JPH08511936A

JPH08511936A - 多発性硬化症ウィルス

Info

Publication number: JPH08511936A
Application number: JP7500386A
Authority: JP
Inventors: ジェレミーガーソン; フィリップトゥーク
Original assignee: ユニヴァーシティカレッジロンドン; ビオムリュエスアー
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1994-05-24
Publication date: 1996-12-17
Also published as: AU6760094A; AU676568B2; US6136528A; DE69433964D1; EP0700441A1; ES2227525T3; DE69433964T2; CA2163641C; ATE274584T1; WO1994028138A1; GB9310657D0; EP0700441B1; CA2163641A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む実質的に単離された形態のポリヌクレオチドであって、ここでＨＭＳＶは： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)該ゲノムはタンパク質（１種または複数種）またはポリタンパク質（１種または複数種）をコードする１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)該ゲノムは逆転写酵素をコードする；および(iv)該ゲノムは配列番号１〜６に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つと相同である、または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む、により特徴づけられるポリヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】多発性硬化症ウィルス本発明は、多発性硬化症および特に、この疾病に関与するウィルスに関する。多発性硬化症（ＭＳ）は、衰弱してゆく消耗性疾患であり、一般にその罹病者は青年期以降のある時期に襲われる。この疾病は、神経細胞をとり巻く髄鞘の変性に関連し、運動および感覚機能の喪失をもたらす。ＭＳに対する治療法はなく、症状を改善したり疾病の進行を遅らせる試みはあっても、今までのところ限られた成果しか得られていない。何年もの間、ＭＳの原因となるもの、例えば環境的および／または遺伝的因子を説明するための、多くの種々の学説が説かれてきた。ウィルス起源であるとも仮定されたが、この説を他より支持するような決定的データは示されていなかった。我々は今や、ＭＳがレトロウィルスと関連することを実証した。我々は、ＭＳの患者からの材料(material)を使い、ｃＤＮＡを作り、レトロウィルスのポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子の高度に凝縮された領域に基づく、同義性オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲによりこの材料を増幅した。この手段により、以前には未知であり我々がヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）と呼ぶレトロウィルスから、レトロウィルス配列を得た。我々のＨＭＳＶの単離物は、下記にＨＭＳＶ−１として記載されている。本発明は、ＨＭＳＶゲノムの全部または一部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関する。本発明は、ＨＭＳＶのポリペプチドおよびそのフラグメントも提供する。本発明はさらに、そのようなペプチドに対する抗体（ポリクローナル、モノクローナル、シングルドメインおよびヒト化した(humanised)抗体を含む）およびそのフラグメント（特に、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）₂フラグメントのような抗原結合部位を含むフラグメント）を提供する。本発明のペプチド、抗体およびそのフラグメントは、ＨＭＳＶの免疫診断用キットの中に組入れられ得る。ＨＭＳＶから由来する核酸配列の部分は、試料(sample)中のウィルスの存在を診断するための、およびウィルスの天然に出現する変異種(variant)を単離するためのプローブとして、有川である。これらの配列も、ＨＭＳＶゲノム（１種または複数種）内にコードされているＨＭＳＶ抗原のポリペプチド配列を利用可能にさせ、診断テストの標準物または試薬として、および／またはワクチンの成分として有用であるポリペプチドの産生を可能にする。これらのポリペプチドの配列内に含まれるＨＭＳＶエピトープに対する、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は両方とも、治療剤として、診断テスト用に、抗ウィルス剤のスクリーニング用に、またこれらの配列がそれに由来するＨＭＳＶ作用因子(age nt)の単離のためにも有用である。さらに、これらの配列に由来するプローブを利用することにより、ＨＭＳＶゲノムの他の部分を単離し配列決定することが可能であり、こうして、ＭＳの診断において、および／または予防的ならびに治療的な両方の処置において有用である、追加的なプローブおよびポリペプチドを生み出すもととなる。従って、本発明は、ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムまたはその相補体(complement)に選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む、実質的に単離された形態のポリヌクレオチドを提供し、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)前記ゲノムは、タンパク質（１種または複数種）またはポリタンパク質（１種または複数種）をコードする１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)前記ゲノムは、逆転写酵素をコードする；および (iv)前記ゲノムは、配列番号１〜６に示されるヌクオチド配列のいずれか１つと相同である、または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。配列番号１〜６のいずれか１つの配列と相同であるヌクレオチド配列は、例示された配列の全体にわたって、少なくとも６０％の、例えば７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の相同性があるものである。無論、当業者は、図がｃＤＮＡを示しており、ウィルスがＲＮＡウィルスであるので、相同性の測定を目的とするとき、ＴおよびＵの文字の遺伝コードで示される塩基は等価である、と考慮されなければならないことを認識する。同様に、配列番号１〜６の配列のいずれか１つと選択的にハイブリダイズ可能である配列は、それらがハイブリダイズできる配列の相補鎖と、上述の相同性に類似する程度の相同性を有する。従って、(i)〜(iv)の特徴は、レトロウィルスがＨＭＳＶであるか否かを同定するための、当業者により判読され得る「フィンガープリント」を提供する。配列番号１、２、３、４、５または６のいずれか１つからの配列の領域の存在は、陽性のフィンガープリントを表示するが、確認的疫学的検討により、ある特定のウィルスがＨＭＳＶの株であることを確認することが望ましいかもしれない。従って、本発明が関する更なる局面は精製されたＨＭＳＶポリヌクレオチド；組換えまたは合成したＨＭＳＶポリヌクレオチド；ＨＭＳＶゲノム由来またはＨＭＳＶｃＤＮＡ由来の配列を含む組換えポリヌクレオチド；ＨＭＳＶのエピトープをコードする組換えポリヌクレオチド；あらゆる上記組換えポリヌクレオチドを含む組換えクローニングまたは発現ベクター、およびあらゆるこれらベクターで形質転換された宿主細胞、である。本発明は、ＨＭＳＶのゲノムにコードされる少なくとも１０個のアミノ酸の隣接配列(contiguous sequence)を含むポリペプチドをコードするＤＮＡポリヌクレオチドも提供し、該少なくとも１０個のアミノ酸はＨＭＳＶの抗原決定基(ant igenic determinant)を含み、ここで、ＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)前記ゲノムは、タンパク質またはポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)前記ゲノムは、逆転写酵素をコードする；および (iv)前記ゲノムは、配列番号１〜６に示されるＨＭＳＶ−１のヌクレオチド配列のいずれか１つと相同である、または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、前記ポリペプチドは、１５、２０または２５個以上のアミノ酸をコードする。本発明が関連する他の局面はＨＭＳＶゲノム由来またはＨＭＳＶｃＤＮＡ由来の配列を有するＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む組換え発現システムであり、ここでＯＲＦは望ましい宿主細胞と適合性(compatibl e)の制御配列に作動可能に(operably)連結され、細胞は該組換え発現システムで形質転換され、およびポリペプチドは該形質転換細胞により産生される。本発明は、精製されたＨＭＳＶ粒子、精製されたＨＭＳＶからのポリペプチドの調製物；精製されたＨＭＳＶポリペプチド；ＨＭＳＶに含まれるエピトープと免疫学的に同一であると見なしうる(identifiable)エピトープを含む精製されたポリペプチド、を得るために使用されることができる。従って、本発明は、ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムにコードされる少なくとも１０個のアミノ酸の隣接配列を含む、実質的に単離された形態のポリペプチドを提供し、該隣接配列はＨＭＳＶの抗原決定基を含み、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)前記ゲノムは、タンパク質またはポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)前記ゲノムは、逆転写酵素をコードする；および (iv)前記ゲノムは、配列番号１〜６に示されるＨＭＳＶ−１のヌクレオチド配列のいずれか１つと相同である、または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。本発明に包含される局面は、組換えＨＭＳＶポリペプチド；ＨＭＳＶゲノム由来またはＨＭＳＶｃＤＮＡ由来の配列を含む組換えポリペプチド；ＨＭＳＶエピトープを含む組換えポリペプチド；およびＨＭＳＶポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。該ポリペプチドは、検出可能な標識と付着され得る。本発明にさらに含まれるのは、本発明に従うポリペプチドの前記抗原決定基と結合する抗体を含有する抗ＨＭＳＶ抗体組成物であり、それは、（ａ）ポリクローナル抗体の精製された調製物、または（ｂ）モノクローナル抗体組成物である。本発明の他の局面は、前記配列が真核宿主で産生されるときに粒子を形成することが可能なアミノ酸配列を有する非ＨＭＳＶポリペプチドならびにＨＭＳＶエピトープを含む、ＨＭＳＶ感染に対して免疫原性であるウィルス様粒子である。本発明のさらに他の局面は、ＨＭＳＶ用のポリヌクレオチド・プローブであり、該プローブは、本発明のポリヌクレオチドを必要に応じて検出可能な標識に付着して含む。キットに関連する本発明の局面は、以下を目的とする：適切な容器内にＨＭＳＶ由来の約８個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド・プローブを含むＨＭＳＶ由来のポリヌクレオチドの存在について試料を分析する；適切な容器内に検出されるべきＨＭＳＶ抗原に対する抗体を含むＨＭＳＶ抗原の存在について試料を分析する；適切な容器内にＨＭＳＶ抗原中に存在するＨＭＳＶエピトープを含むポリペプチドを含むＨＭＳＶ抗原に対する抗体の存在について試料を分析する。本発明が関連する他の局面は：ＨＭＳＶエピトープを含む、固体支持体(Solid substrate)に付着されたポリペプチド；固体支持体に付着された、ＨＭＳＶエピトープに対する抗体である。本発明が関連するさらに他の局面は：ＨＭＳＶエピトープを含んだポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下でインキュベートすることを包含する、ＨＭＳＶエピトープを含むポリペプチドを産生する方法；およびこの方法により産生される、ＨＭＳＶエピトープを含むポリペプチドである。本発明は、試料の核酸とＨＭＳＶポリヌクレオチド用プローブとを、該プローブと試料からのＨＭＳＶ核酸との間でポリヌクレオチド・デュプレックスを形成させる条件下で反応させる；およびブローブを含むポリヌクレオチド・デュプレックスを検出することを包含する、試料中のＨＭＳＶ核酸を検出する方法にも関する。該方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を含んで良い。免疫学的テストおよびイムノアッセイも、本発明に含まれる。これらは、（ａ）本発明に従う抗体組成物を提供すること；（ｂ）試料と抗体組成物を、抗体− 抗原複合体を形成可能な条件下でインキュベートすること；および（ｃ）抗ＨＭＳＶ抗体を含む抗体−抗原複合体を検出すること、を包含するＨＭＳＶ抗原を検出するためのイムノアッセイを含む。本発明は、（ａ）前記抗ＨＭＳＶ抗体により結合され得る、抗原決定基を含むポリペプチドをインキュベートすること、ここで該抗原決定基はＨＭＳＶのゲノムにコードされている；（ｂ）生物学的試料を該ポリペプチドと、抗体−抗原複合体を形成可能な条件下でインキュベートすること；および（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること、を包含するＨＭＳＶ抗原に対する抗体を検出するためのイムノアッセイも提供する。本発明は、ＨＭＳＶエピトープを含む免疫原性ペプチド、またはＨＭＳＶの不活化した調製物、またはＨＭＳＶの弱毒化した調製物を含む、ＨＭＳＶ感染の処置のためのワクチン組成物も提供する。本発明の適用は、ＨＭＳＶに感染し組織培養で増殖した細胞である。神経細胞、グリア細胞または末梢血単核細胞のような始原の(primary)または不朽の(immo rtalized)細胞を培養する方法は、ＨＭＳＶに対する適切な宿主細胞を調製するために使用し得、そのような細胞は、ＨＭＳＶ粒子、または核酸で形質転換されることができる。本発明のさらに他の適用は、ＨＭＳＶエピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドを個体に、液性および／または細胞性免疫応答を生起するに十分な量で投与することを包含する、ＨＭＳＶに対する抗体、好ましくは中和抗体を産生する方法におけるその使用である。配列番号１、２、３、４、５および６は、本発明において重要なｃＤＮＡ配列を示す。これらの配列は、それ自体公知の合成的手段により産生し得る。定義本明細書で使用される用語「ＨＭＳＶ」は、ＭＳを引き起こす、またはＭＳに関与するウィルス種、および弱毒化株またはそれに由来する欠損干渉粒子(defec tive interfering particle)を表す。ＨＭＳＶゲノムは、ＲＮＡで構成される。ＲＮＡを含むウィルスは、相対的に高い率の、即ち、報告されるところではヌクレオチド毎に１０^-3〜１０^-4のオーダーでの自然突然変異を有すると知られている。従って、下記に示すＨＭＳＶ種内には複数種がある。本明細書に記載される組成物および方法は、種々の関連する株の、同定、検出、および単離を可能にする。さらに、それらは、その種々の株に対する診断剤およびワクチンの調製も可能にし、またそれらがＨＭＳＶの増殖を阻害するので、抗ウィルス剤の薬理学的使用のためのスクリーニング方法に活用性を有する。本明細書で提供される情報は、これ以降ＨＭＳＶ−１と呼ぶ、ＨＭＳＶの１つの株に由来するものであるが、ウィルス分類学者がその種の範囲内にある他の株を同定するのに十分である。本明細書に記載されるように、我々は、ＨＭＳＶがレトロウィルスまたはレトロウィルス様ウィルスであることを発見した。レトロウィルスの形態学および組成は、公知である。ＨＭＳＶは、本明細書に記載される配列が由来するＨＭＳＶゲノム中のエピトープと免疫学的に同一であると見なしうる(immunologically identifiable)エピトープをコードし；好ましくは、該エピトープは本明細書に記載されるｃＤＮＡ中にコードされている。免疫学的反応性を決定する方法は、当分野で公知のもの、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、赤血球凝集反応による。上述のものに加えて、下記のパラメーターが、単独または組合せのいずれであっても、ある株をＨＭＳＶと同定するのに適用可能である。ＨＭＳＶ株同志は進化的に関連しているので、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体的相同性が６０％以上、好ましくは６５、７０または７５％以上、さらにより好ましくは８０、８５、９０または９５％以上であること；およびそれに加えて、少なくとも約１３ヌクレオチドの相応する(corresponding)隣接配列があること、が期待される。推定の(putative)ＨＭＳＶ株のゲノム配列とＨＭＳＶ−１ｃＤＮＡとの間の相応(correspondence)は、当分野で公知の技術により決定されることができる。ＨＭＳＶの株同志の進化的関連ゆえに、推定上のＨＭＳＶ株は、それらのポリペプチドレベルでの相同性により、同一であると見なし得る。一般に、ＨＭＳＶの株同志は、ポリペプチドレベルで、４０％より大きく相同であり、好ましくは６０、６５、７０または７５％より大きく相同であり、さらにより好ましくは８０、８５または９０％より大きく相同である。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、当分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は、直接的に決定され、本明細書で提供される配列と比較され得る。また例えば、推定上のＨＭＳＶのゲノム物質のヌクレオチド配列は（通常、ｃＤＮＡ中間物を介して）決定され得；そこにコードされるアミノ酸配列が決定され、対応する領域が比較され得る。本明細書で使用されるように、選定された配列(designated sequences)、例えばＨＭＳＶｃＤＮＡ、特に配列番号１、２、３、４、５または６の配列に示されるものの１つ「に由来する(derived from)」、またはＨＭＳＶゲノムからのポリヌクレオチドは、選定されたヌクレオチド配列の領域に相応する(correspondi ng)、即ち相同である、少なくとも６ヌクレオチドの配列から構成され、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０〜１２ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２５ヌクレオチドであるポリヌクレオチド配列を指す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、ＨＭＳＶゲノムに独特(unique)である配列に相同である。そのような同族体(homologues)の相補的配列も、本発明の一部分を形成する。ある配列がＨＭＳＶゲノムに独特(unique)であるかどうかは、当業者に公知の技術により決定され得る。例えば、その配列はデータバンク、例えばジーンバンク(Genebank)にある配列と比較され得、それが非感染宿主または他の生物(organisms)に存在するかどうかを決定する。その配列は、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２などのレトロウィルス性因子(retroviral agents)であるものを含む、他のウィルス性因子(viral agents)の公知の配列と比較されることもできる。由来配列(derived sequence)の他の配列に対する相応性または非相応性も、適切なストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーションにより決定されることができる。核酸配列の相補性を測定するためのハイブリダイゼーション技術は、当分野で公知である。前記由来ポリヌクレオチドは、示されているヌクレオチド配列に必ずしも物理的に由来するものでないが、あらゆる方法、例えば、化学的合成またはＤＮＡ複製または逆転写または転写を含む方法で生成されて良く、それらは、該ポリヌクレオチドが由来する領域（１種または複数種）の塩基配列により提供される情報に基づいている。さらに、選定された配列のものに相応する領域の組合せは、意図される使用に沿うべく、当分野で公知の方法で修飾され得る。相同なポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム内の遺伝コードが、コドンの使用は変化しているが実質的に同じアミノ酸配列を提供するように変化せられたものを含む。コドン使用の変更(alteration)は、例えば組換え宿主細胞システム中での発現の効率を増加させるように、導入されることができる。同様に、選定された核酸配列、例えば配列番号１、２、３、４、５または６中の配列のうちの１つ、あるいはＨＭＳＶゲノムに由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、該配列にコードされるポリペプチド、またはその一部分と同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、ここで該一部分とは、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１１〜１５アミノ酸から構成されるか、あるいは該配列中にコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であると見なしうる。ＨＭＳＶポリペプチドと免疫学的に同一であると見なしうるポリペプチドは、ミメオトープ(mimeotopes)、即ち、関連しない配列であるがＨＭＳＶエピトープに相応する３次元構造を有するポリペプチドでもあり得、即ち、ミメオトープは、ＨＭＳＶに対する抗体により結合されることができる。組換えまたは誘導ポリペプチド(derived polypeptide)は、選定された核酸配列、例えば配列番号１、２、３、４、５または６中の配列の１種あるいはＨＭＳＶゲノムから必ずしも翻訳されず；それは、例えば、化学合成、または組換え発現システムの発現、または突然変異したＨＭＳＶからの単離を含む、あらゆる方法で生成され得る。本明細書で使用される用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源であるポリヌクレオチドを意図し、それはその起源または操作に基づいて：（１）天然状態またはライブラリーの形態では、関連するポリヌクレオチドの全部または一部分と関連せず；および／または（２）天然状態でそれが連結する以外のポリヌクレオチドに連結している。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれであろうと、あらゆる長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。この用語は、一次構造の分子のみを指す。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ、並びに二本鎖および一本鎖のＲＮＡを含む。それは、例えば、メチル化によりおよび／またはキャッピングにより修飾された、ならびに修飾されていない形態のポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用されるように、用語「ｃＤＮＡに相応する配列を含むＨＭＳＶ」は、ＨＭＳＶが、選定されたＤＮＡ中の配列に相同または相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことを意味し；ｃＤＮＡに対する相同性または相補性の度合いは上述の通りである。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」、および、単細胞の存在物(entity)として培養される微生物または高等真核生物の細胞系を表す他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡのための受容体(recipient)として使用されることができるか、または使用された細胞を指し、トランスフェクトされた始原細胞(original cell)の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、偶然のまたは計画的な突然変異により、起源となる親とは、形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体(complement)において、必ずしも完全に同一でなくて良い、と理解されている。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在のような、関連する特性により特徴付けられる、親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義をもって意図される子孫の中に含まれ、上述の用語に包含される。「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律的単位として挙動する(behave)あらゆる遺伝的エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウィルスであり；即ち、それ自身の制御下に複製可能である。「ベクター」は、他のポリヌクレオチドのセグメントが付着して、付着されたセグメントの複製および／または発現をもたらすレプリコンである。「制御配列」は、ポリヌクレオチド配列であって、それが連結されているコーディング配列の発現を起こすのに必要な配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なり；真核生物では、そのような制御配列は、一般にプロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含み；原核生物では、そのような制御配列は、一般にプロモーター、ターミネーターおよび、ある場合にはエンハンサーを含む。用語「制御配列」は、最小の意味としては、その存在が発現に必要である全ての成分(compone nt)を含むことを意図し、その存在が有利である追加的な成分、例えばリーダー配列も含んで良い。「作動可能に(operably)連結された」は、そのように記載された成分が、意図された様式で機能する関係にある並置(juxtaposition)を指す。コーディング配列と「作動可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と適合する(compatible)条件下で為されるように連結反応される(ligated)。「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり；この領域は、コーディング配列の一部分または全コーディング配列を示し得る。「コーディング配列」は、適切な調節配列(regulatory sequences)の制御下に置かれたとき、ｍＲＮＡに転写される、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界線は、５’−末端で翻訳開始コドンおよび３’−末端で翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を含むことができるが、それに限定されない。「...と／として免疫学的に同一とみなしうる(immunologically identifiable )」は、選定されたポリペプチド（１種または複数種）にも存在し、該ペプチドに独特(unique)であるエピトープ（１種または複数種）およびポリペプチド（１種または複数種）、通常ＨＭＳＶタンパク質の存在を指す。免疫学的同一性は、抗体結合および／または結合の際の競合により決定され得；これらの技術は、平均的な当業者に公知である。エピトープの独特性(uniqueness)も、該エピトープをコードするポリヌクレオチド配列については、公知のデータバンク、例えばジーンバンク(Genebank)のコンピューターサーチにより、また他の既知のタンパク質とのアミノ酸配列比較により、決定され得る。本明細書で使用されるように、「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を指し；エピトープは、３アミノ酸から成ることができ、隣接するか、または該エピトープに独特である空間的コンホメーション中のポリペプチドの二次または三次構造により集合せられ、一般にエピトープは、少なくとも５個のそのようなアミノ酸から構成され、より通常には、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸から構成される。アミノ酸の空間的コンホメーションを測定する方法は、当分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。ポリペプチドは、ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープの抗体による認識により、それが抗体と結合するとき、抗体と「免疫学的に反応性」である。免疫学的反応性は、抗体結合によって、より具体的には抗体結合の速度論によって、および／または抗体が向かっていく(directed against)エピトープを含む公知のポリペプチド（１種または複数種）を競合物（１種または複数種）として使用する結合における競合により、決定され得る。ポリペプチドが、抗体と免疫学的に反応性であるかどうかを決定する技術は当分野で公知である。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであって良い。本発明の目的のために、用語「抗体」は、対比されるものを示さない限り、腫瘍標的抗原に対するそれらの結合活性を保持する全抗体のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）₂フラグメント、並びに単鎖( single chain)抗体を含む。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されるように、ヒト化抗体であり得る。本発明に従う抗体は、慣用されているハイブリドーマ技術により、または修飾された抗体またはフラグメントの場合、組換えＤＮＡ技術により、例えばプロモーターと作動可能に連結された修飾された抗体もしくはフラグメントをコードするＤＮＡ構築物の適切な宿主ベクター中での発現により、産生され得る。適切な宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫および哺乳動物を含む。本明細書で使用されるように、用語「ＨＭＳＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチド」は、天然に出現するＨＭＳＶポリペプチドまたはそのフラグメント、並びに他の手段、例えば化学合成、または組換え生物でのポリペプチドの発現、により調製されるポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さの産物を指さない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語も、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを指さない。この用語は、あらゆる適切な手段、例えば、組換え的にまたは合成的に得られ得る、ポリペプチドの起源を指さない。「形質転換」は、本明細書で使用されるように、挿入に使用される方法、例えば直接的取り込み、トランスダクション、またはｆ−交配に関わりなく、宿主細胞中への外来性ポリヌクレオチドの挿入を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター、例えば、プラスミドとして維持され得、あるいは宿主ゲノムに組込まれ得る。本明細書で使用される「処置」は、予防および／または治療を指す。本明細書で使用されるように、核酸の「プラス鎖」は、ポリペプチドをコードする配列を含む。「マイナス鎖」は、「プラス鎖」のものに相補的である配列を含む。本明細書で使用されるように、ウィルスの「プラス鎖ゲノム」は、ゲノムが一本鎖であり、ウィルスポリペプチド（１種または複数種）をコードしているものである。プラス鎖ＲＮＡウィルスの例には、トガウィルス科、コロナウィルス科、レトロウィルス科、ピコルナウィルス科、およびカリチウィルス科を含む。本明細書で使用されるように、「抗体を含む身体の成分」は、興味のある抗体の起源である、個体の身体の成分(component)を指す。抗体を含む身体の成分は、当分野で公知であり、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、気道、腸管、および尿生殖器路(tract)の外分泌物、涙、唾液、乳汁、白血球、および骨髄腫( myelomas)を含むが、それに限定されない。本明細書で使用されるように、「精製されたＨＭＳＶ」は、ウィルスが通常関与する細胞の構成成分(constituent)から、および感染組織に存在するかもしれない他のタイプのウィルスから、単離されたＨＭＳＶの調製物を指す。ウィルスを単離するための技術は、当業者に公知であり、例えば、遠心分離およびアフィニティ・クロマトグラフィを含む。本発明の実施は、他の方法が示されない限り、慣用されている技術である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学を活用し、これらは当分野の技術の範囲内にある。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatis，Fitsch & Sambrook，MOLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL（1 982）；DNA CLONING，ＩおよびII巻（D.N Glover編 1985）；OLIGONU CLEOTIDE SYNTHESIS（M.J．Gait編，1984）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D．Hames & S.J．Higgins編 1984）；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION（B.D．Hames & S.J ．Higgins編 1984）；ANIMAL CELL CULTURE（R.I．Freshney編 1986）；IMMOBIL IZED CELLS AND ENZYMES（IRL Press，1986）；B．Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING（1984）；the series，METHODS IN ENZYMOLOGY（Academi c Press，Inc.）；GENE TRANSFER VECTORS F OR MAMMALIAN CELLS（J.H．MillerとM.P．Calos編 1987，Cold Spring Harbor L aboratory）、Methods in Enzymology 154と155巻（それぞれ、WuとGrossman編およびWu編）、MayerとWalker編（1987）、IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AN D MOLECULAR BIOLOGY（Academic Press，London），Scopes，（1987）、PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，第２版（Springer-Verlag，N.Y.）、およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，I-IV巻(D.M．WeirとC.C．Blac kwell編 1986)を参照。本発明の有用な材料および方法は、ＭＳ患者の血清中に存在する配列に由来するヌクレオチド配列を準備により可能となる。配列番号１、２、３、４、５および６に示される配列情報が利用可能であることにより、ＨＭＳＶ感染によるＨＭＳＶの診断に有用なＤＮＡプローブおよびポリペプチドの構築が可能である。例えば、これらの配列から、約８〜１０個のヌクレオチド、またはそれより長い、例えは１５、１８、２０または２５個以上のヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーで、そのうちの１つ以上はウィルスゲノムの存在を検出するためのハイブリダイゼーション・プローブとして有用であるＤＮＡオリゴマーの合成が可能である。これらの配列も、ＭＳに曝された個体により生ずる(raised)抗体の存在に対する診断試薬として有用な、ＨＭＳＶ特異的ポリペプチドの設計および産生を可能にする。配列情報に由来する精製されたポリペプチドに対する抗体も、感染個体中の、また他の体液および血液のような組織中の、ウィルス抗原を検出するのに使用され得る。これらの配列に関する知識も、ＨＭＳＶに対するワクチンとして、また抗体の生成のために使用され得るポリペプチドの設計および産生を可能にし、それがまた、該疾患に対する防御のために、および／またはＨＭＳＶに感染した個体の治療のために使用され得る。我々は、レトロウィルスをＭＳの原因因子として、または少なくとも疾患ＭＳに関与するものとして同定したので、このことは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の処置または予防に有効である薬学的物質を用いたＭＳ患者の処置の可能性を切り開く。従って、本発明が提供するのは： (i)ＭＳの処置またはコン防用の医薬の生産のための、ＨＩＶの処置または予防に効果的である薬学的物質の使用；および (ii)ＭＳに罹患している個体に、ＨＩＶの処置または予防に効果的である薬学的物質の有効量を投与することを包含する、ＭＳを処置する、またはその症状を改善する方法。適切な薬学的物質の例として、ＡＺＴおよびｄｄＩが含まれる。実施例実施例１．実施例１から得られる、配列番号１〜６の配列由来のプローブを用いて、ＭＳの個体から得た更なる核酸試料を探り(probed)、ＨＭＳＶ核酸の存在を確認した。全核酸または全ＲＮＡのいずれかから出発して、そのような個体からのライブラリーを構築する。配列番号１〜６由来のプローブは、ＨＭＳＶ配列を含むライブラリーのメンバーを同定するために使用される。陽性のクローンは配列決定され、該クローンの３’または５’領域をプローブとして使用し、更なるＨＭＳＶ陽性クローンを同定する。このゲノム・ウォーキング技術を使用して、全ＨＭＳＶゲノム配列を引き出す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月８日【補正内容】請求の範囲１．ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む実質的に単離された形態のポリヌクレオチド、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)該ゲノムはタンパク質（１種または複数種）またはポリタンパク質（１種または複数種）をコードする１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)該ゲノムは逆転写酵素をコードする；および (iv)該ゲノムは配列番号１〜６に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つと相同または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。２．配列番号１、２、３、４、５または６のいずれか１つを含む請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを検出可能な標識に連結して含むポリヌクレオチド・プローブ。４．請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。５．請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを所望の宿主細胞に適合性である制御配列と作動可能に(operably)連結して含む発現ベクター。６．請求項４または５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。７．試料と請求項１〜３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを、試料中核酸とプローブとのポリヌクレオチド・デュプレックスを形成させる条件下で接触させ；およびプローブを含むポリヌクレオチド・デュプレックスを検出することを包含する、試料中の多発性硬化症に関与するウィルス性因子からの核酸の存在または非存在を検出する方法。８．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む請求項７に記載の方法。９．ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムにコードされる少なくとも１０個のアミノ酸の隣接配列を含む実質的に単離された形態のポリペプチド、該隣接配列はＨＭＳＶの抗原決定基を含み、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)該ゲノムはタンパク質またはポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)該ゲノムは逆転写酵素をコードする；および (iv)該ゲノムは配列番号１〜６に示されるＨＭＳＶ−１のヌクレオチド配列のいすれか１つと相同または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。１０．配列番号１、２、３、４、５または６のいずれか１つのＯＲＦにコードされる請求項９に記載のポリペプチド。１１．固体支持体に付着された請求項９または１０に記載のポリペプチド。１２．検出可能な標識に付着された請求項９〜１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。１３．（ａ）抗原決定基を含み抗ＨＭＳＶ抗体により結合され得る請求項９〜１２のいずれかに記載のポリペプチドをインキュベートすること、ここで該抗原決定基はＨＭＳＶのゲノムにコードされている；（ｂ）生物学的試料を該ポリペプチドと、抗体−抗原複合体を形成可能な条件下でインキュベートすること；および（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること、を包含するヒト多発性硬化症ウィルスに対する抗体の存在または非存在を検出するためのイムノアッセイ方法。１４．（ａ）請求項９〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチドと結合する抗体組成物を提供すること；（ｂ）試料を抗体組成物と、抗体−抗原複合体を形成可能な条件下でインキュベートすること；および（ｃ）抗ＨＭＳＶ抗体を含む抗体−抗原複合体を検出することを包含する、ヒト多発性硬化症ウィルスからの抗原の存在または非存在を検出するためのイムノアッセイ方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/566 8310−2Ｊ 33/566 // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (72)発明者ガーソンジェレミーイギリス国ダブリュ１ピー６ディービーロンドンクリーヴランドストリート 46 ウィンダイヤービルディングユニヴァーシティカレッジロンドンメディカルスクールデパートメントオブメディカルマイクロバイオロジー (72)発明者トゥークフィリップイギリス国ダブリュ１ピー６ディービーロンドンクリーヴランドストリート 46 ウィンダイヤービルディングユニヴァーシティカレッジロンドンメディカルスクールデパートメントオブメディカルマイクロバイオロジー

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む実質的に単離された形態のポリヌクレオチド、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)該ゲノムはタンパク質（１種または複数種）またはポリタンパク質（１種または複数種）をコードする１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)該ゲノムは逆転写酵素をコードする；および (iv)該ゲノムは配列番号１〜６に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つと相同または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。２．配列番号１、２、３、４、５または６のいずれか１つを含む請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．検出可能な標識に連結した請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド・プローブ。４．請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。５．所望の宿主細胞に適合性である制御配列と作動可能に(operably)連結した請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。６．請求項４または５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。７．試料と請求項１〜３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを、試料中核酸とプローブとのポリヌクレオチド・デュプレックスを形成させる条件下で接触させ；およびプローブを含むポリヌクレオチド・デュプレックスを検出することを包含する、多発性硬化症に関与するウィルス性因子からの核酸の試料中の存在または非存在を検出する方法。８．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む請求項７に記載の方法。９．ヒト多発性硬化症ウィルス（ＨＭＳＶ）のゲノムにコードされる少なくとも１０個のアミノ酸の隣接配列を含む実質的に単離された形態のポリペプチド、該隣接配列はＨＭＳＶの抗原決定基を含み、ここでＨＭＳＶは以下により特徴付けられる： (i)プラス鎖のＲＮＡゲノム； (ii)該ゲノムはタンパク質またはポリタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む； (iii)該ゲノムは逆転写酵素をコードする；および (iv)該ゲノムは配列番号１〜６に示されるＨＭＳＶ−１のヌせよクレオチド配列のいずれか１つと相同または選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含む。１０．配列番号１、２、３、４、５または６のいずれか１つのＯＲＦにコードされる請求項９に記載のポリペプチド。１１．固体支持体に付着された請求項９または１０に記載のポリペプチド。１２．検出可能な標識に付着された請求項９〜１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。１３．（ａ）抗原決定基を含み抗ＨＭＳＶ抗体により結合され得るポリペプチドをインキュベートすること、ここで該抗原決定基はＨＭＳＶのゲノムにコードされている；（ｂ）生物学的試料を該ポリペプチドと、抗体−抗原複合体を形成可能な条件下でインギュベートすること；および（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること、を包含するヒト多発性硬化症ウィルスに対する抗体の存在または非存在を検出するためのイムノアッセイ方法。１４．請求項９〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチドと結合する抗体。１５．（ａ）本発明による抗体組成物を提供すること；（ｂ）試料を抗体組成物と、抗体−抗原複合体を形成可能な条件下でインキュベートすること；および（ｃ）抗ＨＭＳＶ抗体を含む抗体−抗原複合体を検出することを包含する、ヒト多発性硬化症ウィルスからの抗原の存在または非存在を検出するためのイムノアッセイ方法。