JPH08506484A - 特異的結合力をもつ固定化タンパク質並びに各種プロセス・物品におけるそれらの使用 - Google Patents
特異的結合力をもつ固定化タンパク質並びに各種プロセス・物品におけるそれらの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
特定の化合物に対する結合能力を有する「結合タンパク質」を固定化するための方法にして、上記結合タンパク質又はその機能的部分の生産に組換えＤＮＡ技術を利用した方法が提供される。この結合タンパク質は、アンカータンパク質のＣ末端部分に由来するアンカー部分をも含んだキメラタンパク質の一部分として当該結合タンパク質を生産することによって固定化され、そうすることによって、結合タンパク質は確実に宿主細胞の細胞壁の中又は外側に局在化するようになる。好適なアンカータンパク質は、酵母のα-アグルチニン、ＦＬＯ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｊｓｊａｅにおけるフロキュレーション表現型に関連したタンパク質）、下等真核生物の主要細胞壁タンパク質及び乳酸菌のプロテイナーゼである。分泌用に、キメラタンパク質は、酵母のα-接合因子、酵母のα-アグルチニン、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのインベルターゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのイヌリナーゼ、Ｂａｃｊｌｌｕｓのα-アミラーゼ及び乳酸菌のプロテイナーゼなどの、シグナルペプチドを含んでいてもよい。かかるキメラタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含んでなるベクター、かかるキメラタンパク質が細胞壁に固定化された形質転換微生物、並びにかかる形質転換宿主を用いて単離プロセスを行う方法も提供する。最後の方法では、特定化合物を含んだ媒質をかかる宿主細胞に接触させて複合体を形成させ、媒質から当該複合体を分離し、所望により、結合タンパク質から特定化合物を解離させる。
Description
【発明の詳細な説明】
特異的結合力をもつ固定化タンパク質並びに
各種プロセス・物品におけるそれらの使用 発明の背景
医薬品産業、ファインケミカル産業及び食品産業では、動物・植物組織の抽出
物や培地のような複雑な混合物から単離する必要のある化合物が数多く必要とさ
れている。このような単離プロセスによって製品の価格が決定されることが多い
。従来の単離プロセスは特異性が余り高くなく、単離プロセスの間に単離すべき
化合物がかなり稀釈され、その結果、水その他の溶媒を除去するため経費のかさ
む諸工程を設ける必要があった。
幾つかの特定の化合物の単離にはアフィニティー技術が利用されている。かか
る技術の利点は、それらの化合物がある種のリガンドに極めて特異的に結合する
ことである。しかし、このようなリガンドは非常に高価である場合が極めて多い
。このような高価なリガンドが無駄に使われることのないように、かかるリガン
ドを不溶性担体に連結することも可能である。しかし、こうしたリガンドの連結
処理も経費のかさむ場合が多く、しかもかかる処理によってリガンドの機能が悪
影響を受けることも多い。したがって、有効性の高い固定化リガンドを調製する
ための経済的な方法を開発することが望まれている。発明の概要
本発明は、特定の化合物に対する結合能力を有する「結合タンパク質」を固定
化するための方法にして、上記結合タンパク質又は上記の特異的結合能力を保持
したその機能的部分であって宿主細胞の外部に連結した結合タンパク質又は機能
的部分の生産に組換えＤＮＡ技術を利用して、宿主細胞の細胞壁に固着し得るア
ンカータンパク質のアンカー部分（当該アンカー部分は上記アンカータンパク質
のＣ末端部分から導かれる）のＮ末端に上記結合タンパク質又はその機能的部分
がそのＣ末端で結合しているようなキメラタンパク質を宿主細胞が産生及び分泌
できるようにすることによって上記結合タンパク質又はその機能的部分が細胞壁
中又は細胞壁の外側に局在化するようにさせることを含んでなる方法を提供する
。
宿主は好ましくはグラム陽性細菌及び菌類である。これらはその細胞外部に細
胞壁
を有しており、細胞外部に膜をもつグラム陰性細菌及び動物・植物細胞などの高
等真核生物とは対照的である。好適なグラム陽性細菌には、乳酸菌やＢａｃｉｌ
ｌｕｓ属及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細菌が含まれる。好適な菌類には、
Ｃａｎｄiｄａ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属
の酵母並びにＲｈｉｚｏｐｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ属のカビが含まれる。本明細書中では、菌類は酵母の群とカビの群を
含んでなるが、これらは下等真核生物としても知られている。植物及び動物の細
胞との対比において、細菌及び下等真核生物の群を本明細書では微生物と記載す
ることもある。
本発明は、上記の方法に使用し得る組換えポリヌクレオチドにして、（i）上
記結合タンパク質又は特異的結合能力を保持したその機能的部分をコードする構
造遺伝子、及び（ii）グラム陽性細菌又は菌類の細胞壁に固着し得るアンカータ
ンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分であって、当該遺伝子部分がア
ンカータンパク質のアンカー部分（当該アンカー部分は上記アンカータンパク質
のＣ末端部分に由来する）をコードしているもの、を含んでなるポリヌクレオチ
ドをも提供する。
アンカータンパク質は、α-アグルチニン、ａ-アグルチニン、ＦＬＯ１、下等
真核生物の主要細胞壁タンパク質及び乳酸菌のプロテイナーゼから選択すること
ができる。好ましくは、かかるポリヌクレオチドは当該ポリヌクレオチドの発現
産物の分泌を確実にするためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
をさらに含んでなるが、そのようなシグナルペプチドは酵母のα-接合因子、酵
母のα-アグルチニン、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのインベルターゼ、Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓのα-アミラーゼ及び
乳酸菌のプロテイナーゼから選択されるタンパク質から得ることができる。本発
明のポリヌクレオチドはプロモーターに機能的に連結させることもできるが、プ
ロモーターは誘導型プロモーターであるのが好ましい。
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター、
本発明のポリヌクレオチドにコードされたキメラタンパク質、並びに細胞の外部
に細胞壁をもつ宿主細胞にして本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ保有
する宿主細胞をも提供する。好ましくは、少なくとも１つのポリヌクレオチドが
宿主細胞の染色体に組込まれている。これに関連した本発明の別の具体的態様は
、本発明のキメラタンパク質が細胞壁に固定化されていてそのキメラタンパク質
の結合タンパク質部分が細胞壁中又は細胞壁の外側に局在化している宿主細胞で
ある。
本発明の別の具体的態様は、特定化合物に対する結合能力を保持している固定
化された結合タンパク質又はその機能的部分を用いて単離プロセスを行う方法で
あるが、この方法では、上記特定化合物を含んだ媒質を本発明の宿主細胞に、特
定化合物と固定化結合タンパク質との複合体が形成されるような条件下で、接触
させ、特定化合物を当初含んでいた上記媒質から当該複合体を分離し、所望によ
り、結合タンパク質又はその機能的部分から特定化合物を解離させる。図面の簡単な説明
図１には、ｐＥＭＢＬ９から誘導されたプラスミドであるｐＵＲ４１２２の組
成が示してあるが、その調製法については実施例１に記載されている。
図２には、プラスミドｐＵＲ２７４１の組成が示してあるが、このプラスミド
は既報のプラスミドｐＵＲ２７４０から誘導されたものである。実施例１参照。
図３には、ｐＥＭＢＬ９から誘導されたプラスミドであるｐＵＲ２９６８の組
成が示してある。その調製法については実施例１に記載されている。
図４には、プラスミドｐＵＲ２７４１とｐＵＲ２９６８とｐＵＲ４１２２とを
出発材料としたプラスミドｐＵＲ４１７４の調製法、並びにプラスミドｐＳＹ１
６とｐＵＲ２９６８とｐＵＲ４１２２とを出発材料としたプラスミドｐＵＲ４１
７５の調製法が示してある。これらの調製法は実施例１に記載されている。
図５には、プラスミドｐＵＲ２７４３.４の組成を示した。その調製法は実施
例２に記載されている。このプラスミドは配列番号：１２に示した７１４ｂｐの
ＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントを含んでいるが、このフラグメントには、抗ト
ラセオリド抗体０２/０１/０１のｓｃＦｖ-ＴＲＡＳフラグメントがコードされ
ている（トラセオリド（ｔｒａｓｅｏｌｉｄｅ）は登録商標である）。
図６には、プラスミドｐＵＲ４１７８の組成を示した。その調製法は実施例２
に記載されている。このプラスミドは配列番号：１２に示す上述の７１４ｂｐの
ＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントを含んでいる。このフラグメントは、インベル
ターゼのシグナル
配列（ＳＵＣ２）で先導されたｓｃＦｖ-ＴＲＡＳとαＡＧＧの融合タンパク質
の発現に適している。
図７には、プラスミドｐＵＲ４１７９の組成を示した。その調製法は実施例２
に記載されている。このプラスミドは配列番号：１２に示す上述の７１４ｂｐの
ＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントを含んでいる。このフラグメントは、プレプロ
α-接合因子のシグナル配列で先導されたｓｃＦｖ-ＴＲＡＳとαＡＧＧの融合タ
ンパク質の発現に適している。
図８は分子設計図であり、実施例３に記載のムスク系香料分子のトラセオリド
（登録商標）と修飾ムスク抗原が示してある。
図９には、プラスミドｐＵＲ４１７７の組成が示してある。その調製法は実施
例４に記載されている。プラスミドｐＵＲ４１７７は、ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モンに対するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖フラグメントの可変領域（ｓｃ
Ｆｖ-ＨＣＧフラグメント）をコードした配列番号：１３に示す７３４ｂｐのＥ
ａｇＩ-ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントを含んでおり、ＧＡＬ７プロモーター調節
下でのインベルターゼのシグナル配列で先導されたキメラなｓｃＦｖ-ＨＣＧ-α
ＡＧＧ融合タンパク質の生産に適した基本鎖長２μｍのベクターである。
図１０には、プラスミドｐＵＲ４１８０の組成が示してある。その調製法は実
施例４に記載されている。プラスミドｐＵＲ４１７７は、配列番号：１３に示し
た上述の７３４ｂｐのＥａｇＩ-ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントを含んでおり、
ＧＡＬ７プロモーター調節下でのプレプロα-接合因子のシグナル配列で先導さ
れたキメラなｓｃＦｖ-ＨＣＧ-αＡＧＧ融合タンパク質の生産に適した基本鎖長
２μｍのベクターである。
図１１には、基本鎖長２μｍのベクターであるプラスミドｐＵＲ２９９０の組
成が示してあり、このプラスミドは、実施例５では、プラスミドｐＵＲ４１９６
を調製する際の出発ベクターとして示した（図１２参照）。プラスミドｐＵＲ２
９９０はキメラなリパーゼ-ＦＬＯ１タンパク質をコードするＤＮＡフラグメン
トを含んでいるが、このタンパク質は下等真核生物の細胞壁につなぎとめられ、
脂質の加水分解を触媒し得る。
図１２には、プラスミドｐＵＲ４１９６の組成が示してある。その調製法は実
施例５に記載されている。このプラスミドは、ｓｃＦｖ-ＨＣＧとそれに続くＦ
ＬＯ１タンパク質のＣ末端部分からなるキメラタンパク質をコードするＤＮＡフ
ラグメントを含んで
おり、宿主生物の細胞壁につなぎとめられていてＨＣＧを結合し得るキメラタン
パク質の生産に適したベクターである。
図１３には、プラスミドｐＵＲ２９８５が組成が示してある。その調製法は実
施例６に記載されている。このプラスミドには、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍの染色体からＰＣＲ法で得られたコレステロールオキシ
ダーゼ（ＥＣ １.１.３.６）の成熟部分をコードするｃｈｏＢ遺伝子が含まれて
いる。
図１４には、プラスミドｐＵＲ２９８７の組成を示した。プラスミドｐＵＲ２
９８５からのその調製法は実施例６に記載されている。このプラスミドには、コ
レステロールオキシダーゼの成熟部分をコードするｃｈｏＢ遺伝子と、その前と
後にそれぞれ位置するプレプロα-接合因子のシグナル配列をコードするＤＮＡ
とα-アグルチニンのＣ末端部分をコードするＤＮＡとからなるＤＮＡ配列が含
まれている。
図１５には、既報のプラスミドｐＧＫＶ５５０の組成が示してある。このプラ
スミドは実施例７に記載されており、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ Ｗｇ２株の細胞壁プロテイナーゼのオペロンを
、プロモーター、リボソーム結合部位及びｐｒｔＰ遺伝子を含めて、完全に含ん
でいる。
図１６には、プラスミドｐＵＲ２９８８の組成が示してある。その調製法は実
施例７に記載されている。このプラスミドは別のプラスミドｐＵＲ２９８９の調
製に使用できると期待されるが、そのｐＵＲ２９８９を乳酸菌に導入すれば、乳
酸菌の外表面につなぎとめられていてコレステロールに結合し得るキメラタンパ
ク質が生産されるはずである。
図１７には、プラスミドｐＵＲ２９９３の組成が示してある。その調製法は実
施例８に記載されている。このプラスミドは酵母細胞の形質転換に使用でき、そ
の形質転換酵母細胞は、ＥＧＦレセプターをその一部として有する固定化キメラ
タンパク質を介してヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）に結合し得る。
図１８には、プラスミドｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４８３の組成が示してあ
る。それらの調製法は実施例９に記載されている。プラスミドｐＵＲ４４８２は
、インベルターゼのシグナル配列、ラクダ抗体のＣＨｖ０９可変領域とＭｙｃテ
ールと「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域及びαアグルチニンの細胞壁アンカー領域を
もつ融合タンパク質を発現させるための、酵母のエピソーム型発現プラスミドで
ある。プラスミドｐＵＲ４４８３
は「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域を含んでいない点でｐＵＲ４４８２とは異なる。
図１９には、プラスミドｐＵＲ４４２４、ｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４８３
上に存在するラクダ抗体遺伝子を発現する対数増殖期（ＯＤ530＝０.５）のＳＵ
１０細胞の免疫蛍光標識実験（抗Ｍｙｃ抗体）の結果を示す。Ｐｈ＝位相差。Ｆ
１＝蛍光。
図２０には、プラスミドｐＵＲ４４２４、ｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４８３
上に存在するラクダ抗体遺伝子を発現する対数増殖期（ＯＤ530＝０.５）のＳＵ
１０細胞の免疫蛍光標識実験（抗ヒトＩｇＧ抗体）の結果を示す。Ｐｈ＝位相差
。Ｆ１＝蛍光。図面で用いた略号
α-ｇａｌ： グアーのα-ガラクトシダーゼをコードする
遺伝子；
ＡＧ-ａｌｐｈａ-１/ＡＧα１： Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα-アグルチニ
ンを発現する遺伝子；
ＡＧα１ ｃｄｓ/α-ＡＧＧ： α-アグルチニンのコーディング配列；
Ａｍｐ/ａｍｐ ｒ： β-ラクタマーゼ耐性遺伝子；
ＣＨｖ０９： ラクダ重鎖可変０９フラグメント；
ＥｍＲ： エリスロマイシン耐性遺伝子；
ｆ１： ｆ１ファージ複製配列；
ＥＬＯ１/ＦＬＯ（Ｃ-ｐａｒｔ）：フロキュレーションタンパク質のＦＬＯ１
コーディング配列のＣ末端側部分；
Ｈｉｎｇｅ： ラクダ「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域，実施例
９参照；
ＬＥＵ２： ＬＥＵ２遺伝子；
ＬＥＵ２ｄ/Ｌｅｕ２ｄ： トランケート型ＬＥＵ２遺伝子；
Ｌｅｕ２ｄ ｃｓ： ＬＥＵ２ｄ遺伝子；
ＭｙｃＴ： ラクダＭｙｃテール；
Ｏｒｉ ＭＢ１： 大腸菌プラスミド由来のコーディング配列；
Ｐｇａｌ７/ｐＧＡＬ７： ＧＡＬ７プロモーター；
Ｔｐｇｋ： ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のターミ
ネーター；
ｐｐα-ＭＦ/ＭＦα１ｓｓ： α接合因子のプレプロ部分（＝シグナル配列
）；
ｒｅｐＡ： 複製に必要なタンパク質ｒｅｐＡをコードす
る遺伝子（図１５/１６）；
ＳｃＦｖ（Ｖｈ-Ｖ１）： ＶH鎖とＶL鎖を含む単鎖抗体フラグメント；
ｓｓ： シグナル配列；
ＳＵＣ２： インベルターゼのシグナル配列；
２ｕ/２ｍｉｃｒｏｎ： ２μｍ配列．発明の詳細な説明
本発明は、固定化リガンドを利用して、複雑な混合物から貴重な化合物を単離
することに関する。この固定化リガンドは、遺伝子工学によって得られるタンパ
ク質であって、「アンカータンパク質」又はその機能的部分と「結合タンパク質
」又はその機能的部分との２つの部分で構成される。
「アンカータンパク質」は微生物、好ましくは酵母やカビのような下等真核生
物の細胞壁に固着する。この種のタンパク質は長いＣ末端部分を有していること
が多く、そのＣ末端部分が細胞壁につなぎとめられる。そのようなＣ末端部分は
非常に特殊なアミノ酸配列を有している。この典型的な例がプロリンに富んだタ
ンパク質のＣ末端配列を介した細胞壁への固着である。Ｋｏｋ（１９９０）の報
文参照。
これらのアンカータンパク質のＣ末端部分は、相当数の潜在的セリン及びトレ
オニン-グリコシル化部位を含んでいる可能性がある。これらの部位がＯ-グリコ
シル化されると、タンパク質のＣ末端部分が桿状のコンホメーションをとるよう
になる。
細胞壁固着マンノタンパク質の場合、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用
いてもそれらを細胞壁から抽出することができないのに、グルカナーゼ処理すれ
ばそれらを遊離させることができることから、それらは下等真核生物の細胞壁中
のグルカンに結合しているらしい。本出願人の係属中の特許出願で１９９４年１
月２０日に公開されたＷＯ９４/０１５６７号並びにＳｃｈｒｅｕｄｅｒ他（１
９９３）の報文参照。両文献はいずれも本出願の優先日以降に公開されたもので
ある。タンパク質を細胞の外側につなぎとめるもう一つの機構は、グリコシル-
ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基を含んだタンパク質がそのＧＰＩを介
して細胞表面に固着する性質を利用したものである。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ他（
１９９０）の報文参照。
「結合タンパク質」は、単離すべき特定の化合物に連結又は結合するので、そ
う呼ばれる。アンカータンパク質のＮ末端部分が特定の化合物に結合する能力を
十分
に有していれば、そのアンカータンパク質自身をその特定化合物の単離プロセス
に使用することができる。結合タンパク質として好適なものの例には、抗体、抗
体フラグメント、複数の抗体フラグメントの組合せ、レセプタータンパク質、そ
れぞれの基質に対する結合能力を保持している不活性化酵素及び応用分子進化法
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）で得られるペプ
チド（Ｌｅｗｉｎ（１９９０）の報文参照）、並びにこれらのタンパク質の一部
分で単離すべき特定の化合物に対する結合能力を保持しているものが含まれる。
これらの結合タンパク質はすべて、単離すべき化合物又は関連化合物群を特異的
に認識する能力をもっていることを特徴とする。単離すべき特定の化合物と結合
タンパク質の間の結合速度と解離速度は（したがって、当然に、結合定数も）、
その化合物の存在する抽出液の組成を変化させるか或いはタンパク質工学によっ
て結合タンパク質を変化させることによって調節することができるが、後者の方
法が好ましい。
結合タンパク質とアンカータンパク質（或いはそれらの機能的部分）を含んで
なる「キメラタンパク質をコードする遺伝子」は、構成型、誘導型又は抑制解除
型プロモーターの調節下に置くことができ、通常はキメラタンパク質の効率的な
分泌を図るためにシグナル配列をコードするＤＮＡフラグメントで先導される。
分泌によってキメラタンパク質が微生物の細胞壁に固着して、微生物の表面がそ
のキメラタンパク質によって覆われるようになる。これらの微生物は普通の培養
法で得ることができ、その菌体の単離も遠心や膜濾過法などの物理的分離手段を
用いれば経済的なプロセスとなる。
こうして単離した微生物を、洗浄後、貴重な特定化合物又は化合物群を含んだ
抽出液に添加すればよい。ある程度時間が経過すれば、結合状態にある特定化合
物（群）と遊離状態にある特定化合物（群）との間で平衡が成立し、特定の化合
物又は関連化合物群の結合した微生物を抽出液から簡単な物理的技術で分離する
ことができる。別法として、リガンドで覆われた微生物を担体材料の表面にくっ
つけて、その被覆担体材料をカラムに詰めて使用することもできる。そのカラム
に、特定の化合物又は化合物群を含んだ抽出液を流し込み、その後で、溶出液の
組成か温度又はそれらを共に変化させることによってリガンドから上記化合物（
群）を解離させることができる。これら２通りの可能性の他にも、数々の変法を
用いて、特定化合物
とリガンドとの結合、それらの単離及び／又は特定化合物（群）の解離を行い得
ることは当業者には明らかであろう。
特に、本発明は下等真核生物の細胞壁に結合したキメラタンパク質に関する。
好適な下等真核生物には、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓなどの酵母、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ等のカビが含まれる。用途によっては、特にグラム陽
性細菌などの原核生物を用いることもでき、その具体例には、乳酸菌やＢａｃｉ
ｌｌｕｓ属及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌が含まれる。
「下等真核生物」に関しては、本発明は、キメラタンパク質をコードする遺伝
子にして下記のａ及びｂからなる遺伝子を提供する。
ａ．下等真核生物宿主において機能し得るシグナル配列、例えばα-接合因子、
インベルターゼ、α-アグルチニン、イヌリナーゼのような酵母タンパク質由来
のもの或いはキシラナーゼのようなカビタンパク質由来のものなど、をコードす
るＤＮＡ配列。
ｂ．細胞壁タンパク質のＣ末端をコードする構造遺伝子と、その前に位置する構
造遺伝子にして特定の化合物又は化合物群に対する結合能力を有するタンパク質
をコードする構造遺伝子。後者のタンパク質の例としては、
・抗体；
・単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ及びＷｅｂｂ Ｗａｌｋｅｒ（
１９９１）の報文参照）；
・抗体の重鎖可変領域（ＶH）又は軽鎖可変領域（ＶL）或いはこれらの可変領域
の一部分であって１〜３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を保持した部分；
・レセプタータンパク質のアゴニスト認識部分又はアゴニスト結合能力を保持し
たその一部分；
・触媒活性を喪失した酵素又はかかる酵素の一部分であって酵素の基質結合部位
を保持した部分；
・特異的脂質結合タンパク質又はかかるタンパク質の一部分であって脂質結合部
位を保持した部分（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｆ（１９９２）の報文参照）；並びに
・応用分子進化法で得られるペプチド（Ｌｅｗｉｎ（１９９０）の報文参照）、
が挙げられる。
これらの遺伝子の発現産物はすべてシグナル配列と２つのタンパク質部分（す
なわち単離すべき１種類以上の化合物に対する結合能力を有する部分と通常は細
胞壁結合タンパク質のＣ末端）で構成されていることを特徴とし、後者（細胞壁
結合タンパク質）の具体例としては、α-アグルチニン（Ｌｉｐｋｅ他（１９８
９）の報文参照）；ａ-アグルチニン（Ｒｏｙ他（１９９１）の報文参照）；Ｆ
ＬＯ１（実施例５及び配列番号：１４参照）；並びに下等真核生物の主要細胞壁
タンパク質が挙げられるが、これらのタンパク質のＣ末端は下等真核生物宿主の
細胞壁に発現産物をつなぎとめることができる。
キメラタンパク質をコードするこれらの遺伝子の発現は構成型プロモーターの
制御下に置くこともできるが、誘導型プロモーターが好ましく、その好適な具体
例としては、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのＧＡＬ７プロモーター、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓのイヌリナーゼプロモーター、Ｈａｎｓｅｎｕｌａのメタノー
ルオキシダーゼプロモーター及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのキシラナーゼプロモ
ーターが挙げられる。かかる構築体は新たな遺伝情報が宿主細胞の染色体に安定
に組込まれるような方法で作製するのが好ましい。ＷＯ９１/００９２０号（Ｕ
ＮＩＬＥＶＥＲ）参照。
上記の遺伝子で形質転換した下等真核生物は普通の培養法、連続培養又は流加
培養法で増殖させることができる。適当な微生物増殖法は、使用する遺伝子とプ
ロモーターの構成並びに物理的分離後の菌体の所望精製度に応じて選択される。
「細菌」に関しては、本発明は、キメラタンパク質をコードする遺伝子にして
下記のａ及びｂからなる遺伝子を提供する。
ａ．特定の細菌で機能し得るシグナル配列、例えばＢａｃｉｌｌｕｓのα-アミ
ラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのズブチリシン又はＬａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓのプロテイナーゼ由
来のもの、をコードするＤＮＡ配列。
ｂ．細胞壁タンパク質のＣ末端をコードする構造遺伝子と、その前に位置する構
造遺伝子にして特定の化合物又は化合物群に対する結合能力を有するタンパク質
をコードする構造遺伝子。後者のタンパク質の例は、下等真核生物に関して既に
列挙した。
これらの遺伝子の発現産物はすべてシグナル配列と２つのタンパク質（単離す
べき特定の化合物又は化合物群に対する結合能力を有する部分と通常は細胞壁結
合タンパク質のＣ末端）で構成されていることを特徴とし、後者（細胞壁結合タ
ンパク質）の具体例には、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ
．ｃｒｅｍｏｒｉｓ Ｗｇ２株のプロテイナーゼが含まれるが、そのＣ末端は宿
主細菌の細胞壁に発現産物をつなぎとめることができる。
本発明を以下の実施例で例示するが、これらの実施例は本発明を限定するもの
ではない。最初に、実施例で挙げるエンドヌクレアーゼの制限部位を示しておく
。
実施例１ 下等真核生物の細胞壁に固定化され、複雑な混合物中のリゾチームに 対して高い特異性で結合し得るキメラタンパク質をコードする遺伝子の構築
リゾチームは抗菌酵素であって医薬品産業及び食品産業において数多くの用途
を有する。卵黄やリゾチーム産生微生物含有培地など、幾つかのリゾチーム源が
知られている。リゾチームに対するモノクローナル抗体が得られており（Ｗａｒ
ｄ他（１９８９）の報文参照）、かかる抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｍＲＮ
Ａもハイブリドーマから単離されていて、逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成の鋳
型として用いられている。Ｗａｒｄ他（１９８９）の報文に記載されたプラスミ
ドを出発材料として、我々はｐＵＲ４１２２と名付けたｐＥＭＢＬ由来プラスミ
ドを構築した。このｐＵＲ４１２２においては、ｐＥＭＢＬベクターのＥｃｏＲ
ＩからＨｉｎｄIII部位までの範囲のマルチ
クローニング部位が２３１ｂｐのＤＮＡフラグメントで置換されているが、その
ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は配列番号：１に示したもので、ヌクレ
オチド１〜６にＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）、ヌクレオチド１０５〜１１０
にＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ）、ヌクレオチド１２２〜１２８にＢｓｔＥII部
位（ＧＧＴＣＡＣＣ）、ヌクレオチド２０７〜２１２にＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧ
ＡＧ）及びヌクレオチド２２６〜２３１にＨｉｎｄIII部位（ＡＡＧＣＴＴ）を
有している。ｐＵＲ４１２２の構築
プラスミドｐＥＭＢＬ９（Ｄｅｎｔｅ他（１９８３）の報文参照）をＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIIIで消化し、得られた大フラグメントを配列番号：１に示す合
成二本鎖ＤＮＡと連結した。後段でのＤＮＡフラグメントの連結（それによって
、リゾチームに対する単鎖抗体フラグメントのコーディング配列が最終的に得ら
れる）のために、ｐＥＭＢＬ９ベクターに挿入した上記２３１ｂｐのＤＮＡフラ
グメント（配列番号：１）の中には、以下の要素：ＧＡＬ７プロモーターの３′
部分；インベルターゼのシグナル配列（ＳｕＣ２）；ＰｓｔＩ制限部位；Ｂｓｔ
ＥII制限部位；ＶHフラグメントとＶLフラグメントとを繋ぐ（ＧＧＧＧＳ）×３
ペプチドリンカーをコードする配列；ＳａｃＩ制限部位；ＸｈｏＩ制限部位；Ｈ
ｉｎｄIII制限部位が組込まれており、プラスミドｐＵＲ４１１９が得られる。
ＶHとＧＧＧＧＳリンカーがインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で（すなわち、
フレームシフトを起こさずに）融合するように、プラスミドｐＳＷ１-ＶＨＤ１.
３-ＶＫＤ１.３-ＴＡＧ１（Ｗａｒｄ他（１９８９）の報文参照）をＰｓｔＩ及
びＢｓｔＥIIで消化し、その０.３５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを同様に消化
したｐＵＲ４１１９と連結して、プラスミドｐＵＲ４１１９Ａを得た。続いて、
プラスミドｐＳＷＩ-ＶＨＤ１.３-ＶＫＤ１.３-ＴＡＧ１をＳａｃＩ及びＸｈｏ
Ｉで消化し、得られたＶLのコーディング部分を含むフラグメントをｐＵＲ４１
１９ＡのＳａｃＩ/ＸｈｏＩ部位に連結して、プラスミドｐＵＲ４１２２（図１
参照）を得た。ｐＵＲ４１７４の構築，図４参照
α-アグルチニンのＣ末端部由来の細胞壁アンカーのコードされたＤＮＡを有
するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエピソーム型発現プラスミドを得るため、プラス
ミドｐＵＲ２７４１（図２参照）を出発ベクターとして選んだ。このプラスミド
は基本的にｐＵＲ２７４０の誘導体であり、ｐＵＲ２７４０はＷＯ９１／１９７
８２号及び
Ｖｅｒｂａｋｅｌ（１９９１）の報文に記載されている通りプラスミドｐＵＲ２
７３０の誘導体である。ｐＵＲ２７３０の作製法は欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ１-
０２５５１５３（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）の例９に明瞭に記載されている。プラスミ
ドｐＵＲ２７４１は、既に不活性化されているテトラサイクリン（ｔｅｔ）耐性
遺伝子の残存部分にあるＥａｇＩ制限部位がＮｒｕＩ/ＳａｌＩ消化によって欠
失している点でｐＵＲ２７４０とは異なる。そのＳａｌＩ部位の一本鎖突出端は
再連結前に埋められている。
ｐＵＲ４１２２をＳａｃＩ及びＨｉｎｄIIIで消化（ＳａｃＩは部分的消化）
しておよそ８００ｂｐのフラグメントを単離し、これを、同じ酵素でｐＵＲ２７
４１を消化して得たｐＵＲ２７４１ベクターフラグメントにクローニングした。
得られたプラスミドはｐＵＲ４１２５と名付けた。
ｐＵＲ２９６８と名付けたプラスミド（図３参照）を、（１）Ｌｉｐｋｅ他（
１９８９）の報文に記載されたＡｇα１含有プラスミドｐＬα２１をＨｉｎｄII
Iで消化し、（２）約６．１ｋｂｐフラグメントを単離し、（３）このフラグメ
ントをＨｉｎｄIII処理ｐＥＭＢＬ９と当該６.１ｋｂｐフラグメントがｐＥＭＢ
Ｌ９ベクターのマルチクローニング部位に存在するＨｉｎｄIII部位に導入され
るように連結することによって、作製した。
プラスミドｐＵＲ４１２５をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化して、その約８
ｋｂｐフラグメントを、下記の配列のＸｈｏＩ/ＮｈｅＩアダプターを用いて、
ｐＵＲ２９６８の約１.４ｋｂｐのＮｈｅＩ-ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結し
た。
ＸｈｏＩ ＮｈｅＩ
5′-TC GAG ATC AAA GGC GGA TCT G -3′ ＝配列番号：２
3′- C TAG TTT CCG CCT AGA CGATC-5′ ＝配列番号：３
プラスミドｐＵＲ２９６８及びｐＵＲ４１２５の適当な部分及びＸｈｏＩ/Ｎ
ｈｅＩアダプターをこのように連結して得たプラスミドをｐＵＲ４１７４と名付
けたが、このプラスミドｐＵＲ４１７４は、アミノ末端にインベルターゼのシグ
ナル（プレ）ペプチド、続いてｓｃＦｖ-ＬＹＳポリペプチド、最後にα-アグル
チニンのＣ末端からなるキメラ融合タンパク質をコードしている（図４参照）。ｐＵＲ４１７５の構築，図４参照
ｐＵＲ４１２２（上記参照）をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIIIで消化しておよそ７
００ｂｐのフラグメントを単離し、これを、ＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し
たｐＳＹ１６（Ｈａｒｍｓｅｎ他（１９９３）の報文参照）のベクターフラグメ
ントに、下記配列のＥａｇＩ-ＰｓｔＩアダプターを用いて連結した。
ＥａｇＩ ＰｓｔＩ
5′-G GCC GCC CAG GTG CAG CTG CA-3′ ＝配列番号：４
3′- CGG GTC CAC GTC G -5′ ＝配列番号：５
こうして得られたプラスミドｐＵＲ４１３２をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消
化して、上記のＸｈｏＩ/ＮｈｅＩアダプターを用いて、ｐＵＲ２９６８（上記
参照）の約１.４ｋｂｐのＮｈｅＩ-ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結して、プラ
スミド４１７５を得た（図４参照）。このプラスミドは、α-接合因子のプレプ
ロペプチド、続いてｓｃＦｖ-ＬＹＳポリペプチド、最後にα-アグルチニンのＣ
末端からなるキメラ融合タンパク質をコードしている。実施例２
下等真核生物の細胞壁に固定化され、複雑な混合物中のトラセオリド に対して高い特異性で結合し得る同族キメラタンパク質群をコードする遺伝子群 の構築
ハイブリドーマ細胞系統からのＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの調製並びに抗体可変
領域をコードする遺伝子フラグメントのＰＣＲ法による増幅は、文献記載の常法
にしたがって行った。例えばＯｒｌａｎｄｉ他（１９８９）の報文参照。ＰＣＲ
増幅では、様々なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
重鎖フラグメントに対しては、下記のプライマーを使用した。
Ａ： AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G
ＰｓｔＩ ＝配列番号：６
（ただし、ＳはＣ又はＧ、ＭはＡ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴである
）、及び
Ｂ： TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC
ＢｓｔＥII ＝配列番号：７
軽鎖フラグメント（κ鎖）に対しては、下記のプライマーを使用した。
Ｃ： GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA
ＳａｃＩ ＝配列番号：８
Ｄ： GTT TGA TCT CGA GCT TGG TCC C
ＸｈｏＩ ＝配列番号：９ｐＵＲ４１４３の構築
将来の構築作業を簡単にするために、ｐＵＲ４１２２（上記参照）のインベル
ターゼシグナル配列とｓｃＦｖ-ＬＹＳの連結部にＥａｇＩ制限部位を導入した
。これは、配列番号：１に示す合成フラグメント内の約１１０ｂＰのＥｃｏＲＩ
-ＰｓｔＩフラグメントを下記配列の合成アダプターで置換することによって達
成した。
ＥｃｏＲＩ ＰｓｔＩ
AATTCGGCCGTTCAGGTGCAGCTGCA ＝配列番号：１０
GCCGGCAAGTCCACGTCG ＝配列番号：１１
こうして得たプラスミドをｐＵＲ４１２２.１と名付けたが、このｐＵＲ４１
２２.１は、ＥａｇＩ部位の後にインフレームで続く単鎖Ｆｖをプレプロα-接合
因子配列又はＳＵＣ２インベルターゼシグナル配列のいずれかに引き続いて発現
させるための構築ベクターである。
重鎖ＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIで消化して、約２３０ｂｐ
のＰｓｔＩフラグメントと約１１０ｂＰのＰｓｔＩ/ＢｓtＥIIラグメントの２種
類のフラグメントを得た。後者のフラグメントを、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIで消
化しておいたベクターｐＵＲ４１２２.１にクローニングした。こうして新たに
得られたプラスミド（ｐＵＲ４１２２.２）をＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化し、
次いでこのベクターに軽鎖ＰＣＲフラグメント（同じ制限酵素で消化しておいた
もの）をクローニングしてｐＵＲ４１２２.３を得た。このブラスミドをＰｓｔ
Ｉで消化し、しかる後にこのプラスミドベクターに上記の約２３０ｂｐのＰｓｔ
Ｉフラグメントをクローニングして、ｐＵＲ４１４３と呼ばれるプラスミドを得
た。２通りに配向している可能性があるが、通例の制限酵素分析によって選択す
ることができる。ｐＵＲ４１２２に元々存在してい
たｓｃＦｖ-ＬＹＳ遺伝子の代わりに、この新たなプラスミドｐＵＲ４１４３に
は抗トラセオリド抗体０２/０１/０１のｓｃＦｖ-ＴＲＡＳフラグメントをコー
ドする遺伝子が含まれている（７１４ｂＰのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントの
ヌクレオチド配列に関しては配列番号：１２参照）。ｐＵＲ４１７８及びＰＵＲ４１７９の構築
ｐＵＲ４１４３をＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化すれば、約７１５ｂｐのフ
ラグメントが単離できる。このフラグメントは、同じ制限酵素で消化しておいた
ｐＵＲ２７４１及びｐＵＲ４１７５のベクター主鎖にクローニングすることがで
きる。ｐＵＲ２７４１の場合、そのようにしてプラスミドｐＵＲ２７４３.４が
得られた（図５参照）。このプラスミドはＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化して
ｐＵＲ４１７４の８ｋｂｐのＸｈｏＩ-ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結すること
ができ、ｐＵＲ４１７８を与える（図８）。
ｐＵＲ４１７５を出発ベクターとして用いた場合に得たプラスミドはｐＵＲ４
１７９と名付けた（図９）。
プラスミドｐＵＲ４１７８及びｐＵＲ４１７９を共にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅに導入した。実施例３
ある種の条件下でトラセオリドの結合又は解離を改良するための、ト ラセオリドに結合し得るキメラタンパク質の結合部分の修飾
免疫反応の際の抗体の結合特性が、抗原の分子的性質に応じた抗体の結合領域
中の相補性決定配列の微調整に起因して変化することは周知の免疫学的現象であ
る。抗体フラグメントの抗原結合領域を抗原接触領域の分子モデルに基づいて適
合させることによってこの現象をインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で真似るこ
とができる。
その一つの具体例が、抗ムスク抗体Ｍ０２/０１/０１をもっと強く結合する変
異体Ｍ０２Ｏ５０１ｉへとタンパク質工学的に改変することである。
まず、抗リゾチーム抗体ＨＹＨＥＬ１０の原子座標（ブルックヘブン・プロテ
イン・データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａ
ｎｋ）に収録；３ＨＦＭ）を鋳型として利用したホモロジーモデリングにより、
Ｍ０２/０１/０１可変フラグメント（Ｆｖ）の分子モデルを構築した。この分子
モデルを、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ４Ｄ２４０ワークステーション上
でＢｉｏｓｙｍ製のプログラムＤＩＳＣＯＶＥＲに基づいて、モレキュラー・メ
カニクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）法及びモレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ）法を用いて改良した。次に、こうして得たＦｖの結合部位
のマッピングをＣＤＲ領域にムスク抗原を視覚的にドッキングさせて行った後、
再度モレキュラー・ダイナミクス法を用いて改良した。得られたモデルを充填効
率（ファン・デル・ワールスの接触面積）について検討したところ、ＡＬＡ Ｈ
９６をＶＡＬで置換すればリガンドとＦｖの間の（疎水性）接触面積が増えて相
互作用が強まるものと結論できた（図８）。
この変異を実施例２で得たｃＤＮＡ由来ｓｃＦｖのＭ０２/０１/０１に導入し
たとき、得られるものはＦｖ Ｍ０２０５０１ｉであり、少なくとも５倍増大し
た親和性をもつ変異体であると予想できたが、その増大した親和性は上記ムスク
香料分子に対するＦｖの蛍光滴定法を利用して測定することができた。実施例４
下等真核生物の細胞壁に固定化され、ＨＣＧのようなホルモンに結合 し得るキメラタンパク質をコードする遺伝子の構築
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに対するモノクローナル抗体由来の重鎖及び軽鎖
フラグメントの可変領域をコードする遺伝子フラグメントを、実施例２に記載し
た方法と同様の方法でハイブリドーマから得た。
次に、これらのＨＣＧ ＶH及びＶL遺伝子フラグメントを対応ＰｓｔＩ-Ｂｓｔ
ＥII及びＳａｃＩ-ＸｈｏＩ遺伝子フラグメントの置換によってプラスミドｐＵ
Ｒ４１４３にクローニングして、プラスミドｐＵＲ４１４６を得た。
実施例２に記載した方法と同様に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに対するモノ
クローナル抗体由来の重鎖及び軽鎖フラグメントの可変領域（ｓｃＦｖ-ＨＣＧ
フラグメント）をコードする７３４ｂｐのＥａｇＩ-ＸｈｏＩフラグメント（配
列番号：１３に示すヌクレオチド配列）をｐＵＲ４１６６から単離して、同一の
制限酵素で消化しておいたｐＵＲ４１７８（実施例２参照）のベクター主鎖に実
際に導入したが、同一の制限酵素で消化しておいたｐＵＲ４１７５（実施例１参
照）のベクター主鎖にも導入できるはずである。こうしてプラスミドｐＵＲ４１
７７（図９参照）及びｐＵＲ４１８０（図１０参照）が得られるが、前者につい
ては実際にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＵ１０株に導入し、後者もＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのＳＵ１０株に導入できるはずである。
実施例５ 下等真核生物の細胞壁に固定化され、ＨＣＧのようなホルモンに結合 し得るキメラタンパク質ｓｃＦｖ-ＦＬＯ１をコードする遺伝子の構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるフロキュレーション表現型に関連した遺伝
子の一つがＦＬＯ１遺伝子である。ＦＬＯ１遺伝子の主要部分を含んだクローン
のＤＮＡ配列を今回決定した（２６８５ｂｐのＦＬＯ１遺伝子を示す配列番号：
１４参照）。このクローン化フラグメントは、サザーンハイブリダイゼーション
及びノーザンハイブリダイゼーションの結果ではゲノムコピーよりも約２ｋｂ短
かったが、ＦＬＯ１遺伝子の両端を含んでいた。ＤＮＡ配列データの解析から、
推定タンパク質には、分泌のためのシグナル配列と認められるＮ末端疎水性領域
と、ＧＰＩアンカーの付着のためのシグナルとして機能していると思われる疎水
性Ｃ末端と、多数のグリコシル化部位とが含まれていたが、グリコシル化部位は
特にＣ末端側に多く含まれており、恣意的に決定したＣ末端（アミノ酸２７１〜
８９４）には４６.６％のセリンとトレオニンが含まれている。したがって、Ｆ
ＬＯ１遺伝子産物は酵母細胞壁の中に配向して位置している可能性が高く、隣接
細胞間の相互作用に直接関与しているらしい。
クローン化したＦＬＯ１配列は、したがって、種類の細胞壁アンカーによる細
胞壁へのタンパク質又はペプチドの固定化に適している。ｓｃＦｖ-ＨＣＧとＦ
ＬＯ１タンパク質のＣ末端部分とからなるキメラタンパク質の生産には、出発ベ
クターとしてプラスミドｐＵＲ２９９０（図１１参照）を使用できる。エピソー
ム型プラスミドｐＵＲ２９９０の調製法は、本出願人の係属中の特許出願で１９
９４年１月２０日（本願の優先期間中）に公開されたＷＯ９４/０１５６７（Ｕ
ＮＩＬＥＶＥＲ）に記載されている。プラスミドｐＵＲ２９９０には、Ｈｕｍｉ
ｃｏｌａのリパーゼをコードする遺伝子とＦＬＯ１遺伝子産物の推定Ｃ末端細胞
壁アンカードメインをコードする遺伝子とからなるキメラ遺伝子が含まれており
、そのキメラ遺伝子に先行してインベルターゼのシグナル配列（ＳＵＣ２）及び
ＧＡＬ７プロモーターが存在している。さらに、このプラスミドには、酵母２μ
ｍ配列、Ｅｃｋａｒｄ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（１９８３）の報文に記載され
た不完全Ｌｅｕ２プロモーター、及びＬｅｕ２遺伝子（Ｒｏｙ他（１９９１）の
報文参照）も含まれている。実施例４記載のプラスミドｐＵＲ４１４６をＰｓｔ
Ｉ及びＸｈｏＩで消化すれば、ｓｃＦｖ-ＧＣＧコーディング配列を含んだ約０.
７ｋｂｐのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントが得られる。このＤＮＡ配列を
ＦＬＯ１のＣ末端部分とＳＵＣ２シグナル配列との間にインフレームで融合させ
るには、このフラグメントをプラスミドｐＵＲ２９９０の９.３ｋｂｐ ＥａｇＩ
/ＮｈｅＩ（部分）主鎖に直接連結すればよく、その結果、プラスミドｐＵＲ４
１９６（図１２参照）が得られる。このプラスミドは、ＳＵＣ２シグナル配列と
ｓｃＦｖ-ＨＣＧの開始部分との間にＡｌａをコードする追加トリプレットと、
ＦＬＯ１タンパク質のＣ末端の最初のアミノ酸（Ｓｅｒ）の前にＥ-Ｉ-Ｋ-Ｇ-Ｇ
アミノ酸配列をコードする追加トリプレットを含んでいる。
以上の実施例１〜実施例５において抗体フラグメントの露出度が低すぎる場合
には、抗体フラグメントのフレームワーク領域に変異を導入することによって産
生レベルを上げることができる。このような変異導入は、文献に記載された公知
技術を用いて、部位特異的変異導入法で行うこともできるし、（標的）ランダム
変異誘発法で行うこともできる。実施例６
下等真核生物の細胞壁に固定化され、コレステロールに結合し得るキ メラタンパク質をコードする遺伝子の構築
文献には、コレステロールオキシダーゼについて２種類のＤＮＡ配列：すなわ
ち、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍ由来のｃｈｏＢ遺伝
子（Ｏｈｔａ他（１９９１）の報文参照）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
ＳＡ-ＣＯＯ由来のｃｈｏＡ遺伝子（Ｉｓｈｉｚａｋａ他（１９８９）の報文参
照）が記載されている。コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．６）
をコードするｃｈｏＢ遺伝子とＡＧ-α１遺伝子の３′部分との融合ＤＮＡの構
築には、染色体ＤＮＡ上でのＰＣＲを利用すればよい。染色体ＤＮＡはＢｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍから常法にしたがって単離するこ
とができ、コレステロールオキシダーゼの成熟部分をコードするＤＮＡ部分の増
幅は、下記のＰＣＲプライマーｃｈｏ０１ｐｃｒ及びｃｈｏ０２ｐｃｒによって
行うことができる。
これらのプライマーは共に標的配列に特異的にハイブリダイズし得るので、上
記遺伝子のコーディング部分が増幅されて、その特異的ＰＣＲ産物は、プロテイ
ナーゼＫ処理及びＥｃoＲＩ及びＨｉｎｄIIIでの消化後、適当なベクター（ここ
では、ｐＴＺ１９Ｒ（Ｍｅａｄ他（１９８６）の報文参照）が好ましい）に直接
クローニングすることができるようになる。その結果、プラスミドｐＵＲ２９８
５（図１３参照）が得られる。
上記の制限部位の他に、これらのＰＣＲプライマーはいずれも１.５ｋｂｐの
ＤＮＡフラグメントの５′末端及び３′末端に別の制限部位を生じるので、それ
らの制限部位を利用すれば後段で上記フラグメントをその一端でＳＵＣ２シグナ
ル配列又はプレプロ-α-接合因子シグナル配列と融合させ、かつもう一方の末端
でα-アグルチニンのＣ末端コーディング部分と融合させることができる。プレ
プロＭＦ配列の後での連結を容易にするには、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーｃｈｏ０１ｐｃｒの５′末端にＮｏｔＩ部位を導入して、例えばｐＵＲ４１
７５中のｓｃＦｖ-Ｌｙｓコーディング配列を含んだ７３１ｂｐのＥａｇＩ/Ｎｈ
ｅＩフラグメントでｃｈｏＢコーディング配列を置換できるようにすればよい。
コレステロールオキシダーゼとα-アグルチニンとの酵素活性をもたない融合
タンパク質を作るには、上述したｐＴＺ１９Ｒへのサブクローニング法を用いれ
ばよい。コレステロールオキシダーゼはＦＡＤ依存性酵素であり、Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍの酵素については結晶構造も既に決定さ
れている（Ｖｒｉｅｌｉｎｋ他（１９９１）の報文参照）。この酵素はＧｌｙ-
Ｘ-Ｇｌｙ-Ｘ-Ｘ-Ｇｌｙという配列のＦＡＤ結合ドメインの典型的なパターンに
対する相同性をＮ末端付近（アミノ酸１８〜２３）に示す。プラスミドｐＵＲ２
９８５に対する部位特異的インヴィトロ変異導入を製造業者のプロトコル（Ｂｉ
ｏ-Ｒａｄ社製のＭｕｔａ-Ｇｅｎｅキット）に基づいて利用すれば、Ｇｌｙ残基
（群）をコードするトリプレット（群）を他
のアミノ酸をコードするトリプレットで置換してＦＡＤ結合部位を不活性化し、
ひいては上記酵素を不活性化できるはずである。例えば、保存されたＧｌｙ残基
のうちの２つに部位特異的な変異を導入するには、下記のプライマーを使用する
ことができる。
このプライマーを用いて変異導入を行うと、プラスミドｐＵＲ２９８６が得ら
れるはずである。このプラスミドからは、ＮｏｔＩ/ＮｈｅＩ消化によって、不
活性化されていると推定されるコレステロールオキシダーゼをコードしたＤＮＡ
が１５２７ｂｐフラグメントとして放出されるはずであり、このＤＮＡフラグメ
ントをｐＵＲ４１７５中のｓｃＦｖ-Ｌｙｓコーディング配列との置換に直接使
用すれば、プラスミドｐＵＲ２９８７（図１４参照）が得られる。分泌がＳＵＣ
２シグナル配列で支配されているような、酵母分泌ベクターの変異体を得るには
、例えばプラスミドｐＵＲ２９８６の１８２３ｂｐ長のＳａｃＩ/ＮｈｅＩセグ
メントを用いてｐＵＲ４１７４中のＳａｃＩ/ＮｈｅＩフラグメントを置換すれ
ばよい。こうしたＦＡＤ結合部位の不活性化は他の変異体に対しても好ましいと
考えられるが、それは、活性中心を変えないでおくとコレステロールオキシダー
ゼのコレステロールに対する結合特性が変わらないと予想されるからである。上
述した成熟コーディング配列の１８位及び２０位でのＧｌｙ→Ａｌａへの置換以
外にも、他のどのような適当なアミノ酸への変更を行うこともできる。
酵素を不活性化するには、例えば正にプロトン受容体として機能する部位に位
置する残基であるＧｌｕ３３１の置換などによって、活性部位のくぼみ構造部に
おいて部位特異的変異導入を行うこともでき、そうすることによって酵素活性を
もたない固定化融合タンパク質の新たな変異体を得ることができる。実施例７
乳酸菌の細胞壁に固定化され、コレステロールに結合し得るキメラタ ンパク質をコードする遺伝子の構築
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓのプ
ロテイナーゼが１２７アミノ酸残基からなる長いＣ末端を介して細胞壁に固着し
ていることが報告されている。Ｋｏｋ他（１９８８）並びにＫｏｋ（１９９０）
の報文参照。実施例６に記載した方法と同様の方法で、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍのコレステロールオキシダーゼ（ｃｈｏＢ）をＬ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの細胞壁に固定化することができる。ｃｈ
ｏＢ構造遺伝子とＮ末端シグナル配列とＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
のプロテイナーゼのＣ末端アンカーとの間で融合を行うことができる。プラスミ
ドｐＧＫＶ５５０（図１５参照）は、プロモーター、リボソーム結合部位及び上
述のシグナル配列とアンカー配列をコードしたＤＮＡフラグメントを含め、Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ Ｗｇ２株
の全プロテイナーゼオペロンを含んでいる（Ｋｏｋ（１９９０）の報文参照）。
最初に、以下に示すようなｐＧＫＶ５５０上でのＰＣＲによって、シグナル配列
の主要部とその両側にＣｌａＩ部位とＥａｇＩ部位の含まれたＤＮＡフラグメン
トを構築することができる。
プライマーｐｒｔ１： ＝配列番号：２４
5'-AA GAT CTA TCG ATC TTG TTA GCC GGT ACA-3'
プロテイナーゼ遺伝子（非コーディング鎖）： ＝配列番号：２５
3'-TT CCC GAT AGC TAG AAC AAT CGG CCA TGT CAG-5'
ＣｌａＩ
プロテイナーゼ遺伝子： Gln Ala Lys ＝配列番号：２６
5'-GTC GGC GAA ATC CAA GCA AAG GCG GCT-3'
プライマーｐｒｔ１： ＝配列番号：２７
3'-CAG CCG CTT TAG GTT CGT TGC CGG CCC CCC TTC GAA CCC-5'
ＥａｇＩ ＨｉｎｄIII
実施例６で述べたＰＣＲ反応の後で、９８ｂｐのＰＣＲフラグメントを単離し
てＣｌａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化すればよい。次に、ｐＧＫＶ５５０をＣｌａ
Ｉで部分的に切断し、ＨｉｎｄIIIで完全に切断すれば、かかる消化の後、上記
プロテイナーゼ遺伝
子のプロモーター、リボソーム結合部位、Ｎ末端の８個のアミノ酸と１２７個の
Ｃ末端アミノ酸の細胞壁結合フラグメントをコードしたＤＮＡフラグメントを含
んだベクターフラグメントをゲル上で単離することができる。
ｐｒｔＰアンカードメインとの融合に適したコレステロールオキシダーゼ遺伝
子のコピーは、ｐＵＲ２９８５（実施例６）を鋳型として用い、プライマーｃｈ
ｏ０２ｐｃｒの代わりに下記のプライマーｃｈｏ０３ｐｃｒをプライマーｃｈｏ
０１ｐｃｒ（実施例６）と組合わせて利用したＰＣＲ反応によって作製すること
ができる。
この反応によって生じる約１.５３ｋｂｐフラグメントをＮｏｔＩ及びＨｉｎ
ｄIIIで消化して得られる分子は、次いでｐＵＲ２９８８（図１６参照）由来の
ＥａｇＩ/ＨｉｎｄIII大フラグメントと連結することができる。こうして得られ
るプラスミドｐＵＲ２９８９は、プロテイナーゼ遺伝子のシグナル配列とＣ末端
細胞壁アンカードメインとの間に挿入されたコレステロールオキシダーゼのコー
ディング配列を含んでいるはずである。このプラスミドは、電気穿孔法でＬａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３株に導
入すればプロテイナーゼプロモーターの制御下でコレステロールオキシダーゼを
発現するはずである。膜を通しての輸送はプロテイナーゼのシグナル配列によっ
て媒介されるはずであり、コレステロールオキシダーゼの固定化はプロテイナー
ゼのアンカーによって媒介される。ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓがＦＡＤを同時に分
泌する可能性は低いので、コレステロールオキシダーゼはコレステロールに結合
し得るものの、活性ではないはずである。
実施例８ 下等真核生物の細胞壁に固定化され、上皮成長因子のような成長ホル モンに結合し得るキメラタンパク質をコードする遺伝子の構築
ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を大量に単離するため、結合ドメインが細胞壁ア
ンカーとしてのα-アグルチニンのＣ末端部分と融合した形の対応レセプターを
利用することができる。ヒト上皮成長因子の全ｃＤＮＡ配列がクローニングされ
、配列が決定されて
いる。ＥＧＦ結合能力をもつ融合タンパク質の構築には、成熟型レセプターのＮ
末端部分から中央の２３個のアミノ酸残基からなる膜貫通領域までを利用するこ
とができる。
こうした構築にはプラスミドｐＵＲ４１７５を利用することができる。Ｅａｇ
Ｉ及びＮｈｅＩ（部分）での消化によって、ｓｃＦｖのコードされた配列を含む
７３１ｂｐのＤＮＡフラグメントが放出されるが、このフラグメントは、ヒト上
皮成長因子レセプターの最初の６２１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡフラ
グメントで置換することができる。既存のヒトｃＤＮＡライブラリーを出発点と
するか、さもなければ例えばＡ４３１ガン腫細胞（Ｕｌｌｒｉｃｈ他（１９８４
）の報文参照）のような優先的にＥＧＦレセプターを過剰産生する細胞から常法
によってｃＤＮＡライブラリーを作成しておいて、ＰＣＲをさらに行えばヒト上
皮成長因子レセプターの細胞外結合ドメイン（アミノ酸１〜６２２）とα-アグ
ルチニンのＣ末端部分とのインフレーム連結体を作成することができる。ヒト上皮成長因子レセプターとα-アグルチニンのＣ末端とのインフレーム連結 のためのＰＣＲオリゴヌクレオチド
ａ：ＳＵＣ２シグナル配列と成熟ＥＧＦレセプターのＮ末端との間の移行用ＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチド
ｂ:ＥＧＦレセプターの細胞外結合ドメインのＣ末端とα-アグルチニンのＣ末端
との間のインフレーム移行用ＰＣＲオリゴヌクレオチド
この融合によって、シグナル配列とＥＧＦレセプターの成熟Ｎ末端の間に２つ
のＡｌａ残基が追加されることになる。こうして新たに得られる１.９ｋｂｐの
ＰＣＲフラグメントをＮｏｔＩ及びＮｈｅＩで消化すれば、同じ酵素で消化して
おいたベクターｐＵＲ４１７５に直接連結することができ、ＧＡＬ７プロモータ
ーと、プレプロα-接合因子配列と、ＥＧＦレセプター結合ドメイン遺伝子/α-
アグルチニンの融合遺伝子と、酵母２μｍ配列と、不完全ＬＥＵ２プロモーター
と、ＬＥＵ２遺伝子とを含んだプラスミドｐＵＲ２９９３（図１７参照）を得る
ことができる。このプラスミドはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換すること
ができ、形質転換細胞はＹＰ培地中で培養することができ、キメラタンパク質の
発現はこの培地にガラクトースを添加することによって誘導し得る。実施例９
酵母の細胞壁に固定化され、「ラクダ科」重鎖抗体の結合ドメインを 含んでなるキメラタンパク質をコードする遺伝子の構築
最近、ラクダ類並びにその近縁種（例えばラマ）が重鎖のダイマーだけで構成
されたＩｇＧ抗体分子をかなりの量で含んでいることが報告されている（Ｈａｍ
ｅｒｓ-Ｃａｓｔｅｒｍａｎ他（１９９３）の報文参照）。このような「重鎖」
抗体は軽鎖を欠いているが、それにもかかわらず広い抗原結合範囲を有している
ことが実証されている。この種の抗体の可変領域を生産し、酵母の細胞壁の外側
に連結できることを示すために、下記の構築体を作製した。ｐＵＲ２９９７，ｐＵＲ２９９８及びｐＵＲ２９９９の構築
ｐＵＲ４１７７（実施例４、図９参照）の約２．１ｋｂｐのＥａｇＩ-Ｈｉｎ
ｄIIIフラグメントを単離した。ＰＣＲ法を利用して、ＥａｇＩ部位のすぐ上流
にＥｃｏＲＩ部位を導入したが、そうして得られたＥｃｏＲＩ部位の塩基ＣはＥ
ａｇＩ部位の最初の塩基Ｃと同一である。こうして得たＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIII
フラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで消化しておいたプラスミドｐＥ
ＭＢＬ９に連結して、ｐＵＲ４１７７.Ａを得た。
プラスミドｐＵＲ４１７７.ＡのＥｃｏＲＩ/ＮｈｅＩフラグメントを、３種類
の異なる合成ＤＮＡフラグメント（配列番号：３２，配列番号：３３及び配列番
号：３４）のＥｃｏＲＩ/ＮｈｅＩフラグメントで置換して、それぞれ、ｐＵＲ
２９９７、ｐＵＲ２９９８及びｐＵＲ２９９９を得た。ｐＵＲ２９９７とｐＵＲ
２９９８の約
１.５ｋｂＰのＢｓtＥII-ＨｉｎｄIIIフラグメントを単離した。ｐＵＲ４４２１の構築
プラスミドｐＥＭＢＬ９（Ｄｅｎｔｅ他（１９８３）の報文参照）のマルチク
ローニング部位（ＥｃｏＲＩ部位からＨｉｎｄIII部位までの範囲）を、下記に
示すヌクレオチド配列をもつ合成ＤＮＡフラグメント（コーディング鎖を示す配
列番号：３５並びに非コーディング鎖を示す配列番号：３６参照）で置換した。
このヌクレオチド配列の５′部分は、ＥａｇＩ部位、ラクダＶH遺伝子フラグメ
ントの最初の４つのコドン（ヌクレオチド１６〜２７）、及び５番目及び６番目
のコドン（ヌクレオチド２８〜３３）に一致するＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）
を含んでいる。その３′部分は、ラクダＶH遺伝子の最後の５つのコドン（ヌク
レオチド４６〜６０）（その一部はＢｓｔＥII部位に一致する）、Ｍｙｃテール
の１１個のコドン（ヌクレオチド６１〜９３）（これら１１個のコドンを含んだ
配列番号：３５及びアミノ酸配列を示す配列番号：３７を参照）、及びＥｃｏＲ
Ｉ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでいる。このＥｃｏＲＩ部位はｐＥＭＢＬ９に元
々存在していたもので、ヌクレオチド配列の５′末端が下記の（ＥｃｏＲＩ）と
して示す通りＡＡＴＴＣの代わりにＡＡＴＴＴを含んでいるので、機能しなくな
っている。得られたプラスミドはｐＵＲ４４２１と呼ばれる。ラクダＶHフラグ
メントはＱ-Ｖ-Ｋというアミノ酸で始まり、Ｖ-Ｓ-Ｓというアミノ酸で終わる。
ｐＵＲ４４２４の構築
プラスミドｐＢ０９をＸｈｏＩ及びＢｓｔＥIIで消化して、アガロースゲルか
ら約
０.３４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントは、ラクダ
ＶHフラグメントの最初の４つのアミノ酸と最後の５つのアミノ酸の欠けたトラ
ンケート型ＶHフラグメントをコードしている。プラスミドｐＢ０９は大腸菌Ｊ
Ｍ１０９ ｐＢ０９として１９９３年４月２０日にオランダのバールン（Ｂａａ
ｒｎ）のＣｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌ
ｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に寄託番号ＣＢＳ２７１.９３として寄託された。ラクダ
ＶHフラグメントのＤＮＡ及びアミノ酸配列の後には、欧州特許出願第９３２０
１２３９.６号（未公開）の図６Ｂに記載された通り、プラスミドｐＢ０９中に
存在するＦｌａｇ配列が続いている。この欧州特許出願の開示内容は文献の援用
によって本明細書の内容の一部をなす。得られた約０.３４ｋｂｐのフラグメン
トをｐＵＲ４４２１にクローニングした。そのため、プラスミドｐＵＲ４４２１
をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、アガロースゲルから約４ｋｂのベク
ターフラグメントを単離した。得られたベクターを約０.３４ｋｂｐのＸｈｏＩ/
ＢｓtＥIIフラグメント及び下記の配列の合成ＤＮＡリンカーと連結して、プラ
スミドｐＵＲ４４２１-０９を得た。
ＢｓｔＥII ＨｊｎｄIII
GTCACCGTCTCCTCATAATGA ＝配列番号：３８
GCAGAGGAGTATTACTTCGA ＝配列番号：３９
プラスミドｐＳＹ１６をＥａｇI及びＨｉｎｄIIIで消化して、約６.５ｋｂｐ
長のベクター鎖を単離して、それをｐＵＲ４４２１-０９由来の約０.３８ｋｂｐ
のＥａｇＩ/ＨｉｎｄIIIフラグメントと連結して、ｐＵＲ４４２４を得た。ｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４８３の構築
ｐＵＲ４４２４からインベルターゼのシグナル配列とラクダ重鎖可変０９（Ｃ
Ｈv０９）フラグメントのコードされた約０.４４ｋｂｐのＳａｃＩ-ＢｓｔＥII
フラグメントを単離するとともに、約６.３ｋｂｐのＳａｃＩ-ＨｉｎｄIIIベク
ターフラグメントも単離した。約６.３ｋｂｐフラグメントとｐＵＲ４４２４の
約０.４４ｋｂｐフラグメントをｐＵＲ２９９７又はｐＵＲ２９９８のＢｓｔＥI
I-ＨｉｎｄIIIフラグメントと連結してそれぞれｐＵＲ４４８２とｐＵＲ４４８
３を得た。
プラスミドｐＵＲ４４８２は、インベルターゼシグナル配列とＣＨv０９可変
領域とＭｙｃテールとラクダ「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域（Ｈａｍｅｒｓ-Ｃａｓ
ｔｅｒｍａｎ他（１９９３）の報文参照）とα-アグルチニン細胞壁アンカー領
域との融合タンパク質の発現のための酵母エピソーム型発現プラスミドである。
ｐＵＲ４４８３はＭｙｃテールを含んではいるが「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域を
含んでいない点でｐＵＲ４４８２とは異なる。同様に、ｐＵＲ２９９９のＢｓt
ＥII-ＨｉｎｄIIIフラグメントを、上記の約６.３ｋｂｐベクターフラグメント
及びｐＵＲ４４２４の約０.４４ｋｂｐフラグメントと連結することもでき、ｐ
ＵＲ４４９７が得られるが、このプラスミドは「Ｘ-Ｐ-Ｘ-Ｐ」ヒンジ領域を含
んではいるがＭｙｃテールを含んでいない点でｐＵＲ４４８２とは異なる。
プラスミドｐＵＲ４４２４、ｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４８３を電気穿孔法
でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＵ１０株に導入し、ロ
イシンを欠く平板上で各形質転換体を選択した。ｐＵＲ４４２４、ｐＵＲ４４８
２及びｐＵＲ４４８３の各々で形質転換したＳＵ１０株由来の各形質転換体を、
５％ガラクトース添加ＹＰ培地上で増殖させ、本出願人の係属中の特許出願で１
９９４年１月２０日に公開されたＷＯ９４/０１５６７号（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）
の例１に記載された免疫蛍光顕微鏡法で分析した。細胞表面に存在する、ラクダ
抗体とＭｙｃテールを共に含んだキメラタンパク質を検出するため、この文献記
載の方法に若干の修正を加えた。
一つの方法では、マウスのモノクローナル抗Ｍｙｃ抗体をキメラタンパク質の
Ｍｙｃテールに結合させるための第１抗体として使用し、続いて結合マウス抗体
を検出するためにフルオレセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ポリクロー
ナル抗マウスＩｇ抗血清（Ｓｉｇｍａ社製，製品番号Ｆ０５２７）を使用し、陽
性シグナルの有無を蛍光顕微鏡で測定した。
もう一つの方法では、ラクダ抗体と交差反応することが既に実証されているウ
サギのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ血清をキメラタンパク質のラクダ抗体に結合
させるための第１抗体として使用し、続いて結合ウサギ抗体を検出するためにＦ
ＩＴＣ標識ポリクローナル抗ウサギＩｇ抗血清（Ｓｉｇｍａ社製，製品番号Ｆ０
３８２）を使用し、陽性シグナルの有無を蛍光顕微鏡で測定した。
図１９及び図２０に示す結果から、ＣＨv０９フラグメントとα-アグルチニン
細胞壁
アンカー領域の融合タンパク質を産生する細胞（ｐＵＲ４４８２及びｐＵＲ４４
８３）で蛍光が観察されることが分かる。しかし、このようなアンカーのないＣ
Ｈv０９フラグメントを産生する細胞（ｐＵＲ４４２４）では、同じ状況下で観
察しても、蛍光は全く認められなかった。特許文献
欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ１-０２５５１５３（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）： Producti
on ofguar alpha-galactosidase by hosts transformed by recombinant DNA me
thods．最初の優先日１９８６年６月３日；１９８８年２月３日公開
国際公開ＷＯ-９１/００９２０（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）： Process for preparin
g aprotein by a fungus transformed by multicopy integration of an expres
sionvector．最初の優先日１９８９年７月７日；１９９1年１月２４日公開
国際公開ＷＯ-９１/１９７８２（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）： Xylanase production
．優先日１９９０年６月１９日；１９９１年１２月２６日公開
国際公開ＷＯ-９４/０１５６７（ＵＮＩＬＥＶＥＲ）： Process for immobili
zingenzymes to the cell wall of a microbial cell by producing a fusion p
rotein．最初の優先日１９９２年７月８日；１９９４年１月２０日公開
欧州特許出願ＥＰ９３２０１２３９.６（未公開）： Production of antibodie
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activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains sec
reted from E．coli．Nature 341（12 October 1989）544-546
ブダペスト条約に基づく微生物の寄託に関する情報は本明細書第２７頁３〜６行
に記載されている。欧州特許条約（ＥＰＣ）規則２８（４）又はＥＰＣの締約国
以外の国での同様の規定に基づき、請求のあったときはこれらの寄託菌株の試料
が専門家のみに分譲されることを要求する。
配列表
（1） 一般情報
（i） 出願人
（A） 名称：ユニリーバー・エヌ・ヴイ
（B） 通りの住所：ヴェーナ４５５
（C） 都市名：ロッテルダム
（E） 国名：オランダ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＬ-３０１３ ＡＬ
（A） 名称：ユニリーバー・ピー・エル・シー
（B） 通りの住所：ブラックフライヤーズ、ユニリーバー・ハウス
（C） 都市名：ロンドン
（E） 国名：英国
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＥＣ４Ｐ ４ＢＱ
（A） 名称：レオン・ゲラルダス・ジェイ・フランケン
（B） 通りの住所：ゲルダースストラート ９０
（C） 都市名：ロッテルダム
（E） 国名：オランダ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＬ-３０１１ ＭＰ
（A） 名称：ピーター・ディ・イー・ゲウス
（B） 通りの住所：ボエイエ２４
（C） 都市名：バーレンドレヒト
（E） 国名：オランダ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＬ-２９９１ ＫＢ
（A） 名称：フランシスカス・マリア・クリス
（B） 通りの住所：ベネデンラングス １０２
（C） 都市名：アムステルダム
（E） 国名：オランダ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＬ-１０２５ ＫＬ
（A） 名称：ホルガー・ヨーク・トシュカ；ｃ/ｏラングネーズ・イグロ
，ＢＲ３
（B） 通りの住所：アエケルン１
（C） 都市名：レケン
（E） 国名：ドイツ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：Ｄ-４８７３４
（A） 名称：コルネリス・テオドラス・ヴェルリップス
（B） 通りの住所：ハーグドルン １８
（C） 都市名：マースルイス
（E） 国名：オランダ
（F） 郵便番号（ＺＩＰ）：ＮＬ-３１４２ ＫＢ
（ii） 発明の名称：
（iii） 配列の数：４０
（iv） コンピューター可読形式：
（A） 記録媒体：フロッピーディスク
（B） コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（C） オペレーションシステム（ＯＳ）：ＰＣ-ＤＯＳ／ＭＳ-ＤＯＳ
（D） ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０，
ヴァージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（2） 配列番号：１に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２３１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｐＵＲ４１１９中のフラグメント
（xi） 配列：配列番号：１：
（2） 配列番号：２に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩリンカーのコーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２：
（2） 配列番号：３に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩリンカーの非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：３：
（2） 配列番号：４に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥａｇＩ−ＰｓｔＩリンカーのコーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：４：
（2） 配列番号：５に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１３塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥａｇＩ−ＰｓｔＩリンカーの非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：５：
（2） 配列番号：６に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＰＣＲプライマーＡ（重鎖）
（xi） 配列：配列番号：６：
（2） 配列番号：７に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＰＣＲプライマーＢ（重鎖）
（xi） 配列：配列番号：７：
（2） 配列番号：８に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２４塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＰＣＲプライマーＣ（軽鎖）
（xi） 配列：配列番号：８：
（2） 配列番号：９に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＰＣＲプライマーＤ（軽鎖）
（xi） 配列：配列番号：９：
（2） 配列番号：１０に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２６塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩリンカーのコーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：１０：
（2） 配列番号：１１に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１８塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩリンカーの非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：１１：
（2） 配列番号：１２に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：７１４塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＳｃＦｖ 抗トラセオリド０２／０１／０１
（xi） 配列：配列番号：１２：
（2） 配列番号：１３に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：７３４塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＳｃＦｖ 抗ＨＣＧ
（xi） 配列：配列番号：１３：
（2） 配列番号：１４に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２６８５塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（v） 起源
（A） 生物名：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅ
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｐＹＹ１０５
（ix） 配列の特徴：
（A） 特徴を表わす記号：ＣＤＳ
（B） 存在位置：１...２６８５
（D） 他の情報：／遺伝子産物＝“フロキュレーションタンパク質”
／遺伝子＝“ＦＬＯ１”
（xi） 配列：配列番号：１４：
（2） 配列番号：１５に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：８９４アミノ酸
（B） 配列の型：アミノ酸
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（xi） 配列：配列番号：１５：
（2） 配列番号：１６に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＣｈｏＢ鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：１６：
（2） 配列番号：１７に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＣｈｏＢ鋳型非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：１７：
（2） 配列番号：１８に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３７塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｃｈｏ０１ｐｃｒプライマー
（xi） 配列：配列番号：１８：
（2） 配列番号：１９に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：４２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｃｈｏ０２ｐｃｒプライマー
（xi） 配列：配列番号：１９：
（2） 配列番号：２０に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＣｈｏＢ鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２０：
（2） 配列番号：２１に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数 一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＣｈｏＢ鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２１：
（2） 配列番号：２２に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：４２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：変異導入プライマーＣｈｏＢ
（xi） 配列：配列番号：２２：
（2） 配列番号：２３に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：４２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＣｈｏＢ鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２３：
（2） 配列番号：２４に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：プライマーｐｒｔ１
（xi） 配列：配列番号：２４：
（2） 配列番号：２５に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３２塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：プロテイナーゼ鋳型非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２５：
（2） 配列番号：２６に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２７塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：プロテイナーゼ鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２６：
（2） 配列番号：２７に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｐｒｔ２プライマー
（xi） 配列：配列番号：２７：
（2） 配列番号：２８に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３３塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥＧＦ１プライマー
（xi） 配列：配列番号：２８：
（2） 配列番号：２９に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３３塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥＧＦレセプター鋳型非コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：２９：
（2） 配列番号：３０に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：３０塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥＧＦレセプター鋳型コーディング鎖
（xi） 配列：配列番号：３０：
（2） 配列番号：３１に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：４０塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＥＧＦ２プライマー
（xi） 配列：配列番号：３１：
（2） 配列番号：３２に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１７７塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＭｙｃＴ及びヒンジ部とのＡＧα１リンカー
（xi） 配列：配列番号：３２：
（2） 配列番号：３３に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：６３塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＭｙｃＴとのＡＧα１リンカー
（xi） 配列：配列番号：３３：
（2） 配列番号：３４に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１４４塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：二本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ヒンジ部とのＡＧα１リンカー
（xi） 配列：配列番号：３４：
（2） 配列番号：３５に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１１９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｐＵＲ４４２１コーディング鎖中のフラグメント
（xi） 配列：配列番号：３５：
（2） 配列番号：３６に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１１９塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ｐＵＲ４４２１非コーディング鎖中のフラグメント
（xi） 配列：配列番号：３６：
（2） 配列番号：３７に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：１１アミノ酸
（B） 配列の型：アミノ酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：Ｍｙｃテール
（xi） 配列：配列番号：３７：
（2） 配列番号：３８に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２１塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカーのコーディン
グ鎖
（xi） 配列：配列番号：３８：
（2） 配列番号：３９に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２０塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：ＢｓｔＥＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカーの非コーディ
ング鎖
（xi） 配列：配列番号：３９：
（2） 配列番号：４０に関する情報：
（i） 配列の特徴：
（A） 配列の長さ：２８塩基対
（B） 配列の型：核酸
（C） 鎖の数：一本鎖
（D） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（vii） 直接の起源：
（B） クローン：プライマーｃｈｏ０３ｐｃｒ
（xi） 配列：配列番号：４０：
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９４年１１月２９日
【補正内容】
請求の範囲
１．特定の化合物に対する結合能力を有する結合タンパク質を固定化するため
の方法にして、上記結合タンパク質又は上記の特異的結合能力を保持したその機
能的部分であって下等真核生物の細胞の外部に連結した結合タンパク質又は機能
的部分の生産に組換えＤＮＡ技術を利用して、下等真核生物の細胞の細胞壁に固
着し得るアンカータンパク質のアンカー部分（当該アンカー部分は上記アンカー
タンパク質のＣ末端部分から導かれる）のＮ末端に上記結合タンパク質又はその
機能的部分がそのＣ末端で結合しているようなキメラタンパク質を下等真核生物
の細胞が産生及び分泌できるようにすることによって上記タンパク質又はその機
能的部分が細胞壁又は細胞壁の外側に局在化するようにさせることを含んでなる
方法。
２．請求項１記載の方法において、上記下等真核生物が、Ｃａｎｄｉｄａ属、
Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒoｍｙｃ
ｅｓ属、Ｐｊｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、並び
にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ
属に属するカビからなる群から選択される菌類であることを特徴とする方法。
３．下記の（i）及び（ii）を含んでなる組換えポリヌクレオチド。
（i）結合タンパク質又は特異的結合能力を保持したその機能的部分をコード
する構造遺伝子、及び
（ii）菌類の細胞壁に固着し得るアンカータンパク質をコードする遺伝子の少
なくとも一部分であって、当該遺伝子部分がアンカータンパク質のアンカー部分
（当該アンカー部分は上記アンカータンパク質のＣ末端部分から導かれる）をコ
ードしている遺伝子部分。
４．請求項３記載のポリヌクレオチドにおいて、上記アンカータンパク質が、
α-アグルチニン、ａ-アグルチニン、ＦＬＯ１及び菌類の主要細胞壁タンパク質
からなる群から選択されることを特徴とするポリヌクレオチド。
５．請求項３記載のポリヌクレオチドにおいて、当該ポリヌクレオチドが、当
該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を確実にするためのシグナルペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列をさらに含んでいることを特徴とするポリヌクレオチ
ド。
６．請求項５記載のポリヌクレオチドにおいて、上記シグナルペプチドが、酵
母のα-接合因子、酵母のα-アグルチニン、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅsのイン
ベルターゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒoｍｙｃｅsのイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓのα
-アミラーゼ及び乳酸菌のプロテイナーゼからなる選択されるタンパク質に由来
するものであることを特徴とするポリヌクレオチド。
７．請求項３乃至請求項６のいずれか１項記載のポリヌクレオチドにして、当
該ポリヌクレオチドが任意成分としてのプロモーター（誘導型プロモーターであ
ってもよい）に連結していることを特徴とするポリヌクレオチド。
８．請求項３乃至請求項７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含んでな
る組換えベクター。
９．請求項３乃至請求項７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドにコードさ
れたキメラタンパク質。
１０．細胞の外部に細胞壁をもつ下等真核生物細胞にして、請求項３乃至請求項
７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ保有する細胞。
１１．請求項１０記載の細胞にして、その染色体に請求項３乃至請求項７のいず
れか１項記載のポリヌクレオチドが少なくとも１つ組込まれていることを特徴と
する細胞。
１２．請求項９記載のキメラタンパク質がその細胞壁に固定化されている下等真
核生物細胞にして、当該キメラタンパク質の結合タンパク質部分がその細胞壁中
又は細胞壁の外側に局在化している細胞。
１３．請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項記載の下等真核生物細胞にして
、当該細胞が酵母及びカビからなる群から選択される菌類であることを特徴とす
る細胞。
１４．特定化合物に対する結合能力を保持している固定化された結合タンパク質
又はその機能的部分を用いて単離プロセスを行う方法にして、上記特定化合物を
含んだ媒質を請求項１０乃至請求項１３のいずれか1項記載の下等真核生物細胞
に、特定化合物と固定化結合タンパク質との複合体が形成されるような条件下で
、接触させ、特定化合物を当初含んでいた上記媒質から当該複合体を分離し、所
望により、結合タンパク質又はその機能的部分から特定化合物を解離させること
を特徴とする方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 16/46
19/00 8318−4Ｈ
Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ
11/16 2121−4Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:865）
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，
ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 クリス、フランシスカス・マリア
オランダ国、エヌエル‐1025・ケイエル・
アムステルダム、ベネデンラングス 102
(72)発明者 トシュカ、ホルガー・ヨーク
ドイツ国、ディー‐48734、レーケン、エ
ーケルン １、ラングネーゼ‐ルグロ気
付、ビーアール３
(72)発明者 ベリプス、コルネリス・セオドラス
オランダ国、エヌエル‐3142・ケイビー、
マースルイス、ハーグドールン 18
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．特定の化合物に対する結合能力を有する結合タンパク質を固定化するため の方法にして、上記結合タンパク質又は上記の特異的結合能力を保持したその機 能的部分であって宿主細胞の外部に連結した結合タンパク質又は機能的部分の生 産に組換えＤＮＡ技術を利用して、宿主細胞の細胞壁に固着し得るアンカータン パク質のアンカー部分（当該アンカー部分は上記アンカータンパク質のＣ末端部 分から導かれる）のＮ末端に上記結合タンパク質又はその機能的部分がそのＣ末 端で結合しているようなキメラタンパク質を宿主細胞が産生及び分泌できるよう にすることによって上記タンパク質又はその機能的部分が細胞壁又は細胞壁の外 側に局在化するようにさせることを含んでなる方法。 ２．請求項１記載の方法において、上記宿主がグラム陽性細菌及び菌類からな る群から選択されることを特徴とする方法。 ３．請求項２記載の方法において、上記宿主が、乳酸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属 及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌からなる群から選択されるグラム 陽性細菌であることを特徴とする方法。 ４．請求項２記載の方法において、上記宿主が、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｅｂａ ｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、 Ｐｉｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、並びにＡｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属に属す るカビからなる群から選択される菌類であることを特徴とする方法。 ５．下記の（i）及び（ii）を含んでなる組換えポリヌクレオチド。 （i）結合タンパク質又は特異的結合能力を保持したその機能的部分をコード する構造遺伝子、及び （ii）グラム陽性細菌又は菌類の細胞壁に固着し得るアンカータンパク質をコ ードする遺伝子の少なくとも一部分であって、当該遺伝子部分がアンカータンパ ク質のアンカー部分（当該アンカー部分は上記アンカータンパク質のＣ末端部分 から導かれる）をコードしている遺伝子部分。 ６．請求項５記載のポリヌクレオチドにおいて、上記アンカータンパク質が、 α-ア グルチニン、ａ-アグルチニン、ＦＬＯ１、菌類の主要細胞壁タンパク質及び乳 酸菌のプロテイナーゼからなる群から選択されることを特徴とするポリヌクレオ チド。 ７．請求項５記載のポリヌクレオチドにおいて、当該ポリヌクレオチドが、当 該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を確実にするためのシグナルペプチドをコ ードするヌクレオチド配列をさらに含んでいることを特徴とするポリヌクレオチ ド。 ８．請求項７記載のポリヌクレオチドにおいて、上記シグナルペプチドが、酵 母のα-接合因子、酵母のα-アグルチニン、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのイン ベルターゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓの α-アミラーゼ及び乳酸菌のプロテイナーゼからなる選択されるタンパク質に由 来するものであることを特徴とするポリヌクレオチド。 ９．請求項５乃至請求項８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドにして、当 該ポリヌクレオチドが任意成分としてのプロモーター（誘導型プロモーターであ ってもよい）に連結していることを特徴とするポリヌクレオチド。 １０．請求項５乃至請求項９のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含んでな る組換えベクター。 １１．請求項５乃至請求項９のいずれか１項記載のポリヌクレオチドにコードさ れたキメラタンパク質。 １２．細胞の外部に細胞壁をもつ宿主細胞にして、請求項５乃至請求項９のいず れか１項記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ保有する宿主細胞。 １３．請求項１２記載の宿主細胞にして、その染色体に請求項５乃至請求項９の いずれか１項記載のポリヌクレオチドが少なくとも1つ組込まれていることを特 徴とする宿主細胞。 １４．請求項１１記載のキメラタンパク質がその細胞壁に固定化されている宿主 細胞にして、当該キメラタンパク質の結合タンパク質部分がその細胞壁中又は細 胞壁の外側に局在化している宿主細胞。 １５．請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項記載の宿主細胞にして、当該宿 主細胞が酵母及びカビからなる群から選択される菌類であることを特徴とする宿 主細胞。 １６．特定化合物に対する結合能力を保持している固定化された結合タンパク質 又はそ の機能的部分を用いて単離プロセスを行う方法にして、上記特定化合物を含んだ 媒質を請求項１２乃至請求項１５のいずれか1項記載の宿主細胞に、特定化合物 と固定化結合タンパク質との複合体が形成されるような条件下で、接触させ、特 定化合物を当初含んでいた上記媒質から当該複合体を分離し、所望により、結合 タンパク質又はその機能的部分から特定化合物を解離させることを特徴とする方 法。
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