１mL，10mg/mL ）を含む溶液を、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）を含有する乾
燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ 500μＬ）と渦巻
混合しながら合わせ、次いで42℃の水浴に入れた。「HD
-2」溶液（ 500μＬ）を酵素溶液に渦巻混合しながら滴
下して、モル比を50:1にした。反応混合物を穏やかに攪
拌しながら42℃で１時間インキュベートした。
【００４７】反応生成物を以下のように透析した。 ａ）４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃
度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド
（１Ｌ）と前記緩衝液（pH８， 0.1モル濃度）との比率
1:1の混合物に対して42℃で１時間。 ｂ）透析条件ａ）を繰り返した。 ｃ）ウシ血清アルブミン（ 0.1％）を含有する前記緩衝
液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対して８℃で 1.5
時間。 ｄ）前記緩衝液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対し
て８℃で18時間。 ｅ）塩化ナトリウム（0.15モル濃度）を含有するトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（ 1.5
Ｌ，0.04モル濃度，pH7.5 ）に対して８℃で２時間。 ｆ）透析条件ｅ）を４時間繰り返した。 生成物溶液は、分光光度計で測定するとジフェニルヒダ
ントイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲー
ト1.48mg/mL を含有した。
度）を含有する乾燥Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド
（１Ｌ）と前記緩衝液（pH８， 0.1モル濃度）との比率
1:1の混合物に対して42℃で１時間。 ｂ）透析条件ａ）を繰り返した。 ｃ）ウシ血清アルブミン（ 0.1％）を含有する前記緩衝
液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対して８℃で 1.5
時間。 ｄ）前記緩衝液（ 1.5Ｌ， 0.1モル濃度，pH８）に対し
て８℃で18時間。 ｅ）塩化ナトリウム（0.15モル濃度）を含有するトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（ 1.5
Ｌ，0.04モル濃度，pH7.5 ）に対して８℃で２時間。 ｆ）透析条件ｅ）を４時間繰り返した。 生成物溶液は、分光光度計で測定するとジフェニルヒダ
ントイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲー
ト1.48mg/mL を含有した。
【００４８】ＰＧＥ2 と西洋ワサビペルオキシダーゼと
のコンジュゲートの調製：ＰＧＥ2 と西洋ワサビペルオ
キシダーゼとの水溶性コンジュゲートを以下の方法で調
製した。しかしながらこの方法は、別の有用な方法も知
られているので、代表的なものである。水性Ｎ，Ｎ′−
ジメチルホルムアミド／ジメチルスルホキシド（それぞ
れ13％および26％）にＰＧＥ2 （５mg）を含む溶液（
0.5mL）を、等モル濃度量のトリブチルアミン（2.63μ
Ｌ）で処理し、氷浴中で冷却し、次いで等モル濃度量の
クロロ蟻酸イソブチル（1:100 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド溶液，1.94μＬ）と混合した。得られた混合物を
氷浴中で20分間攪拌した。
のコンジュゲートの調製：ＰＧＥ2 と西洋ワサビペルオ
キシダーゼとの水溶性コンジュゲートを以下の方法で調
製した。しかしながらこの方法は、別の有用な方法も知
られているので、代表的なものである。水性Ｎ，Ｎ′−
ジメチルホルムアミド／ジメチルスルホキシド（それぞ
れ13％および26％）にＰＧＥ2 （５mg）を含む溶液（
0.5mL）を、等モル濃度量のトリブチルアミン（2.63μ
Ｌ）で処理し、氷浴中で冷却し、次いで等モル濃度量の
クロロ蟻酸イソブチル（1:100 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド溶液，1.94μＬ）と混合した。得られた混合物を
氷浴中で20分間攪拌した。
【００４９】大規模に調製し、エチレンジアミンの代わ
りにＬ−リジンを用い、そして１−（４−モルホリノカ
ルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒ
ドロキシド，分子内塩の代わりに１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用
いたことを除いて、米国特許第 5,162,219号明細書（前
記）の実施例１の方法を用いてアミン富化西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを調製した。得られたアミン富化酵素
（ 19.33mg/mL ）の溶液の一部を３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.02モル濃度）で１mg
/mL に希釈した。水酸化ナトリウム（0.05モル濃度）を
用いてpHを９に上げ、次いで予め調製したＰＧＥ2 溶液
（ 1.493mL）を滴下して処理した。混合物を室温で90分
間攪拌し、そして希塩酸を用いてpHを７に下げた。水酸
化アンモニウム（ 0.578mL， 0.2モル濃度，pH７）を最
終濃度0.02モル濃度まで添加し、そして得られた混合物
を室温で２時間インキュベートした。得られたコンジュ
ゲート溶液をゲル濾過カラムで脱塩し、濃縮し、そして
最初に水に対して透析し、次いでリン酸緩衝溶液に対し
て透析した。生成物溶液は、分光光度計で測定するとＰ
ＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート
1.3mg/mL （収率58％）を含有した。
りにＬ−リジンを用い、そして１−（４−モルホリノカ
ルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒ
ドロキシド，分子内塩の代わりに１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用
いたことを除いて、米国特許第 5,162,219号明細書（前
記）の実施例１の方法を用いてアミン富化西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを調製した。得られたアミン富化酵素
（ 19.33mg/mL ）の溶液の一部を３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.02モル濃度）で１mg
/mL に希釈した。水酸化ナトリウム（0.05モル濃度）を
用いてpHを９に上げ、次いで予め調製したＰＧＥ2 溶液
（ 1.493mL）を滴下して処理した。混合物を室温で90分
間攪拌し、そして希塩酸を用いてpHを７に下げた。水酸
化アンモニウム（ 0.578mL， 0.2モル濃度，pH７）を最
終濃度0.02モル濃度まで添加し、そして得られた混合物
を室温で２時間インキュベートした。得られたコンジュ
ゲート溶液をゲル濾過カラムで脱塩し、濃縮し、そして
最初に水に対して透析し、次いでリン酸緩衝溶液に対し
て透析した。生成物溶液は、分光光度計で測定するとＰ
ＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート
1.3mg/mL （収率58％）を含有した。
【００５０】前記ジフェニルヒダントイン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（3.29×10-10 モル
濃度）およびＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・
コンジュゲート（１×10-9モル濃度）を、ウシ血清アル
ブミン（１％）およびメルチオレート（0.02％）を含む
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.
2モル濃度，pH７）中で別個に保存した。本実施例のア
ッセイで用いたジフェニルヒダントインに特異的なモノ
クローナル抗体ならびにＰＧＥ2 に特異的なモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体は、市販品を購入するか
または従来の方法を用いて調製した。これらの抗体は、
以下のようにポリ〔スチレン−コ−ｐ−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン〕（モノマー重量比9
2:8，平均径１μｍ）の粒子に別個に固定化した。モノ
クローナル・バインダー抗体B5-10 を同様に固定化し
た。
ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（3.29×10-10 モル
濃度）およびＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・
コンジュゲート（１×10-9モル濃度）を、ウシ血清アル
ブミン（１％）およびメルチオレート（0.02％）を含む
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（0.
2モル濃度，pH７）中で別個に保存した。本実施例のア
ッセイで用いたジフェニルヒダントインに特異的なモノ
クローナル抗体ならびにＰＧＥ2 に特異的なモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体は、市販品を購入するか
または従来の方法を用いて調製した。これらの抗体は、
以下のようにポリ〔スチレン−コ−ｐ−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン〕（モノマー重量比9
2:8，平均径１μｍ）の粒子に別個に固定化した。モノ
クローナル・バインダー抗体B5-10 を同様に固定化し
た。
【００５１】粒子の懸濁液（固体３％）をそれぞれの抗
体（ 0.829mg/mL ）とホウ酸緩衝液（ 0.1モル濃度，pH
8.5）中24時間室温で混合した。得られた付着量は、抗
ＰＧＥ2 抗体については粒子１ｇ当たり抗体約 0.025ｇ
であり、抗ジフェニルヒダントイン抗体については 0.0
25g/g であり、そして抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗
体については 0.013g/g であった。固定化第１もしくは
第２レセプターとして用いられる、得られた固定化抗体
を洗浄し、そしてアッセイで使用するためにＮ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ
ン酸緩衝液（ 0.1モル濃度，pH７）に懸濁させた。イソ
酵素Ｃを含有する西洋ワサビペルオキシダーゼを、Serv
ac, Inc.（南アフリカ）より入手した。
体（ 0.829mg/mL ）とホウ酸緩衝液（ 0.1モル濃度，pH
8.5）中24時間室温で混合した。得られた付着量は、抗
ＰＧＥ2 抗体については粒子１ｇ当たり抗体約 0.025ｇ
であり、抗ジフェニルヒダントイン抗体については 0.0
25g/g であり、そして抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗
体については 0.013g/g であった。固定化第１もしくは
第２レセプターとして用いられる、得られた固定化抗体
を洗浄し、そしてアッセイで使用するためにＮ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホ
ン酸緩衝液（ 0.1モル濃度，pH７）に懸濁させた。イソ
酵素Ｃを含有する西洋ワサビペルオキシダーゼを、Serv
ac, Inc.（南アフリカ）より入手した。
【００５２】Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに４，５−
ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色
素（１ｇ）を含む溶液（５mL）をポリビニルピロリドン
（ 125ｇ）の溶液（ 500mL）に添加して、１時間攪拌す
ることにより、酵素基質溶液を調製した。ジエチレント
リアミン五酢酸（１mL， 0.1モル濃度）を一塩基性リン
酸ナトリウム一水和物（13.8ｇ）の溶液（9500mL）に攪
拌しながら添加し、続いて３′−クロロ−４′−ヒドロ
キシアセトアニリド（ 9.4ｇ）を添加した。得られた混
合物を成分が溶解するまで攪拌し、そして50％水酸化ナ
トリウムでpHを 6.8に調整した。激しく攪拌しながら、
次いでそれをロイコ色素溶液と混合した。過酸化水素
（10mL，30％）を添加し、そして最終混合物をさらに15
分間攪拌した。
ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色
素（１ｇ）を含む溶液（５mL）をポリビニルピロリドン
（ 125ｇ）の溶液（ 500mL）に添加して、１時間攪拌す
ることにより、酵素基質溶液を調製した。ジエチレント
リアミン五酢酸（１mL， 0.1モル濃度）を一塩基性リン
酸ナトリウム一水和物（13.8ｇ）の溶液（9500mL）に攪
拌しながら添加し、続いて３′−クロロ−４′−ヒドロ
キシアセトアニリド（ 9.4ｇ）を添加した。得られた混
合物を成分が溶解するまで攪拌し、そして50％水酸化ナ
トリウムでpHを 6.8に調整した。激しく攪拌しながら、
次いでそれをロイコ色素溶液と混合した。過酸化水素
（10mL，30％）を添加し、そして最終混合物をさらに15
分間攪拌した。
【００５３】色素信号停止溶液は、リン酸緩衝溶液（0.
05モル濃度，pH 7.3）にベンゾヒドロキシム酸（ 0.1
％）およびメルチオレート（0.01％）を含むものであっ
た。洗浄溶液は、グリシン緩衝液（pH10）にテルジトー
ル（TERGITOL，商標）４陰イオン界面活性剤（1.35
％）、カゼイン（ 0.5％）およびメルチオレート（0.01
％）を含むものであった。標的ジフェニルヒダントイン
もしくはＰＧＥ2 の溶液は、ウシ血清アルブミン（１
％）を含む３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
緩衝液（ 0.2モル濃度，pH７）で調製した。
05モル濃度，pH 7.3）にベンゾヒドロキシム酸（ 0.1
％）およびメルチオレート（0.01％）を含むものであっ
た。洗浄溶液は、グリシン緩衝液（pH10）にテルジトー
ル（TERGITOL，商標）４陰イオン界面活性剤（1.35
％）、カゼイン（ 0.5％）およびメルチオレート（0.01
％）を含むものであった。標的ジフェニルヒダントイン
もしくはＰＧＥ2 の溶液は、ウシ血清アルブミン（１
％）を含む３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
緩衝液（ 0.2モル濃度，pH７）で調製した。
【００５４】固定化第１レセプターが使用される本発明
の態様では（実施例１および２）、米国特許第 4,948,5
61号明細書（前記）に記載のように、ロプロジン（LOPR
ODYNE,商標）微孔質膜（平均孔径 1.2μｍ）を含むフィ
ルター・キャップが嵌め込まれた管（容量６mL）を含む
抽出デバイスを用いて段階Ａ）および二次分離を実施し
た。第１レセプターが水溶性である該態様では、段階
Ａ）を試験管で実施した。本発明の後段階は、各々ロプ
ロジン（LOPRODYNE,商標）微孔質濾過膜（平均孔径 1.2
μｍ）を有する３つの試験ウェルを含む、エバルサイト
（EVALUSITE,商標）試験キット〔米国特許第 5,132,085
号明細書（Pelanek ）に記載されたものなど〕の使い捨
て試験デバイスで実施した。各ウェルの膜上に前記固定
化第２レセプターの懸濁液（ 1.8μＬ，固体 0.3％）を
塗布して乾燥した。
の態様では（実施例１および２）、米国特許第 4,948,5
61号明細書（前記）に記載のように、ロプロジン（LOPR
ODYNE,商標）微孔質膜（平均孔径 1.2μｍ）を含むフィ
ルター・キャップが嵌め込まれた管（容量６mL）を含む
抽出デバイスを用いて段階Ａ）および二次分離を実施し
た。第１レセプターが水溶性である該態様では、段階
Ａ）を試験管で実施した。本発明の後段階は、各々ロプ
ロジン（LOPRODYNE,商標）微孔質濾過膜（平均孔径 1.2
μｍ）を有する３つの試験ウェルを含む、エバルサイト
（EVALUSITE,商標）試験キット〔米国特許第 5,132,085
号明細書（Pelanek ）に記載されたものなど〕の使い捨
て試験デバイスで実施した。各ウェルの膜上に前記固定
化第２レセプターの懸濁液（ 1.8μＬ，固体 0.3％）を
塗布して乾燥した。
【００５５】実施例１ プロスタグランジンＰＧＥ2 に
ついてのアッセイ リガンド、ＰＧＥ2 を、以下のように本発明方法に従っ
て測定した。ミクロ遠心管に、順に、Ｎ−〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
緩衝液〕（ 0.107mL， 0.1モル濃度，pH７）、固定化抗
ＰＧＥ2 抗体試薬（ 0.028mL，固体 0.6％，最終濃度）
そして未標識化ＰＧＥ2 溶液（0.03mL，様々なリガンド
濃度）を添加し、続いて30分間室温でインキュベートし
た。次いで水溶性ＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダー
ゼ・コンジュゲート（0.03mL）を添加し、続いて５分間
室温でインキュベートした。遠心管中の内容物を８分間
遠心分離にかけた。
ついてのアッセイ リガンド、ＰＧＥ2 を、以下のように本発明方法に従っ
て測定した。ミクロ遠心管に、順に、Ｎ−〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
緩衝液〕（ 0.107mL， 0.1モル濃度，pH７）、固定化抗
ＰＧＥ2 抗体試薬（ 0.028mL，固体 0.6％，最終濃度）
そして未標識化ＰＧＥ2 溶液（0.03mL，様々なリガンド
濃度）を添加し、続いて30分間室温でインキュベートし
た。次いで水溶性ＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダー
ゼ・コンジュゲート（0.03mL）を添加し、続いて５分間
室温でインキュベートした。遠心管中の内容物を８分間
遠心分離にかけた。
【００５６】遠心管から固定化抗西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ抗体を含有する使い捨て試験デバイスの試験ウェ
ルに、上清をデカンテーションした。試験溶液中には十
分な標的ＰＧＥ2 が存在したので、上清は結合していな
いＰＧＥ2 と西洋ワサビペルオキシダーゼとの水溶性コ
ンジュゲートを含んでいた。５分間室温でインキュベー
ションした後、洗浄溶液（約 350μＬ）を試験ウェルに
添加し、排水し、続いて第２洗浄した。３滴の酵素基質
溶液を添加した。室温で２分間インキュベートした後、
色素信号停止溶液（３滴）を添加し、そして得られた色
素信号を評価した。
ダーゼ抗体を含有する使い捨て試験デバイスの試験ウェ
ルに、上清をデカンテーションした。試験溶液中には十
分な標的ＰＧＥ2 が存在したので、上清は結合していな
いＰＧＥ2 と西洋ワサビペルオキシダーゼとの水溶性コ
ンジュゲートを含んでいた。５分間室温でインキュベー
ションした後、洗浄溶液（約 350μＬ）を試験ウェルに
添加し、排水し、続いて第２洗浄した。３滴の酵素基質
溶液を添加した。室温で２分間インキュベートした後、
色素信号停止溶液（３滴）を添加し、そして得られた色
素信号を評価した。
【００５７】ミクロ遠心管に標的ＰＧＥ2 および固定化
抗ＰＧＥ2 抗体を存在させないで、陽性対照アッセイを
同様に実施した。そのような場合、すべての水溶性コン
ジュゲートが試験デバイス中で自由に固定化第２レセプ
ター（抗体）と複合化して最大色素信号を提供した。ミ
クロ遠心管に標的ＰＧＥ2 を存在させないが、固定化抗
ＰＧＥ2 抗体を存在させて、陰性対照アッセイを同様に
実施した。得られた色素信号はバックグラウンドのみに
よるものであった。
抗ＰＧＥ2 抗体を存在させないで、陽性対照アッセイを
同様に実施した。そのような場合、すべての水溶性コン
ジュゲートが試験デバイス中で自由に固定化第２レセプ
ター（抗体）と複合化して最大色素信号を提供した。ミ
クロ遠心管に標的ＰＧＥ2 を存在させないが、固定化抗
ＰＧＥ2 抗体を存在させて、陰性対照アッセイを同様に
実施した。得られた色素信号はバックグラウンドのみに
よるものであった。
【００５８】バックグラウンドを越える色素信号の滴定
を、ＰＧＥ2 １×10-9〜３×10-9モル濃度間の検出限界
を伴うＰＧＥ2 濃度の関数として観察した。図１および
２は、陽性および陰性対照（それぞれ曲線１および３）
ならびに本発明のアッセイ（曲線２）を包含するこれら
のアッセイの結果を、用量反応曲線の形で示すものであ
る。図１では、色素信号（色濃度チャートから認められ
た色スコア）をｙ軸にプロットし、そしてＰＧＥ2 濃度
〔log(PGE2）〕をｘ軸にプロットした。図２は同様のプ
ロットだが、しかし色素信号（透過濃度）をｙ軸にプロ
ットした。このアッセイは、ある種の歯周疾患について
のマーカーであるＰＧＥ2 の高感度な検出を具体的に示
すものである。
を、ＰＧＥ2 １×10-9〜３×10-9モル濃度間の検出限界
を伴うＰＧＥ2 濃度の関数として観察した。図１および
２は、陽性および陰性対照（それぞれ曲線１および３）
ならびに本発明のアッセイ（曲線２）を包含するこれら
のアッセイの結果を、用量反応曲線の形で示すものであ
る。図１では、色素信号（色濃度チャートから認められ
た色スコア）をｙ軸にプロットし、そしてＰＧＥ2 濃度
〔log(PGE2）〕をｘ軸にプロットした。図２は同様のプ
ロットだが、しかし色素信号（透過濃度）をｙ軸にプロ
ットした。このアッセイは、ある種の歯周疾患について
のマーカーであるＰＧＥ2 の高感度な検出を具体的に示
すものである。
【００５９】実施例２ ジフェニルヒダントインについ
てのアッセイ リガンド、ジフェニルヒダントイン（フェニトイン）
を、以下のように本発明方法に従って測定した。抽出デ
バイスに、順に、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノメタンスルホン酸緩衝液〕（ 0.211m
L， 0.1モル濃度，pH７）、固定化抗ジフェニルヒダン
トイン抗体試薬（ 0.059mL，固体 0.2％，最終濃度）そ
して未標識化ジフェニルヒダントイン溶液（0.03mL，様
々なリガンド濃度）を添加し、続いて５分間室温でイン
キュベートした。次いで水溶性ジフェニルヒダントイン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（0.03
mL）を添加し、続いて５分間室温でインキュベートし
た。次いでフィルター・キャップを抽出管に嵌めた。
てのアッセイ リガンド、ジフェニルヒダントイン（フェニトイン）
を、以下のように本発明方法に従って測定した。抽出デ
バイスに、順に、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノメタンスルホン酸緩衝液〕（ 0.211m
L， 0.1モル濃度，pH７）、固定化抗ジフェニルヒダン
トイン抗体試薬（ 0.059mL，固体 0.2％，最終濃度）そ
して未標識化ジフェニルヒダントイン溶液（0.03mL，様
々なリガンド濃度）を添加し、続いて５分間室温でイン
キュベートした。次いで水溶性ジフェニルヒダントイン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（0.03
mL）を添加し、続いて５分間室温でインキュベートし
た。次いでフィルター・キャップを抽出管に嵌めた。
【００６０】抽出管からフィルター・キャップを通して
上清を絞り出し、そして第２レセプターとして固定化抗
ジフェニルヒダントイン抗体を含有する使い捨て試験デ
バイスの試験ウェルに塗布した。十分な標的ジフェニル
ヒダントインが存在したので、上清は結合していないジ
フェニルヒダントインと西洋ワサビペルオキシダーゼと
の水溶性コンジュゲートを含んでいた。５分間室温でイ
ンキュベーションした後、洗浄溶液（約 350μＬ）を試
験ウェルに添加し、排水し、続いて第２洗浄した。３滴
の酵素基質溶液を添加した。室温で２分間インキュベー
トした後、色素信号停止溶液（３滴）を添加し、そして
得られた色素信号を評価した。
上清を絞り出し、そして第２レセプターとして固定化抗
ジフェニルヒダントイン抗体を含有する使い捨て試験デ
バイスの試験ウェルに塗布した。十分な標的ジフェニル
ヒダントインが存在したので、上清は結合していないジ
フェニルヒダントインと西洋ワサビペルオキシダーゼと
の水溶性コンジュゲートを含んでいた。５分間室温でイ
ンキュベーションした後、洗浄溶液（約 350μＬ）を試
験ウェルに添加し、排水し、続いて第２洗浄した。３滴
の酵素基質溶液を添加した。室温で２分間インキュベー
トした後、色素信号停止溶液（３滴）を添加し、そして
得られた色素信号を評価した。
【００６１】陽性および陰性対照アッセイを実施例１に
記載した方法と同様に実施した。バックグラウンドを越
える色素信号の滴定を、ジフェニルヒダントイン１×10
-8〜３×10-8モル濃度間の検出限界を伴うジフェニルヒ
ダントイン濃度の関数として観察した。図３および４
は、陽性および陰性対照（それぞれ曲線１および３）な
らびに本発明のアッセイ（曲線２）を包含するこれらの
アッセイの結果を、用量反応曲線の形で示すものであ
る。図３では、色素信号（色濃度チャートから認められ
た色スコア）をｙ軸にプロットし、そしてジフェニルヒ
ダントイン濃度〔log(ジフェニルヒダントイン）〕をｘ
軸にプロットした。図４は同様のプロットだが、しかし
色素信号（透過濃度）をｙ軸にプロットした。
記載した方法と同様に実施した。バックグラウンドを越
える色素信号の滴定を、ジフェニルヒダントイン１×10
-8〜３×10-8モル濃度間の検出限界を伴うジフェニルヒ
ダントイン濃度の関数として観察した。図３および４
は、陽性および陰性対照（それぞれ曲線１および３）な
らびに本発明のアッセイ（曲線２）を包含するこれらの
アッセイの結果を、用量反応曲線の形で示すものであ
る。図３では、色素信号（色濃度チャートから認められ
た色スコア）をｙ軸にプロットし、そしてジフェニルヒ
ダントイン濃度〔log(ジフェニルヒダントイン）〕をｘ
軸にプロットした。図４は同様のプロットだが、しかし
色素信号（透過濃度）をｙ軸にプロットした。
【００６２】実施例３ プロスタグランジンＰＧＥ2 に
ついての別のアッセイ リガンド、ＰＧＥ2 を、水溶性（非固定化）第１レセプ
ターを用いて以下のように本発明の別の態様に従って測
定した。試験管に、順に、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液〕
（ 0.1モル濃度，pH７）中の抗ＰＧＥ2 抗体（ 0.270m
L，0.00316mg/mL ）および未標識化ＰＧＥ2 溶液（0.03
mL，実施例１と同様に様々なリガンド濃度）を添加し、
続いて５分間室温でインキュベートした。次いで水溶性
ＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲー
ト（0.03mL）を添加し、続いて５分間室温でインキュベ
ートした。
ついての別のアッセイ リガンド、ＰＧＥ2 を、水溶性（非固定化）第１レセプ
ターを用いて以下のように本発明の別の態様に従って測
定した。試験管に、順に、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液〕
（ 0.1モル濃度，pH７）中の抗ＰＧＥ2 抗体（ 0.270m
L，0.00316mg/mL ）および未標識化ＰＧＥ2 溶液（0.03
mL，実施例１と同様に様々なリガンド濃度）を添加し、
続いて５分間室温でインキュベートした。次いで水溶性
ＰＧＥ2 −西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲー
ト（0.03mL）を添加し、続いて５分間室温でインキュベ
ートした。
【００６３】固定化モノクローナル抗ＰＧＥ2 抗体を含
有する使い捨て試験デバイスの試験ウェルに、内容物を
デカンテーションした。試験溶液中には十分な標的ＰＧ
Ｅ2が存在したので、上清は結合していないＰＧＥ2 と
西洋ワサビペルオキシダーゼとの水溶性コンジュゲート
を含んでいた。５分間室温でインキュベートした後、洗
浄溶液（約 350μＬ）を試験ウェルに添加し、排水し、
続いて第２洗浄した。３滴の酵素基質溶液を添加した。
室温で２分間インキュベートした後、色素信号停止溶液
（３滴）を添加し、そして得られた色素信号を評価し
た。
有する使い捨て試験デバイスの試験ウェルに、内容物を
デカンテーションした。試験溶液中には十分な標的ＰＧ
Ｅ2が存在したので、上清は結合していないＰＧＥ2 と
西洋ワサビペルオキシダーゼとの水溶性コンジュゲート
を含んでいた。５分間室温でインキュベートした後、洗
浄溶液（約 350μＬ）を試験ウェルに添加し、排水し、
続いて第２洗浄した。３滴の酵素基質溶液を添加した。
室温で２分間インキュベートした後、色素信号停止溶液
（３滴）を添加し、そして得られた色素信号を評価し
た。
【００６４】試験管に標的ＰＧＥ2 および抗ＰＧＥ2 抗
体を存在させないで、陽性対照アッセイを同様に実施し
た。そのような場合、すべての水溶性コンジュゲートが
試験デバイス中で自由に固定化第２レセプター（抗体）
と複合化して最大色素信号を提供した。試験管に標的Ｐ
ＧＥ2 を存在させないが、抗ＰＧＥ2 抗体を存在させ
て、陰性対照アッセイを同様に実施した。得られた色素
信号はバックグラウンドのみによるものであった。
体を存在させないで、陽性対照アッセイを同様に実施し
た。そのような場合、すべての水溶性コンジュゲートが
試験デバイス中で自由に固定化第２レセプター（抗体）
と複合化して最大色素信号を提供した。試験管に標的Ｐ
ＧＥ2 を存在させないが、抗ＰＧＥ2 抗体を存在させ
て、陰性対照アッセイを同様に実施した。得られた色素
信号はバックグラウンドのみによるものであった。
【００６５】バックグラウンドを越える色素信号の滴定
を、ＰＧＥ2 １×10-8〜３×10-8モル濃度間の検出限界
を伴うＰＧＥ2 濃度の関数として観察した。このアッセ
イは、ある種の歯周疾患についてのマーカーであるＰＧ
Ｅ2 の高感度な検出を具体的に示すものである。本発明
をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載してきた
が、修正および変更が本発明の精神および範囲内で可能
であることは理解されるであろう。
を、ＰＧＥ2 １×10-8〜３×10-8モル濃度間の検出限界
を伴うＰＧＥ2 濃度の関数として観察した。このアッセ
イは、ある種の歯周疾患についてのマーカーであるＰＧ
Ｅ2 の高感度な検出を具体的に示すものである。本発明
をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載してきた
が、修正および変更が本発明の精神および範囲内で可能
であることは理解されるであろう。
【図１】図１は、log ＰＧＥ2 濃度に対して色素信号色
スコアをプロットしたグラフであり、実施例１により詳
細に記載されている。
スコアをプロットしたグラフであり、実施例１により詳
細に記載されている。
【図２】図２は、log ＰＧＥ2 濃度に対して色素信号透
過濃度値をプロットしたグラフであり、実施例１により
詳細に記載されている。
過濃度値をプロットしたグラフであり、実施例１により
詳細に記載されている。
【図３】図３は、log ジフェニルヒダントイン濃度に対
して色素信号色スコアをプロットしたグラフであり、実
施例２により詳細に記載されている。
して色素信号色スコアをプロットしたグラフであり、実
施例２により詳細に記載されている。
【図４】図４は、log ジフェニルヒダントイン濃度に対
して色素信号透過濃度値をプロットしたグラフであり、
実施例２により詳細に記載されている。
して色素信号透過濃度値をプロットしたグラフであり、
実施例２により詳細に記載されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン エー．スナイダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14626, ロチェスター，ハーベスト ドライブ 226
Claims (21)
- 【請求項１】 下記段階： Ａ）任意の順序で、 １）標的特異的結合リガンドを含むことが予測される流
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの第１レセプター、お
よび ３）前記標的特異的結合リガンドとリポーター酵素との
水溶性コンジュゲート、を合わせて、 前記第１レセプターと、前記標的特異的結合リガンドま
たは前記水溶性コンジュゲートのいずれかとの複合体を
含有する混合物を生成せしめること、 Ｂ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記混合
物の試料および固定化第２レセプターを合わせて（但
し、前記第２レセプターは、前記リポーター酵素または
前記標的特異的結合リガンドのいずれかに特異的であ
る）、 前記固定化第２レセプターと未複合化水溶性コンジュゲ
ートとの水不溶性反応生成物を生成せしめること（但
し、前記第１レセプターが水溶性であるときには、前記
固定化第２レセプターが前記標的特異的結合リガンドに
特異的であることを条件とする）、 Ｃ）前記段階Ｂ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｄ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記分離した水不溶性反応生成物により発生
した信号を検出すること、を含む、標的特異的結合リガ
ンドを検出するための特異的結合方法。 - 【請求項２】 前記第１および第２レセプターが前記標
的特異的結合リガンドの抗体である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 前記リポーター酵素が、ペルオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼまたはグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記リポーター酵素が西洋ワサビペルオ
キシダーゼである、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記検出段階Ｄ）が、適当な基質の存在
下で前記リポーター酵素により発生した比色信号を評価
することによって実施される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 低分子量標的特異的結合リガンドを検出
するための方法であって、前記第１レセプターが前記低
分子量標的特異的結合リガンドに特異的な抗体であり、
かつ前記固定化第２レセプターが前記低分子量標的特異
的結合リガンドまたは前記リポーター酵素のいずれかに
特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 プロスタグランジンＥ2 （ＰＧＥ2 ）を
検出するための方法であって、前記リポーター酵素が西
洋ワサビペルオキシダーゼであり、前記第１レセプター
がＰＧＥ2 に特異的な抗体であり、かつ前記固定化第２
レセプターがＰＧＥ2 または西洋ワサビペルオキシダー
ゼのいずれかに特異的な抗体である、請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】 前記第１レセプターが固定化されてお
り、かつ前記段階Ａ）で生成された複合体が水不溶性で
あり、そしてさらに、段階Ａ）とＢ）との間に、前記水
不溶性複合体が未複合化水溶性コンジュゲートを含有す
る上清から分離される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記第１および第２レセプターがポリマ
ー粒子上に固定化されている、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記固定化第１レセプターが前記標的
特異的結合リガンドの抗体であり、かつ前記固定化第２
レセプターが前記リポーター酵素の抗体である、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記流体試料および前記固定化第１レ
セプターが、前記水溶性コンジュゲートと接触せしめら
れる前に混合され、 前記段階Ａ）で生成された水不溶性複合体が、濾過によ
り前記上清中の前記未複合化水溶性コンジュゲートから
分離され、 前記固定化第２レセプターが、段階Ｃ）で前記上清を濾
過した濾過膜上に配置されている、請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１２】 下記段階： Ａ）任意の順序で、 １）２種以上の標的特異的結合リガンドを含むことが予
測される流体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの各々の固定化第１レ
セプター、ならびに ３）各標的特異的結合リガンドおよび同一のリポーター
酵素から生成されたコンジュゲートである、２種以上の
水溶性コンジュゲート、を合わせて、 前記固定化第１レセプターと、対応する標的特異的結合
リガンドまたは水溶性コンジュゲートのいずれかとの２
種以上の異なる水不溶性複合体を生成せしめること、 Ｂ）前記段階Ａ）で生成された水不溶性複合体を、未複
合化水溶性コンジュゲートを含有する上清から分離する
こと、 Ｃ）未複合化水溶性コンジュゲートを含有する前記上清
の試料、および前記標的特異的結合リガンドの各々の固
定化第２レセプターを合わせて（但し、前記固定化第２
レセプターは、水不溶性支持体の異なる領域に配置され
ている）、 前記水不溶性支持体上のそれぞれ異なる領域で、前記固
定化第２レセプターと未複合化水溶性コンジュゲートと
の水不溶性反応生成物を生成せしめること、 Ｄ）前記段階Ｃ）で生成された水不溶性反応生成物を、
未反応水溶性コンジュゲートから分離すること、そして Ｅ）前記流体試料中の前記２種以上の標的特異的結合リ
ガンドの測定として、前記水不溶性支持体上の異なる領
域の前記分離した水不溶性反応生成物により発生した信
号を検出すること、を含む、２種以上の標的特異的結合
リガンドを検出するための特異的結合方法。 - 【請求項１３】 個々のパックに、 標的特異的結合リガンドとリポーター酵素との水溶性コ
ンジュゲート、 前記標的特異的結合リガンドの第１レセプター、および
固定化第２レセプター（但し、前記第２レセプターは、
前記リポーター酵素または前記標的特異的結合リガンド
のいずれかに特異的であるが、前記第１レセプターが水
溶性であるときには、前記固定化第２レセプターが前記
標的特異的結合リガンドに特異的であることを条件とす
る）、を含む、標的特異的結合リガンドの検出に有用な
試験キット。 - 【請求項１４】 個々のパックに、少なくとも１つの以
下のもの：前記リポーター酵素に応じて比色、蛍光もし
くは化学ルミネセンス信号を提供するための１つ以上の
試薬、 洗浄溶液、 使い捨て試験デバイス、または濾過デバイス、をさらに
含む、請求項１３に記載の試験キット。 - 【請求項１５】 前記第１および第２レセプターがポリ
マー粒子上に固定化されている、請求項１３に記載の試
験キット。 - 【請求項１６】 前記第１および第２レセプターが前記
標的特異的結合リガンドの抗体である、請求項１３に記
載の試験キット。 - 【請求項１７】 前記第１レセプターが前記標的特異的
結合リガンドの抗体であり、かつ前記第２レセプターが
前記リポーター酵素の抗体である、請求項１３に記載の
試験キット。 - 【請求項１８】 前記リポーター酵素がペルオキシダー
ゼであり、かつ前記第２レセプターがペルオキシダーゼ
の抗体である、請求項１７に記載の試験キット。 - 【請求項１９】 前記第１および第２レセプターがＰＧ
Ｅ2 の抗体であり、かつ前記リポーター酵素が西洋ワサ
ビペルオキシダーゼである、請求項１３に記載の試験キ
ット。 - 【請求項２０】 前記第２レセプターが、前記標的特異
的結合リガンドまたは前記リポーター酵素のいずれかに
特異的な抗体である、前記第２レセプターを付着させた
ポリマー粒子を配置した微孔質濾過膜を有する使い捨て
試験デバイスをさらに含む、請求項１３に記載の試験キ
ット。 - 【請求項２１】 個々のパックに、 各標的特異的結合リガンドおよび同一のリポーター酵素
から生成されたコンジュゲートである、２種以上の水溶
性コンジュゲート、 前記標的特異的結合リガンドの各々の固定化第１レセプ
ター、ならびに前記標的特異的結合リガンドの各々の固
定化第２レセプター、を含む、２種以上の標的特異的結
合リガンドの検出に有用な試験キット。
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