JPH0736015B2 - 診断試験キットおよびリガンドの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、過酸化水素およびペルオキシダーゼのような
過酸化物作用性（peroxidative）物質の存在下で染料を
供給するイミダゾール系ロイコ染料を含んでなる染料供
給性組成物を使用した試験キット並びに前記染料供給性
組成物およびリガンドに対するペルオキシダーゼ標識レ
セプターを用いるリガンド測定方法に関する。本発明
は、診断手段にとって有用である。

〔従来の技術〕

低濃度で生物学的流体に存在する生物学的な物質の迅速
かつ正確な測定のための診療、調査および診断方法は、
依然として必要性がある。例えば、血液、尿、唾液、膣
分泌物、精液および他の生物学的流体における医薬、麻
薬、ホルモン、ステロイド、ポリペプチド、プロスタグ
ランディンまたは感染性の生物の存在は、適切な診断ま
たは処置のためには正確かつ迅速な方法で測定しなけれ
ばならない。

かかる測定を実施するために、検出される物質（本明細
書では「リガンド」という）および該物質と特異的に反
応するレセプター間の特異的な結合反応を利用する生物
学的な物質の単離および同定のための多様な方法が提案
されている。放射性、蛍光または酵素標識が、得られる
反応複合体を測定するために使用されてきた。最近で
は、酵素標識の使用が、放射性および蛍光標識の使用に
対して種々の利点があることからますます多くの注目を
集めている。酵素標識を用いるアッセイは、当該技術分
野で競合的エンザイムイムノアッセイ（EIA）並びに直
接的および間接的な酵素結合性イムノソルベンドアッセ
イ（ELISA）として知られているものを包含する。

開発されている別の種類のアッセイは、当該技術分野で
イムノメトリックまたは“サンドイッチ（sandwich）”
アッセイとして知られている。かかるアッセイは、リガ
ンド（例えば、抗原）を妨害しない方法でかつ別のエピ
トープ部位で標識化合物に結合した２以上のレセプター
分子（例えば、抗体）で“はさみ込んだもの（sandwich
ing）”を含む。殆どのサンドイッチアッセイでは、１
以上のレセプター分子が不溶性担体、例えば小粒子、
膜、プレート、または類似の対象物上に適当な固定化さ
れており、そして他のレセプターは、例えば酵素により
適当に標識されている。

ペルオキシダーゼは、すべての種類の特異的バインディ
ングアッセイを包含するいろいろなアッセイに標識とし
て用いられている酵素の一つである。ペルオキシダーゼ
は、基質としての過酸化水素に作用し、種々の色原体ま
たは染料供給性物質を酸化して、存在するペルオキシダ
ーゼの量に比例した検出可能な種を与えることができ
る。多様な染料供給性物質が、当該技術分野で既知であ
り、ベンジジンおよびそれらの誘導体を包含している。
米国特許第4,596,770号明細書には、テトラアルキルベ
ンジジンがイムノアッセイのペルオキシダーゼ標識抗体
を伴う染料供給性組成物としてのＮ−メチルピロリドン
と一緒に使用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

かかる組成物は、調製して直ちに溶液アッセイに使用さ
れる場合に有用であるとは言え、テトラアルキルベンジ
ジンの使用は、リガンドが試験液中に低濃度で存在する
ような一定のアッセイでは十分な感度を示さないことが
わかっている。また、ベンジジン組成物は、かなり不安
定でもある。さらに、濾過膜を用いて実施される一定の
アッセイでは、テトラメチルベンジジンのようなテトラ
アルキルベンジジンに由来する染料が水溶性であり、そ
の他意図するところとは無関係に膜を通過する場合があ
るので、膜を前処理しなけらばならない。長期貯蔵のた
めのキット状にパッケージ化することができるより安定
な染料供給性組成物を入手することは有用であろう。ま
た、医院や家庭を含む多様な環境下で使用することを目
的として販売し得る、より感度の高い診断方法を入手す
ることも要望されるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

上記した課題は、水溶性または水分散性ポリマーと、電
子移動剤と過酸化水素および過酸化物作用性物質の存在
下で染料を供給し得るイミダゾール系ロイコ染料とを含
んでなり、前記ポリマー対前記ロイコ染料の重量比が1
0,000:1〜100:1で、かつ前記ポリマーがビニルピロリド
ンの重合体、アクリルアミドの重合体、アクリル酸の重
合体、メタクリル酸の重合体、ポリエチレングリコール
またはポリアミンである染料供給性組成物によって解決
される。

さらに本発明が提供するのは、ペルオキシダーゼの触媒
作用に由来する被分析物の測定のための診断試験キット
であって、 （ａ）ペルオキシダーゼに対する基質、 （ｂ）前記の染料供給性組成物、並びに （ｃ）イムノアッセイで物質を分離するための濾過膜を
含む使い捨て試験装置、を含んでなる診断試験キットで
ある。

またさらに、 A.リガンドに対するペルオキシダーゼ標識レセプター
と、液体試料を接触させてレセプターとリガンドの反応
生成物を形成し、 B.接触段階（Ａ）より前にか、それと同時にか、または
その後に、前記の染料供給性組成物と液体試料を接触
し、 C.接触段階（Ｂ）より前にか、それと同時にか、または
その後に、濾過膜を用いて未反応物質から前記反応生成
物を分離し、そして D.前記濾過膜上の前記反応生成物の存否を測定するこ
と、を含んでなる水溶液におけるリガンドの測定方法も
本発明により提供される。

〔実施の態様〕

本発明の組成物は、ペルオキシダーゼのような過酸化物
作用性物質および過酸化水素の存在下で染料を供給する
ことにより有用である。本発明の組成物は、過酸化水素
またはペルオキシダーゼ、あるいは１以上の反応により
反応して過酸化水素を生ずるすべての被分析物の測定に
使用することができる。例えば、組成物は、一連の反応
にペルオキシダーゼが使用される場合に、被分析物の存
在の結果として検出可能な種を生ずるグルコース、ガラ
クトース、アミノ酸、尿酸、トリグリセリド、クレアチ
ンキナーゼ（そのものまたはそれらのアイソザイム）、
コレステロールおよび当該技術分野で既知のその他のも
のの如き被分析物のアッセイに有利に用いることができ
る。好ましくは、本発明の組成物は、以下により詳細に
記載されるように、イムノアッセイのような特異的なバ
インディング（binding）反応を伴うアッセイにおいて
使用される。

本発明の組成物は、１以上の水溶性または水分散性ポリ
マー、例えばビニルピロリドンの重合体、アクリルアミ
ドの重合体、アクリル酸の重合体、メタクリル酸の重合
体、ポリエチレングリコールおよびポリアミン類を含
む。これらのポリマーは、ホモポリマーかコポリマーの
いずれであってもよい。限定されるものではないが、有
用なポリマーの代表例としては、ポリアクリル酸、ポリ
メタクリル酸、コポリ（アクリル酸−アクリル酸メチ
ル）（重量比、90:10）、ポリアクリルアミド、コポリ
（アクリルアミド−アクリル酸）（重量比、50:50）、
米国特許第3,702,249号明細書および同第4,689,359号明
細書に記載されているもののようなポリアミン類が挙げ
られる。これらのポリマーは、水溶液におけるロイコ染
料の維持を容易にし、ならびに濾過膜のような支持体上
に、その膜の前処理を要することなく得られる染料の固
定化を促進する。

また、これらのポリマーは、本発明の機能またはロイコ
染料を妨害しない他のエチレン系不飽和重合性モノマー
を少量（即ち、50モル％未満）含むこともできる。殊
に、ポリビニルピロリドンが好ましいポリマーである。

また、本発明の組成物は、過酸化水素および過酸化物作
用性物質の存在下で染料を供給し得る１以上のロイコ染
料も含む。得られる染料は、一般に電磁スペクトラムの
可視領域（通常400〜700nm）で検出できる。好ましく
は、染料は500〜650nmで測定される。

本発明において有用なイミダゾール系ロイコ染料は、ジ
アリールイミダゾール系ロイコ染料であるか、またはト
リアリールイミダゾール系ロイコ染料である。数多くの
有用な化合物は、当該技術分野で既知であり、米国特許
第4,089,747号明細書並びにそこに引用されているヨー
ロッパ特許出願公開第122,641号公報および特開昭58−4
5,557号公報に記載されているものが含まれる。

次の一般式 （上式中、R¹，R²およびR³は、それらの少なくとも１つ
が、炭素原子数18以下のオルソまたはパラ−ヒドロキシ
置換アリール基であるような有機基であり、他の２つの
基は、炭素をベースにした電極を用いる標識カロメル電
極に対してサイクリック・ボルタンミトリー（cyclic v
oltammetry）により測定した場合に、イミダゾール酸化
電位が−70〜＋110mVであるように選ばれるアリール基
である。）で示されるトリアリールイミダゾール類が特
に有用である。なお、酸化電位の測定は、通常の電気化
学的な手段（例えば、Sawyer等、Experimental Electro
chemistry for Chemists,John Wiley ＆ Sons,New Yor
k,1974、参照）に従い行うことができる。好ましいトリ
アリールイミダゾール化合物類およびそれらの製造方法
のより詳細は、米国特許第4,089,747号明細書に示され
ている。

具体的に有用なトリアリールイミダゾールロイコ染料と
しては、 ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾール、 ２−（3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）−4,5
−ジフェニルイミダゾール、 ２−（３−ブロモ−５−メトキシ−４−ヒドロキシフェ
ニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾ
ール、 4,5−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４
−ヒドロキシフェニル）イミダゾール、 4,5−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４
−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール、 ２−（４−ヒドロキシフェニル）−4,5−ビス（４−メ
トキシフェニル）イミダゾール、および 4,5−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４
−ヒドロキシ）−3,5−ジメトキシフェニルイミダゾー
ルが挙げられる。

本発明の組成物におけるロイコ染料およびポリマーは、
組成物の使用方法に応じて多様であることができる。一
般に、ロイコ染料は、10^-6〜10^-3モル濃度、好ましくは
10^-5〜10^-4モル濃度で存在する。ポリマー量は、使用さ
れるロイコ染料の量に依存する。一般に、前述の優位性
を達成するには、ポリマー対ロイコ染料の重量比は、通
常10,000:1〜100:1、好ましくは5,000:1〜500:1であ
る。

前記組成物の成分は、多数の供給源から商業的に容易に
入手できる。他方、これらは、米国特許第4,089,747号
明細書および他に上記の引例に記載されているような公
知の出発原料および公知の方法を用いて製造することも
できる。

組成物は、一般に、たとえ一の態様では水性媒体中に存
在するとしても、ロイコ染料または他の疎水性試薬を溶
解するために少量の水混和性の有機溶媒を含むことがで
きる。この様式では、メタノールまたは他のアルコール
類、アセトンまたはアセトニトリルが有用である。好ま
しくは、ロイコ染料は、直接ポリマー水溶液中に溶解さ
れる。

また、本発明の組成物は、具体的な使用の必要に応じて
他の成分を含むことができる。例えば、組成物は、過酸
化水素か、または過酸化物作用性物質のどちらかを含む
こともできるが、添加後にロイコ染料が早期に酸化され
ることから、両者を同時に含ませることはできない。過
酸化物作用性物質は、過酸化水素または他の過酸化物に
よって、他の物質の酸化を促進し得るものである。限定
されるものではないが、かかる物質は、天然および合成
ペルオキシダーゼ、チトクローム、ヘミン、ヘモグロビ
ン構成物、アルカリヘマチン、チオシアン化物、タンニ
ン酸鉄およびクロム酸塩等を包含する。ペルオキシダー
ゼが、特に有用な過酸化物作用性物質である。

また、本発明の組成物は、過酸化物作用性物質が結合し
ている特異的バインディング化合物、例えばペルオキシ
ダーゼ標識免疫反応性化合物を含むこともできる。特異
的バインディング化合物は、他の化合物と特異的に反応
する化学的または生物学的な物質、例えばビオチンに対
するアビジン、または対応する抗原に対する抗体であ
る。これらの物質は、以下にさらに詳細に記載する。

電子移動剤、すなわち、酸化−還元反応における化合物
間で１以上の電子の移動を促進する化合物を、組成物中
に含ませることもできる。数多くの有用な電子移動剤
が、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第4,74
6,607号明細書に記載されているようなフェナジンメト
スルフェート、ベンゾキノンまたはナフトキノンが挙げ
られる。特に有用な電子移動剤は、ヨーロッパ特許出願
公開第252,747号公報に記載されているフェノール類お
よびアニリン類である。

本発明の好ましい組成物は、pH6〜８に緩衝化され、そ
して過酸化水素、フェノール系の電子移動剤、ポリビニ
ルピロリドンおよび最も好ましいものとして２−（４−
ヒドロキシ−3,5−ジ−メトキシフェニル）−4,5−ビス
（４−メトキシフェニル）イミダゾールを有する前述の
好ましいロイコ染料の一覧から選ばれるトリアリールイ
ミダゾール系ロイコ染料を含んでなる。

本発明の診断試験キットは、前述の組成物、並びに１以
上の他の試薬、アッセイのための試薬装置または試験容
器を包含する。該キットは、ペルオキシダーゼに対する
基質、即ち、過酸化水素の如き適当に過酸化物を含む。

好ましくは、アッセイ、例えばイムノアッセイを実施す
るための試験装置をも該キットは含む。一般に、かかる
装置は、１以上の試験区画（例えば試験ウェル）を有す
る水不溶性の支持体からなる。支持体は、水不溶性物
質、例えばガラス、高分子材料、セルロース系材料およ
び当該技術分野で既知の他の材料から製造される。かか
る装置は、反応のための区画を有する試験管、ペトリ
皿、濾紙または試験ストリップであってもよい。また、
それは、多数のアッセイが実施できる試験ウェルを有す
る試験プレートであることもできる。

また、本発明のキットは、水不溶性の分離特異性バイン
ディング試薬（該試薬と特異性に反応することにより他
の化合物を不溶化し、そして不溶化物を他の物質から分
離するもの）、ペルオキシダーゼ標識特異的バインディ
ング化合物（例えば、ペルオキシダーゼ標識抗体）、洗
浄後、ビチオンを結合した抗体、緩衝溶液、試薬溶液、
試薬ビン、ピペット、試験装置、予備濾過装置、および
アッセイを容易にするために診断キットにおいて有用で
あることが知られている他の材料の１以上を含むことも
できる。

本発明は、リガンド（検出される物質）とレセプター
（リガンドと特異的に反応する化合物）との間の検出可
能な複合体を得ることによる測定方法を提供する。好ま
しくは、本発明の方法は、簡便であり、そのために医院
または家庭で実施して、直ちに結果を得ることができる
ものである。この試験キットを用いて、生物学的流体の
ような水溶液における一価、多価、または複数抗原決定
基（multideterminant）を有するリガンドの存否を検出
することができる。好ましくは、それは、hCGのような
複数抗原決定基のリガンドの検出に使用される。

一価のリガンドは、複合体化のためのただ１個のエピト
ープ部位を有する。多価のリガンドは、同一の特異的バ
インディングレセプターの複数のものと複合するための
２個以上のエピトープ部位を有する。複数抗原決定基の
リガンドは、多様な種々のレセプターと複合するための
２以上のエピトープ部位を有する。

より具体的には、本発明は、天然起源のまたは合成的に
調製した特異的バインディングレセプターの存在下で水
溶液中のリガンドの測定（定性または定量分析）に使用
することができる。この測定は、リガンドの存否だけを
測定するか、またはリガンドの量を定量的に測定するこ
とにより実施することができる。就中、本発明は、動
物、ヒトまたは植物の生物学的液体をアッセイするため
に使用することができるが、好ましくはヒトの生物学的
液体に対して使用することができる。限定されるもので
はないが、かかる流体は、全血、血漿、血清、リンパ
液、胆汁、尿、脊髄液、精液、涙液、膣分泌物、喀痰お
よび汗等、並びい便通検体を包含する。また、ヒトまた
は動物の組織、例えば骨格筋、心臓、腎、肺、脳、骨髄
および皮膚等の液状調製物をもアッセイすることが可能
である。

興味の対象となるリガンドは、（１）免疫担当宿主が存
在する場合に、ある物質とバインディングしうる特異的
な抗体の産生をもたらす可能性のあるすべての物質、ま
たは（２）そのように産生される抗体が、抗原−抗体反
応に関与するリガンド、である免疫学的な種であること
ができる。ある態様では、アビジン、ビチオンまたはア
ビジンもしくはビチオンの誘導体、あるいは酵素または
他の標識がリガンドと特異的に反応するレセプター分子
に適当に結合されている。

本発明により検出し得る代表的なリガンドは、一級アミ
ン、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク、リ
ポタンパク、糖タンパク、医薬、ハプテン、酵素、ステ
ロイド、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖、糖脂
質、アルカロイド、生物（細菌、プロトゾア、カビ、レ
トロウイルスを含むウイルスおよびリケッチア等）およ
びそれらの構成要素、血液成分、細胞および器官の抗
原、並びに当業者の既知の他の物質を包含する。代表的
なリガンドとしては、医薬、ホルモン、抗生物質または
抗原的な特性を備える他の化合物に対して向けられる抗
体が挙げられる。他のリガンドは、抗原的物質であって
もよい。さらに他の態様では、免疫学的は種は、別の抗
体（即ち、抗−抗体）に対して向けられる抗体である。
モノクローナルおよびポリクローナルのいずれの抗体も
使用することができそれらは分子全体またはそれらの種
々の断片であることもできる。本発明のアッセイでは、
好ましくはモノクローナル抗体が使用される。

好ましい態様では、本発明の方法は、妊娠初期の指標と
してのhCGの検出にとって有用である。この態様では、
種々のエピトープ部位でhCGと複合体を形成するところ
の試薬を提供する目的で、hCGに対する１以上の種々の
抗体が、試験装置内に固定化される。

一般に、本発明の方法は、試験装置内に存在するいずれ
かのリガンドとレセプターの反応生成物を形成するよう
な方法で、リガンドを含有すると思われる液体試料を、
目的とする対象のリガンドに対するペルオキシダーゼ標
識レセプターと接触することにより実施される。一般
に、液体試料は、試験装置の形状に応じて、試験装置の
試験区分に供給されるか、または試験ウェル中に置かれ
る。次に、反応生成物の存否は、本発明の染料供給性組
成物と接触させた後、次いで未反応物質から反応生成物
を分離して適当な方法で測定される。

分離は、染料形成と同時には、または前後の何時に生じ
てもよい。

本発明の方法は、標識したレセプターと標識していない
レセプターの両方を用いる競合的バインディングイムノ
アッセイであることができる。結合（即ち、複合化し
た）または未結合（即ち、複合化していない）物質のど
ちらかを測定することができる。結合および未結合物の
物理的な分離は、所望により、何等かの適当な分離方法
を用いて実施することができる。

好ましい態様では、前記の方法は、イムノメトリックア
ッセイとして当該技術分野で既知のものである。かかる
アッセイの詳細は、米国特許第4,486,530号明細書に示
されている。かかるアッセイを用いれば、前述したよう
な多価のまたは複数抗原決定基のリガンドを測定するこ
とができ、即ち、２以上のレセプター分子が免疫反応の
ための２以上のエピトープ部位を有するからである。サ
ンドイッチアッセイでは、試験装置とリガンドとの接触
（従って、第１のレセプターとリガンドの接触）より前
にか、それと同時にか、それともその後に第２のレセプ
ターがリガンドとの接触に供される。その結果、２つの
相違するレセプターとリガンドとの複合体が形成するこ
とになる。好ましくは、レセプターの少なくとも１つは
ビチオン化したものである。最も好ましくは、第１のレ
セプターがビチオン化したものである。不溶性相のアビ
ジンと第１レセプター部としてのビチオンが反応する場
合、得られる複合体は不溶性となり、こうして得られた
不溶性複合体は試験装置における未反応物質から分離す
ることができる。不溶性複合体の検出のためにレセプタ
ーかまたは不溶性相の一方を標識することができる。

好ましい態様としては、次の A.1以上の試験区画を有し、該試験区画の少なくとも１
つが固定化したhCGに対するビチオン化抗体を有する水
不溶性支持体を含んでなる試験装置を液体試料と接触さ
せて、第１のエピトープ部位でビチオン化抗体とhCGの
反応生成物を形成し、 B.接触段階（Ａ）により前にか、それと同時にか、また
はその後に、標識され、かつ、第２のエピトープ部位で
hCGと反応するhCGに対する第２の抗体を液体試料と接触
させて、第１および第２の抗体とhCGの複合体を形成
し、 C.アビジンを結合した不溶性相を含んでなる不溶化した
分離特異性試薬と前記複合体を接触させ、ビオチンとア
ビジンの反応を介して不溶性複合体を形成し、 D.接触段階（Ｃ）より前にか、それと同時にか、または
その後に、過酸化水素の存在下で本明細書に記載されて
いる染料供給性組成物を前記複合体と接触し、 E.得られる標識化し、不溶化した複合体を未反応物から
分離し、そして F.前記複合体と関連する染料の量を測定することによ
り、標識化し、不溶化した複合体の存否を測定する、段
階を含んでなる水性溶液中のhCGの測定方法が提供され
る。

この方法は、医院または家庭において、尿試料をアッセ
イすることにより妊娠の早期測定を実施することができ
る。

以下の例は、本発明の実施の代表例を示すものであり、
本発明の範囲の限定を意図するものではない。

例1.黄体形成ホルモン（LH）の測定に有用な染料供給性
組成物 次の染料供給性組成物は、本発明の実施におけるLHの測
定に有用である。

ロイコ染料4,5−ビス（４−メトキシフェニル）−２−
（3,4−ジメトキシ−４−ヒドロキシ）イミダゾールの
メタノール溶液（15mg/ml）を調製した。

リン酸二水素ナトリウム（100ミリモル濃度、pH7）、ポ
リビニルピロリドン（１％）、キレート剤ジエチレント
リアミン五酢酸（５ミリモル濃度）および電子移動剤
４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）を
水酸化ナトリウムでpH7に調節した溶液500mlに前記試料
溶液（5ml）を添加した。

例2.hCGの測定に有用な染料供給性組成物 本発明に実施に従い、次の組成物を調製し、hCGの測定
に使用した。

第１水溶液は、リン酸二水素ナトリウム（10ミリモル濃
度）、キレート剤ジエチレントリアミン五酢酸（10ミリ
モル濃度）および電子移動剤４′−ヒドロキシアセトア
ニリド（５ミリモル濃度）により調製した。この溶液に
10モル濃度の水酸化ナトリウムでpH6.8に調節した。

第２水溶液は、20（w/w）％ポリビニルピロリドンおよ
び例１の0.01％のロイコ染料を用いて調製した。

第２水溶液の１重量部を、第１水溶液の19重量部に添加
した。過酸化水素（30％、9.7モル濃度）を添加し、10
ミリモル濃度の過酸化水素最終濃度とした。

例3.不溶性試薬の調製およびhCGに対する尿のアッセイ 以下に略述される３種の溶液を、以下に示した速度によ
り80℃で脱酸素化した水を含有する1365mlの容器に連続
的に添加した。

溶液1:スチレン（739g）、ｍおよびｐ−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン（82g）および１−ド
デカンチオール（8.2g）。2.5g/分の速度で、380分間で
添加。

溶液2:過硫酸アンモニウム（19.7g）および蒸留し、脱
酸素化した水（1152g）。2.14g/分の速度で、380分間で
添加。

溶液3.ピロ亜硫酸ナトリウム（9.9g）および蒸留水（11
52g）。2.27g/分の速度で、380分間で添加。

380分後、反応を停止して固体が33.4％のラテックス約1
218gを得た。このラテックスを３日間透析して、27.3％
の固体を有し、そしてpH5のラテックスを得た。このラ
テックスを13.5％の固体まで希釈した。NMR分析で、ス
チレン対第２モノマーのモル比96:4が確認された。得ら
れたラテックス粒子は、透過型電子顕微鏡により測定し
たところ約0.67μｍの平均直径を有していた。

前記のラテックス試料（0.75ml）を、硼酸緩衝液（50ミ
リモル濃度、pH8.5）で20mlに希釈し、次いでアビジン
（5mg）を添加した。得られた懸濁液を37℃で18時間ぐ
るぐる回転させながら攪拌し、次いで遠心した。上澄を
廃棄し、緩衝液を用いて粒子を遠心により１度洗浄し、
そして硼酸緩衝液10mlに再び懸濁した。

ビチオンバインディング分析（即ち、トリチウム標識ビ
チオンによる滴定）は、アビジンが前記粒子に共有結合
（0.3％のビーズ懸濁液当たり７×10^-6モル濃度バイン
ディング部位）し、本発明の試薬を形成したことを示し
た。

次の方法で試験装置を使用して尿試験中のhCGを測定し
た。３つの試験ウェルを含むこの装置は、スクシニル化
したカゼイン（1.07g/m²）で被覆した市販のナイロン膜
から成る濾過膜をそれぞれ備えている。

試験装置の陰性対照の試験ウェルは、ポリアクリルアミ
ド（60μｇ）中、MOPS緩衝剤（2mg）を含有している。
試験試料ウェルは、それに固定化されているビオチン化
した抗−hCG抗体（３μｇ）を含み、そしてMOPS緩衝剤
をそれらの別の場所に加えた。陽性対照の試験ウェル
は、ビオチン化した抗−hCG抗体（３μｇ）、それらの
別の場所にMOPS緩衝剤（2mg）およびhCG（400mI.U.）を
含ませた。

濾過して不純物を除去し、hCG約50mI.U./mlを含有した
尿検体を試験装置の各ウェルに添加し、次いでペルオキ
シダーゼ標識抗−hCG抗体（10^-9モル濃度溶液の40μ
ｌ）を添加した。１分間インキュベーションした後、前
述の不溶性試薬を各ウェルに添加（0.42％の分散物の40
μｌ）し、そして流動物を各ウェル中の膜を通して徐々
に排出した。

次に、洗浄した後、例２に記載したロイコ染料溶液（40
μｌ）を各試験ウェルに添加した。２分後、各ウェルの
膜上に形成された色を標準的な反射率測定装置および測
定方法を用いて測定し、ウィリアムス−クラッパー（Wi
lliams−Clapper）変換を用いて透過率濃度に換算し
た。測定される染料の量は、試験された尿検体中のhCG
量を示すものであった。

例4.粒子上へのアビジンの固定化および黄体形成ホルモ
ン（LH）に対するアッセイ チオメルサール（thiomersal:消毒剤）（0.01％）を含
有する硼酸緩衝溶液（50ml、0.05モル濃度、pH8.5）
を、ポリプロピレン製遠心管に入れ、次いで脱イオン化
蒸留水6mlに溶解した卵白アビジン（6mg）の溶液6mlを
加えた。この遠心管に蓋をした後、激しく振盪し、次い
でコポリ〔スチレン−ｍおよびｐ−（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレン〕（モル比、95.5:4.5）の
ビーズ（平均径2.54μｍ）の分散液（固体、15.5％）1.
35mlを添加し、そして24時間ぐるぐる回転させた。

ポリマービーズにアビエチンが共有結合したビーズを、
0.01％のチオメルサールを含有するグリシン緩衝液（0.
1モル濃度、pH8.5）で洗浄した後、0.01％のチオメルサ
ールを含有するグリシン緩衝液（0.1モル濃度）に再懸
濁し、不溶性分離特異性バインディング試薬（固体、0.
3％）を含有する分散液を調製した。

LHのアッセイ 本アッセイでは、カゼインで前処理した５μｍのナイロ
ン濾過膜を各ウェル中に備え、例３に記載した如き３種
の試験ウェルを有する試験装置を使用した。また本アッ
セイでは、前述のhCGに対するビオチン化抗体と同様に
調製した、LHに対するビオチン化抗体（リン酸塩で緩衝
化した生理食塩水中、0.044mg/ml）、LHに対するワサビ
ペルオキシダーゼで標識した抗体（0.5％のウシ血清を
含有するリン酸塩で緩衝化した生理食塩水中、0.0015mg
/ml）、およびビーズに固定したアビジンを含む前述の
試薬（固体、0.9％、pH8.5）を使用した。

このアッセイでは、次の種々の尿試料を試験した。

（ａ）18mI.U.LH/mlを含有する女性の月経周期の第13日
目に採取した試料、および （ｂ）64mI.U.LH/mlを含有する前記女性の月経周期の第
14日目に採取した試料。

これらの両試料を同一人から採取し、LH含量を、ダイア
ゴノスティック・プロダクツ・コーポレーション（Diag
nostic Products Corporation）から入手したLHラジオ
イムノアッセイのキットで測定した。

尿試料（ａ）（200ml）、ペルオキシダーゼ標識抗体（3
5ml）およびビオチン化抗体（10ml）の混合物を調製
し、室温で２分間インキュベーションした。その後、不
溶化アビジン試薬（40ml）を、前記混合物に添加し、さ
らに５分間インキュベーションを継続した。次に、試験
装置の１の試験ウェルに混合物を移し、インキュベーシ
ョン過程で濾過膜上に形成される不溶化した複合体を残
して、流動物および未反応物を徐々に排出させた。残存
する不溶化生成物を、界面活性剤ツウィーン（TWEEN）2
0の0.1％を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（125m
l）で２度洗浄した後、再度濾過し、次いで例１の染料
供給性組成物（50μｍ）と接触させた。

尿試料（ｂ）は、試験装置の第２の試験ウェルを用いて
同様にアッセイした。

どちらの試験装置とも、５分以内で濾過膜上に色が観察
された。第１ウェルにおける色彩は、淡いピンクであっ
たが、一方、第２ウェルにおける色彩は、明るい赤色で
あった。

例5.クエン酸抽出後のストレプトコッカス（Streptococ
cus）抗原のELISA分析 地方病院から入手したストレプトコッカスＡの単離物
（20μｌ）を、亜硝酸ナトリウム（８モル濃度、120μ
ｌ）およびクエン酸（1.2モル濃度、10μｌ）を用いて
処理した抗原を抽出した。次に、抽出液を、３−（Ｎ−
モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（２モル濃度）
およびエチレンジアミン四酢酸（25ミリモル濃度、pH7.
5）の溶液120μｌを用いて中和した。

使い捨て装置に取り付けたナイロン膜をスクシニル化カ
ゼイン（1.07g/m²）で被覆した。

ストレプトコッカスＡ〔バクト・ストレプトコッカス・
抗血清（Bacto Streptococcus Antiserum）、Ａ群、ロ
ット♯2672−50,Difco Labs製〕に対するラビット抗血
清由来のIgG画分を、45％の飽和硫酸アンモニウムで沈
殿させて精製し、次いで透析して過剰の塩を除去した。
次に、精製したIgG画分を、コポリ〔スチレン−ｍおよ
びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレ
ン〕ビーズ（モル比、90:10）上に固定化し、防腐剤と
して0.01％のチオメルサール（またはチメロサル）を含
有する0.05モルのグリシン緩衝液（pH8.5）中で分散試
薬（固体、0.3％）を得た。

他方、Yoshitake等の方法（Eur.J.Biochem．101,395〜3
99,1979）と同様な方法で、スクシンイミジル４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レートを用いてワサビペルオキシダーゼに精製IgG画分
を抱合させ、次いで希釈して0.1％カゼイン中にIgGを９
μg/ml含む抱合体溶液を得た。

ビーズ懸濁液（40μｌ）を、使い捨て装置に加え、次い
で抗原抽出物（40μｌ）、0.1％のカゼイン（120μｌ）
および抱合体（40μｌ）を添加した。この混合物を25℃
で２分間、膜上でインキュベーションした。次に、膜を
リン酸塩で緩衝化した生理食塩水（320μｌ）で洗浄し
た後、ロイコ染料２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメト
キシフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）
イミダゾール（0.005重量％）、リン酸ナトリウム（５
ミリモル濃度、pH6.8）、ポリビニルピロリドン（１
％）、過酸化水素（10ミリモル濃度）４′−ヒドロキシ
アセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチレント
リアミン五酢酸（10ミリモル濃度）を含む染料供給性組
成物を加えた。３分後、さらに洗浄し、膜上の染料を反
射率によって読み取った。読み値をウィリアムス−クラ
ッパー（Williams−Clapper）変換によりD_Tに換算し
た。抗原の各レベル（コロニー形成単位、CFU）に対す
る２または３種の試験の平均として、以下の表に結果を
示した。

〔発明の効果〕 本発明は、アッセイ系にペルオキシダーゼまたは他の過
酸化物作用性物質を含む場所に、有利に使用することが
できる大幅に改良された染料供給性組成物を提供する。
この染料供給性組成物は、過酸化水素およびペルオキシ
ダーゼのような過酸化物作用性物質の存在下で染料に酸
化されるイミダゾール系のロイコ染料と特有な水溶性ま
たは水分散性ポリマーの組み合わせであるので、改善さ
れた安定性を有する。

この染料供給性組成物は、感度の著しい低下を伴うこと
なく輸送や長期間の貯蔵をすることができる診断試験キ
ットとして容易にパッケージ化することができる。染料
供給性組成物が高感度であるために、本発明を用いて非
常に低濃度のペルオキシダーゼ標識と特異的なバインデ
ィングする化合物を測定することができる。

好ましい態様、例えば使い捨て試験装置において、アッ
セイが濾過膜を用いて実施される場合には、染料供給性
物質としてテトラメチルベンジジンが使用されるときに
対比して、使用する膜を前処理する必要がない。驚くべ
きことに、本発明の組成物のポリマーは、染料供給性組
成物における溶液でのイミダゾール系ロイコ染料の維持
を促進し、そしてアッセイ過程で得られた染料の膜上へ
の固定化を促進する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレゴリー ジョーゼフ マクルーン アメリカ合衆国，ミシガン 49002，ポー ティッジ，マンスフィールド アベニュ 2162 (72)発明者 ブライアン アンソニー スナイダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ロチェスター，オークウッド ロード 263 (72)発明者 ポール バーナード コンテスタブル アメリカ合衆国，ニューヨーク 14624, ロチェスター，ロイヤリスト アベニュ 26 (56)参考文献 米国特許4615972（ＵＳ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ペルオキシダーゼの触媒作用に由来する被
   分析物の測定のための診断試験キットであって、 （ａ）ペルオキシダーゼに対する基質、 （ｂ）水溶性または水分散性ポリマーと、電子移動剤と
   過酸化水素および過酸化物作用性物質の存在下で染料を
   供給し得るイミダゾール系ロイコ染料とを含んでなり、
   前記ポリマー対前記ロイコ染料の重量比が10,000:1〜10
   0:1で、かつ前記ポリマーがビニルピロリドンの重合
   体、アクリルアミドの重合体、アクリル酸の重合体、メ
   タクリル酸の重合体、ポリエチレングリコールまたはポ
   リアミンである染料供給性組成物、並びに （ｃ）イムノアッセイで物質を分離するための濾過膜を
   含む使い捨て試験装置、を含んでなる診断試験キット。
2. 【請求項２】A.リガンドに対するペルオキシダーゼ標識
   レセプターと、液体試料を接触させてレセプターとリガ
   ンドの反応生成物を形成し、 B.接触段階（Ａ）より前にか、それと同時にか、または
   その後に、水溶性または水分散性ポリマーと、電子移動
   剤と過酸化水素および過酸化物作用性物質の存在下で染
   料を供給し得るイミダゾール系ロイコ染料とを含んでな
   り、前記ポリマー対前記ロイコ染料の重量比が10,000:1
   〜100:1で、かつ前記ポリマーがビニルピロリドンの重
   合体、アクリルアミドの重合体、アクリル酸の重合体、
   メタクリル酸の重合体、ポリエチレングリコールまたは
   ポリアミンである染料供給性組成物と、前記液体試料を
   接触し、 C.接触段階（Ｂ）より前にか、それと同時にか、または
   その後に、濾過膜を用いて未反応物質から前記反応生成
   物を分離し、そして D.前記濾過膜上の前記反応生成物の存否を測定するこ
   と、を含んでなる水溶液におけるリガンドの測定方法。