JPH08511282A - カタラーゼを主成分とする抗ヘリコバクターピロリ免疫組成物 - Google Patents
カタラーゼを主成分とする抗ヘリコバクターピロリ免疫組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
活性成分として実質的に精製された形のヘリコバクターピロリ(H.pylori)のカタラーゼを含有するH.pyloriに対する免疫組成物。
Description
【発明の詳細な説明】
カタラーゼを主成分とする
抗ヘリコバクターピロリ免疫組成物
本発明はヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)感染症の治療または
予防用の医薬組成物に関するものである。
ヘリコバクターピロリ(H.pylori)は今日までのところヒトの胃腸の粘膜表
面、特定に胃および十二指腸の潰瘍凹変部の周りのみで発見されているグラム陰
性菌である。この細菌は当初カンピロバクターピロリディス(Campylobacter Py
loridis)といわれていた(Warren & Marshall,Lancet 1,1273-1275,1983
)。
現在では、H.pyloriは前庭胃炎(gastrites anttrales)の病因物質であると
認識されており、潰瘍の進行に必要な補足要因の1つであるといわれている。ま
た、胃癌の進行もこのH.pyloriの存在に関係があるといわれている。
この感染症には各種の要因が関与する。この細菌はウレアーゼによって与えら
れる高い尿素分解活性を有し、胃中の酸性環境下でも生存可能である。さらに、
鞭毛によって粘液中を移動してその好適生態場所(ecological niche)に達する
ことができ、付着素(adhesines)によって粘膜に付着することができる。
この細菌は血清免疫応答性が高く、炎症性応答が極めて高いにもかかわらず、
この細菌による感染症は持続性が強い。従って、病原体が生産するカタラーゼが
この感染症の慢性性に中心的な役割を果たしているとするとの仮定が極めて有力
である。事実、一般にカタラーゼ(EC 1.11.1.6)は過酸化水素の存在下
で細菌が生存する上で重要な酵素である。従って、この場合、H.pyloriはカタ
ラーゼによって炎症現象の際に生じる酸素ラジカルの有毒作用から逃げることが
できると考えられる。
H.pyloriでは既に1種類のカタラーゼが特徴付けされている(Hazell達、J.
Gen.Microbiol.(1991)137、57)。このカタラーゼはそのサブユニットの分
子量が約50〜60kDである4量体である。このカタラーゼのN−末端配列も分かっ
ている(Westblom達、Eur.J.Clin.Microbiol.Inf.Dis.(1992)11(6)、
522)。しかし、この細菌が互いにわずかに異なる数種類のカタラーゼを持って
いることを否定するものではない。
本発明者は、H.pyloriのカタラーゼが病原体そのものに対する免疫物質とし
て使用でき、特に予防または治療に有効であるということを見出した。
本発明の対象は、実質的に精製された形のH.pyloriのカタラーゼを活性成分
とするH.pyloriに対する免疫組成物にある。
「実質的に精製されたカタラーゼ」とは、H.pyloriの細胞構成成分の大部分
を除去したカタラーゼの調製物を意味する。
本発明で利用されるカタラーゼはH.pyloriから抽出で得るか、対応するDN
A断片を異種系の細菌、酵母または哺乳類細胞中で発現させる遺伝子組み換え法
で得ることができる。
H.pyloriからのカタラーゼの精製は、ハーゼル(Hazell)達の方法「J.of G
en.Microbiol.(1991)137,57)またはそれに類似した方法で行うことができ
る。また、この蛋白をコードするDNA断片はニューウェル(Newell)達によっ
てクローニングおよび配列決定されている(Microbiol.Ecology in Health and
Disease(1991)4:Supplement S120,H3-1)。
本発明で利用されるカタラーゼはそのカタラーゼ活性を保持
していても変異(好ましくは点変異)によって活性を失っていてもよい。
本発明で利用されるカタラーゼはリポソームのような運搬用ベクター中に封入
されていてもよい。カタラーゼが経口投与される場合にはこうすることが特に有
利である。
本発明組成物はカタラーゼの他にH.pyloriの抗原、例えばウレアーゼを含ん
でいてもよい。
本発明組成物は通常の方法で製造することができる。特に、カタラーゼは製薬
上許容可能なアジュバント、希釈剤またはベヒクルと組み合わされる。本発明組
成物はワクチンの分野で従来用いられている任意の投与経路、特に経口または非
経口ルートで投与することができる。投与は1回で行っても一定の間隔をあけて
複数回で行ってもよい。投与量は各種の因子、例えば治療を受けるヒトまたは投
与方法で変わる。実施例1
H.pyloriからのカタラーゼの精製
(1)培養
H.pylori株 No.ACTT 43579〔ACTT(12301 Parklawn Drive,Rockville
MD USA)より入手可能、−70℃のグリセロール中に保存〕を2相培地を
入れた25cm2のフラスコに接種する。この2相培地は、10mlのトリプチカーゼソ
ヤアガー(Trypticase soja Agar)(Difco社製)に6%の新鮮な羊の血液を添
加したもので構成される固体相と、20%の牛胎児血清を含むトリプチカーゼソヤ
ブロス(Difco社製)3mlからなる液体相とで構成される。フラスコを「ゲナー
(gener)バッグ」(BBL)として周知の液密な袋に入れ、緩やかに回転攪拌
し
ながら37℃で48時間、Microaer System(BBL)によって得られた微好気性条
件(8〜10%のCO2、5−7%のO2、85−87%のN2)下で培養する。48時間
培養後、同じ条件で継代培養を行ってバイオマスを増加させる。遠心分離で細菌
を回収し、PBS(Biomerieux)で洗浄して残留培地を除去する。
(2)精製
洗浄した細菌のペレットを100μMのPMSF(フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド、Sigma社製)を含むpH 7.5の50mM燐酸ナトリウム緩衝液(バッフ
ァーA)に懸濁させて、最終濃度を1mlあたり0.1g(湿重量)にする。Ultratu
rrax型ミキサーを用いて懸濁液をホモジナイズする。次いで、直径1.8cmのゾン
デを備えたSonifier型装置(Branson社)を用いて超音波処理で細菌細胞を破壊
する。この超音波処理は1分間の超音波処理の後に1分間氷の上に静置して断続
的に行う。細菌懸濁液5gを完全に破壊するには10分間の超音波処理で十分であ
る。こうして得られる溶解物を4℃、4000gで15分間遠心分離する。上澄みを回
収し、4℃、100,000gで30分間遠心分離する。この2回目の遠心分離の上澄み
液(S2)を回収してクロマトグラフィーで精製する。このようにして調製され
た画分S2は前記Hazell達の方法またはビーヤ・シーザー(Beers & Sizer)の
方法(J.Biol.Chem.(1952)195,133)の方法に従って測定した全「カタラ
ーゼ」酵素活性を約90%を保持している。
S2画分をバッファーAを用いて予め平衡化したS−セファロースカラム(Ph
armacia社製)に添加する。同じ緩衝液でカラムを洗浄する。蛋白質に関しては
UV検出器(280nm)を用い、
カタラーゼに関しては酵素活性によってクロマトグラフィーをモニターする。固
定していない蛋白質(280nmでの吸収がベースラインにくる)を除去した後、0
〜1MのNaCl濃度勾配を付けたバッファーAでカラムを洗浄する。酵素活性のピ
ークに相当する画分を集め、カットオフ閾値が100,000ダルトンのメンブレンを
備えたAmicon型の濃縮セルを用いて濃縮する。得られた濃縮画分を予めPBSバ
ッファーで平衡化したセファクリルS-300HRカラムに添加する。カタラーゼ活
性を有する画分を集め、1mg/mlに濃縮し、PBSバッファーに対して透析する
。最終溶液を多孔度が0.22μmのメンブレンを用いて濾過し、−70℃で保存する
。
こうして精製された蛋白質は以下の特性を有する:
ペロキシダーゼ活性の非存在下での典型的なカタラーゼ酵素活性
ヘモプロテインに典型的な可視スペクトラム(406nmにソーレー(Soret)ピ
ークかつ520nm〜550nmの間にαとβのピーク
SDS−PAGEで54kDの下記N−末端配列を有するモノマーフォーム:
MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG実施例2
経口投与用医薬組成物
実施例1で得られた蛋白はそのまままたは別のH.pylori蛋白の存在下にゼラ
チンカプセルに封入して胃液による分解から抗原を保護して投与するか、重炭酸
ナトリウムの存在下に投与
することができる。このような調合物は製薬組成物として既に用いられている〔
ブラック(Black)達、Dev.Biol.Stand.53(1983)〕。この蛋白は別の報告
〔エルドリッジ(Eldridge)達、Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1989)146
、59-66〕に記載の方法でPLGAミクロスフィア(グリコール酸と乳酸のコポ
リマー)に封入してもよい。この蛋白質は、さらに、よく知られた従来法(“Li
posomes:a practical approach”,ed.RRC New,D.Rickwood & B.D.Hames
,1991,Oxford Press,ISBN 0-19-963077-1)に従って調製されたリポソームに
包むこともできる。
いずれの調合物を用いた場合でも人間に経口投与する蛋白質の量は1回の投与
あたり1〜10mgとし、4週間の間隔をおいて少なくとも3回投与するのが好まし
い。実施例3
非経口投与用医薬組成物
従来法を用いて実施例1の蛋白質をアルミナゲルに吸着させる。蛋白質を約6.
5のpHを有する緩衝液を用いて濃度1mg/mlの溶液とし、濃度10mg/ml(Al+++に
ついて測定)の水酸化アルミニウムと1時間接触させる。この調製法で得られる
最終組成物は下記の通り:カタラーゼ活性を有する蛋白質50μg/ml、Al+++250
μg/ml、メルチオレート1/10000、全てPBS中。
経口投与の場合と同様に、前回の投与から4週間の間隔をおいて3回注射する
のが好ましい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.活性成分として実質的に精製された形のヘリコバクターピロリ(H.pylori )のカタラーゼを含有するH.pyloriに対する免疫組成物。 2.カタラーゼが変異によってその酵素活性を失っている請求項1に記載の組成 物。 3.カタラーゼがリポソーム等の運搬ベクターに封入されている請求項1または 2に記載の組成物。 4.明礬のようなアジュバントを含有する請求項1〜3のいずれか一項に記載の 組成物。 5.カタラーゼ以外のH.pyloriの抗原、例えばウレアーゼを含有する請求項1 〜4のいずれか一項に記載の組成物。
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