JPH08505867A

JPH08505867A - 炎症治療用の可溶性補体レセプター１（ｓｃｒ−１）とアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルの組み合わせ

Info

Publication number: JPH08505867A
Application number: JP6516809A
Authority: JP
Inventors: モサコウスカ，ダヌータ・エワ・イレナ; スミス，リチャード・アンソニー・ゴドウィン
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1996-06-25
Also published as: TW241203B; WO1994016719A1; GB9301289D0; CN1118141A; AU5863694A; CA2153797A1; ZA94398B; NZ259737A; EP0680332A1

Abstract

(57)【要約】炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療法であって、治療を必要とする哺乳動物に有効量の可溶性ＣＲ１蛋白質および有効量のアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステル（その医薬上許容される塩を含む）を投与することからなる治療法。

Description

【発明の詳細な説明】炎症治療用の可溶性補体レセプター１（ＳＣＲ−１）とアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルの組み合わせ本発明は、相乗的に作用して補体の活性化を阻害するプロテアーゼ阻害物質およびヒト可溶性補体レセプター１の治療組成物に関する。このような組成物は、補体活性化に関連する炎症または免疫障害の治療において有用である。１型補体レセプター（ＣＲ１）は赤血球、単核細胞／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、ある種のＴ細胞、脾小胞樹状細胞、および糸球足細胞の膜上に存在する。ＣＲ１は補体成分Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターと称されてきた。あるＣＲ１アロタイプの構造および一次配列は公知である（クリックシュタイン（Klickstein）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（J．Exp．Med.）１６５：１０９５−１１１２（１９８７）、クリックシュタインら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１６８：１６９９−１７１７（１９８８）、ホーケード（Hourcade）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１６８：１２５５−１２７０（１９８８）、ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７）。これはそれぞれが６０〜７０個程度のアミノ酸を含有する３０個の短いコンセンサス重複配列（ＳＣＲ）からなる。ＳＣＲあたり平均６５個のアミノ酸のうち約２９個が保持されている。各ＳＣＲはジスルフィド結合における３番目および１番目ならびに４番目および２番目のシスチン１／２とのジスルフィド結合により３次元的三重ループ構造を形成すると提案されている。ＣＲはさらにそれぞれＳＣＲ７個ずつの４個の長相同重複配列（ＬＨＲ）として配列する。リーダー配列に続いて、ＣＲ１分子はＮ末端ＬＨＲ−Ａ、次の２個の重複配列、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−Ｃ、Ｃ末端ＬＨＲ− Ｄの大部分とそれに続く２個の別のＳＣＲ、２５残基の推定トランスメンブラン領域および４３残基の細胞質末端からなる。数種のＣＲ１の可溶性フラグメントは発現されたＤＮＡからトランスメンブラン領域を除去することにより組換えＤＮＡ法で産生されてきた（ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７）。可溶性ＣＲ１フラグメントは機能的に活性であり、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合し、それらを含有する領域によりファクターＩコファクター活性を示した。このような構造はは好中球酸化破裂、補体媒介溶血現象、およびＣ３ａおよびＣ５ａ産生などのin vitroにおける補体関連機能を抑制した。ある可溶性構造のｓＣＲｌ／ｐＢＳＣＲｌｃもまた、逆受動アルチュス（reversed passive Arthus）反応においてin vivo活性を示し（ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７；イェー（Yeh）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）１４６：２５０−２５６）、虚血後心筋炎症および壊死を抑制し（ＷＯ８９／０９２２０、ＷＯ９１／０５０４７；ワイズマン（Weisman）ら、サイエンス（Science）、１９９０、２４９：１４６− １５１；デュープ、アール（Dupe,R.）ら、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thrombosis ＆ Haemostasis）（１９９１）６５（６）６９５）、移植後の生存率を向上させ（プルット・アンド・ボリンガー（Pruitt ＆ Bollinger）、１９９１、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（J.Surg.Res.）５０：３５０；プルットら、１９９１、トランスプランテーション（Transplantation）５２；８６８）、ならびに肺傷害（ラビノビッチ（Rabinovici）ら、１９９２、ジャーナル・オブ・イムノロジー１４９：１７４４−１７５０；ムリガン（Mull igan）ら、１９９２、シャーナル・オブ・イムノロジー１４８：３０８６−３０９２）、腸虚血（ヒル（Hill）ら、１９９２ＦＡＳＥＢＪ．６：Ａ１０４９）および急性心筋梗塞（ワイズマンら、１９９０、サイエンス、２４９：１４６ −１５１、デュープら、１９９１（前掲））などの病気の数種の動物モデルにおける補体活性化の治療的阻害を示した。多くの場合、これらのモデルにおいて治療的効果を得るのに必要なｓＣＲｌの用量は大きい（＞５ｍｇ／ｋｇ）。ｓＣＲｌは哺乳動物細胞培養技術により製造される生物薬剤であるので、投与量を減らしそれにより治療コストを下げるのが望ましい。ある種のカルボン酸のアミジノフェニルおよびアミジノナフチルエステルは、補体活性化の阻害物質であると共に、抗トリプシン、抗プラスミン、抗カリクラインおよび抗トロンビン活性を有することが知られている（ＧＢ２０９５２３９、ＧＢ２０８３８１８）。ＧＢ２０８３８１８は、式（Ａ）：［式中、Ｚは−（ＣＨ₂）a、−（ＣＨ₂）b−ＣＨ（Ｒ₃）−、−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ₄） −または−Ｏ−ＣＨ（Ｒ₄）−（ここに、ａは０、１、２または３、ｂは０、１または２、Ｒ₃は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基または炭素数３〜６のシクロアルキル基、Ｒ₄は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基であり、ここに−ＣＨ（Ｒ₃）−、＝Ｃ（Ｒ₄）−または−ＣＨ（Ｒ₄ ）−基は−ＣＯＯ基と結合する；Ｒ₁およびＲ₂は、同一または異なって、各々、水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基、−Ｏ−Ｒ₅、−Ｓ−Ｒ₅ 、−ＣＯＯＲ₅、−ＣＯＲ₆、−Ｏ−ＣＯＲ₇、−ＮＨＣＯＲ₇、−（ＣＨ₂）ｃ− ＮＲ₈Ｒ₉、−ＳＯ₂ＮＲ₈Ｒ₉、ＮＯ₂、ＣＮ、ハロゲン、ＣＦ₃、メチレンジオキシ、であり、ここに、ｃは０、１または２；Ｒ₅は水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基またはベンジル基；Ｒ₆は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₇は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異なって、各々、水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基あるいはアミノ保護基；Ｒ₁₀は水素原子、ジメチルまたはＣＦ₃ を意味する］で示される化合物を開示している。ＧＢ２０９５２３９は、一般式（Ｂ）：［式中、Ｒ₁₁は炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖アルキル基、１〜３個の二重結合を有する炭素数２〜６の直鎖または分枝鎖アルケニル基、Ｒ₁₃−（ＣＨ₂）d−、Ｒ₁₄ −（ＣＨ₂）e−、であり、ここに、Ｒ₁₃は炭素数３〜６のシクロアルキル基または１または２個の二重結合を有する炭素数３〜６のシクロアルケニル基；ｄは０、１、２または３；Ｒ₁₄はアミノまたはグアニジノ基または保護されたアミノまたはグアニジノ基；ｅは１〜５；Ｒ₁₅およびＲ₁₆は、同一または異なって、各々、水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基、−ＯＲ₁₇、メチレンジオキシ基、−ＳＲ₁₇、− ＣＯＯＲ₁₇、−ＣＯＲ₁₈、−ＯＣＯＲ₁₉、−ＮＨＣＯＲ₁₉、−（ＣＨ₂）f−ＮＲ₂₀ Ｒ₂₁（ｆは０、１、２）、−ＳＯ₂ＮＲ₂₀Ｒ₂₁、ハロゲン原子、−ＣＦ₃、ＮＯ₂ 、ＣＮ、であり、Ｒ₁₇は水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基またはベンジル基；Ｒ₁₈は水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₁₉は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₂₀およびＲ₂₁は、同一または異なって、各々、水素原子、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基、またはアミノ保護基；Ｒ₂₂はＯ、ＳまたはＮＨ；Ｒ₂₃は２’，３’−ジメチルまたは３’− ＣＦ₃基；Ｙは−（ＣＨ₂）ｇ−（ｇは０、１、２または３）、−（ＣＨ₂）ｈ− ＣＨＲ₂₄−（ｈは０、１、２または３）または−ＣＨ＝ＣＲ₂₅−；Ｒ₂₄は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基であり、炭素原子またはＣＨＲ₂₄基はＣＯＯ基に結合しており；Ｒ₂₅は水素原子または炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基であり、ＣＲ₂₅基の炭素原子はＣＯＯ基に結合しており；Ｒ₁₂は−Ｒ₂₆、−○Ｒ₂₆、−ＣＯＯＲ₂₇、１個または２個の同一のハロゲン原子、−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、であり、ここに、Ｒ₂₆は炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₂₇は水素原子、炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基；Ｒ₂₈は水素原子またはグアニジノ基を意味する］で示される化合物を開示している。カルボン酸の他のアミジノフェニルエステルはまた、凝集経路のプロテアーゼを阻害することが知られており（エイ・ディー・ターナー（A.D.Turner）ら、１９８６バイオケミストリー（Biochem.）２５：４９２９−３５）、さらにフィブリン溶解酵素の活性中心を可逆的にアクリル化するのにも用いられる（米国特許第４,２８５,９３２号、米国特許第４,５０７,２８３号、ＥＰ０,２９７,８８２、アール・エイ・ジー・スミス（R.A.G.Smith）ら、１９８５，プログレス・イン・フィブリノリシス（Progress in Fibrinolysis）VII ２２７−２３１）。米国特許第４２８５９３２号、米国特許第４５０７２８３号およびＥＰ０２９７８８２は、式（Ｃ）：［式中、Ｒｘは、所望により、ハロゲン、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルカノイルオキシ、Ｃ_1-6アルカノイルアミノ、アミノ、ジメチルアミノまたはグアニジノから独立して選択される１または２個の置換基で置換されていてもよいベンゾイル；ナフトイル；または所望により、Ｃ_1-6アルキル、フリルまたはフェニルで置換されていてもよいアクリロイル（ここに、フェニル基は、所望によりＣ_1-6アルキルで置換されていていてもよい）を意味する］で示される化合物を開示している。したがって、この種の化合物は補体系のプロテアーゼの特異的阻害物質ではない。ＣＲ−１関連ポリペプチドのある種の有機化合物との相乗作用組成物が記載されている（ＷＯ９２／１０２０５）。本発明によれば、炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療法であって、その治療を必要とする哺乳動物に有効量の可溶性ＣＲ１タンパク質および有効量の補体阻害活性を有する式（Ｉ）［式中、Ａは、所望によりＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルコキシカルボニル、ハロ、ＮＨ₂、スルホニル、ベンゾイルまたはＣ_1-4アルキルベンゾイルアミノで置換されていてもよいフェニルまたはナフチル；Ｂは、所望により、Ｃ_1-6アルキル、フェニルおよびＣ_1-6アルキルで置換されたフェニルから選択される基により置換されていてもよいＣＨ₂＝ＣＨ−；所望により、ハロゲン、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6 アルケノイルオキシ、Ｃ_1-6アルカノイルアミノ、アミノ、ジメチルアミノまたはグアニジノからなる群から独立して選択される１または２個の置換基で置換されていてもよいフェニル、またはナフチルを意味する］で示されるアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステル（その医薬上許容される塩を包含する）を投与することからなる方法が提供される。好ましくは、Ａは所望により２−または３−位でハロゲンで置換されていてもよいフェニルであり、アミジン置換基は該フェニル環の４位にある。Ｂは好ましくはＣ_1-4アルコキシにより４位が置換されたフェニルであり、所望によりさらにハロゲンで置換されていてもよい。もっとも好ましくは、Ｂは４−メトキシフェニルであり、Ａは４位がアミジン基で置換されたフェニルまたは２−ブロモフェニルである。ハロゲンの適当な例は、塩素および臭素を包含する。医薬上許容される塩は、医薬上許容される酸、例えば、マレイン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸、フマル酸、サリチル酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、酒石酸、メタンスルホン酸およびシュウ酸を用いて形成される。好ましい態様において、組合せ療法において用いられる可溶性ＣＲ１成分はｐＢＳＣＲｌｃ、ｐＢＳＣＲｌｓ、ｐＢＭ−ＣＲｌｃ、ｐＢＳＣＲｌｃ／ｐＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲｌｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる群より選択される核酸ベクターによりコードされ、特にＷＯ８９／０９２２０に記載されているように、ｐＢＳＣＲｌｃ／ｐＴＣＳｇｐｔから得られる。各化合物の量は、標準的補体分析において感作赤血球の溶血を５０％まで阻害するのに必要な各成分の濃度が、同一分析にて各成分に対して必要な濃度に比べて減少するように選択される。この効力の増加は以下に詳細に定義する相乗因子により表わされる。本発明はまた、可溶性ＣＲ１蛋白質および補体阻害活性を有するアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルの、炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療用医薬の製造における使用を提供する。該化合物は、標準経路、例えば静脈内注入または濃縮塊注射により投与され、一緒に、またはいかなる順序で連続して投与してもよい。化合物を一緒に投与する場合、これらは両薬剤を含む医薬組成物の形態で投与するのが好ましい。したがって、本発明の別の態様において、可溶性ＣＲ１蛋白質および補体阻害活性を有するアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルを医薬上許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。好ましい具体例において、組成物はヒトに静脈内投与するための医薬組成物として慣用的操作にしたがって処方される。さらに別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の製法であって、可溶性ＣＲ１蛋白質および式（Ｉ）のアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステル（その医薬上許容される塩も含む）を混合することからなる製法を提供する。本発明はまた、炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療法であって、このような治療を必要とする対象に、治療上有効な本発明の組成物を投与することからなる方法も提供する。前記方法において、対象は好ましくはヒトである。疾患または障害の治療に有効なな蛋白質の量は、０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。疾患または障害の治療に有効なエステルの量は、０.０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.０５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。蛋白質のエステルに対する比は好ましくは１：１〜１：２０（重量比）の範囲である。組成物は典型的には治療上活性量の蛋白質およびエステル、ならびに食塩水、緩衝食塩水、デキストロースまたは水のような医薬上許容される賦形剤または担体を含有する。組成物はまた、特定の安定化剤、例えばマンノースおよびマンニトールを含む糖類、例えばリドカインを含む注射組成物用局所麻酔剤からなっていてもよい。１またはそれ以上の医薬組成物の成分を充填した１またはそれ以上の容器からなる医薬パックも本発明の範囲に含まれる。本発明はまた、血栓症の治療、特にヒトまたはヒト以外の動物における急性心筋梗塞の治療法であって、患者に本発明の組成物を投与することからなる治療法を提供する。本発明はさらにヒトまたはヒト以外の動物における成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療法であって、本発明の組成物を患者に投与することからなる治療法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物を投与することにより、移植片を受けたヒトまたはヒト以外の動物における超急性同種移植片または超急性異種移植片拒絶反応を遅らせる方法を提供する。本発明の方法および組成物は、以下に列挙する多くの補体媒介性または補体関連障害（これに限定されない）の治療において有用である。補体関連の疾患および障害神経系障害多発性硬化症卒中ギラン・バレー症候群外傷性脳障害パーキンソン病アレルギー性脳炎不適当または望ましくない補体活性化の障害血液透析合併症超急性同種移植片拒絶反応角膜移植片拒絶反応異種組織移植拒絶反応ＩＬ−２療法中のインターロイキン−２誘発毒性発作性夜間ヘモグロビン尿症炎症性障害自己免疫疾患の炎症クローン病成人呼吸窮迫症候群火傷および凍傷を含む熱傷ぶどう膜炎虚血後再灌濯流症状心筋梗塞風船様血管形成心肺バイパスまたは腎血液透析におけるポストポンプ症候群腎虚血肝虚血感染症または敗血症多半官不全敗血症性ショック免疫合併症および自己免疫疾患リウマチ様関節炎全身紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）ＳＬＥ腎炎増殖性腎炎糸球体腎炎溶血性貧血重症筋無力症生殖障害抗体または補体媒介性不妊症物質ＢＲＬ５５７３０ − ＣＨＯ細胞におけるプラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔの発現に由来する可溶性１型補体レセプター（ＷＯ８９／０９２２０）。ＢＲＬ２４８９４Ａ（ＡＰＡＮ） − ４’−メトキシ安息香酸４−アミジノフェニルＨＣｌ（ＥＰ−０００９８７９）ＢＲＡＰＡＮ − ４’−メトキシ安息香酸４−アミジノ−２−ブロモフェニルＨＣｌ（実施例３）方法ヒツジ赤血球の溶血により測定する抗補体活性補体阻害物質の機能活性をウサギ抗体（Diamedix Corporation，マイアミ州、米国より入手）で感作したヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を測定することにより評価した。０.１Ｍ Hepes pH ７.４／０.１５ＭＮａＣｌ緩衝液中で１：１２５または１／３５.７に希釈したヒト血清が補体源であり、基本的にDacie ＆ Lewis（１９７５）（プラクティカル・ヘマトロジー第５版（Practical Haemato logy 5th Edition，Churchill Livingstone，Edinburgh and New York，３−４頁）に記載されたようにボランティアのプールから調製した。簡単には、血液を３７℃に５分間暖め、血餅を除去し、残存する血清を遠心分離により清澄化した。血清フラクションを少量のアリコートに分割し、−１９６℃で貯蔵した。アリコートを必要に応じて解凍し、使用直前にHepes緩衝液中で希釈した。感作ヒツジ赤血球の補体媒介溶解の阻害を、以下のようにして、基本的にはワイズマン（Weisman）ら（１９９０）（前掲）により記載されたようにして、ｖ底マイクロタイタープレートフォーマットを用いた標準的溶血検定を用いて測定した。標準的検定 Hepes（０.１Ｍ Hepes pH ７.４／０.１５ＭＮａＣｌ）緩衝液中希釈した２５μｌのある範囲の濃度の阻害物質（典型的には、ＢＲＬ５５７３０に関しては最終濃度が０.１μｇ／ｍｌ〜０.０００７８μｇ／ｍｌ、ＡＰＡＮまたはＢＲＡＰＡＮに関しては最終濃度が1００−０.１μＭの範囲）を２５μｌの緩衝液および５０μｌの１／１２５希釈血清と共に３７℃で１５分間培養した。１００μｌの予め暖めた感作ヒツジ赤血球を１時間３７℃で添加し、最終反応容積を２００ μｌにした。サンプルを３００ｇ、４℃で１５分間スピンさせ、平底マイクロタイタープレートに上清１５０μｌを移し、４１０ｎｍでの吸収を測定した。これは各試験溶液中の溶解量を反映する。最大溶解を、血清を赤血球と共に阻害物質の非存在下（Ｅ＋Ｓ）に培養することにより測定し、それから基底溶解度（赤血球を緩衝液と共に培養することにより測定する）（Ｅ）を引いた。阻害物質による基底溶解を、阻害物質を赤血球と共に培養する（Ｅ＋Ｉ）ことにより評価し、これを試験サンプル（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）から差し引いた。阻害率を、全細胞溶解の分数として表わし、ＩＨ５０は、溶解の５０％阻害を与えるのに必要な阻害物質の濃度を表わす。血清を１／３５.７に希釈した実験に関しては、培養時間を３７ ℃で１５分間に減らした。それ以外の条件は同一であった。最大溶解： Amax＝（Ｅ＋Ｓ）−（Ｅ）阻害物質の存在下での溶解： Ao＝（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）−（Ｅ＋Ｉ）［阻害物質］をＩＨに対してプロットし、ＩＨ₅₀値をＩＨ＝０.５に対応する濃度を読み取ることにより滴定曲線から決定する。相乗作用検定この検定は、阻害物質１、例えばＢＲＬ５５７３０を一定濃度の阻害物質２、例えばＡＰＡＮの存在下で滴定する以外は前記と同様にして行った。これは、血清の存在下に２５μｌの阻害物質１を２５μｌの阻害物質２に添加し、前記のようにして溶解度を測定することにより行った。相乗因子の決定各相乗実験に関して両阻害物質をそれ自体ならびに両方に対して滴定した。実施例１阻害物質１、ＢＲＬ５５７３０をそれ自体に対しておよび種々の濃度の阻害物質２、ＡＰＡＮの存在下で滴定した。［ＢＲＬ５５７３０］をＡＰＡＮを用いてまたは用いないでＩＨに対してプロットした（図１）。ＢＲＬ５５７３０のＩＨ５０を各ＡＰＡＮ濃度で評価した。ＢＲＬ５５７３０のＩＨ値を各ＡＰＡＮ濃度で評価した。［ＡＰＡＮ］のＩＨに対する２回目のプロットを行い（図２）、これから相乗実験において用いたＡＰＡＮの濃度に対応するＩＨを評価した。結果を表にする（表１）。第１列はＡＰＡＮの濃度である。特定の濃度のＡＰＡＮが寄与する阻害物質の割合を［ＡＰＡＮ］対ＩＨのプロット（図２）（第２列）から評価した。ＢＲＬ５５７３０に関するＩＨ５０値を各濃度のＡＰＡＮ（第３列）で決定した。ＢＲＬ５５７３０のＩＨ５０に対してなされた特定の濃度のＡＰＡＮの寄与を差し引き、即ち、０.５−ＩＨ_(APAN)（第４列）とした。この値を用いて単独でこのレベルの阻害（第５列）を与えるＢＲＬ５５７３０の濃度を読み取った。調節したＢＲＬ５５７３０濃度をＩＨ５０測定値で割って相乗因子、即ち、第５列／第３列＝第６列を得た。ＡＰＡＮの効果が付加的である場合、相乗因子は１であり、値が１より大きいことは、相乗効果であることを意味し、値が大きいほど、相乗作用の程度が大きいことを示す。イソボログラム分析阻害物質１、例えばＢＲＬ５５７３０および阻害物質２、例えばＡＰＡＮのＩＨ５０を別々に測定した。これらの実験的測定値をイソボログラム軸にプロットし、直線で結び、相加直線と称した（図３）。この直線は２つの阻害物質の組合せを表わし、これを一緒に用いた場合、５０％阻害が得られた（タラリダ（Tall arida）（１９９２）ペイン（Pain）４９：９３−９７）、ミアスコスキーおよびレビン（Miaskowski＆Levine（１９９２）５１：３８３−３８７））。相加直線上にある点は付加的効果を示し、直線より上の点は拮抗作用を示し、直線より下の点は、相乗作用を示す。ＢＲＬ５５７３０を一定濃度のＡＰＡＮの存在下で滴定し、各ＡＰＡＮ濃度でのＢＲＬ５５７３０のＩＨ５０を測定する。このデータをイソボログラム上でプロットする（図３）。一定濃度対を用いた相乗効果作用の統計的分析ＢＲＬ５５７３０をそのＩＨ５０値より低い濃度ｘで標準的検定において評価した。ＡＰＡＮもそのＩＨ５０値より低い濃度ｙで評価した。ついで、ＢＲＬ５５７３０_[x]をＡＰＡＮ_[y]と共に同一の溶血検定において分析した。阻害量を２つの阻害物質に関して別々に分析した場合、および一緒に分析した場合につき計算した。相乗作用が起こった場合、一緒に分析した化合物の阻害は２つの阻害剤の個別の測定値の合計よりも大きくなければならない。即ち、ＢＲＬ５５７３０_[x]／ＡＰＡＮ_[y]＞ＢＲＬ５５７３０_[x]＋ＡＰＡＮ_[y]である。このデータを次式にしたがってｔ−試験により統計的に分析した。ｔをｔ表における臨界レベルと比較した。ただし、自由度（ｄｆ）は以下のとおりである：ｄｆ＝ｎa＋ｎb＋ｎab−３ａ．１／１２５に希釈した血清中のＡＰＡＮのＢＲＬ５５７３０との相乗作用ＢＲＬ２４８９４Ａ（ＡＰＡＮ）分子量３２４.２４をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中５０ｍＭにした。ＢＲＬ５５７３０（１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液pH７.２中）は５.３ｍｇ／ｍｌである。標準的分析において、ＡＰＡＮに関しては１００μＭ〜０.７８μＭ、ＢＲＬ５５７３０に関しては０.１２５μｇ／ｍｌ〜０.０００９８μｇ／ｍｌの範囲にわたり、両阻害物質を滴定した。２つの滴定曲線をＢＲＬ５５７３０に関して作成し、これから平均ＩＨ５０は０.０１μｇ／ｍｌ（図１）、ＡＰＡＮに関する曲線から、ＩＨ５０は１０μＭであった（図２）。相乗効作用を試験するために、ＢＲＬ５５７３０を同じ濃度範囲であるが、一定濃度のＡＰＡＮの存在下（各滴定に関して１〜６μＭ）で滴定した（図１）。データから相乗因子を前記のようにして計算した。表１のデータから、６μＭＡＰＡＮとＢＲＬ５５７３０は、ＩＨ５０を約８倍減少させることがわかる。ＡＰＡＮの各濃度での相乗因子の計算値を表１に示し、相乗因子が＞１であるのでＡＰＡＮの効果は付加的以上であることがわかる。相乗因子は用いた濃度にわたって一定のままで、平均値は１.８である。ＢＲＬ５５７３０（濃度範囲０.０４〜０.００００３９μｇ／ｍｌ）をそれ自身に関して滴定した。補体活性化の阻害が起こらない濃度は〜０.０００４μｇ／ｍｌであることが判明した。ＡＰＡＮのそれ自身に関する滴定から４μＭの濃度でＩＨは０.３１、２μＭでＩＨは０.１６であった。ＢＲＬ５５７３０を４および２μＭのＡＰＡＮの存在下で滴定した場合、ＢＲＬ５５７３０の０.０００４μｇ／ｍｌでの阻害は、ＡＰＡＮに関して計算される値より大きく、ＡＰＡＮは効果なしの濃度以下でＢＲＬ５５７３０を活性にする。ｂ．ＡＰＡＮとＢＲＬ５５７３０のイソボログラム分析相加直線を前記のようにして、図１および図２からデータを読み取って作成した。ＢＲＬ５５７３０の各ＡＰＡＮ濃度でのＩＨ５０（表１のそれぞれ第１および３列）を図３に示すイソボログラム上にプロットした。相加直線の下にある点は、相互作用が相乗的であることを意味する。ｃ．ＢＲＬ５５７３０およびＡＰＡＮ間の一定濃度対を用いた相乗作用の統計的分析以下の濃度対を前記のように相乗作用に関して試験する。（ｉ）０.００５μｇ／ｍｌＢＲＬ５５７３０４μＭＡＰＡＮ（ii）０.００５μｇ／ｍｌＢＲＬ５５７３０２μＭＡＰＡＮ（iii）０.００２μｇ／ｍｌＢＲＬ５５７３０４μＭＡＰＡＮ（iv）０.００２μｇ／ｍｌＢＲＬ５５７３０２μＭＡＰＡＮ各濃度対についての統計学的パラメータを以下に示す。各試験濃度対で、仮説１が正しいことが判明した。即ち効果は付加的でなく、ａ＋ｂ＜ａｂであるので相乗作用が示された。ｄ．ＡＰＡＮに対するＢＲＬ５５７３０の相乗効果ＢＲＬ５５７３０のＡＰＡＮのＩＨ５０に対する効果を実施例１ａに記載したのと同様の方法で試験するが、この場合ＡＰＡＮを０.７８μＭ〜１００μＭにわたり０.００１〜０.００６μｇ／ｍｌの一定濃度のＢＲＬ５５７３０の存在下で滴定した。ＢＲＬ５５７３０のＡＰＡＮのＩＨ５０に対する効果を表２に示し、０.００６μｇ／ｍｌのＢＲＬ５５７３０の添加はＡＰＡＮのＩＨ５０を１０ μＭから１μＭにシフトさせ、これは１０倍の向上である。相乗因子は、方法において記載したようにして決定し、＞１であることが判明し（表６）、ＡＰＡＮおよびＢＲＬ５５７３０間の相乗プロセスは可逆的であることを示す。すでに記載した実施例１ａと異なり、相乗因子はＢＲＬ５５７３０の濃度に依存すると考えられる。ｅ．ＡＰＡＮとＢＲＬ５５７３０のイソボログラム分析イソボログラム分析を前記のようにして、図２および６表のデータを用いて行った。相加直線の下にある点は効果が相乗的であることを示す。ｆ．１／３５.７に希釈した血清中のＡＰＡＮおよびＢＲＬ５５７３０の相乗効果ＡＰＡＮおよびＢＲＬ５５７３０間にみられる相乗作用がより濃縮された血清中で再生可能かどうかを試験するために、実施例１ａにおいて記載したものより３.５倍濃縮された１／３５.７希釈の血清中で実験を行った。この血清濃度が感作ヒツジ赤血球の最大溶解を起こさないことを確かめる予備実験として、５０μ ｌの１／１０〜１／１５０の種々の希釈度の血清を５０μｌの０.１Ｍ Hepes pH ７.４／０.１５ＭＮａＣｌ緩衝液と共に３７℃で１５分間予備培養した。１００μｌの赤血球を添加し、サンプルを１５分または３０分間３７℃で培養した。未溶解細胞を〜３００ｇ、４℃で１５分間回転させ、次に４１０ｎｍでの吸光度を読み取る前に１５０μｌの上清を平底ミクロタイタープレートに移した。血清希釈度の吸光度に対するプロットから１／３５.７の希釈度で１５分間赤血球と共に血清を培養すると〜９０％の最大溶解が得られることがわかった。この血清濃度が適していることが証明されたので、ＢＲＬ５５７３０とＡＰＡＮの相乗実験をより濃縮した血清を用い、培養時間を１５分に減少させる以外は実施例１ａと同様にして行った。ＢＲＬ５５７３０のより濃縮した血清中の滴定により、ＩＨ５０は〜０.１４ μｇ／ｍｌ（２つの測定値の平均）であり、これは１／１２５希釈血清中よりも１４倍大きい。同様に、ＡＰＡＮのＩＨ５０は５２μＭであることが判明し（２測定値の平均）、これはより希釈された血清中よりも約５倍大きい。ＢＲＬ５５７３０を１〜０.００７８μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたり、２〜１８μＭの濃度範囲のＡＰＡＮの存在下で滴定することにより相乗実験を行った。データをまとめて表７に示し、これは相乗効果がより濃縮された血清中で大きくなることを示す。この場合の相乗因子はＡＰＡＮの濃度に依存すると考えられる。ｇ．濃縮された血清中のＡＰＡＮとＢＲＬ５５７３０のイソボログラム分析１／３５.７に希釈した血清中のＡＰＡＮおよびＢＲＬ５５７３０のＩＨ５０を用いて相加直線を作成した。表７の第１および３列からのデータを用いてイソボログラムを作成した。２μＭ以外の点はすべて相加直線の下にあり、これは相乗作用であることを示す。２μＭのデータは第７表の相乗因子が１.０３であることを示し、イソボログラムの相加直線上にあり、これはこの濃度で効果は付加的であることを示す。ｈ．ＢＲＡＰＡＮのＢＲＬ５５７３０に対する相乗効果４’−メトキシ安息香酸４−アミジノ−２−ブロモフェニルＨＣｌ（ＢＲＡＰＡＮ）分子量３８６をＤＭＳＯ中１０ｍＭにし、方法において記載したようにして１／１２５に希釈した血清を用いて滴定した。２つの別の測定値からＢＲＡＰＡＮの平均ＩＨ５０値は３μＭであった。ＢＲＬ５５７３０の０.１〜０.０００７８μｇ／ｍｌの滴定曲線を作成し、これからＩＨ５０は０.０２１μｇ／ｍｌであった。相乗作用を試験するために、ＢＲＬ５５７３０を同じ濃度範囲にわたり、ただし０.１μＭ〜０.９μＭの範囲のＢＲＡＰＡＮの存在下で滴定した。表８はＢＲＡＰＡＮのＢＲＬ５５７３０に対する相乗作用を示す。同じ血清希釈度でのＡＰＡＮに関して、相乗因子は＞１で、これはＢＲＡＰＡＮがＢＲＬ５５７３０と相乗作用することを示す。相乗因子は濃度範囲にわたりほぼ一定に維持され、平均値は１.７であり、これはまたＡＰＡＮに関して見られるのと非常に類似している。ｉ．ＢＲＡＰＡＮのＢＲＬ５５７３０に対する効果のイソボログラム分析実施例１ｈにおいてＢＲＡＰＡＮに関して記載したデータを用いて、イソボログラムを作成する。すべての点は相加直線の下にあり、相乗作用が起こったことを示す。実施例２ｓＣＲｌ（ＢＲＬ５５７３０）およびＡＰＡＮ（ＢＲＬ２４８９４Ａ）の共処方Ｄ−マンニトール（シグマ社（Sigma.ＵＫ）、６０ｍｇ）を注射用水（９.５ｍｌ）中に溶解した。ＡＰＡＮをＨＰＬＣ等級のメタノール中に外界温度（２０〜２５℃）で５分間攪拌することにより溶解し、最終濃度を６ｍｇ／ｍｌにした。溶液（０.５ｍｌ）を直ちにマンニトール溶液に添加し、振盪することにより混合した。ＢＲＬ５５７３０の溶液（１０ｍＭ燐酸ナトリウム（pH７.２）中、５ｍｇ／ｍｌ、０.２ｍｌ）を添加し、振盪し、直ちにドライアイス中で凍結した。物質を平均圧力２〜３ミリバール、冷却温度（−６０℃）で２０時間凍結乾燥した。白色固体は以下の組成を有し、これをデシケータ中、−７０℃で貯蔵した：ＢＲＬ５５７３０：１ｍｇ；ＢＲＬ２４８９４Ａ：３ｍｇ；Ｄ−マンニトール；６０ｍｇ；燐酸ナトリウム：微量。実施例３４’−メトキシ安息香酸４−アミジノ２−ブロモフェニルＨＣｌ（ＢＲＡＰＡＮ）の調製該物質を２−ブロモ−４−シアノフェノールより２工程にて調製した。ａ：２−ブロモ−４−アミジノフェノール塩酸塩の調製２−ブロモ−４−シアノフェノール（１.３５ｇ、６.８ミリモル）をエタノール（２０ｍｌ）中に溶解した。塩化水素ガスを該冷却溶液に通すと、４５分後に白色沈殿が形成された。２時間後、発泡が停止し、溶液中固体を４℃で２日間静置した。白色固体を濾過により単離した。これを直ちにエタノール溶液（５０ｍｌ）中に懸濁させ、エタノール中アンモニア飽和溶液（７５ｍｌ）を添加した。懸濁液は略すぐに透明になり、これを２４時間攪拌し、同じ期間静置した。揮発性物質をすべて除去し、白色固体を水（２０ｍｌ）中に溶かした。濃塩酸（５ｍｌ）を添加すると白色結晶塊が素早く形成され、これを濾過により単離し、エタノール（２０ｍｌ）およびジエチルエーテル（１００ｍｌ）から再結晶した。収率：８６０ｍｇ（５０％）。融点２７９〜８０℃。 ¹Ｈｎｍｒ（ＣＤＣｌ₃−ｄ⁶ＤＭＳＯ）δ：９.２（４Ｈ，ｂｒｄ，アミジン）、８.２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，アリール−Ｈ）、７.８（１Ｈ，ｍ，アリール−Ｈ）、７.２５（１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，アリール−Ｈ）ＩＲ（ヌジョール）：３３２５、３１２５、２３００〜３４００、１６７０、１６１０、１５８５、１４１０、１３００、１１７５、１０４５、８８０、８３５、７２５、６２０ｃｍ^-1 元素分析：Ｃ₇Ｈ₈Ｎ₂ＯＢｒＣｌとして、計算値（％）；Ｃ，３３.４５、Ｈ，３.２８、Ｎ，１０.９５；計算値（％）；Ｃ，３３.４３、Ｈ，３.２１、Ｎ，１１.１４ｂ．標記化合物の調製４−メトキシベンゾイルクロリド（２７１ｍｇ、１.５９ミリモル）の乾燥ピリジン（５ｍｌ）中溶液に、２−ブロモ−４−アミジノフェノール塩酸塩（４００ｍｇ、１.５９ミリモル）を添加した。最初の懸濁液は透明溶液になり、次に沈殿が再形成された。１時間攪拌した後、赤外分析によりエステルが形成されたことがわかる。ピリジンを減圧下に除去し、最終微量残存物をエタノールと共沸した。得られた白色固体を５：１ジエチルエーテル／エタノールから２回再結晶して、白色の標記化合物を得た。収率：２２５ｍｇ（３７％）。融点２１２〜３ ℃。 ¹Ｈｎｍｒ（ｄ⁶ＤＭＳＯ−トレースＣＤＣｌ₃）δ：９.５５（４Ｈ，ｂｒ，アミジノフェノールＮＨ）、６.９５〜８.２５（７Ｈ，ｍ，アリール−Ｈ）、３ .９（１Ｈ，ｓ，ＯＣＨ₃）ＩＲ（ヌジョール）：２５００〜３４００、１７３５、１６６５、１６０５、１５８０、１２６０、１２３０、１１７０、１０７０、１０２０、８３０ｃｍ^-1 元素分析：Ｃ₁₅Ｈ₁₂Ｎ₂ＢｒＣｌとして、測定値（％）：Ｃ，４６.６６；Ｈ，３.７４；Ｎ，７.１９；測定値（％）：Ｃ，４６.７２；Ｈ，３.６６；Ｎ，７ .２６図面；図１は、異なる濃度のＡＰＡＮのＢＲＬ５５７３０に対する効果を示す；図２は、ＡＰＡＮによる補体活性化の阻害を示す；図３は、標準分析法におけるＢＲＬ５５７３０およびＡＰＡＮのイソボログラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スミス，リチャード・アンソニー・ゴドウィンイギリス国エセックス・シーエム19・５エイディー、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コールドハーバー・ロード（番地の表示なし）スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療法であって、治療を必要とする哺乳動物に有効量の可溶性ＣＲ１蛋白質および有効量の補体阻害活性を有する式（Ｉ）：［式中、Ａは、所望により、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルコキシカルボニル、ハロ、ＮＨ₂、スルホニル、ベンゾイルまたはＣ_1-4アルキルベンゾイルアミノで置換されていてもよいフェニルまたはナフチル；Ｂは、所望により、Ｃ_1-6アルキル、フェニルおよびＣ_1-6アルキルで置換されたフェニルから選択された基により直換されていてもよいＣＨ²＝ＣＨ−；所望により、ハロゲン、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-6アルケニル、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルケノイルオキシ、Ｃ_1-6アルカノイルアミノ、アミノ、ジメチルアミノまたはグアニジノからなる群から独立して選択される１または２個の置換基で置換されていてもよいフェニルまたはナフチルを意味する］で示されるアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルあるいはその医薬上許容される塩を投与することを特徴とする治療法。２．可溶性ＣＲ１蛋白質および請求項１において定義した補体阻害活性を有する式（Ｉ）のアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルの、炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療用医薬の製造における使用。３．可溶性ＣＲ１蛋白質および請求項１において定義した補体阻害活性を有する式（Ｉ）のアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルと、医薬上許容される担体とからなる医薬組成物。４．炎症または不適切な補体活性化に付随する疾患または障害の治療法であって、かかる治療を必要とする対象に治療上有効量の請求項３に記載の組成物を投与することを特徴とする治療法。５．１またはそれ以上の請求項３に記載の医薬組成物の成分を充填した１またはそれ以上の容器からなる医薬パック。６．可溶性ＣＲ１蛋白質と請求項１において定義した式（Ｉ）のアミジノフェニルまたはアミジノナフチルエステルの組合せを混合することからなる請求項３記載の医薬組成物の製法。７．可溶性ＣＲ１蛋白質が、核酸ベクターｐＢＳＣＲｌｃ／ｐＴＣＳｇｐｔによりコードされたものであり、エステル化合物が４’−メトキシ安息香酸４−アミジノフェニルＨＣｌまたは４’−メトキシ安息香酸４−アミジノ−２−ブロモフェニルＨＣｌである請求項１、２、３、４、５または６の各々に記載の治療法、使用、組成物、治療法、パックまたは製法。