JPH08503935A

JPH08503935A - 線虫チューブリン由来のペプチドおよびワクチン

Info

Publication number: JPH08503935A
Application number: JP6510491A
Authority: JP
Inventors: ケー．プリチャード，ロジャー; イナヤトバジョー，ナスリーン; マリオフォーバート，ガータン
Original assignee: マクギルユニバーシティ
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 1996-04-30
Also published as: AU5282193A; WO1994010201A1; KR950704359A; CA2147756A1; EP0674659A1

Abstract

(57)【要約】本発明は線虫起原のβ−チューブリンに実質的に結合するモノクローナル抗体およびその断片に関する。寄託番号HB11129のもとでATCCに寄託された本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が提供される。本発明の抗体は寄生性疾患に対する駆虫剤および診断薬剤として使用できる。本発明は又、免疫化剤としてそしてワクチン組成物中で、モノクローナル抗体により認識される抗原の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】線虫チューブリン由来のペプチドおよびワクチン発明の背景１．発明の分野本発明は、線虫起源のβ−チューブリンに特異的に結合するモノクローナルに関し、この抗体は寄生性疾患に対する駆虫剤および診断剤として使用できる。本発明は又哺乳動物、例えばヒトおよび犬に対しブルギス(Brugis)およびジロフィラリア(Dirofilaria属)に対し保護するためのワクチン組成物において有用なイムノゲンのペプチドの使用に関する。本発明はブルギスおよびジロフィラリア属の寄生虫に対し哺乳動物を保護するための改善された手段を提供するペプチド断片の使用に関する。更に詳しくは、本発明のペプチド断片に暴露された犬は、ペプチドにより誘発された細胞毒性抗体により犬糸状虫症から保護される。２．従来技術の簡単な説明寄生性疾患、例えば住血吸虫症（ビルハルツ住血吸虫症）マラリアおよびフィラリア症は、多くの人々を冒しそしてしばしば胃腸管、循環系および他の疾患の原因となる。寄生性感染は、しばしば慢性又は再発性であり、そしてイムノゲンタイプの疾患が記載されていなかったことは驚くべきことでない。フィラリア症は、熱帯のおよび亜熱帯の国において発生しそしてフィラリオデス(Filarioides属)によって引きおこされる一群の疾患である。フィラリア症はリンパ系を巻き込み、尿び尿症、ヒドロコエレ(hydrocoele)および、陰のう、足および腕をおかすであろう象皮病の障害に到らしめる。フィラリア症の病因学と病原論 Wuchereria bancrofriはヒトにおいてのみ見出され； Brugia malayiはしばしば男性から動物宿主に拡がる。成糸状虫はヒトのリンパ系に住む。妊娠した雌により放出されたミクロフィラリアは、通常夜に末梢の血液中に見出される。感染は多くの種の蚊により拡がる。ミクロフィラリアは昆虫の脳の筋肉内で発育しながら、蚊により摂取され、そして成長するとその口部に移行する。感染した蚊が新しい宿主をかむと、ミクロフィラリアはかみついた剌し傷に侵入しそして必然的にリンパに達し、ここでそれらは成長段階に発育する。病因論幼虫および成虫付近で発生する炎症および線維症は、著るしいリンパ障害をもたらす症状および症候潜伏期間は２ケ月と短い。「予備潜伏」期間、すなわち感染から血液中におけるミクロフィラリアの出現は少なくとも８カ月である。臨床的発見は感染の程度に依存し；それらにはリンパ管炎、リンパ節炎、こう丸炎、精索炎、こう丸副こう丸炎、リンパ静脈瘤および乳び尿症が含まれる。寒け、熱、頭痛およびけん怠感も又現われる。象皮病および他の後のひどい余病が、地方病の地域およびくりかえしの再感染において長期の帯留を伴って生じる。フィラリア病（熱帯性好酸球増加症）の異常な形態は、過好酸球増加症、組織内であるが血液中ではないミクロフィラリアの存在および高力価の抗フィラリアの抗体（熱帯性好酸球増加症）により特徴づけられる。臨床的に、患者はリンパ節−スプレノミグリ(splenom egly)又はせき、気管支けいれんおよび胸部浸潤を伴う可能性がある。診断ミクロフィラリアは、血液又はリンパ液中に見出すことができる。多数の血清学テストが入手可能であるが、しかし完全には信頼できない。抗体検知手順が開発されつつある。チューブリンミクロチューブリンはタンパク質様小器官でありこの小器官は、有糸分裂、細胞内輸送、細胞形状の保持並びに線毛、べん毛および知覚小器官の形成を含む多様の細胞の機能に関係している。微小管の主な構造成分はチューブリンであり、これはα−およびβ−サブユニットから構成され、ダイマーは分子量110kDaを有する。α−およびβ−チューブリンは不均一なものとして表われるが、異なる生物体、組織においておよび同じ生物体における単細胞において多数の異形の密接に関連した科である。チューブリンイソフォーム（isoforms)の不均一母集団は明確なチューブリン遺伝子の相違発現と翻訳後改変の両方から生じ得る。以下の内容が提案された；すなわちチューブリンイソフォームの相違点は特異的MT 機能に対し関係を有している（レヴィスアンドコーワン，J．of Cell Biol ．，1988，106：2023-2033)。α−およびβ−チューブリンイソフォームの正確な性質又は役割はこれまで明らかにされていない、しかし幾つかのグループの研究者達はチューブリンの生体内での機能は或る程度、イソフォーム特異的であると実証した（グルーダーソン等、Cell，1984，38：779-789)。ベンズイミダゾール、抗−有糸分裂および抗−真類剤は、駆虫性疾患の治療において広く用いられている。幾つかの化学薬品例えばコルヒチン、ビンブラスチンはチューブリンに結合することが明らかにされている。ベンズイミダゾールは、チューブリンに結合しそしてヘテロダイマーが微小管に重合することを阻止することにより毒性作用を示す。ベンズイミダゾールは、麻すい並びに自由生活線虫ケノルハブデチスエレガンス(Caenorhabditis elegans)において遅い成長を誘発する。これらの薬物はB.phangiおよびB.malayiに対する強力なフィラリア撲滅薬である。しかし正確なベンズイミダゾール結合部位は決定されていない。モノクローナル抗体は、チューブリンの構造、分布および機能を研究するため、異なる種においてチューブリンの異なるドメインを認識することを可能にした。タングおよびプリカード(Mol．& Biochem．Parasitology，1989，32：145-152 )は、成虫 B.pahangiのチューブリン富化抽出物中に４〜５個のβ−チューブリンイソフォームの存在を報告した。加えて、B.malayi成虫に関するイムノゴールド（immunogold）研究は小皮、腸管内ブラシ縁下方の身体筋肉ブロック並びに成虫の子宮内ミクロフィラリア内にβ−チューブリンの存在を明らかにした（ヘム等、Parasite Immunology，1988，11:479-502)。寄生性原生動物および線虫に対して生ぜしめられた幾つかの他の抗−チューブリンモノクローナル抗体が、他の種からのチューブリンと交差反応することが見出された。例えば、ブラベー等(Protoplasma，1985，128:201-207)は豚の脳のチューブリンに対し生ぜしめられたモノクローナル抗体を報告しており、該チューブリンは多様の種（哺乳動物、鳥、両生動物、菌類、きょく皮動物、へん形動物、変形菌）からの微小管と反応するが、原生動物チューブリンとは反応しない。同様に、バーケット等(FEBS Letters，1985，187:211-218)はPysarum myxamoe baeに対する抗−β−チューブリンモノクロナール抗体を生ぜしめたが、該Pysar um myxamoebaeは種々の菌類、藻類、高度植物、鳥、昆虫および幾つかの哺乳動物源からのβ−チューブリンと反応する。加えて、ヘム等(Parasite Immuno logy，1989，11：479-502)はBrugia種のミクロフィラリアに対するモノクローナル抗体を生ぜしめた。本発明の抗−B.pahangi β−チューブリンモノクローナル抗体に反し、これらのモノクローナル抗体は哺乳動物チューブリンと交差反応した。従来技術の全てのこれらのモノクローナル抗体は線虫起源のチューブリンに対し特異的でない。線虫チューブリンに対し特異的に結合しそして駆虫剤としてそして駆虫性疾患に対する信頼性のある診断薬として使用できるモノクローナル抗体を有することが極めて望ましい。 BrugiaおよびDirofilariaの如き寄生虫に対する哺乳動物を免疫するために使用できるペプチドを有することが極めて望ましい。望ましいペプチドはこれらの寄生虫に対する免疫保護を与えるためワクチン組成物中で使用できる。発明の要約本発明によれば、線虫由来のβ−チューブリンに特異的に結合するモノクローナル抗体およびその断片が提供される。本発明のモノクローナル抗体は駆虫性疾患における駆虫薬および診断薬として使用できる。本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、18個のアミノ酸に相当する線虫β−チューブリンのＣ−末端を認識する。本発明の別の態様によれば、寄生虫に対する免疫化剤としてペプチドの使用が提供され、ここにおいて該ペプチドは次のアミノ酸配列：を有する。本発明に係るペプチドの使用は、寄生虫、例えばBrugiaおよびDirofilariaに対する細胞毒性抗体の生産を宿主により誘発する。本発明によれば、ペプチドを含んでなる寄生性感染に対するワクチンが提供され、このペプチドは次のアミノ酸配列：最後に、本発明によれば本発明のワクチンの投与を含んでなる、寄生虫に対する哺乳動物の免疫方法が提供される。本発明のワクチンは、体重１kg当たり0.01 5μｇ〜0.l5mg、好ましくは体重１kg当たり1.5μｇ〜l5mgの用量で投与できる。図面の簡単な説明本発明の性質を一般的に説明したので、添付図面への参照はなされないかもしれないが、この図面は本発明の好ましい態様を例示的に示している。図１は、図１Ａにおいて抗−B.pahangi βチューブリンモノクローナル抗体および図１Ｂにおいて抗−ひな鳥脳チューブリンモノクローナル抗体を用い、寄生虫、豚脳および3T3線維芽細胞からの抽出物のウェスタンブロット（Wes tern blot）分析である。図２は、図２Ａにおいて抗−B.pahangi βチューブリンモノクローナル抗体P3D又は図２Ｂにおいて抗−B.pahangi βチューブリンモノクローナル抗体 1B6を用い、成虫B.pahangiの抽出物の全タンパク質のウェスタンブロット分析である。図３は、図３Ａにおいて抗−B.pahangi βチューブリンモノクローナル抗体P3Dおよび図３Ｂにおいて抗−B.pahangi βチューブリンモノクローナル抗体1B6の限定加水分解からの生成物のウェスタンブロット分析である。図４は試験管内で雌のB.phangi成虫の生物適合性に対する抗−B.pahangiチューブリンモノクロナール抗体P3Dの効果のグラフである。図５は試験管内で雌のB.phangi成虫の生物適合性に対する抗−B.phangiチューブリンモノクローナル抗体1B6の効果のグラフである。図６は試験管内で雌のB.phangi成虫の生物適合性に対する抗−ひな鳥脳チューブリンモノクローナル抗体357の効果のグラフである。発明の詳細な記載Ｉ−モノクローナル抗体本発明の第一の態様は抗−B.phangiチューブリンモノクローナル抗体の生産および特徴に関する。本発明のモノクローナル抗体、P3Dとして示される、は特にB.pahangiおよびDi rofilariaからのβ−チューブリンのＣ−末端部分に関しそして従ってこれらの寄生虫を殺すことができる。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマP3Dは、1992年９月18日に寄託番号HB11129のもとでアメリカンタイプカルチュアコレクション（12301 パークローンドライブ，ロックビレ，メリーランド，米国20852）に寄託された。この寄託は、この特許を開示する、譲受人マクギル（McGill）大学に対して特許の付与後入手可能である。寄託は又対応特許が出願された国において外国特許法により要求される如く入手できる。合計、45個の抗−B.pahangiチューブリンモノクロナール抗体が、精製したB .pahangiチューブリンでマウスを免疫した後に得られた。チューブリンに対するそれらの著るしい特異性のため、とりわけモノクローナル抗体P3Dおよび1B6がより広範な特徴化に対し選ばれた。一次元SDS-PAGEのウェスタンブロット分析は、本発明の抗−B.pahangiモノクローナル抗体が多数のフィラリアの線虫（B.pah angi，B.malayiおよびD.immitis）および腸管の線虫H.contorcus）からのチューブリンを認識することを示した。しかし、モノクローナル抗体は豚脳、3T3マウス線維芽細胞又は寄生性原生動物G.murisからのチューブリンと交差反応しなかった。一方、抗−ひな鳥モノクローナル抗体357は、それがフィラリアのおよび他の線虫β−チューブリンについて強く反応した如く豚脳、3T3マウス線維芽細胞と反応した。本発明の抗−B.pahangiチューブリンモノクローナル抗体は、エピトープを認識しこのエピトープはフィラリアのおよび腸内線虫β−チューブリンとの間で維持されるが、原生動物と哺乳動物β−チューブリンにおいては維持されない。一方、交差反応性抗−ひな鳥モノクローナル抗体357はエピトープを認識し、このエピトープはフィラリアノおよび腸内線虫並びに原生動物および哺乳動物β−チューブリンにおいて維持される。モノクローナル抗体357によって認識されたエピトープは豚脳チューブリンのタンパク分解断片中のアミノ酸33 9−417間でβ−チューブリンの領域に対し局在化された（セラノ等、Analytical Biochemistry，1986，159：253-259）。本発明の抗−B.pahangiチューブリンモノクローナル抗体は線虫チューブリンに対し高度に特異的である。チューブリンのα−又はβ−サブユニットに対する特異的本発明のモノクローナル抗体は細胞下の局在下および研究すべきチューブリンの各サブユニットの機能を与える。チューブリンのサイズのタンパク質は、明確な機能を有する幾つかの構造的ドメインから一般に構成される。チューブリンの場合、そのような機能は抗−微小管薬、GTP又は微小管−関連タンパク質の結合並びにモノマー、ダイマー又はプロトフィラメント間の会合を含む。本発明の線虫−特異的抗−チューブリンモノクローナル抗体は、B.pahangiチューブリン分子の構造および分布を特徴づけるためおよび微小管の安定性および機能的ドメインを定義するため役立ち得る。次の手順が本発明のモノクローナル抗体の調製および特徴づけのため用いられる。酵素−結合イムノソルベント分析（ELISA）ポリリシン−精製チューブリン又はB.pahangiチューブリン（グエンテ等、Mol ．and Biochem．Parasitology，1991，44：153-164）の一番端のＣ−末端残基43 0-448に相当する18個のアミノ酸ペプチドでコートされたマイクロタイタープレート（ファルコン）中でホスフェート緩衝液中10μｇ／mlの濃度でELISAを行った。プレートをPBS中１％のウシ血清アルブミン（BSA）200μｌと共にインキュベートした。西洋わさびペルオキシダーゼ−ラベル化抗−マウスIgG又はIgM（バイオーガン，ミシガン，オンタリオ）をそれぞれ１：5000および１：20,000の希釈で各ウェルに加え次いで37℃で１時間インキュベートした。基質は２，２′− アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（シグマ）である。プレートをタイターテークマルチスカン（Titertek multiskan）（商標）プレート（フローラボラトリー，イルビン，アシレ，英国）上で414nmで読みとる。ハイブリドーマを増殖させるために用いた通常のマウス血清又は培地（イスコベス変性ダルベコの培地（IMDM）20％ FCS、10％NCTC135およびHFを有す）をネガチブ対照として用いる° ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）濃縮用ゲルとして４％ポリアクリルアミドおよび分離用ゲルとして12％ポリアクリルアミドを用いミニプロティーンII（Mini Protean）II（商標）デュアルスラブセル（バイオラッド，リッチモンド，カナダ）中でサンプルを装作する。等電点電気泳動および二次元電気泳動（IEF-2D SDS-PAGE） IEFゲルを調製しそして9.5Ｍの尿素（LKB）および２％（ｗ／ｖ）のアンフォリン（ampholines）（LKB）（1.6％ pH４−６および0.4％ pH3.5−10）を含有するチューブゲル（1.5×８cms）中で装作する。IEFを400Ｖで16時間行いそして 800Ｖを３時間行った。電気泳動を４％ポリアクリルアミド濃縮用ゲルおよび12 ％ポリアクリルアミド分離用ゲル中で行い、50Ｖで30分間そして150Ｖで６分間ミニプロティーンII（商標）スラッブセル中で装作した。２次元（2D）SDS−P AGE後、ゲルを銀染色剤（バイオラッド）で染色するか又はタンパク質をウェスターンブロット分析に対しニトロセルロース（NC）シート上に移す。ウェスターンブロッティング１および2D SDS-PAGE後、チューブリンサブユニット、個々のチューブリンイソ型およびペプチドを電気泳動的に４℃で２時間ニトロセルロースシート上に移行させた。ニトロセルロースシートを、分離したタンパク質の同一パターンを有する幾つかの小片に切断した。タンパク質帯を可視するため、２個のニトロセルロース小片をアミド黒で染色する。残りの小片をPBS中で洗い、ニトロセルロースの未占有タンパク質結合部位を飽和させるためトリス−緩衝液塩類溶液（140mM NaCl₂、50mM Tris-HCl、pH7.4、0.1％（ｖ／ｖ）Tween20（商標）（TBS-T）と共に）中、新生子牛血清（Gibco）中で室温でインキュベートする。洗浄後、小片を抗−チューブリンモノクローナル抗体（MAbs）又はIMDM（ネガチブ対照）と共に４℃で一夜インキュベートする。次いでニトロセルロース小片をTBS-Tと共に６×５分洗い、高塩緩衝液（1M NaCl、10mM Tris-HCl、pH7.4 ；0.5％（ｖ／ｖ）Tween20（商標）（HSB-T）、10％NBCSと共に）で１：500に希釈したペルオキシダーゼ−共役やぎ抗−マウスIgM又はIgG（Bio-Can）中に浸漬し、次いで室温で２時間インキュベートする。TBS-Tでニトロセルロース小片を3 0分間洗った後、結合したペルオキシダーゼを、30％の過酸化水素0.075％を含有する、メタノール／PBS、１：５（vol／vol）中３mg／mlで基質４−クロロ−１ −ナフトール（Sigma）を用いて検出する。１−抗原の調製 400B．pahangi伝染性幼虫で腹腔内にすでに感染し９−10月経たゲルビルス（G ebils）（Meriones unguiculatus）を、J.McCall博士（ジョージア大学、米国）から得る。成虫のB.pahangi（0.7ｇ）を温生理食塩水（0.85％NaCl）中でねずみの腹腔から集め、１mMのエチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸（EGTA）、0.5mMのMgSO₄および１mMのグアノシン−５′−トリホスフェート（GTP）を含有する0.025Ｍの緩衝液で洗い、次いで７mlの２（Ｎ−モルホリ）−エタンスルホン酸（MES）緩衝液で均一化する。ホモジネートを100,000ｇで４℃で１時間遠心分離する。上澄みを保持しペレットをすてる。同じ手順を用い他のフィラリア（B.malayiおよびD.immitis）および非−フィラリア線虫（A.suum，H.contortusのベンズイミダゾール−感受性および抗抵抗系統）からチューブリンを作成するため用いる。豚脳からのチューブリンを２サイクルの重合−脱重合により調製した。 Giardra Muris抗原を超音波処理物として得る。アプライドビシステムペプチドシンセサイザー（商標）を用い合成し、 HPLC精製し、配列決めしそして担体タンパク質、キーホールLimpet Hemocyanin （KLH）（アルバートペプチドインスティチュート）に結合させる、B.pahan gi β−チューブリンのアミノ酸残基430-448に対応するペプチドも又酵素−結合イムノソルベント分析（ELIST）において抗原として使用される。２−寄生虫チューブリンの精製 B.pahangi，B.malayi，D.immitis，A.suumおよびH.concortusチューブリンを、ポリリシンアフィニティクロマトグラフィーを用い部分的に精製する（レーシーアンドプリカード，Mol．&Biochem．Para-sitology，1986，19：171- 181）。溶出プロフィルは三つの明確なピークから成っていた。最出のタンパク質のピークはMES緩衝液で溶出され、第二のピークは１％の水性（NH₄）₂SO₄で溶出される。各ピークの分画をプールしそしてClntriflo（商標）（Amicon）中400 ｇで別個に濃縮する。ポリリシン−精製タンパク質をSDS-PAGEで分離し、チューブリンに相当する分子量のタンパク質帯を削り、そしてタンパク質を電気−溶出する（Electroelute r（商標）、Bio-Rad）（ブルーズ等、J．of Cell Biol.，1984，98：847：858）。溶出したタンパク質を−20℃で５時間80％アセトンで３回沈でんさせ次いで0. 125Ｍ Tris-HCl（pH6.8）；0.1％SDSおよび１mM EDTAに溶解し、この緩衝液に対し４℃で一夜透析しそして用いるまで−70℃で保存した。成虫B.pahangiの粗上澄みをポリリシンアガロースカラムでクロマトグラフィー処理する。各分画の溶出含量を測定する。溶出プロフィルは、３つの明確なピークから成っていた。第一および第二のピークにおけるタンパク質濃度は、第三のピーク中の濃度と比較して極めて高かったが、しかしこの最後のピークに反し、最初の二つのピークはもしチューブリンがあったとして少ない量しか含んでいなかった。これは、タングおよびプリカード（Mol & Biochem．Parasitology，1989，32：145-152）による報告と一致する。第三のピークのタンパク質を濃縮し次いでそれぞれSDS-PAGEに委ねる。チューブリン帯を SDS−ゲルから切断しそして更に精製するため電気−溶出に委ねる。３−モノクローナル抗体の免疫および調製６週目の老雌BALB／ｃマウス（カーレスリバーカナダ社，St．コンスタント，クベック）に、第一の注射に対し同量の完全フロイドアジュバントそして第二の注射に対し不完全アジュバントを用い、精製溶出B.pahangiチューブリン（1 00μｇ／注射）を用い３週間の間隔で皮下注射する。PBS中の100μｇのチューブリノンの第３回目の免疫を腹腔内（i.p.）投与する。この段階で、マウスを出血させそして血清をELISAおよびウェスターンブロッティングにより抗−チューブリン抗体に対しテストする。最高の力価を与えるマウスからのひ臓細胞を、ミエローマ細胞系P3×63．Ag8（アメリカンタイプカルチュアコレクション（ATCC）、寄託番号CRL1580）ロックビレ，MD）と、ハーレル（「Monoclonal hy bridoma antibodies：Techniques and Applications」，1982、CRC社、ボマラトン，フロリダ、P.22）により記載される如く融合させる。 ELISAおよびウェスターンブロッティングにより測定される如く陽性培養物を制限希釈により２回クローン化する。抗−B.pahangiモノクローナル抗体の２つの異なるイソタイプを得た。54個のモノクローナル抗体の内７つは多反応性IgMであり、これはチューブリン並びに高分子量および低分子量のタンパク質を認識し、一方残りのモノクローナル抗体は２つの集団のIgGイソタイプを示した。これらの内、54の内４つはチューブリンおよび他の低分子量タンパク質と反応し；しかし53 個のモノクローナル抗体はチューブリンに対し特異的であった。線虫チューブリンに特異的モノクローナル抗体P3Dおよび1B6を、更に特徴化のため選んだ。これらのモノクローナル抗体はIgGイソタイプからのものである。４−モノクローナル抗体（MAbs）三種のモノクローナル抗体（全てチューブリンに特異的）を調ベる。抗−ひな鳥脳モノクローナル抗体357（これは真核細胞タイプのスペクトルからのβ−チューブリンと交差反応する）を、ラジオケミカルセンター（アマースハム，英国）から購入しそしてモノクローナル抗体P3Dおよび1B6を成虫B.pahangiのチューブリンに対し生ぜしめる。全ての抗−チューブリンモノクローナル抗体はIgG イソタイプから成る。５−モノクローナル抗体（MAbs）P3D，1B6および357の特異性これらのモノクローナル抗体の特異性を、ELISAおよびウェスターンブロットを用い、多様のフィラリアのおよび非−フィラリアの線虫からのタンパク質に対するそれらの反応性を測定することによって調べる。 ELISAにおいて、抗−B.pahangiモノクローナル抗体P3Dおよび1B6はG.murisチューブリンと反応せず、このチューブリンは抗−ひな鳥脳チューブリンモノクローナル抗体357によって認識される。B.pahangiの成虫およびミクロフィラリア、成虫B.malayiおよびD.immicis，H.contortusの卵、成虫A.suum、豚脳および3T 3マウス繊維芽細胞チューブリンの粗および部分精製抽出物をSDS-PAGE上で分離しそして電気泳動的にニトロセルロース上に移した。ブロットを（１）アミドブロック；（２）モノクローナル抗体1B6；（３）モノクローナル抗体P3Dおよびモノクローナル抗体357で処理する。アミド黒染色ブロットの分析により次の内容が判明した；B.pahangiの成虫およびミクロフィラリア、成虫B.malayiおよびD.immitis，H.contortusの感受性かつ抵抗性系統の卵、成虫A. suum、豚脳および3T3マウス繊維芽細胞の粗製抽出物はチューブリン領域に多くの帯を含んでいた。種々の線虫および哺乳動物抽出物からのチューブリンは２つ帯に分かれ、αおよびβで示される。抵−B.pahangiモノクローナル抗体P3Dはフィラリア虫B.pahangi，B.malayiおよびD.immitisの成虫およびミクロフィラリアからのβ−チューブリンを特異的に認識する（Fig．１Ａ、レーン１〜４）。それは又腸内線虫H.concorcus（Bz−感受性およびベンズイミダゾール−抵抗性系統）からのチューブリンと同程度に反応する（Fig．１Ａ、レーン５〜６）。A.s uumからのチューブリンはこのモノクローナル抗体とは非常に強い反応性を示さず、3T3マウス繊維芽細胞又は豚脳チューブリンに対する反応性は検出されない（Fig．１Ａ、レーン８〜９）。同様の結果は、モノクローナル抗体1B6を用いても得られる（図示せず）。一方、交差反応抗−ひな鳥β−チューブリンモノクローナル抗体357は全ての線虫および哺乳動物細胞からのβ−チューブリンを認識した（Fig．１Ｂ、レーン１〜９）。６−チューブリンイソ型の同定抗−B.pahangi β−チューブリンモノクローナル抗体P3Dおよび1B6および抗−ひな鳥β−チューブリンモノクローナル抗体357を用い、B.pahangiチューブリンにおいてβ−チューブリンイソ型を特徴化する。モノクローナル抗体P3 D（Fig．２Ａ）および357は同イソ型パターンを認識し、B.pahangiの粗製並びに部分精製抽出物中の２つのβ−チューブリンイソ型と反応した（図示せず）。一方、モノクローナル抗体1B6は、B.pahangiの抽出物中１個のβ−チューブリンイソ型のみ特異的に認識した（Fig．２Ｂ）。 β−チューブリンイソ型はpH5.1−5.3内にある。モノクローナル抗体357のプローブしたブロットを、同じスポットがこのモノクローナル抗体によって認識されることを実証するため、モノクローナル抗体P3Dおよび1B6でそれぞれ再プローブ化する。更に、β−チューブリンイソ型の完全な補体を示すため、P3Dおよび1B6プローブ化ブロットをモノクローナル357で再プローブする。結果は次の内容を示す；すなわち、全てのこれらのモノクローナル抗体は成虫B.pahangiのチューブリン富化抽出物中の同イソ型を認識した。７−チューブリンのタンパク質限定加水分解ゲルスライ中でのチューブリンのタンパク質限定加水分解を行う。チューブリンに対応するゲル片をポリアクリルアミドゲルから切断しそして第二の15％SDS −ポリアクリルアミドゲルのサンプルウェルに直接投入する。ゲル断片を次のプロテアーゼの一つと共に重ねる：牛のすい臓からのα−キモトリプシン（シグマ）又はS.aureus V8プロテアーゼ（ベーリンガーマインハイム）。SDS-PAGEは、ブロモフェノールブルー染料がスタッキングゲルの底に達するまで50Ｖで行いそして残りの電気泳動に対し150Ｖに増加させる。SDS-PAGE後、ウェスタンブロット分析に対し記載したと同様の方法で消化されたペプチドを銀染料で染色するか、又はニトロセルロースシート上に移し、次いでいずれかを、抗−B.paha ngiチューブリンモノクローナル抗体又は抗−ひな鳥チューブリンモノクローナル抗体357と反応させる。８−チューブリンタンパク分解断片と抗−チューブリンモノクローナル抗体の相互反応３個の同一のゲルを製作しそしてペプチド断片をニトロセルロース上に移す。これらの三つは、抗−B.pahangiチューブリンモノクローナル抗体P3Dおよび1B 6で抗体染色され（Fig．３）そして抗−ひな鳥脳β−チューブリンモノクローナル抗体357で抗体染色される（図示せず）。一方、キモトリプシンで消化されたペプチドのブロットは、モノクローナル抗体P3Dが21kDaのキモトリプシン断片と反応し（Fig．３Ａ、レーン２）そして21k DaのV8プロテアーゼβ−チューブリン断片と反応した（Fig．３Ａ、レーン３）ことを示した。これに反し、モノクローナル抗体1B6は、42および43kDaの２つのキモトリプシン−消化断片と反応した（Fig．３、レーン２）。それは42kDa断片と強く反応しそして34kDa断片と弱く反応した。しかし、同じプロテアーゼ（Fig ．３Ｂ、レーン３）。タンパク質限定加水分解分析のこれらの結果は次の内容を示している；すなわちモノクローナル抗体P3Dにより認識された抗原部位は、モノクローナル抗体1B6により認識された抗原部位とは異なる。モノクローナル抗体357は、B.pahangiからのそのようなβ−チューブリンに強く反応するけれどもキモトリプシン又はV8プロテアーゼで消化されたβ−チューブリン断片との相互反応は見られなかった（図示せず）。プロテアーゼの消化は、モノクローナル抗体357に対しB.pahangiチューブリンの反応性を破壊するようである。II−寄生虫に対する免疫化剤として使用されるペプチド本発明のモノクローナル抗体P3Dは、18個のペプチドに相当する線虫β−チューブリンのＣ−末端を認識する。本発明の第二の態様は、本発明の抗体により認識される、ペプチドの使用に関し、これは次のアミノ酸配列：リンのＣ−末端に位置する。更に、本発明はワクチンに関し、このワクチンは次のアミノ酸配列：本発明は、B.pahangiおよびDirofilariaからのβ−チューブリンのＣ末端で18 個のアミノ酸から由来するアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。このペプチドはペプチド配列を用い又は組換えDNA工学を用いて製造できる。本発明のペプチド、その断片又は本発明のペプチドのアミノ酸配列を含んでなるより大きなペプチドは、寄生虫感染に対し有効な保護を与える。そのようなワクチンは当業者により製造できる。 B.pahangi又はDirofilariaからのβ−チューブリンのＣ−末端部分に特異的に反応するモノクローナル抗体はこれらの寄生虫を殺すことが見出された。従って、B.pahangi又はDirofilariaのＣ末端のエピトープを有するペプチドを含んでなるワクチンを用いることは、これらの寄生虫を殺しそして寄生虫に対し哺乳動物を保護するワクチン化した哺乳動物における細胞毒抗体を明らかにするであろう。本発明はB.pahangi又はDirofilaria β−チューブリンのＣ末端から18個のアミノ酸酸基又はその断片を含んでなるワクチン並びに18個のアミノ酸配列である部分を有するペプチドを含んでなるワクチンに関する。 BrugiaおよびDirofilaria β−チューブリンのカルボキシ末端でのアミノ酸は DEEGDLQEGESEYIEQEE又は −グルタメート−グリシン−アスパルテート−ロイシン−グルタミン−グルタメート−グリシン−グルタメート−セリン−グルタメート−チロシン−イソロイシン−グルタメート−グルタミン−グルタメート−グルタメートである。本発明のペプチド、その断片又はこの配列を含むより大きいペプチドの生産は、標準ペプチド合成又は組換えDNA工学を用いて行うことができ、双方とも当業者に周知である。ペプチド合成は約50個のアミノ酸又はそれ以下を含んでなるポリペプチドを作るのに好ましい方法である。より大きい分子に対し、組換えDNA 工学を用いた宿主細胞中での生産は好ましい。本発明に従ったより小さなペプチドは、以下に述べるようにアプライドバイオシステム 430Aペプチド合成機（アプライドバイオシステム，フォスター市，カリフォルニア）を用い例えば、固体−相法により合成できる。より大きな分子に対しては、組換えDNAを用い宿主細胞内での生産が好ましい。タンパク質を生産するために組換えDNA工学を用いることを望む当業者にとって利用できる幾つかの異なる方法がある。典型的には所望のポリペプチドをエンコードする遺伝子を発現ベクター内に挿入し次いでこれは適当な宿主細胞を形質転換又は移入するために用いられる。次いで挿入された遺伝子は宿主細胞内で発現されそして所望のポリペプチドが生産される。遺伝子および組換えベクターを生産するための方法および材料、それらを用い宿主細胞に移入又は形質転換、宿主細胞内のベクターの複製および生物学的に活性な外来ペプチドおよびタンパク質の発現は、オールドおよびプリムローズによる「Principles of Gene Manipulation」，２版、1981およびサムブルック等「M olecular Coloning」，コールドスプリングハーバーラボラトリー社，NY （1989）に記載されており、両方の開示は引用して本明細書に加えれる。 1989年６月28日に公表されたヨーロッパ特許出願322,237、米国特許4,735,801 （ストッカー、４月５日、1988年）および米国特許4,837,151（ストッカー、４月５日、1988年）は、ワクチンにおいて有用な希薄した微生物を記載しておりそしてその微生物はそれらの芳香生合成経路において２つの明確な遺伝子において非−復帰変異を有する。これらの微生物は、経口の生きたワクチンの基礎を有用に形成できそして他の病原体から抗原を発現せしめるように遺伝子工学的に操作できる。これらの文献は、それを引用して本明細書に全て加えられる。例Ｉ B.pahangi阻害の試験管内分析雌B.pahangi又は抗−ひな鳥モノクローナル抗体に対する抗−B.pahangiチューブリンモノクローナル抗体P3D，1B6および抗−ひな鳥脳チューブリンモノクローナル抗体は、独立に無傷の成虫を害せしめることができる。メベンダゾール（MBZ）は、MBZ薬単独の存在又はモノクローナル抗体との共働において特異な効果を有するがどうかを決定するため用いられる。阻害剤抗−B.pahangi β−チューブリンモノクローナル抗体P3D，1B6 （培地中）、抗−ひな鳥β−チューブリンモノクローナル抗体357（腹水液中）およびメベンダゾール（MBZ）（DMSO中）、ベンズイミダゾール駆虫性薬を試験管内分析において阻害剤として用いる。抗−B.pahangi抗−ひな鳥脳モノクローナル抗体357は腹水液中にありそして培地IMDM／FCSを用いて１：1000濃度に希釈される。試験管内での培養寄生性線虫をそれらの哺乳動物宿主から単離する。B.pahangiを、20％胎児血清を補なわれたイスコブの改変ダルベコの培地／NCTC-135（IMDM／FCS）の無菌フード（hood）において先に述べた如く、アレチネズミの腹膜腔から単離する。単離に次いで、B.pahangiを表面殺菌に対し、無菌IMDM／FCS培地で５回洗う。24 個のウェルのプレート（Nune）中の３個のウェルを、毎試験モノクローナル抗体、薬に対しおよび対照培養物に対し準備する。各ウェルに純粋なモノクローナル抗体P3D，1B6，357単独又はモノクローナル抗体およびMBZおよび２匹の成虫を含有する適当な試験培地２mlを加えた。プレートを95％の空気および５％CO₂の存在下、湿らしたインキュベーター中37℃でインキュベートした。虫の活性を２時間毎に観察しそして運動性を肉眼で観察することにより主観的に評価する。48時間のインキュベーション中培地は変えない。対照培地は、モノクローナル又は薬なしでIMDM／FCSの同一量を含有していた。 MTT還元分析の最適化雌の生存B.pahangi虫を、0.5mg／ml〔３−（４，５−ジメチル（チアゾール− ２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド」（Sigma）（MTT）を含有する0.5mlのIMDM中に入れそして０−90分の種々の間隔の間37℃でインキュベートする（MTＴ−還元）。予じめ熱で殺された雌の虫も又この範囲にわたって選られた時間間隔の間MTTと共にインキュベートされる。各タイムポイントに対し三匹の複製の虫を用いる。MTTインキュベーションの最後に、虫をとり除きそして20μｌのDMSOを含有するマイクロタイタープレートの個別のウェルに注意深く移しそして色彩を均一に分散させるため時折穏やかに撹拌しながら、室温で１時間放置する（ホルマザン可溶化）。次いで得られたホルマザン溶液の吸光度を、ELISAリーダーを用い500nmで測定し、そしてBMSOブランクと比較する。 B.pahangi生物適合性の定量 MTTに基づく三工程比色分析を、寄生性線虫の生活力を評価するために用いる。MTTを5.0mg／mlの濃度でPBS中に溶解し次いで引き続きPBSで0.5mg／mlに希釈する。虫を37℃で30分間インキュベートする（MTT減少）。インキュベーション後、200μｌのDMSOを含有する96個のウェルのプレートに移す。プレートを室温で１時間法する（ホルマザン可溶化）。虫の存在および不存在下、550nmで吸光度を測定しそしてDMSOブランクと比較する。対照目的のため、虫をPBS中100℃で 10分間加熱することにより殺す。これまでの研究は、抗−ガン治療における増殖と細胞毒分析におけるMTT−ホルマザン比色定量の有用性を実証した。引き続き、以下の内容が実証された；すなわちこの分析の適用はフィラリアの生活力を測定するため並びに試験管内抗− フィラリア薬のスクリーニングに対して好結果であった。MTTは薄−黄色溶液であるが、生きている細胞とインキュベートすると、活性ミトコンドリアにより還元され細胞内に暗青結晶析出物（ホルマザン）を生成し、一度可溶化したものは比色定量的に定量化できる。本発明によれば、MTT分析が寄生性線虫の生活力に対する抗チューブリンモノクローナル抗体の効果を測定するために行なわれる。生活可能な対照の雌B.pa hangiは、MTTとのインキュベーションの最初の30分内で最大かつ線状であるホルマザン形成速度を示した。１時間までには、ホルマザン形成速度は落ちはじめ60〜90分間で平坦になった。熱死させた虫はホルマザン形成のバックグラウンドレベルのみを示した。抗−B.pahangiモノクローナル抗体P3DのみおよびMBZと共同して処理された虫は、12時間処理後、検知できる運動性の減少を示す。単独およびMBZと共同した他の抗−B.pahangiモノクローナル1B6は、又虫の運動性の明白な衰えを示すが、しかし実験中これらのモノクローナル抗体を用い死亡は観察されない。MBZのみ又は抗ひな鳥脳モノクローナル抗体357のみ又はMBZで処理された虫、又は対照虫の運動性に関し観察できる減少は認められず、その期間中虫は飼育される。これらの観察から、虫の運動性の減少は抗−B.pahangiモノクローナル抗体のみにより主に起因することが示唆される、何故ならMBZ単独では虫の運動性に関し作用を与えないからである。 MTT分析は、B.pahangi処理されたモノクローナル抗体がMTTを還元しホルマザンとするそれらの能力において著るしい減少を示すことを示す（図４）。このモノクローナル抗体のみは、未処理の生きている虫、48時間後処理と比較して、虫の生活力において高度に著るしい80％の減少をもたらした。モノクローナル抗体 P3Dと協動してMBZは、虫の生活力において著るしい70％の減少をもたらした。虫の生活力の著るしい減少は、モノクローナル抗体P3Dの存在に帰因するようであり、MBZの存在のためではないようである。MBZのみは虫の生活力において最少の減少（10％）を誘発する。モノクローナル抗体1B6に暴露すると、MTTを還元する虫の能力において40％の減少をもたらした（Fig．５）。モノクローナル抗体P3D および1B6は雌に関して雄の生活力に関し同じそれぞれの効果を有していた。抗 −ひな鳥β−チューブリンモノクローナル抗体357は、虫の生活力に関して何ら著るしい効果を示さなかった（Fig．６）。抗−B.pahan giおよび抗−ひな鳥脳モノクローナル抗体の性質は定量的に同等と思われる。B. pahangiの運動性および生活力における差異は、それらの異なる結合親和力に依存するであろう。対照の未処理生存雌の虫は、ホルマゾンの生産に関し線状速度を示しそして550nmで1.1の吸光度の読み取りを示した。これに反し、熱死虫はMT Tの還元に対し能力を示さない（Fig．４−６）。１時間DMSOの可溶化後、生成ホルマゾンの吸光度を、雌虫の存在下又は非存在下で測定する。これは虫の存在が吸光度に対し何らかの作用を有するとき測定するために行なわれる。虫の存在下において、得られた吸光度値のわずかな増加が存在する。MTT還元の阻害は、処理された虫の全長に沿って必ずしも常に均一に生ぜずそして生活力を保持する領域が認められる。従ってMTT還元中虫を精密に観察すると、時として選択的損害の部位を決定することが可能である。結論例Ｉの結果は、虫を本発明の抗−チューブリンモノクローナル抗体P3Dおよび1B6と共に飼育したとき、運動性の明白な減少を実証する。しかし、虫を抗− ひな鳥モノクローナル抗体357、抗体なしのMBZもしくはIMDM／FCS培地で処理するとき、運動性の顕著な減少は観察されない。虫の生活力はMTT分析により評価された。本発明の抗−B.pahangi、モノクローナル抗体P3Dおよび1B6は、寄生性線虫の生活力を著るしく減少させた。成虫B.pahangiを抗−ひな鳥モノクローナル抗体357および／又はMBZに暴露したとき、生活力の減少は認められなかった。例II 抗−寄生性抗体組成物腹腔内投与に対し適当な医薬担体中に１mg／0.5mlから10mg／0. ５mlまで変化する用量で、駆虫剤としてアレチネズミに投与すべき抗体組成物。そのような投与に対する担体は、IMDM培地である。例III 18個のアミノ酸ペプチドの製造このペプチドは次のアミノ酸配列：から成る。ワクチン中で使用するためのペプチドを製造するため、0.1mmoleスケールでAB I’s スモールスケールラビットサイクル（SSRC）を用いたアプライドバイオシステム社（ABI）430Aペプチド合成機又は他の同様の合成機を用い、固相法によりこのペプチドを合成する。SSRCは標準Boc化学を用い簡略化した単一カップルサイクルを利用する。用いたｔ−Boc−Ｌ−アミノ酸（１mmole）は、標準側鎖保護基を備えABIにより供給される。完成したペプチドは支持PAM（フェニルアセタミドメチル）樹脂から、ペプチドのアミノ酸配列に応じ適当なカチオン補促剤（10％ｖ／ｖアミソール、ｐ−クレゾール＋ｐ−チオクレゾール、１，４ −ブタンジオール＋アニソール又はDMS＋アニソール）を用いる標準HF法により、側鎖保護基と同時に、除去される。 HF開裂後、粗製ペプチドを水−アセトニトリルグレージェントを用いPhenomen ex C-10カラムを用い調製逆相クロマトグラフィーにより精製する（各相は0.1％のTFAを含有する）。純粋な分画（分析用HPLCにより測定される如く）をプールし、アセトニトリルを蒸発させ次いで水性溶液を凍結乾燥する。ペプチドを高速原子衝撃質量スペクトル法により分析し次いで生成（Ｍ＋Ｈ）⁺を予期した（Ｍ＋Ｈ）⁺と比較する。例IV 18個のアミノ酸ペプチドを含んでなるワクチンペプチドは、周知の手順によりワクチン用量形態で製造できる。ワクチンは、舌下に、筋肉内に皮下的に又は経鼻的に投与される。非経口投与、例えば筋肉内投与に対し、イムノゲンは適当な担体と共に一緒にでき、例えばそれは水、食塩水又は種々の補助薬と共に又はそれらなしで緩衝化されたビヒクル又は免疫調節剤、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（alum）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルション、水中油型エマルション、コリネバクテリウムパラム（Corynebacterium paru m）、（Propionobacterium acnes）、ボルデテラペルツソス（Bordetella per tussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、イソロイシン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、DEAE−デキストラン、ブロックコポリマー又は他の合成補助薬と共に投与できる。そのような補助薬は種々の会社より商業的に入手でき、例えばメルク補助薬65（メルク社，ラーウィ，NJ）である。イムノゲンおよび補助薬の割合は、両者が有効な量で存在する限り広い範囲にわたって変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約0.5量で存在する（Al₂O₃基剤）。用量基剤当たりにつき、イムノゲンの濃度は動物又はヒトの患者に対し、患者の体重kg当たり約0.015μｇから約1.5mgの範囲にわたることができる。ヒトにおける好ましい用量範囲は、約0.1−１ml、好ましくは約0.1mlである。従って、筋肉内注射に対する用量は、例えば0.5％水酸化アルミニウムと共にイムノゲンを含有する0.1mlを含んでなる。本発明のワクチンは又他の疾患に対する他のワクチンと共に組合せて多価ワクチンを製造することができる。本発明のワクチンは又、他の医薬、例えば抗生物質と組合せることもできる。本発明はその特定の態様に関連して記載したが、次のように理解されるべきである；すなわち更に改変が可能であり、この出願は一般に本発明の原則に従いそして本発明の開示が、発明が関連している技術の範囲内で実施できるものとしてそして前記した本質的特徴に適用される如くそして請求の範囲で権利要求される如く、本発明の如何なる変形、使用又は適用を含むものである。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：マクギル大学 845シェルブルックスストリートウェストモートリアル，クベック，カナダ H3A 1B1 （ii）発明の名称：線虫チューブリン由来のペプチドおよびワクチン（iii）配列の数：１（iv）通信住所（Ａ）名あて人：マーチャントアンドゴールド（Ｂ）街：3100 ノースウェストセンター（Ｃ）市：ミネアポリス（Ｄ）州：ミネソタ（Ｅ）国：米国（Ｆ）ZIP：55402 （ｖ）コンピューター読みとり方式（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：LBM PC コンパチブル（Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインレリース＃1.0バージョン＃1.25 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）先行出願データ：（Ａ）出願番号：US 07／967，829 （Ｂ）出願日：1992年10月28日（Ｃ）分類：（viii）代理人／代理店情報（Ａ）名称：ウェスナー，バーレンＤ（Ｂ）登録番号：30，440 （Ｃ）参考／ドケット番号：10022.3-WOO1 （ix）通信情報（Ａ）電話：612-332-5300 （Ｂ）テレファクス：612-332-9081 （２）配列番号：１に対する情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：18個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号：１：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者フォーバート，ガータンマリオカナダ国，ケベックエイチ９ジェイ２ピー１，カークランド，デスバラッツ 21

Claims

【特許請求の範囲】１．線虫起源のβ−チューブリンに実質的に結合するモノクローナル抗体およびその断片。２．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体を産生しそして寄託番号HB11 129のもとでATCCに寄託されているハイブリドーマ細胞系。３．駆虫剤としての請求の範囲第１項記載の抗体の使用。４．寄生性疾患用の診断薬としての請求の範囲第１項記載の抗体の使用。５．フィラリア症の原因である寄生虫に対して向けられた請求の範囲第３項記載の使用。６．寄生性疾患がフィラリア症である、請求の範囲第４項記載の使用。７．寄生虫に対する免疫化剤としてのペプチドの使用であって、ここにおいて該ペプチドが少なくとも次のアミノ酸配列：８．寄生虫に対する免疫化剤としてのペプチドの使用であって、ここにおいて該ペプチドが少なくとも次のアミノ酸配列：９．寄生虫に対し、細胞毒性の抗体の宿主により生産を誘発するペプチドの使用であって、該ペプチドが次のアミノ酸配列： 10．寄生虫に対し細胞毒性の抗体の宿主による生産を誘発するペプチドの使用であって、該ペプチドが少なくとも次のアミノ酸配列 11．医薬担体と共に、次のアミノ酸配列：でなる寄生虫の感染のためのワクチン。 12．少なくとも次のアミノ酸配列：の感染のためのワクチン。 13．寄生虫に対し哺乳動物を免疫する方法であって、請求の範囲第11又は12項記載のワクチンを投与することを含んでなる、前記方法。 14．寄生虫が線虫である、請求の範囲第13項記載の免疫方法。 15．線虫がイヌシジョウチュウでありそして哺乳動物がイヌ類である、請求の範囲第14項記載の免疫方法。 16．前記ワクチンを体重１ｋｇ当たり0.015μｇ〜0.l5mgの用量範囲で投与する、請求の範囲第13〜15項のいずれか１項に記載の方法。 17．前記ワクチンを体重１kg当たり1.5μｇ〜0.l5mgの用量範囲で投与する、請求の範囲第16項記載の方法。