JPH08506421A

JPH08506421A - 細胞関連分子を検出し、その量を測定するための方法および器具

Info

Publication number: JPH08506421A
Application number: JP6525706A
Authority: JP
Inventors: エイチ．パーソンズ，ジョージ; エイ．ジョーンズ，マーガレット; イー．ラッグ，アーサー
Original assignee: ティーセルダイアグノスティックス，インコーポレーテッド
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 1996-07-09
Also published as: WO1994026935A1; AU7017794A; EP0698125A1; CA2161650A1; AU678260B2; US5747265A; EP0698125A4; CN1122614A

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的液体サンプル中の細胞関連分子を検出し、またはその量を測定するための方法および器具に関する。検出または測定可能な細胞関連分子には、細胞表面抗原、細胞内サイトカイン、微生物抗原、薬理学的作用剤またはその代謝産物、核酸などがあり、これらに限らない。好ましい実施態様では、全血サンプルを濾紙上に採取して、乾燥させる。乾燥させた血斑からドット（斑点）をパンチで抜き取り、緩衝化された比較的濃厚な界面活性剤溶液を用いて濾紙から測定対象物質を溶出する。その後、イムノアッセイのような標準的なアッセイで溶出物を分析する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞関連分子を検出し、その量を測定するための方法および器具発明の背景細胞関連分子には、細胞表面抗原、細胞内サイトカイン、微生物抗原、薬理学的作用剤およびその代謝産物、核酸などを含めて、数多くの分子が存在している。こうした細胞関連抗原の多くは、さまざまな細胞において免疫機能にとって重要な細胞間の相互作用ならびに連絡に関与している。さらに他のものは免疫機能障害や他の疾病状態のための重要なマーカーである。特定分子の検出は異常な状態だけでなく正常な状態を分析する上で非常に役に立つだろう。サイトカインサイトカインは、多様な細胞活動を調節する、比較的分子量の小さい生物活性タンパク質およびペプチドの多岐にわたる大きなグループである。例えば、サイトカインはＢリンパ球による免疫グロブリン産生および種々の細胞型の生合成活性を調節している。最初はＴ細胞増殖因子として発見されたインターロイキン− ２（ＩＬ−２）や他の免疫学的に活性なサイトカイン類はＴ細胞の機能に関連しており、また、種々の造血細胞型の増殖および分化にも関係している。サイトカインは一般に非構成的方法で産生されるが、通常、非構成的方法には、おそらく細胞表面受容体を介する、産生細胞の活性化または剌激が必要となる。より詳細に特性付けがなされているサイトカインの多くは免疫系の細胞によって産生されるが、サイトカインは多種多様な細胞型によっても産生される。一般的には、所定の細胞型が多数の異なるサイトカイン類を産生している。サイトカインはさまざまな免疫反応と炎症反応に関与している。それらの作用は複雑な相互作用ネットワークで組織化されており、そこでは、あるサイトカインの放出が数々の多様な生理学的反応（一部はさらに他のサイトカインの誘導による）を引き出すことができる。サイトカインの生産および作用に関する研究は、大半がin vitro培養系を用いて行われた。実際、大部分のサイトカインは免疫反応の間でさえも血流中に検出することができない。免疫反応において活性なサイトカインは狭い範囲で短時間作用するように設計されているらしく、また、それらは一般に極めて低濃度で活性を示す。大半のサイトカイン研究は、各種のバイオアッセイでサイトカインの生物学的活性を測定することに基づいている。エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなイムノアッセイを用いてサイトカインの血中濃度が測定された。しかし、この方法を血清中の細胞由来のサイトカインの検出に用いる場合は、いくつかの制限を伴う。というのは、それらの濃度が低く、しかもそれらのin v ivo半減期が極端に短いからである。モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡによる血清中のサイトカインの検出可能性はいくつかの要因によって影響を受ける。すなわち、１）in vivoで局所的に産生されたサイトカインは標的細胞の受容体によってすみやかに吸着されて、決して血漿に達することがない；２）サイトカインの半減期が短いため、サンプル採取時間が臨界的となる；そして３）サンプル貯蔵中のサイトカインタンパク質が通常不安定である；という要因である。総じて、血清中に存在する分子のイムノアッセイは貯蔵後に残存しないタンパク質の検出には不向きである。上述したすべての理由のために、血液サンプル中のサイトカインを検出および測定するための改良方法の必要性が存在している。微生物抗原最も広く適応した一部の微生物は、体内侵入部位の上皮細胞の中またはその表面で増殖し、上皮への波及的感染を生じ、その後外部へ放出される。例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルスおよびパピローマを含むウイルスの感染は一般的に上皮表面に限定される。当技術分野では、上皮細胞、組織または体液サンプル中に含まれるウイルスに関連した分子または抗原を検出し、その量を測定することによって、上皮に侵入する微生物の存在を検出するための、簡便で、直接的で、感度のよい方法の必要性が存在している。より重要なウイルスの一部は、通常、上皮表面を横切った後で全身感染を成し遂げる。これらには細胞内微生物が含まれる。真正の細胞内微生物が全身に広がるためには、まず第一に、それらは血液またはリンパ液に入らねばならない。このことは、それらがフリーな微生物として上皮下のリンパ管または血管の内腔に接近するか、または、最初に血液やリンパ液によって運ばれる移動性細胞（例えば、白血球）に侵入する必要があることを意味している。白血球に感染する微生物の例として、麻疹ウイルスと痘瘡ウイルスが挙げられる。こうした微生物はリソソーム分解のような細胞内防御機構を回避しながら細胞の内側で増殖する。もしも病原微生物を含む体液または該微生物を保有する宿主細胞の、簡便で、直接的で、感度のよいアッセイにより、サンプルの最小限の取扱いおよび処理でもって、種々の病原微生物の検出および定量が可能となるのであれば、それは非常に有益であろう。本発明はこうしたアッセイを提供するものである。核酸細胞に含まれるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）の量はある種の細胞関連分子の存在の有用なマーカーとなる。さらに、悪性細胞や前悪性細胞の存在を判定するのに、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出が役立つ可能性がある。正常細胞は単一コピーの細胞ＤＮＡを含むにすぎないが、悪性細胞はしばしば多倍数体である。通常、多倍数性はＤＮＡ結合色素を用いて全細胞ＤＮＡのフローサイトメトリー分析により評価される。本発明は、フローサイトメーターが設置されていない実験室で細胞中のＤＮＡまたはＲＮＡの多倍数性を検出したり、その量を測定することを可能にし、それゆえ、細胞サンプル中の各種成分、それに腫瘍細胞さえも検出する方法を提供するものである。細胞表面抗原タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖などの多数の分子は細胞表面膜上に発現される。また、ウイルスのような細胞内寄生体により産生される分子も細胞の表面または細胞内区画のいずれかにおいて検出可能である。細胞表面分子は細胞質にも存在している。従来のフローサイトメトリー分析は、細胞表面の所定の分子のエピトープへの抗体の結合を可視化または測定することにより、表面上に該分子を発現する細胞を検出したり、数えたりするものである。臨床上重要な公知の細胞表面分子として、Ｔ細胞受容体分子がある。多くのこのような分子は特定のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）との反応性により同定される。とりわけ、ＣＤ４およびＣＤ８分子を発現するＴ細胞の同定および計数は臨床上大いに利用されている。実際、ＣＤ４⁺細胞の循環レベルを追跡することは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の進行を評価する上で重要な予後判定の指標となる。Ｔ細胞の２つの主要なサブセットはＣＤ４およびＣＤ８として知られており、それらの調節機能、ヘルパー／インデューサー（誘導物質）およびサプレッサー／細胞障害性によってそれぞれ区別される。ＣＤ４分子は細胞外膜貫通領域と細胞質領域を有する約５５キロダルトンの糖タンパク質単量体である。ＣＤ４分子は細胞内シグナルを伝達して、Ｔ細胞の活性化を調節するように機能することができる。Ｔ細胞の活性化により、Ｂ細胞のシグナリングおよびＣＤ８⁺Ｔ細胞の誘導が生じ、サイトカインの放出により細胞障害性となる。また、ＣＤ４は接着分子として作用して、ＭＨＣクラスＩＩ分子または抗原提示細胞とＴ細胞受容体との結合を助ける。それ自体では、ＣＤ４分子はヘルパーＴリンパ球の表現型マーカーとして作用する。一般に、細胞表面マーカーによるヒトＢおよびＴリンパ球サブセットの同定のおかげで、病理学的状態のみならず正常な状態についての免疫状態の様相を明らかにすることが可能となった。例えば、細胞表面抗原のＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２１は血液Ｂリンパ球の９０％以上に見いだされ、一方、ＣＤ２およびＣＤ３は正常な末梢血液中のほぼ全てのＴリンパ球で発現される。細胞性免疫に関与しているＴリンパ球は、その表現型、ＭＨＣに対する受容体特異性および細胞機能により２つのサブセットにさらに区別される。一般的に、ＣＤ４⁺ＣＤ８^-ヘルパーＴリンパ球は末梢Ｔ細胞の約６５％を占め、ＭＨＣクラスＩＩ分子と関連した抗原活性化の際にサイトカインを分泌することができる。別のサブセット、ＣＤ４^-ＣＤ８⁺細胞障害性リンパ球（末梢Ｔ細胞の約３５％）はＭＨＣクラスＩ提示抗原による活性化後に標的細胞を溶解することができる。これらの種々の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体試薬をフローサイトメトリー法とともに用いることにより、さまざまな自己免疫疾患、免疫不全疾患、白血病、リンパ腫、さらに移植拒絶反応と関連した末梢血液中のリンパ球サブセットの組成の変化をモニターすることが可能となった。エイズ（ＡＩＤＳ）の場合には、ＣＤ４分子がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の細胞表面受容体であることがすでに確立されており、エイズの進行に特徴的なＣＤ４Ｔリンパ球の減少をモニターし得ることが示された。リンパ球サブセットをアッセイするための初期の方法（例えば、プラークおよび細胞媒介機能アッセイ）は高度に技術依存的であって、細胞系統に特異的なものではなかった。細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体が利用可能となったことにより、フローサイトメトリーによる細胞表面ＣＤ４の測定が免疫監視のためのリンパ球サブセットの同定の研究を進展させた。しかし、この方法は複雑な手順と高価な機器の使用を必要とし、相当に労力を要するものであった。ＴＲＡｘ^TMＣＤ４は、全血溶解産物から総ＣＤ４タンパク質を測定することができるエンザイムイムノアッセイである。このマイクロタイターをベースとしたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて得られた結果は、フローサイトメトリーにより測定されたＣＤ４Ｔリンパ球のカウント数と８８％以上において相関する。乾燥血斑（dried blood spot：ＤＢＳ）検体採取法は疫学研究のための価値ある方法であることが証明されている。新生児踵穿剌検体が日常的に採取され、ＰＫＵおよび甲状腺機能低下、鎌状赤血球貧血および他の異常血色素症、そしてＨＩＶを検査するのに有用であることが分かった。開発途上国では、成人指穿剌ＤＢＳが、集団のサンプリングを行って、安定な検体を試験研究所に輸送する方法を提供した。しかし、この技法はこれまで細胞内または細胞表面に存在する細胞関連分子を測定する方法に適用されたことがなかった。今まで、乾燥血液採取法は血中のＣＤ４リンパ球の測定に使用されたことがない。発明の概要細胞関連抗原をアッセイする方法が提供される。ある実施態様において、全血サンプルは所定の細胞関連抗原（例えば、ＣＤ４）の総量についてアッセイされる。特定の実施態様では、血液サンプルを濾紙に点在させ、この濾紙を乾かし、選ばれた希釈剤および溶解試薬を含むバイアルの中に入れ、所定の温度で所定の時間インキュベートする。その後、所定量のサンプルをバイアルから回収し、標準的なアッセイ（例えば、イムノメトリックアッセイ）で分析する。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）、ＣＤ２、ＣＤ５６、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、細胞内ウイルス、サイトカイン、核酸などの細胞関連抗原が本発明の方法に従って測定され得る。細胞関連抗原は、血漿画分中に存在する可溶性抗原とは対照的に、細胞内または細胞表面のいずれかに存在する。本発明のアッセイにおいて用いられる器具も提供される。本発明の更なる実施態様は、サンプル中の所定の細胞関連分子に関して陽性の細胞の概数を算出することを提供する。本発明のこの態様によると、細胞関連分子を測定する方法を用いて、特定の細胞関連分子を発現する細胞の数を算出することができる。本発明者らは、濾紙または他の適当な採取器具上に採取されたサンプルから、細胞数と相関する量の細胞関連分子を回収できることを見いだした。本方法によれば、従来の細胞数検出方法により得られた測定値との線形相関を示す量の細胞関連分子をサンプルから得ることが可能である。本発明の方法は従来技術と比べて利点を有する。本発明では、所定の細胞関連分子（例えば、ＣＤ４）の総量についてサンプルをアッセイする。サンプル、好ましくは血液サンプル、より好ましくは全血サンプルを適当な採取材料、好ましくは濾紙上に採取する。この濾紙を乾かし、その後細胞関連分子を回収する。好ましい態様では、細胞関連分子を回収するにあたって、所定の回収剤（例えば、希釈剤と溶解試薬）を含むバイアル中に濾紙または他の適当な採取材料を入れ、所定の温度で所定の時間インキュベートする。その後、所定量のサンプルをバイアルから回収し、標準的なアッセイ（例えば、イムノメトリックアッセイ）で分析する。イムノアッセイによる細胞関連サンプルの検出は、サンプル中に存在する細胞関連分子の量の指標を提供する。その後、本発明によれば、細胞関連サンプルの量を細胞数と相関させることができる。図面の説明図１は、ＣＤ４ＴＲＡｘ^TMアッセイにおける乾燥血液検体と溶解産物との相関を示すグラフである。乾燥血液検体のＣＤ４値はユニット／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ）で表してある。１ユニットは、１％ＮＰ−４０により溶解された１０³個のジャーカット細胞中に存在するＣＤ４の量として定義される。図２は、ＣＤ４ＴＲＡｘ^TMアッセイにおける乾燥血液検体とフローサイトメトリーとの相関を示すグラフである。乾燥血液検体のＣＤ４値はユニット／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ）で表してある。１ユニットは、１％ＮＰ−４０により溶解された１０³個のジャーカット細胞中に存在するＣＤ４の量として定義される。Ｕ／ｍｌの等価ＣＤ４カウント数への換算は、Ｕ／ｍｌとフローサイトメトリーにより測定されたＣＤ４細胞カウント数との間で確立された線形関係に基づくものである。換算式を誘導するために、広範囲のＣＤ４レベルを有する患者の臨床試験からのデータを採用した。ＴＲＡｘ^TMアッセイキットの標品の値はＣＤ４Ｔリンパ球にキャリブレートされ、検体の結果を標準曲線から直接読み取って、細胞／μｌとして記録した。発明の詳細な説明本発明は、サンプル中の細胞関連分子（以後「標的分子」という）の検出およびその総量の測定、ならびに疾病および障害の検出、診断、病期判定、重症度の判定および治療における、または標的分子を発現する細胞の計数における上記の検出または測定の使用に関する。本発明の方法および器具は、抗体のような結合相手との結合による検出のためにこれまで容易に接近することができなかった標的分子の検出または測定を可能にするものである。結合相手を入手することができる標的分子はどれも本発明に従って検出または測定が可能である。標的分子は内因性の分子（すなわち、宿主細胞のゲノムによってコードされるか、または宿主細胞によって産生される分子）であり得る。内因性標的分子の例として、サイトカイン、細胞接着分子、表現型マーカー、活性化マーカーおよび核酸が挙げられる。標的分子はまた外因性の分子（すなわち、宿主細胞のものではないゲノムによってコードされるか、さもなければ外因物質によって産生される分子）であってもよい。本発明により測定し得る代表的な外因性標的分子は、ウイルス抗原のような微生物病原体と関連した分子である。本発明を適用しうる標的分子の非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、薬理学的作用剤およびその代謝産物など、またはこれらの断片である。本発明による好適な標的分子は微生物関連分子、サイトカイン、接着分子、薬理学的作用剤またはその代謝産物などである。特定の実施態様において、本発明は細胞内にある標的分子を検出し、またはその総量を測定する方法を提供する。別の実施態様において、標的分子は細胞表面分子である。本明細書中で用いる「細胞関連分子」とは、該分子が細胞表面に結合されているか、または細胞内にあることを意味する。サンプルおよび標的分子の性質により、標的分子を発現する細胞の直接的計数の代わりに、標的分子の総量の測定が用いられる。この測定は被験者に及ぼす治療薬の効果をモニターするのに、被験者の疾病の検出、診断または病期判定を行うのに、治療の結果または病気の予後を予想するのに、さらには患者の免疫状態を評価しかつモニターするのに有効でありうる。本発明のアッセイで用いられる結合相手としては、標的分子の受容体および抗体があるが、これらに限らない。特に、抗体ではない結合相手には標的分子の細胞表面受容体が含まれる。好ましい実施態様において、標的分子は抗原であり、そして該標的分子の検出または測定が少なくとも１つの抗体への標的分子の免疫特異的結合の方法により実施される。イムノアッセイで検出または定量し得る抗原決定基またはエピトープを保有する全ての抗原は本発明の範囲に含まれるものである。本発明方法のためのサンプルを得ることができる好適な被験者は哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、有袋動物を含むがこれらに限らない脊椎動物であり、最も好ましくはヒトである。従って、本発明の方法はヒトの臨床用途および動物の病気治療に適用される。本明細書中で用いる「サンプル」とは、細胞が得られた環境中の細胞の採取物（すなわち、生物学的液体）、または細胞の膜および／または細胞質内成分を指す。生物学的液体から誘導されたサンプル（例：全血、血漿、血清、血球、唾液、尿、滑液、胸膜滲出液、腫瘍および組織浸潤物、羊水、脊髄液または脳髄液）中の総分子が測定され得る。他の実施態様では、生物学的液体は細胞培養液であり得る。サンプルは間質液を含めて組織であってもよい。好ましくは、サンプルが組織サンプルである場合、例えばトリプシン消化またはホモジナイゼーション（均質化）により結合組織マトリックスを破壊するように組織を処理する。他の実施態様において、サンプルは上記の供給源に由来する細胞を含むものである。好ましい実施態様において、サンプルは血液サンプルからなり、より好ましいものは全血サンプルである。「全血」とは、針穿刺から採取されたままの非分画血液のことである。用いるサンプルの量は標的分子のタイプおよび調製物中に含まれるその量に関係し、過度の実験操作を行うことなく当業者によって決定され得る。以下に詳述する本発明の方法は従来技術の多くの制限を取り払うものであり、特に、細胞の単離とその後の顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーによる直接または間接免疫蛍光分析をこれまで必要としていた細胞関連分子の測定または検出に関しての制限を撤廃するものである。従来技術の制限として、新鮮なサンプル、相当に大きなサンプルサイズ、全組織または全血よりもむしろ濃縮細胞集団、多くの調製時間、フローサイトメーターのような高価な機器の必要性が挙げられる。ここに提供される方法はこれらの制限を無くすものである。驚いたことに、ここに教示する本方法および器具は、新鮮なサンプル（すなわち、全血）の種々の成分を比較的少ないサンプル量（すなわち、約２０〜１００μｌ）でアッセイするのに適している。かくして、サンプル採取は指穿剌と同じくらい簡単な手法を用いる。その後、サンプルは十分に安定しており、郵便や他の方法で中央の検査場所まで輸送することができる。従って、新鮮な血液サンプルおよび瀉血（静脈切開）の必要性が排除される。本発明の方法工程において、所定量の生物学的液体サンプルは適当な採取材料の上に採取される。ある実施態様では、サンプルを紙採取器具上に点在させる。本発明において適した採取材料は濾紙であるが、これに限らない。本発明の目的にかなう濾紙は当技術分野で一般的に知られたもので、市販されている。さまざまなグレードのものが入手可能で、これらは濾紙の吸収性、コンシステンシー、原料ばかりでなく、その多孔性に関係する。本明細書中で用いる「点在させる」とは、サンプルを例えば濾紙採取材料と接触させて、サンプルの全部または一部をその器具に移すことを意味する。濾紙の場合には、サンプルが濾紙の構成繊維に吸収されるように傷口にあてる（wickin g）ことにより達成される。当業者は、サンプルが濾紙の規定領域に全体的に一様に分散するようにこれらのパラメーターを最適化すべきであり、こうすることによりドット（血斑）をパンチで抜き取るとき、サンプルの濃度がサンプル間で比較的均一になるだろう。ある好ましい実施態様において、例えば全血サンプル中の白血球マーカーが標的分子であるとき、１００％綿の繊維から構成される濾紙が好適である。この場合に、濾紙スポットあたり約１．４〜１．７μｌの平均血清吸収量が好ましく、約１．５〜１．６μｌが特に好ましいものである。血清の吸収量は通常の吸光度測定で調べることができ、従って吸収性はこの技法を用いて測定し、最適化できる。吸収時間は約１分以内とすることが一般に好ましく、５〜３０秒がより好適である。コンシステンシーはウイッキング時間と流れの一様性により測定される。多孔性は、濾紙の孔径と孔分布が上記のパラメーターに影響するので、吸収性とコンシステンシーの両方に関係している。ある実施態様では、ポリエステルやゴーテックス（Gortex^TM）のような合成布（織布と不織布の両方）が全体的なアッセイ性能に利点を付与するかもしれない。この目的に適したサンプル量は比較的少なく、すなわち、約１５０〜１０μｌの範囲の量が好ましく、約８０〜４０μｌが特に有利である。このようにして移されたサンプルは、一般的には約１８〜２９℃の範囲の室温条件（好ましくは、約２０〜２６℃）で、またはサンプルの長期安定性が必要でない場合は約３０〜３７℃でより短い時間、優先的に乾燥させる。この乾燥工程は一般に約１〜４時間である。この時点で、サンプルはその後の分析に供するまで保存することができ、また、ここに教示する後続の処理に直ちに付すことができる。乾燥サンプルは更なる処理のために中央の試験施設に送ってもよいし、サンプルが採取された場所でこのような工程に付してもよい。適量の乾燥サンプルは点在領域から抜き取り、溶解試薬と組み合わせた所定の希釈剤と、該サンプルを可溶化するのに十分な時間接触させる。一般に、直径が１／４インチのドットは約１２μｌのサンプルを保持し、これはある種のアッセイ条件にとって適当なサンプルサイズである（他のアッセイには、もっと多量または少量が必要かもしれない）。当業者は、通常の最適化により、これに関してそれらの要求を決定し得る。例えば、より小さいドットは比較的低濃度（すなわち、約１０^-11未満）のアナライトのために使用され、一方、多重ドット（直径約５．５ｍｍ）はより高い濃度（すなわち、約１０^-11以上）のアナライトのために使用されるだろう。「可溶化」とは、生物学的サンプルの固体部分（つまり、無傷の細胞）を溶解して、希釈剤と溶解試薬中に標的分子を放出させることを意味する。好ましい実施態様において、この期間は室温で少なくとも約２時間である。適当な希釈剤として、生理学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝溶液、食塩水、ダルベッコ媒体などが挙げられる。特に好ましい緩衝液はリン酸緩衝溶液を含み、少なくとも１種のタンパク質（例えば、ウシ由来の血清タンパク質）を補給したものが好ましい。適当な溶解試薬は少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含むものである。これらのうち、Triton系列（例えば、Triton X-1 00、X--114、X-305、X-405）、Brij系列（例えば、Brij 35、56、58）、Tween系列（例えば、Tween 20、Tween 80、Nonidet P-40（NP40）、両性イオン界面活性剤（例えば、CHAPS、CHAPSO）などに含まれる非イオン性界面活性剤が挙げられる。比較的高濃度のTriton X-100 とNP40の組合せがここで用いるのに適している。サンプルと接触させるための好ましい濃度は、それぞれ約６〜１０％と約４〜７％の範囲であり、白血球マーカーが標的分子であるときは、それぞれ約９％と６％が特に有利である（すべて、液体サンプルの希釈係数を考慮するときの最終濃度ではない濃度に基づいて測定）。可溶化サンプルはここに教示する方法に従ってさらに処理されるか、または更なる操作が必要となるまで保存される。保存する場合は、少なくとも約−２０ ℃で凍結させることが好ましく、約−２０℃から少なくとも約−７０℃までがより好ましく、少なくとも約−７０℃での凍結が特に好適である。このようにして可溶化したサンプルの所定量を採取し、検出または計数すべき標的分子に特異的な結合相手少なくとも１種と接触させる。この工程はこの目的にかなう容認されたイムノアッセイ検出キットを用いて行うことができる。一例として、ＣＤ４受容体を検出する場合は、T Cell Diagnostics，Inc．（Cambrid ge，MA）から販売されているＴＲＡｘ^TMＣＤ４アッセイキット（1992年５月29日に発行された、Rittershaus，C．による国際特許出願番号WO92/08981を参照のこと）がこのキットに添付されたアッセイプロトコールに従うことによりこの目的に利用される。これは他のこのような慣用のアッセイ技法を用いても、または他の細胞表面受容体アッセイ用の市販のアッセイキットを用いても行うことができる。好ましい実施態様では、毛細血管または静脈の血液サンプルを濾紙上に採取して、乾燥する。乾燥血斑から適当な領域を取り出し、例えば、乾燥した血斑から５．５ｍｍ（０．２５インチ）のドットをパンチで抜き取る。そして、緩衝化界面活性剤溶液を用いて室温で少なくとも２時間かけて濾紙からアナライトを溶出させる。その後、液体血液サンプル中のＣＤ４細胞数を定量するための標準ＴＲＡｘ^TM ＣＤ４マイクロタイタープレートで５０μｌの溶出液をアッセイする。アッセイＣＶはアッセイ内およびアッセイ間の双方について８％未満である。アッセイ感度は約８６〜１３０細胞／μｌ、特に８６細胞／μｌであり、フローサイトメトリーとの相関は約９０％である。サンプルは４℃で乾燥剤とともに保存したとき数カ月間安定である。可溶化サンプルも界面活性剤処理後に、例えば−２０℃、好ましくは−７０℃での凍結保存が可能である。このことは、異なる時点に採取された複数のサンプルを１回のアッセイで同時に分析することができるという利点を有し、こうしてアッセイ間変動が少なくなる。本発明の方法は、フローサイトメトリーへの接近が限られている地域において大いに有望視されている。本発明の濾紙採取器具は、生物学的サンプルの「インフィールド（in field）」検索に適した別個の包装形態で提供され得る。また、濾紙にサンプルを点在させた後で該サンプルを保持させるための容器も提供され、これはサンプルの潜在的感染力を封じ込めるのに役立つ。さらに、濾紙採取器具と共にまたは別個に、本発明の実施に用いる残りの試薬類をキットとして提供することが有利である。本発明のキットのこの部分の必須成分は、濃厚な非イオン性界面活性剤溶液と、抗原の存在を免疫学的に検出するための手段である。キットは当技術分野で知られた任意の免疫学的検出手段、すなわちサンドイッチアッセイフォーマット、競合的イムノアッセイフォーマットなどを含むことができる。好ましくは、免疫学的検出手段は細胞関連分子に特異的な第一の捕獲抗体と、細胞関連分子に特異的な第二の検出可能抗体である。第一の抗体はガラスまたはプラスチックのビーズ、膜、プラスチック棒、マイクロウェル、ガラスまたはプラスチック製の試験管、その他のイムノアッセイの技術分野で知られた担体などの固体支持体上に固定化された状態で提供され得る。また、第一の抗体はあとで固定化するためにも提供され得る。第一および第二の抗体は用時調製するための凍結乾燥品として提供されてもよいし、濃厚な溶液として提供されてもよい。第二の抗体は標識手段によって検出可能でありうる。好ましい実施態様において、標識手段は酵素である。界面活性剤溶液は、キットが意図するアッセイの数に必要な量の溶液を保持するのに十分な容積を有する容器の中に入れて提供される。好ましくは、界面活性剤溶液は２種以上の非イオン性界面活性剤を含有する。好ましい実施態様において、界面活性剤溶液は蒸留水中に９％のTriton X-100と６％のＮＰ４０を含むものである。この特定の界面活性剤濃度はＣＤ４とＣＤ８のどちらのアッセイにも最適である。好ましくは、キットは溶解状態または用時調製のための凍結乾燥状態の細胞関連分子標品を含んでいる。より好ましくは、キットは測定対象分子について陽性の細胞を既知数だけ含む標品を含んでいる。こうして、未知のサンプル中の細胞関連分子のアッセイにおける活性を既知のサンプルと直接比較することができ、その結果、未知のサンプルに含まれる該分子について陽性の細胞の数を算出することができる。本発明によると、サンプル中の白血球マーカー陽性細胞の数は、（１）本発明の方法によりサンプル中の細胞関連分子の量を測定し、そして（２）細胞関連分子の量から細胞関連分子陽性細胞の総数を算出する、ことにより決定し得る。ある実施態様において、この算出は、細胞関連分子陽性細胞の総数に対する総細胞関連分子の標準曲線から外挿することにより行われる。他の実施態様では、標準曲線から式を導き出し、その式に細胞関連分子の量を当てはめる。キットはさらに、第二の抗体が該抗体と標識の結合により検出可能であるときには、標識と反応性の試薬を含んでいる。例えば、標識が酵素である場合、キットは酵素の基質を含むことができる。また、キットは希釈用の緩衝液を最終濃度で、希釈のために高濃度で、または用時調製のために乾燥状態で提供することもできる。更なる実施態様では、キットは１種より多い分子の免疫学的検出手段を提供する。好ましい実施態様において、キットはＣＤ４とＣＤ８の両抗原の免疫学的検出手段を含んでいる。本発明を次の非限定的実施例によってさらに説明することにする。実施例実施例１：アッセイプロトコール皮膚穿剌または指の剌傷の後で、全血をSchleicher and Schuell，Inc．（Kee ne，NH）製のグレード９０３濾紙に点在させる。円形の印が約６０μｌの血液で満たされる。この濾紙を室温で約２時間乾かし、直ちに使用するか、または約４ ℃の密閉容器に乾燥剤とともに入れて保存する。乾燥させた血斑から０．２５インチのドットをパンチで抜き取り、１２×７５ｍｍガラス管に入れる。１００μｌの溶出緩衝液を加える。溶出緩衝液はＴＲＡｘ^TMＣＤ４サンプル希釈剤（T Cell Diagnostics，Inc.；Cambridge，MA）とＴＲＡｘ^TMＣＤ４溶解試薬（T Cell Diagnostics，Inc.；Cambridge，MA）の６：１溶液、例えばサンプル希釈剤（ウシ由来の血清タンパク質およびチメロサールを含む緩衝溶液）１．０ｍｌ＋溶解試薬（１×ＰＢＳ中の６％ Nonidet P-40 （ NP-40）と９％ Triton X-100）０．２ｍｌである。その後、ガラス管に栓をして、２００ｒｐｍの振とう器の上に室温で少なくとも２時間置く。この時間の終わりに、ピペットの先端を使ってドットを注意しながら絞り出し、この溶液を混ぜ合わせた後に、ガラス管から５０μｌを取り出す。この５０μｌサンプルを、ＴＲＡｘ^TMＣＤ４アッセイキットインサート（T Cell Diagnostics，Inc.；Cambri dge，MA）中のプロトコールに従って標準ＴＲＡｘ^TMＣＤ４アッセイに加える。実施例２：ＴＲＡｘ^TMＣＤ４アッセイＴＲＡｘ^TMＣＤ４アッセイは、ヒト血液中の総ＣＤ４タンパク質を定量しかつＣＤ４リンパ球を算出するためのサンドイッチＥＩＡである。このアッセイを用いて得られた結果は、血液学的データと組み合わせたフローサイトメトリーにより測定された絶対的なＣＤ４Ｔリンパ球数と相関することが実証されている。全血検体の簡単な前処理によりリンパ球からＣＤ４タンパク質を放出させる。次いで、検体をＥＩＡでアッセイし、かつ／また、その後の検査のために−２０℃ないし−７０℃で保存する。アッセイはヒトＣＤ４タンパク質に対するモノクローナル抗体を予め被覆しておいたマイクロタイターウェルを用いて行う。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた第二の抗ＣＤ４モノクローナル抗体をウェルにピペットで注入し、続いて標品、対照または検体を加える。標品、対照または検体中に存在する可溶化ＣＤ４タンパク質はプレートに被覆された抗体と結合し、一方、抗体結合体がＣＤ４分子の第二エピトープに結合してサンドイッチを完成する。インキュベーション期間後、ウェルを十分に洗って未反応の成分を除き、酵素に特異的な色素原溶液を加える。さらに短時間のインキュベーションを行った後、反応を停止させ、４９０ｎｍで吸光度を測定する。結果として生じる着色エンドポイント（終点）は、存在するＣＤ４タンパク質の量に直接比例し、もとの検体中のＣＤ４Ｔリンパ球の数に等しい。標品および対照から標準曲線を作成し、この標準曲線から検体値を求め、細胞／μｌとして記録する。実施例３：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− スパイクおよび回収率５つの新鮮な全血サンプルをＥＤＴＡ中に採取し、１／２容量の各サンプルからＣＤ４を枯渇させた。これは、測定するときに既知量のＣＤ４の添加をもたらすように、サンプルの残りの半量を希釈するために用いられた。添加は４つの異なる濃度で行った。これらを実施例１に記載した手順に従ってＳ＆Ｓ製の９０３濾紙に点在させ、同様にサンプルの高検体（非希釈）および枯渇部分も処理した。実施した希釈は標準曲線の範囲をカバーしていた。アッセイを上記の実施例に記載した手順に従って行った。回収量を添加量（非希釈値と枯渇値から測定した）で割って回収率を計算した。結果を表１に示す。標準曲線の範囲にわたる５つの別個の新鮮全血点在サンプルへの既知量のＣＤ４の添加に関する回収率は平均９８％であった。実施例４：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− 直線性１１の新鮮全血サンプルをＥＤＴＡ中に採取し、実施例１に記載した手順に従ってＳ＆Ｓ製の９０３濾紙に点在させた。各サンプルの一部をフロー測定および溶解産物調製のために取っておいた。血斑に対して行った希釈は標準曲線の範囲をカバーしていた。アッセイを実施例１および２に記載した手順に従って行った。非希釈値に基づいて回収率を計算した。結果を表２に示す。標準曲線の範囲にわたる１１の新鮮全血点在サンプルの対応する希釈に関する回収率は平均１１２％であった。実施例５：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− アッセイ内精度１つのアッセイで、１０のサンプルを３通り（すなわち、各サンプルにつき３つの血斑）ずつ検査し、表３に示した結果を得た。上記１０サンプルの３通り（血斑）の平均相関値（ＣＶ）は４．１％であった。実施例６：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− アッセイ間変動アッセイ間変動について４つのサンプルを試験した。結果を表４に示す。平均ＣＶ５．９は次のようにして求めた：実施例７：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− 乾燥血液検体と溶解産物との相関溶解産物に対する乾燥血液検体の相関を調べた。結果を表５と図１に示す。実施例８：ＣＤ４ＴＲＡｘ^TM濾紙ドットアッセイ− 乾燥血斑とフローサイトメトリーとの相関フローサイトメトリーにより得られた結果に対する乾燥血液検体の結果の相関を調べた。結果を表６と図２に示す。図２に示すように０．９３の相関が見られた。

【手続補正書】【提出日】１９９５年１１月３０日【補正内容】請求の範囲１．被験者由来のサンプル中の細胞関連分子を検出し、またはその量を測定する方法であって、（ａ）被験者由来の生物学的液体サンプルの所定量を濾紙採取器具の上に点在させ、（ｂ）該濾紙採取器具を、選ばれた希釈剤および溶解試薬と、所定の温度で所定の時間にわたり接触させて可溶化サンプルを調製し、（ｃ）該可溶化サンプルの所定量を回収し、（ｄ）該可溶化サンプルを、細胞関連分子に特異的な結合相手少なくとも１種と、特異的結合を可能とする条件下で接触させ、そして（ｅ）サンプル中の成分と少なくとも１種の結合相手との間で生じる特異的結合を検出するか、またはその量を測定し、その際、特異的結合の検出または量がサンプル中の細胞関連分子の存在または量を示すものである、各工程を含んでなり、ここで、検出または測定される細胞関連分子がＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２およびＣＤ５４より成る群から選ばれる、上記の方法。２．前記の選ばれた希釈剤が緩衝液と溶解試薬を含む、請求項１に記載の方法。３．前記の選ばれた溶解試薬が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。４．前記の非イオン性界面活性剤がTriton X-100とNonidet P-40を含む、請求項３に記載の方法。５．濾紙採取器具を希釈剤および溶解試薬とほぼ室温で少なくとも２時間接触させる、請求項１に記載の方法。６．前記の可溶化サンプルの所定量が５０μｌである、請求項１に記載の方法。７．前記の生物学的液体サンプルが血液であり、血液を濾紙採取器具の上に点在させ、乾かして乾燥血斑をつくる、請求項１に記載の方法。８．乾燥血斑の直径０．２５インチの部分を分離し、工程（ｂ）において希釈剤および溶解試薬と接触させる、請求項７に記載の方法。９．前記の濾紙採取器具が約６０μｌの血液を含むことができるその上に表示された円形の印を有するグレード９０３の濾紙を含むものである、請求項１に記載の方法。 10．前記の生物学的液体サンプルが唾液、尿、胸膜滲出液、組織浸潤液、脊髄液、滑液および血液より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 11．サンプル中の細胞関連分子陽性細胞の概数を求める方法であって、（ａ）請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法に従って細胞関連分子の量を測定し、そして（ｂ）工程（ａ）で測定された細胞関連分子の量から細胞関連分子陽性細胞の概数を算出する、ことを含んでなる、上記の方法。 12．（ａ）被験者由来の生物学的液体サンプルの所定量を濾紙採取器具の上に点在させ、（ｂ）該濾紙採取器具を、選ばれた希釈剤および溶解試薬と、所定の温度で所定の時間にわたり接触させて可溶化サンプルを調製し、（ｃ）該可溶化サンプルの所定量を回収し、（ｄ）該可溶化サンプルを、細胞関連分子に特異的な結合相手少なくとも１種と、特異的結合を可能とする条件下で接触させ、（ｅ）サンプル中の成分と少なくとも１種の結合相手との間で生じる特異的結合を検出するか、またはその量を測定し、その際、特異的結合の検出または量がサンプル中の細胞関連分子の存在または量を示すものであり、そして（ｆ）サンプル中の細胞関連分子の量から該細胞の概数を算出する、各工程を含む、請求項１１に記載の方法。 13．細胞関連分子陽性細胞の概数を求めるためのキットであって、（ａ）紙採取器具、（ｂ）界面活性剤、および（ｃ）免疫学的検出手段を含んでなる、上記のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ジョーンズ，マーガレットエイ. アメリカ合衆国 02154 マサチューセッツ州ウォルサム，マラードウェイ 48 番地 (72)発明者ラッグ，アーサーイー. アメリカ合衆国 03053 ニューハンプシャー州ロンドンデリー，パインホロードライブ 11番地

Claims

【特許請求の範囲】１．被験者由来のサンプル中の細胞関連分子を検出し、またはその量を測定する方法であって、（ａ）被験者由来の生物学的液体サンプルの所定量を濾紙採取器具の上に点在させ、（ｂ）該濾紙採取器具を、選ばれた希釈剤および溶解試薬と、所定の温度で所定の時間にわたり接触させて可溶化サンプルを調製し、（ｃ）該可溶化サンプルの所定量を回収し、（ｄ）該可溶化サンプルを、細胞関連分子に特異的な結合相手少なくとも１種と、特異的結合を可能とする条件下で接触させ、そして（ｅ）サンプル中の成分と少なくとも１種の結合相手との間で生じる特異的結合を検出するか、またはその量を測定し、その際、特異的結合の検出または量がサンプル中の細胞関連分子の存在または量を示すものである、各工程を含んでなる、上記の方法。２．前記の細胞関連分子がＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２、ＣＤ５６およびＣＤ５４より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。３．前記の細胞関連分子がＣＤ４である、請求項２に記載の方法。４．前記の細胞関連分子がサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。５．前記の細胞関連分子が細胞内ウイルス抗原である、請求項１に記載の方法。６．前記の細胞関連分子が核酸を含む、請求項１に記載の方法。７．前記の細胞関連分子が薬理学的作用剤またはその代謝産物を含む、請求項１に記載の方法。８．前記の選ばれた希釈剤が緩衝液および溶解試薬を含む、請求項１に記載の方法。９．前記の選ばれた緩衝化溶解試薬が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。 10．前記の非イオン性界面活性剤がTriton X-100とNonidet P-40を含む、請求項９に記載の方法。 11．濾紙採取器具と希釈剤および溶解試薬とをほぼ室温で少なくとも２時間接触させる、請求項１に記載の方法。 12．前記の可溶化サンプルの所定量が５０μｌである、請求項１に記載の方法。 13．血液を濾紙採取器具の上に点在させることが、血液サンプルを濾紙の上に採取し、それを乾かして乾燥血斑をつくることを含む、請求項１に記載の方法。 14．乾燥血斑の直径０．２５インチの部分を取り出す、請求項１３に記載の方法。 15．その後、工程（ｂ）において前記の直径０．２５インチの部分を希釈剤および溶解試薬と接触させる、請求項１３に記載の方法。 16．前記の濾紙採取器具がその上に表示された円形の印を有するグレード９０３の濾紙を含むものである、請求項１に記載の方法。 17．前記の円形の印が約６０μｌの血液を含むことができる、請求項１６に記載の方法。 18．前記の生物学的液体サンプルが唾液、尿、胸膜滲出液、組織浸潤液、脊髄液、滑液および血液より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 19．サンプル中の細胞関連分子陽性細胞の概数を算出する方法であって、（ａ）請求項１〜３および１１〜１７に記載の方法に従って細胞関連分子の量を測定し、そして（ｂ）工程（ａ）で測定された細胞関連分子の量から細胞関連分子陽性細胞の概数を算出する、ことを含んでなる、上記の方法。 20．（ａ）被験者由来の生物学的液体サンプルの所定量を濾紙採取器具の上に点在させ、（ｂ）該濾紙採取器具を、選ばれた希釈剤および溶解試薬と、所定の温度で所定の時間にわたり接触させて可溶化サンプルを調製し、（ｃ）該可溶化サンプルの所定量を回収し、（ｄ）該可溶化サンプルを、細胞関連分子に特異的な結合相手少なくとも１種と、特異的結合を可能とする条件下で接触させ、（ｅ）サンプル中の成分と少なくとも１種の結合相手との間で生じる特異的結合を検出するか、またはその量を測定し、その際、特異的結合の検出または量がサンプル中の細胞関連分子の存在または量を示すものであり、そして（ｆ）サンプル中の細胞関連分子の量から該細胞の概数を算出する、各工程を含む、請求項１７に記載の方法。 21．生物学的サンプルが全血を含む、請求項２２に記載の方法。 22．細胞関連分子がＣＤ４である、請求項２１に記載の方法。 23．細胞関連分子陽性細胞の概数を算出するためのキットであって、（ａ）紙採取器具、（ｂ）界面活性剤、および（ｃ）免疫学的検出手段を含んでなる、上記のキット。